CN106556524A - 一种适合植物组织器官的冰冻切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适合植物组织器官的冰冻切片方法，是将植物组织器官在温度为‑20℃至‑25℃条件下用冰冻包埋剂包埋后，在温度为‑6℃至‑12℃条件下保持30分钟以上再进行切片。采用本发明方法，能够快速地获得高质量且保持植物原有生物活性的植物组织器官切片，并且操作简易，成本低，尤其适用于鲜重含水量在85%以上的幼嫩植物组织器官以及切面组织间木质化程度不均一且髓部所含海绵组织超过茎秆横切面面积二分之一的植物组织器官。另外，采用本发明方法制备的切片如果只需要进行普通组织结构观察，用冰水浴保存可以存放3天以上，方便对切片进行长时间的显微观察分析。
Description
技术领域
本发明属于植物材料切片技术领域，涉及一种适合植物组织器官的冰冻切片方法。
背景技术
在植物学及细胞生物学研究方面，切片制作尤其是获得高质量的切片非常重要。
冰冻切片是将生物组织置于低温下迅速冻结达到一定硬度后进行切片的一种实验技术。与常规的石蜡切片相比，冰冻切片不需要脱水、透明、浸蜡等繁琐的操作过程，生物组织不会收缩，易保持细胞结构原有的生活形态，并且还具有快速、简便、易操作，成本较低等优点，因此常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究。
目前冰冻切片技术主要在动物和人体组织器官研究方面应用得比较广泛，而在植物方面，由于植物细胞含有较硬的细胞壁以及含水量很高的大液泡，冰冻后的植物组织器官硬度大，形成的冰晶多，从而不易获得高质量的切片。近年来，有一些研究报道对关于植物中不同组织器官冰冻切片技术的应用及方法进行了探讨，但这些方法大多数是将植物材料经过FAA、多聚甲醛或乙醇等固定液固定、以及一定浓度的甘油处理或液氮速冻等处理后才能得到较好的切片效果，不仅切片条件各异，而且操作过程也较为复杂，对于初学者较难掌握。另外对于切面组织间木质化程度差异大、直径较大且髓部含有较大面积海绵状细胞的植物组织器官（如甘蓝型油菜发育成熟的主茎）也很难获得完整的切片。
因此，为了推广冰冻切片在植物研究方面的应用，有必要进一步优化和发明操作简易且效果理想的植物材料冰冻切片新技术。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适合植物组织器官的冰冻切片方法，可以快速地获得高质量且保持植物原有生物活性的植物组织器官切片，并且操作简易，成本低，尤其适合鲜重含水量在85%以上的幼嫩植物组织器官，以及切面组织间木质化程度不均一、且髓部所含海绵组织超过茎秆横切面面积二分之一的植物组织器官。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种适合植物组织器官的冰冻切片方法，是将植物组织器官在温度为-20℃至-25℃条件下用冰冻包埋剂包埋后，在温度为-6℃至-12℃条件下保持30分钟以上再进行切片。
上述方法中，切片温度为-6℃至-12℃，具体温度可根据植物组织器官的含水量进行选择，通常植物组织器官的含水量越高，切片所需的温度越高。
上述方法中，所述植物组织器官可以是新鲜的植物组织器官。特别是鲜重含水量在85%以上的幼嫩植物组织器官，例如植物幼嫩茎秆、叶片、叶柄或花药，可以直接采用新鲜材料按照上述方法进行冰冻切片。
上述方法中，所述植物组织器官还可以是经过预处理的植物组织器官。对于不易直接包埋做切片的新鲜的植物组织器官，特别是切面组织间木质化程度不均一且髓部所含海绵组织超过茎秆横切面面积二分之一的植物组织器官，例如植物发育成熟的茎秆、根或角果皮，可以将新鲜材料经过预处理后再按照上述方法进行冰冻切片。所述预处理是将新鲜的植物组织器官在冰水浴中浸泡2至3天，保持冰水浴中一直有冰存在。这种预处理方法不需要应用大量化学试剂，既可以软化植物材料，又可以使髓部空腔部分填充适当的水分，可以获得高质量的切片。
上述方法除了适用于甘蓝型油菜，可以用于制备甘蓝型油菜茎秆、叶片、叶柄、花药、根、角果皮切片外，还适用于制备其他植物相似组织器官的切片。
