CN109187717A - 一种植物中外源有机污染物的检测方法 - Google Patents

一种植物中外源有机污染物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种植物中外源有机污染物的检测方法，通过采用特定的基质溶液，配合其他步骤，可以很好地检测出植物中的外源有机污染物，可以观察到外源有机污染物在植物体内空间分布的情况。与传统检测植物中污染物的方法相比，本发明提供的方法检测高效快速，还可以同时分析多种不同质荷比的化合物，无需建立和优化单个化合物的方法。同时，这种方法简化了传统方法中复杂的样品前处理步骤，大大缩短用时，省时省力，避免了前处理过程中植物的生化反应，同时减少了待测目标分子的损失，提高了分析结果的准确性。

Description

一种植物中外源有机污染物的检测方法
技术领域
本发明涉及有机污染物分析检测领域，尤其涉及一种植物中外源有机污染物的检测方法。
背景技术
环境自然水体中普遍存在着痕量的有机物，这些微污染物具有难降解性、生物积累性和长期危害性。一些研究发现某些环境微污染物会对植物及动物产生不同程度的毒性作用。传统对植物吸收外源污染物的分析方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)等。然而，在利用色谱法和色谱质谱联用技术在样品分析前，都需要经过一系列复杂的样品预处理过程，不仅费时费力，而且复杂的生物样品在前处理过程中可能伴随着生化反应。最关键的是，上述方法无法提供可视化的空间信息，不利于进一步对有机污染物在植物体内迁移转化及代谢的研究。
质谱成像(MSI)是基于质谱的分子离子成像技术，使得直接在样品组织表面上确定大量分析物的空间分布成为可能。质谱成像中的样品前处理是非常重要的步骤，将直接影响成像结果的质量和可靠性。合适的样品前处理可以保持分子的原始、分布和丰度，进而保证高质量的信号和足够的空间分辨率，从而更有利于最终结果的检测。
目前的质谱成像更多应用于动物组织，这是由于植物组织相比于动物组织来说更具有技术挑战性：高等植物体内的表皮造成了第一层屏障，一些软电离技术很难穿透它们，不利于对内部分子的直接成像；植物特有的细胞壁是第二层屏障，细胞壁会阻止基质溶液在组织切片的扩散；第三，植物组织内部的高含水量在冷冻切片过程中造成新的挑战，组织在冷冻后会变脆，在脱水过程中组织经常会缩水和破损，不能得到薄而完整的切片，极大地影响到了检测结果的准确性。因而，植物组织的前处理相比与动物组织来说，技术难度更大。
尽管质谱成像也逐渐开始应用于植物组织，但是现有技术的植物组织的质谱成像仅仅只适用于植物本身的有机物的检测，也就是内源分子，脂质、代谢物等，而这些内源的有机物与植物中的外源有机污染物的性质存在很大的差异，适用于植物本身的有机物的检测的方法并不适用于植物中外源有机污染物的检测，因此，探索植物中外源有机污染物的检测方法是非常有必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种植物中外源有机污染物的检测方法，本发明提供的检测方法可以很好地检测出植物中的外源有机污染物，可以观察到外源有机污染物在植物体内空间分布的情况。
本发明提供了一种植物中外源有机污染物的检测方法，包括以下步骤：
A)将空白对照组的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理空白样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到空白对照组的质谱图；
B)将含有外源有机污染物的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理样品；所述外源有机污染物包括离子液体、卡马西平和环丙沙星中的一种或几种；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到受污染样品组的质谱图；通过比较空白对照组的质谱图和受污染样品组的质谱图，得到目标有机污染物的特征峰。
优选的，步骤B)中，所述离子液体选自溴化1-丁基-3-甲基咪唑、溴化1-己基-3-甲基咪唑和溴化1-辛基-3-甲基咪唑中的一种或几种。
优选的，步骤A)中，所述基质溶液的浓度为5～10g/L，所述基质溶液中的溶剂为二氯甲烷；
步骤B)中，所述基质溶液的浓度为5～10g/L，所述基质溶液中的溶剂为二氯甲烷。
优选的，步骤A)中，所述空白对照组的植物的组织切片的厚度为50～200μm；
步骤B)中，所述含有外源有机污染物的植物的组织切片的厚度为50～200μm。
优选的，步骤A)中，所述空白对照组的植物选自双子叶植物中的一种；
步骤B)中，所述含有外源有机污染物的植物选自双子叶植物中的一种。
优选的，步骤A)中，所述组织切片中的组织选自根部组织、茎部组织和子叶组织中的一种；
步骤B)中，所述组织切片中的组织选自根部组织、茎部组织和子叶组织中的一种。
优选的，步骤A)中，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度为-0.1～-0.05MPa；
