KR102003825B1 - 샘플 내 표적분자를 검출하고 정량하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 식별하고 정량하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 분석대상인 샘플을 지지체에 증착시키는 단계;
b) 질량분석법에 의해 샘플을 분석하여, 상기 샘플 내 표적분자의 스펙트럼을 획득하는 단계;
c) 표적분자 및 샘플에 특이적인 흡광계수(TEC)에 의해 상기 샘플 내 표적분자의 질량 스펙트럼에 관련된 신호를 가중시키 단계; 및 선택적으로
d) 표적분자의 가중된 신호를 사용하여 샘플 내 표적분자의 양을 결정하는 단계.

Description

샘플 내 표적분자를 검출하고 정량하는 방법{METHOD FOR DETECTING AND QUANTIFYING A TARGET MOLECULE IN A SAMPLE}
본 발명은 질량분석법(mass spectrometry)에 의해 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 검출하고 정량하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 질량분석이미징(mass spectrometry imaging), 특히 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization: MALDI) 이미징을 사용함으로써 샘플의 표면 상에서 직접적으로 표적분자를 검출하고 정량하는 방법을 제공한다.
일반적으로는, 본 발명은 샘플 내 분자의 정량이 유용하거나 필요한 어떠한 분야에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 다양한 생물학적 조직에서 약물의 분포 및 약동학(pharmacokinetics)을 연구하기 위한 약학 분야에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 특히 식물 및/또는 환경(토양, 주변 지하수 등)에서 제초제와 같은 분자의 독성 및 분해성을 평가하기 위해, 농예 화학(agricultural chemistry) 분야에 적용될 수 있다.
질량분석법은 샘플 내 관심 분자를 검출하고 식별하기 위한 화학적 및 생화학적 분석에 널리 알려지고 사용되는 기법이다. MALDI 이미징과 같은 질량분석법에 의한 분자 이미징이 최근 수년간 개발되었으며, 이는 관심 분자의 분포를 생물학적 조직의 박편 상에 직접적으로 시각화할 수 있게 한다. MALDI 이미징은 높은 감도에 의해 매우 많은 수의 다른 분자를 샘플의 표면에 직접적으로 동시에 시각화할 수 있다. 약학 분야에서, 이와 같은 기술은 예를 들어 처리 중 다양한 시간에서 다양한 기관의 분자의 분포를 비교할 수 있다.
그러나, 이에 따라 시간 t에서 검출된 분자의 정량이 필요하면, 이와 같은 이미징 기법을 전통적인 또는 기기적인(instrumental) 방법에 의해 정량적 화학 분석과 결합할 필요가 있다. 이와 같은 두번째 정량화 단계는 조작 및 해석 오류의 원인일 수 있다. 더욱이, 이는 관심 분자의 존재와 샘플 내에서 이의 정량적 분포를 직접적으로 연관시킬 수 없다.
본 발명은 일반적으로 질량분석법을 사용하여 단일 분석 동안에 샘플 내 표적분자를 검출하고 선택적으로 정량하는 방법을 제안한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 샘플 내 상기 표적분자의 분포 및 적어도 상대량의 이미지를 재구성하기 위해 분자의 질량 스펙트럼에 관련된 신호를 샘플 상에서 직접적으로 자동으로 획득할 수 있게 하는 질량분석이미징을 사용한다.
