CN108037147A - 一种用于同步辐射x射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法 - Google Patents

一种用于同步辐射x射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法。该方法包括样品前处理，改良OCT冷冻包埋剂，样品先用改良OCT冷冻包埋剂浸泡处理，改良OCT冷冻包埋剂为按聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮按一定比例混合而成，控制切片刀口温度，修剪时通过对样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度是否一致进行观察，采用延长冷冻时间或适当回温的有效措施，确保了对新鲜植物根部切片的成功率达到100％。本发明能够获得结构完整的新鲜植物根部组织冷冻切片，对开展新鲜植物根部组织同步辐射X射线荧光微分析，研究重金属、营养元素、微量元素在植物中的吸收累积微区分布，重金属对植物生理生态方面的影响提供了有力的技术支撑。

Description

一种用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制 作方法
技术领域
本发明属于显微组织切片技术领域，具体涉及一种适用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片的制作方法。
背景技术
植物根部是植物的营养器官，通常位于地表下面，主要负责吸收土壤里面的水分及溶解其中的无机盐，并且具有支持、繁殖、贮存及合成有机物质的作用。植物的根系形态多样，一般分为直根系、须根系和不定根等，水稻根系属于典型的须根系。在植物进化发展过程中，根系为了适应环境的变化，形态构造产生了许多变态，有具有肥大肉质的贮藏根，如萝卜、红薯等；还有支持根、气生根、呼吸根、攀援根和寄生根等。因植物品种而异，植物根部，有的质重坚实、有的体轻松泡、有的折断时或有粉尘散落(淀粉粒)、有的呈纤维性、角质状等。
植物根系的主要作用及其特殊形态，成为研究土壤重金属对植物毒害机理的重点关注对象。近年来，通过利用物理、化学和生物等方法对不同植物根部进行研究，
植物组织切片主要用于观察植物细胞结构形态。其制作方法有徒手切片法、石蜡切片法、冷冻切片法等。其中，冷冻切片法是利用冷冻包埋剂包埋样品后利用冷冻切片机进行切片的一种快速方法，制片周期较短，观察效果好，获得的材料结构完整。
植物组织切片通常在生物显微镜下观察植物的细胞组织结构形态，但它不能观察到营养元素、微量元素及重金属在植物细胞中的分布及不同微区分布中的含量变化情况。
同步辐射X射线荧光微分析(synchrotron radiation X-ray fluorescence,SRXRF)是采用由加速器产生的同步辐射作光源进行X射线荧光分析的方法。与常规X射线荧光分析相比，由于同步辐射光通量大、频谱宽、偏振性好等优点，因此，分析灵敏度显著增高，此外取样量少，分析速度快，可作微区三维扫描分析.给出被测元素的分布特征。己广泛用于生物、环境材料、地学等领域中微量元素的测定、以及植物根部吸收和累积重金属元素的微区分布情况的分析检测，有助于进一步研究植物对重金属的累积和吸收。
我国同步辐射X射线荧光试验站支持检测的植物切片为低温冷冻鲜样切片。而徒手切片法、石蜡切片法制作的植物切片为永久性切片，在切片制作过程中植物样品已进行灭活处理，因此不适于用同步辐射X射线荧光微分析检测重金属元素的微区分布。所述低温冷冻鲜样切片(简称：植物冷冻切片)可以最大限度的保留新鲜植物样品组织的完整性，但由于不同植物的根部结构各有不同，如有些植物根部活力根伸长区发育明显，质嫩柔软；有些植物根部木质部较环外的皮部大，质重坚实，因此，植物根部的切片比叶片等其他部位的制片难度大。
目前，植物微量元素、营养元素、重金属元素的同步辐射X荧光分析主要步骤有：样品冷冻切片制备、同步辐射X荧光检测、数据分析。其中植物根部冷冻切片的制作方法主要有：样品冷冻包埋-冷冻切片-展片-冷冻干燥。目前广泛用于冷冻切片的包埋剂有OCT包埋剂(optimal cutting temperature compound，OCT)，其主要作用是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。OCT包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色，因此，制作的切片也可用于显微镜上观测。但现有销售的OCT包埋剂各成分配比固定，并不适宜各种形态结构的植物根部冷冻切片制作时包埋，如，新鲜三七根部的韧皮组织，具有很强的柔韧性，但其根部中心呈木质化，具有酥脆的特征,制作其冷冻切片时，直接用市售的OCT包埋剂进行样品冷冻固定时，包埋剂已冷冻成块，而三七根部仍然柔韧酥脆，切片时不易成片，植物组织易破损，很难看到完整的根部形态及细胞结构。
发明内容
为解决现有市售OCT包埋剂制作植物根部的冷冻切片用于步辐射X射线荧光分析检测时存在的切片不易成型以及易破损的技术问题，本发明提供一种用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
(1)样品前处理：
取1～2年生新鲜植物根部，洗净泥沙，用滤纸吸干其植物根部表面水分，将该植物根部切成小块，然后将小块置于改良OCT冷冻包埋剂中，在-4℃冷藏浸泡50min～120min；
(2)样品冷冻包埋：