步骤B)中，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度为-0.1～-0.05MPa。
优选的，步骤A)中，所述冷冻干燥的温度为-55～-80℃，所述冷冻干燥的时间为12～48h；
步骤B)中，所述冷冻干燥的温度为-55～-80℃，所述冷冻干燥的时间为12～48h。
优选的，
步骤A)中，所述质谱分析的条件为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量50～80％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱50～100；
反射器电压1500～2000V，离子源加速电压15～20kV，离子源真空度4.0×10-7～5.0×10-6mbar；
步骤B)中，所述质谱分析的条件为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量50～80％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱50～100；
反射器电压1500～2000V，离子源加速电压15～20kV，离子源真空度4.0×10-7～5.0×10-6mbar。
优选的，步骤A)中，所述带有激光的质谱仪为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；
步骤B)中，所述带有激光的质谱仪为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
本发明提供了一种植物中外源有机污染物的检测方法，包括以下步骤：
A)将空白对照组的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理空白样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到空白对照组的质谱图；
B)将含有外源有机污染物的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理样品；所述外源有机污染物包括离子液体、卡马西平和环丙沙星中的一种或几种；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到受污染样品组的质谱图；通过比较空白对照组的质谱图和受污染样品组的质谱图，得到目标有机污染物的特征峰。
本发明提供的植物中外源有机污染物的检测方法中，基质溶液对激光光源需要有很强的吸收；同时，基质溶液能够将能量传递给被分析物，使被分析物离子化，这就要求基质和分析物具有很好的相容性，而且不能有分子间的相互作用。所以，基质溶液的选择是非常关键的，也是极其不易的。本发明通过采用特定的基质溶液，配合其他步骤，可以很好地检测出植物中的外源有机污染物，可以观察到外源有机污染物在植物体内空间分布的情况。与传统检测植物中污染物的方法相比，本发明提供的方法检测高效快速，还可以同时分析多种不同质荷比的化合物，无需建立和优化单个化合物的方法。同时，这种方法简化了传统方法中复杂的样品前处理步骤，大大缩短用时，省时省力，避免了前处理过程中植物的生化反应，同时减少了待测目标分子的损失，提高了分析结果的准确性。
附图说明
图1为本发明实施例2制备的空白样品的质谱图；
图2为本发明实施例2制备的受污染的样品的质谱图；
图3为实施例2中目标有机污染物的质谱图像；
图4为本发明实施例3制备的空白样品的质谱图；
图5为本发明实施例3制备的受污染的样品的质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种植物中外源有机污染物的检测方法，包括以下步骤：
A)将空白对照组的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理空白样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到空白对照组的质谱图；
B)将含有外源有机污染物的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理样品；所述外源有机污染物包括离子液体、卡马西平和环丙沙星中的一种或几种；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到受污染样品组的质谱图；通过比较空白对照组的质谱图和受污染样品组的质谱图，得到目标有机污染物的特征峰。
本发明先将空白对照组的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种。
在本发明中，所述空白对照组的植物优选为生长周期为4周的植物。所述植物优选为双子叶植物中的一种。在本发明的某些实施例中，所述空白对照组的植物为生长周期为4周的豌豆植株。
所述植物的组织切片中的组织优选为根部组织、茎部组织和子叶组织中的一种。在本发明的某些实施例中，所述组织为根部组织。
所述植物的组织切片优选由植物组织通过冷冻切片机切片得到。