采用本发明方法制备的切片，当只需要进行普通植物组织结构观察时，可以直接将切片放在冰水中保存，可保存3天以上；当需要对切片进行染色处理时，可将切片从冰水中转移到载玻片上直接染色；对于需要及时处理观察，或是切片中目标观察物会受到冰水浴影响时，可以直接用载玻片在冷冻切片机机箱中贴片，然后再进行各种处理或是直接观察。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种适合植物组织器官的冰冻切片方法，能够快速地获得高质量且保持植物原有生物活性的植物组织器官切片，并且操作简易，成本低，尤其适用于鲜重含水量在85%以上的幼嫩植物组织器官以及切面组织间木质化程度不均一且髓部所含海绵组织超过茎秆横切面面积二分之一的植物组织器官。另外，采用本发明方法制备的切片如果只需要进行普通组织结构观察，用冰水浴保存可以存放3天以上，方便对切片进行长时间的显微观察分析。
附图说明
图1为采用本发明方法制备的幼嫩甘蓝型油菜茎秆切片图，A为切片整体图，B为切片局部观察图。
图2为甘蓝型油菜终花期中下部茎秆横切面图。
图3为采用本发明方法制备的甘蓝型油菜终花期中下部茎秆切片图，A为切片整体图，B为切片局部观察图。
图4为采用本发明方法制备的甘蓝型油菜中期花蕾中花药切片图，A为切片整体图，B为切片局部观察图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1 幼嫩甘蓝型油菜茎秆切片的制备、染色及观察
一、切片的制备
（1）样品包埋：打开Leica CM1850冰冻切片机，将机箱温度降到-20℃，待温度稳定后，用刀片切取幼嫩的甘蓝型油菜蕾薹期花序茎（鲜重含水量在85%以上），用吸水纸吸干样品材料切口组织液及表面的水分，然后在样品托头上涂一层冰冻包埋液，在冰冻包埋液凝固之前将样品放到样品托头上并且调整好样品角度方位，接下来用冰冻包埋液进一步包埋好样品，在包埋样品时不能有气泡在样品周围形成。
（2）切片：将冰冻切片机的机箱温度上升到-8℃保持30分钟以上，然后把样品托头固定在切片机可定位样品头上，按照切片机使用说明书操作进行切片。将切好的切片用预冷的毛笔或毛刷刷到装有冰水（不含冰）的平皿里，然后将平皿放在冰面暂时保存。
二、切片的组织化学染色
用小铁勺将切片从平皿中转移到载玻片上，用移液枪吸干水分后，用蒸馏水清洗切片两次并吸干水分，然后在切片上滴加质量百分浓度为1%的高锰酸钾溶液浸染5分钟，用蒸馏水清洗3次，再滴加体积百分浓度为3%的HCl溶液浸泡2分钟，用蒸馏水清洗3-5次，再滴加体积百分浓度为29%的氨水溶液浸泡2分钟，最后盖上盖玻片，吸掉多余的染液。
三、显微观察
将染好色的切片放在Nikon SMZ1500和Olympus MUX10体视显微镜以及Nikon EclipseE600显微镜下进行观察，如图1所示，可见采用本发明方法制备的幼嫩甘蓝型油菜茎秆切片组织结构完整，细胞层次清晰，切片厚度均匀。
实施例2 甘蓝型油菜终花期中下部茎秆切片的制备、染色及观察
一、切片的制备
（1）材料预处理：将甘蓝型油菜终花期中下部茎秆材料（其横切面如图2所示，可见切面组织间木质化程度不均一且髓部所含海绵组织超过茎秆横切面面积二分之一）在冰水浴中浸泡2-3天，保持冰水浴中一直有冰存在。
（2）样品包埋：打开Leica CM1850冰冻切片机，将机箱温度降到-20℃，待温度稳定后，用刀片切取预处理后的茎秆3-8mm，用吸水纸吸干样品材料切口组织液及表面的水分，然后在样品托头上涂一层冰冻包埋液，在冰冻包埋液凝固之前将样品放到样品托头上并且调整好样品角度方位，接下来用冰冻包埋液进一步包埋好样品，在包埋样品时不能有气泡在样品周围形成。
（3）切片：将冰冻切片机的机箱温度上升到-10℃保持30分钟以上，然后把样品托头固定在切片机可定位样品头上，按照切片机使用说明书操作进行切片。将切好的切片用预冷的毛笔或毛刷刷到装有冰水（不含冰）的平皿里，然后将平皿放在冰面暂时保存。
二、切片的组织化学染色
用小铁勺将切片从平皿中转移到载玻片上，用移液枪吸干水分后，用蒸馏水清洗切片两次并吸干水分，然后在切片上滴加质量百分浓度为1%的高锰酸钾溶液浸染5分钟，用蒸馏水清洗3次，再滴加体积百分浓度为3%的HCl溶液浸泡2分钟，用蒸馏水清洗3-5次，再滴加体积百分浓度为29%的氨水溶液浸泡2分钟，最后盖上盖玻片，吸掉多余的染液。