在冷冻切片机箱体内的冷台底座表面先滴3～5滴改良OCT冷冻包埋剂，将长方形硬质纸框平面放在冷台底座表面，再将步骤(1)经前处理的样品放置在长方形硬质纸框内，在长方形硬质纸框内加入改良OCT冷冻包埋剂将样品包埋，调节箱体温度为-20℃，包埋冷冻10～20min后，长方形硬质纸框内的样品和改良OCT冷冻包埋剂冷冻为一体即为样品包埋块；
(3)冷冻切片：
①修片：在箱体温度控制为-20℃，切片刀口温度控制为-10℃的条件下，切去样品包埋块外的长方形硬质纸框，对样品包埋块进行修片切去样品包埋块表面的改良OCT冷冻包埋剂，使样品表面露出，观察样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度是否一致，样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致，则按下述②切片中所述的方法进行切片；
②切片：在箱体温度控制为-20℃，切片刀口温度控制为-10℃的条件下，将切片厚度调节旋钮调至切片厚度为5μm～7μm，摇动旋转手轮对样品包埋块进行切片；
(4)展片：将切下来的切片黏附于X射线荧光光谱仪专用胶带上，一块切片黏附于一块X射线荧光光谱仪专用胶带上，然后在室内室温条件下，将黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带固定在样品框上，再将样品框置于样品框架上即为展片；
(5)冷冻干燥：展片后，将样品框架和其框架上的黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带的样品框一起放置于-80℃条件下，冷冻干燥24h-72h，即制成用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片；
上述改良OCT冷冻包埋剂由质量浓度20％的聚乙烯醇水溶液和聚乙二醇按质量浓度20％的聚乙烯醇水溶液:聚乙二醇的体积比为2:1混合均匀得基础混合液，再加入为基础混合液重量1％的聚乙烯吡咯烷酮混合均匀而成。
进一步，步骤(1)中所切的植物根部为根径10mm以下的植物根部，切成小块的厚度为3～5mm。
进一步，步骤(1)中所述浸泡50min～120min为：所述植物根部的根径为1～5mm,其浸泡时间50min～60min,5mm＜所述植物根部的根径≤10mm，60min＜浸泡时间≤120min。
进一步，步骤(2)中所述的长方形硬质纸框的长为6～15mm、宽为6～15mm、高为7～10mm。
进一步，步骤(3)①修片中对样品包埋块进行修片时，将切片厚度调节旋钮调至切片厚度为40μm±5μm。
进一步，步骤(3)①修片中样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度不一致，且样品比改良OCT冷冻包埋剂软，需延长样品包埋块的冷冻时间，仍在箱体温度为-20℃的条件下，继续对样品包埋块进行冷冻，待样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致时，则按步骤(3)②切片中所述的方法进行切片；样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度不一致，且样品比改良OCT冷冻包埋剂硬时，打开箱体盖回温，使箱体温度回升至样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致时，则按步骤(3)②切片中所述的方法进行切片。
进一步，步骤(4)展片中样品框的外框长×宽为50mm×50mm，内框的长×宽为35mm×24mm。
进一步，步骤(4)展片中每个样品框内固定2～3片黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带。
进一步，步骤(4)展片中展片3～5min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、对样品采取用本发明的改良OCT冷冻包埋剂浸泡的方式进行前处理，避免了现有直接将样品冷冻包埋导致样片杂质较多影响切片观察分析、切片时易碎，不易形成切片的缺陷，为后续的制片奠定了良好的基础。
2、采用本发明的改良OCT冷冻包埋剂进行包埋，可以获得结构完整的新鲜植物根部组织冷冻切片。解决了由于植物的根部结构复杂，植物根部的切片比叶片等其他部位的制片难度大，尤其是有些新鲜植物根部韧皮组织柔韧性强，而根部中心呈木质化，具有酥脆特征等植物根部制片时,采用现有OCT包埋剂对新鲜植物根部包埋切片易碎、不易成片或难以获得结构完整的新鲜植物根部组织冷冻切片的缺陷。
3.本发明方法对新鲜植物根部切片的成功率达到100％。同时，不浪费样品原材料，节省时间，提高了切片效率。
本发明通过修剪时对样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度是否一致进行观察，达不到样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致的要求，采用延长冷冻时间或适当回温的有效措施，才进行切片的技术手段，确保了对新鲜植物根部切片的成功率达到100％。同时，也解决了现有新鲜植物根部冷冻切片易碎、不易成片、成功率低，需重新包埋制片浪费样品原材料、延长制片时间的技术问题。
4、本发明控制切片刀口温度为-10℃，有利于成片，该温度过低(小于-10℃)，植物根部在切的过程中容易碎；该温度过高(大于-10℃)，样品变软，不易成片。
5、本发明对各步骤的改进，操作性强，容易掌握，能够获得结构完整、清晰的新鲜植物根部组织冷冻切片，不仅可以满足同步辐射X射线荧光微分析对新鲜植物根部样品切片的要求，同时还可以制作用于生物显微镜下观测的普通染色切片。对开展植物根部组织同步辐射X射线荧光微分析，研究重金属、营养元素、微量元素在植物中的吸收累积微区分布，重金属对植物生理生态方面的影响提供了有力的技术支撑。