이를 위해, 본 발명에 따르면, 주어진 샘플 내의 각 표적분자에 특이적인 표적분자를 위한 흡광계수(extinction coefficient: TEC)가 정의되고 본 발명에 통합된다. 실제로, 주어진 농도의 주어진 분자는 이것이 검출되는 샘플에 따라 같은 강도의 신호를 방출하지 않는다. 유사하게, 주어진 샘플 내 동일한 농도의 두 개의 다른 분자는 다른 신호 강도를 갖는다. TEC의 계산 및 통합은 분석대상인 샘플 내 표적분자의 질량 스펙트럼에 관련된 신호 강도 변화를 인식하고 참작할 수 있게 한다. TEC는 그 후 상기 분자에 대해 획득된 신호를 정규화하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 이는 샘플의 성질 및 상기 샘플상에서 이의 위치와 독립적으로 이의 농도를 대표한다. 따라서, 분석된 샘플 내 표적분자에 대해 획득된 질량분석 결과로부터 분자의 직접적인 정량이 가능해진다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 식별 및/또는 정량하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 분석대상인 샘플을 지지체에 증착시키는 단계;
b) 질량분석법에 의해 샘플을 분석하여, 상기 샘플 내 표적분자의 스펙트럼을 획득하는 단계;
c) 표적분자 및 샘플에 특이적인 흡광계수(TEC)에 의해 상기 샘플 내 표적분자의 질량 스펙트럼에 관련된 신호를 가중시키는 단계; 및 선택적으로
d) 표적분자의 가중된 신호를 사용하여 샘플 내 표적분자의 양을 결정하는 단계.
본 발명에 따른 방법은 샘플이 유기 또는 무기, 액체 또는 고체인지에 관계없이 질량분석기에 의해 분석될 수 있는 어떠한 종류의 샘플에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 질량분석에 사용될 수 있는 어떠한 종류의 지지체(슬라이드, 플레이트, 막 등)에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 방법은 생물학적 조직의 분석에 특히 적합하다. 이와 같은 경우, 조직 박편이 통상적으로 약 수 마이크로미터의 두께로 제조되고, 슬라이드와 같은 지지체에 증착되어 질량분석기 내로 주입될 수 있게 한다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 혈액, 혈장, 혈청, 침, 뇌척수액, 소변 등과 같은 모든 생물학적 액체의 분석을 위해 사용될 수 있다. 또한, 토양, 물, 식물 등의 샘플과 같이 환경적인 샘플의 분석을 위해 사용될 수 있다.
a) 단계 동안, 샘플은 임의의 공지된 기법에 의해, 즉 수동적으로(예를 들어, 피펫에 의해), 또는 자동적으로(예를 들어, 스폿팅 장치(spotting apparatus)를 사용하여, 또는 분무 또는 승화에 의해) 증착될 수 있다. 샘플은 샘플 지지체에 증착시키기 전에 희석되거나 처리될 수 있다.
표적분자 분석의 b) 단계는 임의의 질량분석법에 의해, 특히 직접 질량분석법(direct mass spectometry: MS) 또는 탠덤 질량분석법(tandem mass spectometry: MSn, MRM, SRM)을 사용하여 수행될 수 있다.
질량 범위 및/또는 레이저 강도와 같은 실험적 파라미터는 유리하게는 강도, 감도 및 해상도의 측면에서 표적분자의 검출을 최적화하도록 세팅된다.
그 후, 질량 스펙트럼이 획득된다.
c) 단계를 위해, 다양한 스펙트럼 특성이 신호, 특히 질량 스펙트럼의 피크의 강도, 신호 대 잡음 비(signal-to-noise ratio: S/N), 피크의 면적 등으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 중요한 단계는 측정된 신호의 정규화에 있다. 이에 따라, 샘플 내 표적분자를 위한 신호로서 선택된 스펙트럼 특성은 분자 및 샘플에 특이적인 흡광계수(TEC)에 의해 가중된다. 이와 같은 가중은 신호를 정규화하고 신호의 근원에서의 분자의 양에만 의존하게 한다.
TEC는 비활성 샘플 지지체의 상기 분자의 신호 또는 표준분자(standard molecule)의 신호와 비교하여, 샘플의 성질 및/또는 샘플 내 이의 위치에 따른 표적분자의 신호의 강도 손실 또는 증가를 나타낸다. TEC는 몇몇의 요인, 특히 샘플의 근원(동물, 식물, 박테리아, 무기), 표면 종류(조직, 식물세포, 금속 등), 화학적 환경, 샘플의 화학적 처리의 존부 등에 의존한다. 생물학적 조직의 샘플의 경우, 분자의 흡광계수는 조직의 흡광계수에 대응된다.