三、显微观察
将染好色的切片放在Nikon SMZ1500和Olympus MUX10体视显微镜以及Nikon EclipseE600显微镜下进行观察，如图3所示，可见采用本发明方法制备的甘蓝型油菜终花期中下部茎秆切片组织结构完整，细胞层次清晰，切片厚度均匀。
实施例3 甘蓝型油菜中期花蕾中花药切片的制备、染色及观察
一、切片的制备
（1）样品包埋：打开Leica CM1850冰冻切片机，将机箱温度降到-20℃，待温度稳定后，在样品托头上涂一层冰冻包埋液，在冰冻包埋液凝固之前将去掉花萼的甘蓝型油菜中期花蕾样品（鲜重含水量在85%以上）放到样品托头上并且调整好样品角度方位，接下来用冰冻包埋液进一步包埋好样品，在包埋样品时不能有气泡在样品周围形成。
（2）切片：将冰冻切片机的机箱温度上升到-10℃保持30分钟以上，然后把样品托头固定在切片机可定位样品头上，按照切片机使用说明书操作进行切片。在机箱中将切好的切片用预冷的镊子夹住切片周边的包埋剂迅速将切片转移到载玻片上展片。
二、切片的组织化学染色
在切片上滴加质量百分浓度为1%的番红染液浸染5分钟，用蒸馏水清洗3-5次，最后盖上盖玻片，吸掉多余的染液。
三、显微观察
将染好色的切片放在Nikon SMZ1500和Olympus MUX10体视显微镜以及Nikon EclipseE600显微镜下进行观察，如图4所示，可见采用本发明方法制备的甘蓝型油菜中期花蕾中花药切片组织结构完整，细胞层次清晰，切片厚度均匀。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (8)
1.一种适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，将植物组织器官在温度为-20℃至-25℃条件下用冰冻包埋剂包埋后，在温度为-6℃至-12℃条件下保持30分钟以上再进行切片。
2.根据权利要求1所述的适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，所述植物组织器官为新鲜的植物组织器官。
3.根据权利要求2所述的适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，所述植物组织器官为鲜重含水量在85%以上的幼嫩植物组织器官。
4.根据权利要求3所述的适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，所述植物组织器官为植物幼嫩茎秆、叶片、叶柄或花药。
5.根据权利要求1所述的适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，所述植物组织器官为经过预处理的植物组织器官，所述预处理是将新鲜的植物组织器官在冰水浴中浸泡2至3天，保持冰水浴中一直有冰存在。
6.根据权利要求5所述的适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，所述植物组织器官为切面组织间木质化程度不均一且髓部所含海绵组织超过茎秆横切面面积二分之一的植物组织器官。
7.根据权利要求6所述的适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，所述植物组织器官为植物发育成熟的茎秆、根或角果皮。
8.根据权利要求4或7所述的适合植物组织器官的冰冻切片方法，其特征在于，所述植物为甘蓝型油菜。
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| 谢佩松 等: "冰冻切片技术在植物显微结构和组织化学中的应用" * |
| 谢佩松 等: "冰冻切片技术在植物显微结构和组织化学中的应用", 《生物学杂志》, vol. 26, no. 3, pages 72 - 73 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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