所述植物的组织切片的厚度优选为50～200μm。在本发明的某些实施例中，所述植物的组织切片的厚度为100μm。
所述氧化铟锡导电载玻片除了可以用于放置植物的组织切片，还可以解冻通过冷冻切片机切片得到的植物的组织切片，从而有利于后续的质谱分析。
所述干燥优选为冷冻干燥。所述冷冻干燥的真空度优选为-0.1～-0.05MPa。在本发明的某些实施例中，所述冷冻干燥的真空度为-0.08MPa。所述冷冻干燥的温度优选为-55～-80℃。在本发明的某些实施例中，所述冷冻干燥的温度为-60℃或-70℃。所述冷冻干燥的时间优选为12～48h。在本发明的某些实施例中，所述冷冻干燥的时间为24h。
所述基质溶液包括DHB(2,5-二羟基苯甲酸)、DCTB(反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈)和HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)中的一种或几种；优选为DCTB。所述基质溶液的浓度优选为5～10g/L。在本发明的某些实施例中，所述基质溶液的浓度为10g/L。所述基质溶液中的溶剂优选为二氯甲烷。所述基质溶液的作用是从脉冲激光中吸收能量，因此，所选择的基质溶液对激光光源需要有很强的吸收；同时，基质溶液能够将能量传递给被分析物，使被分析物离子化，这就要求基质和分析物具有很好的相容性，而且不能有分子间的相互作用。所以，基质溶液的选择是非常关键的。本发明对所述基质溶液的来源并无特殊的限制，可以为一般市售。
得到干燥后的组织切片后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品。所述沉积优选包括喷雾、孵育和干燥。在本发明的某些实施例中，所述沉积包括进行2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥，干燥之后，继续重复2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥。在本发明的某些实施例中，所述重复的次数为59次。本发明对所述喷雾、孵育和干燥的方法并无特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的喷雾、孵育和干燥的方法即可。所述沉积的设备优选为ImagePrep仪器(Bruker Daltonics)。
得到预处理空白样品后，将所述预处理空白样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到空白对照组的质谱图。
在本发明中，所述带有激光的质谱仪优选为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
所述质谱分析的条件优选为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量50～80％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱50～100；
反射器电压1500～2000V，离子源加速电压15～20kV，离子源真空度4.0×10-7～5.0×10-6mbar。
其他参数优选为系统缺省值。
在本发明的某些实施例中，所述质谱分析的条件为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
然后，将含有外源有机污染物的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理样品；所述外源有机污染物包括离子液体、卡马西平和环丙沙星中的一种或几种；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种。
在本发明中，所述含有外源有机污染物的植物优选为生长周期为2周、在外源有机污染物的条件下继续培养2周的植物。所述含有外源有机污染物的植物的培养中，所述植物的前2周的生长环境与空白对照组的植物的生长环境是一样的，所述植物的后2周的生长中，与空白对照组的植物相比，仅仅是增加外源有机污染物。在本发明的某些实施例中，所述含有外源有机污染物的植物为生长周期为2周、在外源有机污染物的条件下继续培养2周的豌豆植株。
所述外源有机污染物包括离子液体、卡马西平和环丙沙星中的一种或几种。所述离子液体优选为溴化1-丁基-3-甲基咪唑、溴化1-己基-3-甲基咪唑和溴化1-辛基-3-甲基咪唑中的一种或几种。所述外源有机污染物的浓度优选为5～10mg/L。在本发明的某些实施例中，所述外源有机污染物的浓度为10mg/L。本发明对所述外源有机污染物的来源并无特殊的限制，可以为一般市售。
所述植物的组织切片中的组织优选为根部组织，茎部组织和子叶组织中的一种。在本发明的某些实施例中，所述组织为根部组织。
所述植物的组织切片优选由植物组织通过冷冻切片机切片得到。
所述植物的组织切片的厚度优选为50～200μm。在本发明的某些实施例中，所述植物的组织切片的厚度为100μm。