유리하게는, 샘플의 조직학적, 화학적 또는 다른 예비 연구가 다양한 관심영역을 규명하고 TEC의 계산에 이들을 사용하기 위해 수행된다. 실제로, TEC는 샘플, 특히 비균질 샘플의 특정 구역에 연관될 수 있다.
일 구현예에서, TEC는 하기의 관계에 의해 획득될 수 있다:
Figure 112013095107987-pct00001
또는 역으로:
Figure 112013095107987-pct00002
신호는 선택된 표적분자의 질량 스펙트럼의 스펙트럼 특성, 예를 들어 질량분석기에서 획득된 상기 분자의 피크의 강도에 대응된다. 물론, 기준매질(reference medium) 내 및 샘플 상의 분자를 위해 사용된 스펙트럼 특성은 동일해야한다.
TEC는 기준매질 내 및 분석대상인 샘플상에서 표적분자의 동일한 농도를 사용하여 계산된다. 또한, 기준매질 내 표적분자의 위치에, 표적분자와 유사한 물리화학적 성질을 갖는 관련 분자를 사용하는 것이 가능하다.
이와 같은 TEC의 계산을 위해, 기준 매질은 유리하게는 샘플 지지체에만 대응된다. 이에 따라, 예를 들어 분자는 샘플 지지체에 증착시키기 전에 적합한 매질(유기 용매, 물 또는 그 외)에 용해된다. 증착 후에 용매의 증발이 일어나고, 지지체 상에서 분자의 건조된 증착물이 획득된다. 샘플 지지체의 상기 분자에 대해 획득된 신호가 그 후 TEC를 위해 사용된다.
신뢰할만한 계수를 획득하기 위해, TEC 값은 일반적으로 동일한 조건 하에서 표적분자를 수회 측정한 것의 평균이다.
바람직하게는, 흡광계수(TEC)는 샘플의 주어진 종류의 주어진 표적분자에 대해 단 한 번만 계산되고, 샘플의 주어진 종류의 상기 표적분자의 각 분석에 위해 재사용된다. 따라서, 수 개의 다른 샘플 내 표적분자의 TEC를 나열하는 TEC의 데이터베이스는 유리하게는 주어진 표적분자에 대해 생성될 수 있고, 다양한 샘플 내 상기 분자의 각 분석에 사용될 수 있다.
선택적으로는, TEC 값은 각 분석 전에 결정된다.
다른 구현예에서, TEC는 하기의 관계에 의해 획득될 수 있다:
Figure 112013095107987-pct00003
또는 역으로:
Figure 112013095107987-pct00004
신호는 선택된 분자의 질량 스펙트럼의 스펙트럼 특성, 예를 들어 질량분석기에서 획득된 상기 분자의 피크의 강도에 대응된다. 물론, 표준분자 및 표적분자를 위해 사용된 스펙트럼 특성은 동일해야한다.
본 발명에 있어서, "표준분자"는 표적분자와 구조적으로 유사한 분자를 지칭한다. 바람직하게는, 표준분자의 분자량은 표적분자의 분자량과 상이하여, 획득된 질량 스펙트럼이 용이하게 분석될 수 있다. 예를 들어, 표준분자의 분자량은 표적분자의 분자량으로부터 1 내지 17 돌턴의 차이가 있다. 유리하게는, 용해화 용액(수성 또는 용매 포함)에 포함된 표준분자의 농도는 총 신호를 포화시키지 않기 위해 정의된다.