附图说明
图1是采用本发明方法制作的新鲜三七根部冷冻切片样品进行同步辐射X射线荧光微分析所获得的三七根部砷元素微区荧光分布图。
图2是采用本发明方法制作的新鲜三七根部冷冻切片样品进行同步辐射X射线荧光微分析所获得的三七根部营养元素磷的微区荧光分布图。
图3是本发明方法制作的2年生新鲜三七根部冷冻切片照片。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。各实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，或按照仪器、设备制造厂商所建议的条件。
实施例1
药用植物三七根部质重坚实，新鲜的三七韧皮部柔韧、中心木质层酥脆，比一般植物根部制片难度大，采用本发明可以制得组织结构完整、清晰的新鲜三七根部冷冻切片，具体步骤如下：
(1)样品前处理：
取2年生新鲜三七主根部，洗净泥沙，用滤纸吸干三七根部表面水分，切取三七根部的根径为10mm以下的根茎，切成厚度为4mm的小块，将小块置于改良OCT冷冻包埋剂中，在-4℃冷藏浸泡50min～120min；三七根部的根径为1～5mm,浸泡时间50min～60min,三七根部的根径大于5mm小于等于10mm，其浸泡时间大于60min小于等于120min(即5mm＜所述植物根部的根径≤10mm，60min＜浸泡时间≤120min)。
(2)样品冷冻包埋：
在Leica CM1950冷冻切片机箱体内的冷台底座表面先滴3～5滴改良OCT冷冻包埋剂，将长方形硬质纸框平面放在冷台底座表面，再将步骤(1)经前处理的样品放置在长方形硬质纸框内，在长方形硬质纸框内加入改良OCT冷冻包埋剂将样品包埋，调箱体温度为-20℃，包埋10～20min后，长方形硬质纸框内的样品和改良OCT冷冻包埋剂冷冻为一体即为样品包埋块；所述的长方形硬质纸框的长为6～15mm、宽为6～15mm、高为7～10mm。
(3)冷冻切片：
①修片：在箱体温度控制为-20℃，切片刀口温度控制为-10℃的条件下，切去样品包埋块外的长方形硬质纸框(仍在所述冷台底座表面进行)，将切片厚度调节旋钮调至切片厚度为40μm±5μm，对样品包埋块进行修片切去样品包埋块表面的改良OCT冷冻包埋剂，使样品表面露出，观察样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度是否一致，样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致，则按下述②切片中所述方法进行切片；如果样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度不一致，且样品比改良OCT冷冻包埋剂软，需延长样品包埋块的冷冻时间，仍在箱体温度为-20℃的条件下，继续对样品包埋块进行冷冻(此时样品包埋块仍在所述冷台底座表面)，待样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致时，则按下述②切片中所述方法进行切片；如果样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度不一致，且样品比改良OCT冷冻包埋剂硬时，打开箱体盖回温，使箱体温度回升至样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致时，则按下述②切片中所述方法进行切片。
②切片：在箱体温度控制为-20℃，切片刀口温度控制为-10℃的条件下，将切片厚度调节旋钮调至切片厚度至6μm，摇动旋转手轮对样品包埋块进行切片。所切得的新鲜三七根部冷冻切片照片如图3所示。
(4)展片：将切下来的切片黏附于X射线荧光光谱仪专用胶带(型号：TF-500，XRF带)上，一块切片黏附于一块X射线荧光光谱仪专用胶带上，然后在室内室温条件下，将黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带固定在样品框上，再将样品框置于样品框架上即为展片，展片3～5min。所述样品框的外框长×宽为50mm×50mm，内框的长×宽为35mm×24mm，每个样品框内固定2～3片黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带。
(5)冷冻干燥：展片后，将样品框架和其框架上的有黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带的样品框一起放置于-80℃条件下，冷冻干燥24h-72h，即制成用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片。根据同步辐射X射线荧光微分析的试验准备情况，冷冻干燥24h-72h的上述切片均可用于同步辐射X射线荧光微分析。
上述各步骤所述的改良OCT冷冻包埋剂由质量浓度20％的聚乙烯醇水溶液和聚乙二醇按质量浓度20％的聚乙烯醇水溶液:聚乙二醇的体积比为2:1混合均匀得基础混合液，再在基础混合液中加入为基础混合液重量1％的聚乙烯吡咯烷酮混合均匀而成。
本实施例制作的新鲜三七根部冷冻切片在北京同步辐射X射线荧光微分析试验站，按常规同步辐射X射线荧光微分析条件，获得图1和图2。