所述氧化铟锡导电载玻片除了可以用于放置植物的组织切片，还可以解冻通过冷冻切片机切片得到的植物的组织切片，从而有利于后续的质谱分析。
所述干燥优选为冷冻干燥。所述冷冻干燥的真空度优选为-0.1～-0.05MPa。在本发明的某些实施例中，所述冷冻干燥的真空度为-0.08MPa。所述冷冻干燥的温度优选为-55～-80℃。在本发明的某些实施例中，所述冷冻干燥的温度为-60℃或-70℃。所述冷冻干燥的时间优选为12～48h。在本发明的某些实施例中，所述冷冻干燥的时间为24h。
所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；优选为DCTB。所述基质溶液的浓度优选为5～10g/L。在本发明的某些实施例中，所述基质溶液的浓度为10g/L。所述基质溶液中的溶剂优选为二氯甲烷。所述基质溶液的作用是从脉冲激光中吸收能量，因此，所选择的基质溶液对激光光源需要有很强的吸收；同时，基质溶液能够将能量传递给被分析物，使被分析物离子化，这就要求基质和分析物具有很好的相容性，而且不能有分子间的相互作用。所以，基质溶液的选择是非常关键的。本发明对所述基质溶液的来源并无特殊的限制，可以为一般市售。
得到干燥后的组织切片后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品。所述沉积优选包括喷雾、孵育和干燥。在本发明的某些实施例中，所述沉积包括进行2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥，干燥之后，继续重复2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥。在本发明的某些实施例中，所述重复的次数为59次。本发明对所述喷雾、孵育和干燥的方法并无特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的喷雾、孵育和干燥的方法即可。所述沉积的设备优选为ImagePrep仪器(Bruker Daltonics)。
得到预处理样品后，将所述预处理样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到受污染样品组的质谱图；通过比较空白对照组的质谱图和受污染样品组的质谱图，得到目标有机污染物的特征峰。
在本发明中，所述带有激光的质谱仪优选为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
所述质谱分析的条件优选为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量50～80％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱50～100；
反射器电压1500～2000V，离子源加速电压15～20kV，离子源真空度4.0×10-7～5.0×10-6mbar。
其他参数优选为系统缺省值。
在本发明的某些实施例中，所述质谱分析的条件为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
经过激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到含有外源有机污染物的植物的组织切片的质谱图，即为受污染样品组的质谱图。通过比较空白对照组的质谱图和受污染样品组的质谱图，可以得出目标有机污染物的特征峰。选定目标有机污染物的特征峰，质量区间设定为139.2±0.25％Da，经过TIC模式归一化处理，软件重构得到由不同颜色表示相对丰度的二维图像，即为目标有机污染物的质谱图像。
得到的质谱图像中，不同的颜色表示有机污染物在该点不同的相对丰度。成像结果整体呈现出外部边缘低浓度，内部中心浓度较高的趋势。并且中心局部分散高浓度的点。这与目前根部吸收环境污染物的机理相一致。根部吸收目标有机污染物，由外表皮到中心的维管组织形成一定的浓度梯度，最后沿着中心的木质部组织向上运输。由此可见，本发明提供的方法可以很直观地看到环境污染物被植物吸收后，在植物体内部空间分布的情况。加上该方法前处理简单，分析过程简便快速。不仅可以应用在其他可以被植物体吸收的环境污染物的检测，也可以应用在其他需要确定植物组织中一个或多个有机物空间分布的体系中，在结构和功能方面更好地理解污染物在植物特定组织细胞中的相互作用，并且有助于更深入地研究生态修复机理。
另外，目标有机污染物在植物中的代谢产物的质荷比不同，在质谱中有不同的特征峰，可以根据每一个特征峰得到相应的成像分布图，根据每个代谢物分布不同进而研究目标有机污染物在体内的代谢机理。
本发明提供了一种植物中外源有机污染物的检测方法，包括以下步骤：
A)将空白对照组的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理空白样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到空白对照组的质谱图；