특정 구현예에서, 표준분자는 표적분자의 중수소화 분자, 즉 중수소에 의해 표지된 분자 또는 표준분자로서 임의의 다른 적합한 동위원소에 의해 표지된 분자이다. 표적분자 및 이의 중소수화 보완체(complement)(또는 동위원소에 의해 표지된 대응되는 분자)는 분석된 샘플에서 동시에 평가된다. 이들의 이온화가 동일할 것이라는 점을 고려하면, 질량분석법에 의한 이들의 분석은 동위원소의 존재에 의한 질량의 차이를 갖는 동일한 신호로 결론지어진다. 동위원소에 의해 표지된 분자의 농도는 알려져 있기 때문에, 그 후 상대량을 구하기 위해 비가 계산될 수 있다.
유리하게는, 분석 단계 b) 전에, 분자량이 알려진 표준분자가 알려진 농도로 분석대상인 샘플에 첨가된다. 본 발명에 따른 방법이 MALDI 또는 매트릭스-강화 2차 이온 질량분석(ME-SIMS) 이미징과 같이 매트릭스의 사용을 필요로 하는 질량분석이미징 기법을 사용하는 경우, 사용 전에 표준분자가 매트릭스에 첨가될 수 있다. 매트릭스/표준분자 혼합물이 샘플 및 샘플의 주변, 즉 샘플 지지체에 균일하게 증착되어, TEC를 계산할 수 있게 한다. 건조하는 동안, 혼합물의 동시결정화(co-crystallization)가 육안으로 관찰될 수 있다.
바람직하게는, 혼합물은 증착되기 전에 균질화된다.
표준분자를 사용하는 이와 같은 TEC가 레이저 탈착/이온화(LDI), 탈착 전기분무 이온화(desorption electrospray ionization: DESI), 레이저 융삭 전기분무 이온화(laser ablation electrospray ionization: LAESI) 또는 2차 이온 질량분석법(SIMS)과 같이 매트릭스 용액을 필요로 하지 않는 이미징 기법에 사용될 수 있다. 이와 같은 경우, 표준분자는 매트릭스와 혼합되지 않고, 동일한 증착 장치를 사용함으로써 샘플 및 지지체에 증착될 수 있다. 따라서, 샘플이 연구를 위한 참고용으로 사용될 수 있는 표준분자에 의해 함침될 수 있다.
농도가 알려진 표준분자에 대해 획득된 신호는, 억제효과를 고려하면서, 표적분자 분포를 현실으로 시각화하기 위해 표적분자의 스펙트럼 특성을 정규화하는 것에 사용된다. 또한, 표준분자에 대해 획득된 신호는 표적분자의 신호를 표준분자의 신호와 비교함으로써 적어도 샘플 내 표적분자의 상대량을 추론하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 하기에서 더욱 자세히 기재되는 바와 같이, 매트릭스의 효과를 보완하는 것이 가능하다.
d) 단계 동안, 샘플 내에서 측정된 가중된 신호가 상기 분자를 정량하기 위해 사용될 수 있다. 가중된 신호는 대응하는 계산된 TEC의 함수에 따라 증가되거나 감소된 표적분자에 대해 획득된 신호 강도에 대응된다. 더욱 자세하게는, 가중된 신호는 샘플 내 표적분자의 신호 대 관련된 TEC의 비, 또는 이의 역에 대응된다.
가중된 신호의 값은 분자의 농도에만 의존한다. 따라서, 예를 들어 표적분자에 대한 기준신호(reference signal)에 따라 표적분자의 양을 결정하는 것이 가능하다.
"표적분자에 대한 기준신호"라는 표현은 샘플의 성질 및 샘플 내 이의 위치와 독립적으로, 알려진 농도를 나타내는 신호를 지칭한다. 기준신호는 특정 분자의 알려진 양에 대해 미리 결정되거나 설정된 평균값 또는 중간값(또는 평균값 또는 중간값의 범위)일 수 있다. 또한, 이는 표준 곡선일 수 있다.
선택된 방법 및 필요하면 사용된 기준신호에 따라, 상대적 또는 절대적 방법으로 표적분자의 양을 결정할 수 있다.