实验结果：图3显示利用本发明方法制得的新鲜植物根部切片组织结构完整、清晰，不易变形，用于同步辐射X射线荧光站检测效果理想(图1、图2)，图1、图2显示同步辐射X射线荧光站检测分析后获得的三七根部的砷元素微区分布、三七根部的营养元素磷的微区分布均清晰，为研究植物根部组织吸收和累积重金属元素过程、吸收和累积营养元素过程提供了清楚的依据，对重金属、营养元素、微量元素在植物中的吸收累积微区分布进行研究，研究重金属对植物生理生态方面的影响、研究营养元素对提供植物生长及其对重金属的影响提供了有力的技术支撑。

Claims (9)

1.一种用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：
取1～2年生新鲜植物根部，洗净泥沙，用滤纸吸干植物根部表面水分，将植物根部切成小块，然后将小块置于改良OCT冷冻包埋剂中，在-4℃冷藏浸泡50min～120min；
(2)样品冷冻包埋：
在冷冻切片机箱体内的冷台底座表面先滴3～5滴改良OCT冷冻包埋剂，将长方形硬质纸框平面放在冷台底座表面，再将步骤(1)经前处理的样品放置在长方形硬质纸框内，在长方形硬质纸框内加入改良OCT冷冻包埋剂将样品包埋，调节箱体温度为-20℃，包埋冷冻10～20min后，长方形硬质纸框内的样品和改良OCT冷冻包埋剂冷冻为一体即为样品包埋块；
(3)冷冻切片：
①修片：在箱体温度控制为-20℃，切片刀口温度控制为-10℃的条件下，切去样品包埋块外的长方形硬质纸框，对样品包埋块进行修片切去样品包埋块表面的改良OCT冷冻包埋剂，使样品表面露出，观察样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度是否一致，样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致，则按下述②切片中所述的方法进行切片；
②切片：在箱体温度控制为-20℃，切片刀口温度控制为-10℃的条件下，将切片厚度调节旋钮调至切片厚度为5μm～7μm，摇动旋转手轮对样品包埋块进行切片；
(4)展片：将切下来的切片黏附于X射线荧光光谱仪专用胶带上，一块切片黏附于一块X射线荧光光谱仪专用胶带上，然后在室内室温条件下，将黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带固定在样品框上，再将样品框置于样品框架上即为展片；
(5)冷冻干燥：展片后，将样品框架和其框架上的黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带的样品框一起放置于-80℃条件下，冷冻干燥24h-72h，即制成用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片；
上述改良OCT冷冻包埋剂由质量浓度20％的聚乙烯醇水溶液和聚乙二醇按质量浓度20％的聚乙烯醇水溶液:聚乙二醇的体积比为2:1混合均匀得基础混合液，再加入为基础混合液重量1％的聚乙烯吡咯烷酮混合均匀而成。
2.按照权利要求1所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(1)中所切的植物根部为根径10mm以下的植物根部，切成小块的厚度为3～5mm。
3.按照权利要求1或2所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(1)中所述浸泡50min～120min为：所述植物根部的根径为1～5mm,其浸泡时间50min～60min,5mm＜所述植物根部的根径≤10mm，60min＜浸泡时间≤120min。
4.按照权利要求1所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(2)中所述的长方形硬质纸框的长为6～15mm、宽为6～15mm、高为7～10mm。
5.按照权利要求1所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(3)①修片中对样品包埋块进行修片时，将切片厚度调节旋钮调至切片厚度为40μm±5μm。
6.按照权利要求1所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(3)①修片中样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度不一致，且样品比改良OCT冷冻包埋剂软，需延长样品包埋块的冷冻时间，在箱体温度为-20℃的条件下，继续对样品包埋块进行冷冻，待样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致时，则按步骤(3)②切片中所述的方法进行切片；样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度不一致，且样品比改良OCT冷冻包埋剂硬时，打开箱体盖回温，使箱体温度回升至样品的软硬程度与改良OCT冷冻包埋剂的软硬程度一致时，则按步骤(3)②切片中所述的方法进行切片。
7.按照权利要求1所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(4)展片中样品框的外框长×宽为50mm×50mm，内框的长×宽为35mm×24mm。
8.按照权利要求1所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(4)展片中每个样品框内固定2～3片黏附有切片的X射线荧光光谱仪专用胶带。
9.按照权利要求1所述的用于同步辐射X射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法，其特征在于：步骤(4)展片中展片3～5min。
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