B)将含有外源有机污染物的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理样品；所述外源有机污染物包括离子液体、卡马西平和环丙沙星中的一种或几种；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到受污染样品组的质谱图；通过比较空白对照组的质谱图和受污染样品组的质谱图，得到目标有机污染物的特征峰。
本发明提供的植物中外源有机污染物的检测方法可以很好地检测出植物中的外源有机污染物，可以观察到外源有机污染物在植物体内空间分布的情况。与传统检测植物中污染物的方法相比，本发明提供的方法检测高效快速，还可以同时分析多种不同质荷比的化合物，尤其是质荷比为0～1000范围内的化合物，无需建立和优化单个化合物的方法。同时，这种方法简化了传统方法中复杂的样品前处理步骤，大大缩短用时，省时省力，避免了前处理过程中植物的生化反应，同时减少了待测目标分子的损失，提高了分析结果的准确性。
本发明对上述所采用的原料的来源并无特殊的限制，可以为一般市售。
试剂：二氯甲烷(色谱纯)；
仪器：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(布鲁克·道尔顿公司)；
材料：植物种子为豌豆种，购置于北京农科院种业科技有限公司；
培育豌豆种的营养液为霍格兰营养液。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种植物中外源有机污染物的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
基质的选择：
(1)用移液枪准确吸取1μL浓度为1mg/L的溴化1-丁基-3-甲基咪唑标准溶液，在不锈钢靶板上点样，待其自然风干后，再用移液枪准确吸取1μL浓度为10g/L的DHB基质溶液，点在风干的位置上。在自然干燥的条件下形成共结晶，将靶板放入质谱仪器内进行分析。
质谱分析方法：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
从而得到DHB基质溶液检测溴化1-丁基-3-甲基咪唑的信号强度，实验结果表明，采用DHB基质溶液的信号强度为1×103。
(2)用移液枪准确吸取1μL浓度为1mg/L的溴化1-丁基-3-甲基咪唑标准溶液，在不锈钢靶板上点样，待其自然风干后，再用移液枪准确吸取1μL浓度为10g/L的DCTB基质溶液，点在风干的位置上。在自然干燥的条件下形成共结晶，将靶板放入质谱仪器内进行分析。
质谱分析方法：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
从而得到DCTB基质溶液检测溴化1-丁基-3-甲基咪唑的信号强度，实验结果表明，采用DCTB基质溶液的信号强度为5×104。
(3)用移液枪准确吸取1μL浓度为1mg/L的溴化1-丁基-3-甲基咪唑标准溶液，在不锈钢靶板上点样，待其自然风干后，再用移液枪准确吸取1μL浓度为10g/L的HCCA基质溶液，点在风干的位置上。在自然干燥的条件下形成共结晶，将靶板放入质谱仪器内进行分析。
质谱分析方法：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
从而得到HCCA基质溶液检测溴化1-丁基-3-甲基咪唑的信号强度，实验结果表明，采用HCCA基质溶液的信号强度为2×104。
可以看出，上述基质溶液可以很好地与待测分子相互作用并形成共结晶，在激光作用后，基质溶液吸收能量并将能量转移给待测物，使目标分子解吸同时电离。其中，采用DCTB基质溶液的信号强度最高，用于检测溴化1-丁基-3-甲基咪唑效果最优。
实施例2
空白对照组的设置：
将豌豆种在营养液中培育4周，得到的豌豆植株作为空白对照组。
1、空白样品的前处理：
选取一棵豌豆植株，剪下1cm根部组织，经冷冻切片机切片，获得的组织切片厚度为100μm。将组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，在真空度为-0.08MPa下进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-60℃，时间为24h。然后，用ImagePrep仪器(Bruker Daltonics)沉积浓度为10g/L的DCTB基质溶液，溶剂为二氯甲烷，所述沉积需要经历2s的喷雾、30s的孵育和60s的干燥，干燥之后，继续重复2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥，所述重复的次数为59次，得到预处理空白样品。
2、质谱分析方法：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对未受污染的植物组织检测得到的质谱图如图1所示。图1为本发明实施例2制备的空白样品的质谱图。
受污染样品组的设置：
将豌豆种在营养液中培育2周，然后，在添加了浓度为10mg/L的溴化1-丁基-3-甲基咪唑的营养液中继续培育2周，得到受污染的豌豆植株。
1、受污染样品的前处理：
选取一棵受污染的豌豆植株，剪下1cm根部组织，经冷冻切片机切片，获得的组织切片厚度为100μm。将组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，在真空度为-0.08MPa下进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-60℃，时间为24h。然后，用ImagePrep仪器(BrukerDaltonics)沉积浓度为10g/L的DCTB基质溶液，溶剂为二氯甲烷，所述沉积需要经历2s的喷雾、30s的孵育和60s的干燥，干燥之后，继续重复2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥，所述重复的次数为59次，得到预处理受污染的样品。
2、质谱分析方法：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对受污染的植物组织检测得到的质谱图如图2所示。图2为本发明实施例2制备的受污染的样品的质谱图。通过图1和图2的对比，可以得出目标有机污染物的特征峰。
从图1中可以看出，在m/z 139.2及附近没有发现特征峰；图2中，在m/z 139.2处有溴化1-丁基-3-甲基咪唑的特征峰，且信号较强，分辨率较高。以上结果表明，本发明的方法可以很好地检测植物根部中吸收的环境污染物溴化1-丁基-3-甲基咪唑，且不受植物根部组织背景干扰。
选定目标污染物溴化1-丁基-3-甲基咪唑的特征峰，质量区间为139.2±0.25％Da，经过TIC模式归一化处理，软件重构得到由不同颜色表示相对丰度的二维图像，即为目标有机污染物的质谱图像，如图3所示。图3为实施例2中目标有机污染物的质谱图像。图3中，不同的颜色表示有机污染物在该点不同的相对丰度。成像结果整体呈现出外部边缘低浓度，内部中心浓度较高的趋势。并且中心局部分散高浓度的点。这与目前根部吸收环境污染物的机理相一致。根部吸收溴化1-丁基-3-甲基咪唑，由外表皮到中心的维管组织形成一定的浓度梯度，最后沿着中心的木质部组织向上运输。由此可见，本发明提供的方法可以很直观地看到环境污染物被植物吸收后，在植物体内部空间分布的情况。加上该方法前处理简单，分析过程简便快速。不仅可以应用在其他可以被植物体吸收的环境污染物的检测，也可以应用在其他需要确定植物组织中一个或多个有机物空间分布的体系中，在结构和功能方面更好地理解污染物在植物特定组织细胞中的相互作用，并且有助于更深入地研究生态修复机理。
实施例3
空白对照组的设置：
将豌豆种在营养液中培育4周，得到的豌豆植株作为空白对照组。
1、空白样品的前处理：
选取一棵豌豆植株，剪下1cm根部组织，经冷冻切片机切片，获得的组织切片厚度为100μm。将组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，在真空度为-0.08MPa下进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-70℃，时间为24h。然后，用ImagePrep仪器(Bruker Daltonics)沉积浓度为10g/L的DCTB基质溶液，溶剂为二氯甲烷，所述沉积需要经历2s的喷雾、30s的孵育和60s的干燥，干燥之后，继续重复2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥，所述重复的次数为59次，得到预处理空白样品。
2、质谱分析方法：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对未受污染的植物组织检测得到的质谱图如图4所示。图4为本发明实施例3制备的空白样品的质谱图。
受污染样品组的设置：
将豌豆种在营养液中培育2周，然后，在添加了浓度为10mg/L的卡马西平的营养液中继续培育2周，得到受污染的豌豆植株。
1、受污染样品的前处理：
选取一棵受污染的豌豆植株，剪下1cm根部组织，经冷冻切片机切片，获得的组织切片厚度为100μm。将组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，在真空度为-0.08MPa下进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-70℃，时间为24h。然后，用基质喷雾仪沉积浓度为10g/L的DCTB基质溶液，溶剂为二氯甲烷，所述沉积需要经历2s的喷雾、30s的孵育和60s的干燥，干燥之后，继续重复2s的喷雾，30s的孵育和60s的干燥，所述重复的次数为59次，得到预处理受污染的样品。
2、质谱分析方法：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量60％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱100；
反射器电压1800V，离子源加速电压18kV，离子源真空度3.0×10-6mbar。
其他参数为系统缺省值。
利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对受污染的植物组织检测得到的质谱图如图5所示。图5为本发明实施例3制备的受污染的样品的质谱图。通过图4和图5的对比，可以得出目标有机污染物的特征峰。
从图4中可以看出，在m/z 237.1及附近没有发现特征峰；图5中，在m/z 237.1处有卡马西平的特征峰，且信号较强，分辨率较高。以上结果表明，本发明的方法可以很好地检测植物根部中吸收的环境污染物卡马西平，且不受植物根部组织背景干扰。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种植物中外源有机污染物的检测方法，包括以下步骤：
A)将空白对照组的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理空白样品；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理空白样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到空白对照组的质谱图；
B)将含有外源有机污染物的植物的组织切片固定在氧化铟锡导电载玻片上，干燥后，在干燥后的组织切片上沉积基质溶液，得到预处理样品；所述外源有机污染物包括离子液体、卡马西平和环丙沙星中的一种或几种；所述基质溶液包括DHB、DCTB和HCCA中的一种或几种；
将所述预处理样品置于带有激光的质谱仪中进行质谱分析，激光解析后电离的质谱数据经图像处理软件处理后，得到受污染样品组的质谱图；通过比较空白对照组的质谱图和受污染样品组的质谱图，得到目标有机污染物的特征峰。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)中，所述离子液体选自溴化1-丁基-3-甲基咪唑、溴化1-己基-3-甲基咪唑和溴化1-辛基-3-甲基咪唑中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述基质溶液的浓度为5～10g/L，所述基质溶液中的溶剂为二氯甲烷；
步骤B)中，所述基质溶液的浓度为5～10g/L，所述基质溶液中的溶剂为二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述空白对照组的植物的组织切片的厚度为50～200μm；
步骤B)中，所述含有外源有机污染物的植物的组织切片的厚度为50～200μm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述空白对照组的植物选自双子叶植物中的一种；
步骤B)中，所述含有外源有机污染物的植物选自双子叶植物中的一种。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述组织切片中的组织选自根部组织、茎部组织和子叶组织中的一种；
步骤B)中，所述组织切片中的组织选自根部组织、茎部组织和子叶组织中的一种。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度为-0.1～-0.05MPa；
步骤B)中，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度为-0.1～-0.05MPa。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述冷冻干燥的温度为-55～-80℃，所述冷冻干燥的时间为12～48h；
步骤B)中，所述冷冻干燥的温度为-55～-80℃，所述冷冻干燥的时间为12～48h。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
步骤A)中，所述质谱分析的条件为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量50～80％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱50～100；
反射器电压1500～2000V，离子源加速电压15～20kV，离子源真空度4.0×10-7～5.0×10-6mbar；
步骤B)中，所述质谱分析的条件为：
应用正离子反射检测模式，质量范围0～1000Da，采样率2.0GS/s；
采用337nm氮源激光，激光能量50～80％，激光频率30.0Hz；
激光点击数：每图谱50～100；
反射器电压1500～2000V，离子源加速电压15～20kV，离子源真空度4.0×10-7～5.0×10-6mbar。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述带有激光的质谱仪为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；
步骤B)中，所述带有激光的质谱仪为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
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