예를 들어, 용해화된 분자가 증착된 샘플 지지체와 같은 기준매질 내 표적분자(또는 표적분자와 유사한 물리화학적 성질을 갖는 다른 분자)의 3 이상의 다른 알려진 농도에 의해 표준 범위를 준비함으로써 기준신호가 획득된다. 분자가 조직 샘플에 증착되면, 분자는 유리하게는 용해화 매질의 증착 및 증발 후 상기 조직에 흡착된다.
표적분자와 다른 내부표준이 상기 표적분자의 신호를 정규화하기 위해 표준 범위에 도입될 수 있다. 내부표준으로 사용되는 분자는 유리하게는 표적분자와 유사한 물리화학적 성질을 갖는다. 이와 같은 표준의 일정한 농도가 증착 전에 표적분자의 표준범위에 첨가된다.
그 다음, 각 농도에 대한 질량 스펙트럼이 분석된다. 비교신호로 선택된 스펙트럼 특성이 상기 각 농도에 대해 판독된다. 유리하게는, 각 농도점에 대한 질량 스펙트럼을 획득한 후에, 선택된 관련 스펙트럼 특성이 상기 분자에 대한 검량선(calibration curve)을 설정하기 위해 사용될 수 있다. 이때, 분석된 샘플 내 농도를 정밀하게 결정하기위해 이와 같은 검량선을 참고하는 것으로 충분하다.
본 발명에 따른 방법은 유리하게는 질량분석이미징과 함께 사용될 수 있다. 이와 같은 경우, 비행시간(time-of-flight: TOF), 오빗트랩(orbitrap), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(Fourier transform ion cyclotron resonance: FT-ICR) 등과 같이 다양한 종류의 분석기와 결합된 MALDI, 레이저 탈착/이온화(LDI), 탈착 전기분무 이온화(DESI) 등과 같은 다양한 이온화원이 사용될 수 있다. 이와 같은 이미징 기법은 샘플 내 표적분자의 공간적 분포에 대응되는 샘플에 대해 획득된 이온 밀도 지도(ion density map) 상에서 표적분자를 직접적으로 정량할 수 있게 한다. 상기 이온 밀도 지도의 가중된 신호는 실제로 관심 분자의 특이적인 기준신호와 비교될 수 있다.
MALDI 또는 ME-SIMS와 같은 특정 질량분석이미징 기법은 UV-흡수 유기 소분자를 포함하는 매트릭스에 의해 분석대상 샘플이 미리 커버될 필요가 있다. 이와 같은 매트릭스는 샘플에 존재하는 분자의 탈착 및 이온화를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법은 선택된 매트릭스와 관계없이 사용될 수 있다. 이들 매트릭스는 고체 형태(샘플상에서 결정화) 또는 액체 형태로 제공되고, 이온성 또는 비이온성이다. 매트릭스는 분석되는 질량 범위에 따라 선택된다. 이들은 일반적으로 용매/수용액 혼합물 중으로 사용되기 직전에 제조된다.
매트릭스를 증착시키기 위해 다수의 방법이 가능하고, 특히 샘플에 정밀한 부피의 매트릭스를 증착시킬 수 있는 피펫을 사용한 수동 증착이 가능하다. 또한, 매트릭스를 분무(spraying) 또는 연무(nebulization)에 의해 증착시킬 수 있고, 여기서 매트릭스는 로봇 시스템에 의해 또는 수동적으로 조직에 직접 분무 또는 연무된다. 유사하게, 압전(piezoelectric), 어쿠스틱(acoustic) 또는 시린지(syringe) 펌프 시스템에 의해 매트릭스가 스폿(spot)되는 미세소적(microdroplet)에 의한 증착을 예상할 수 있다. 또한, 매트릭스를 고체 형태로 증착시키기 위해 매트릭스를 시프팅(sifting)에 의해 증착시킬 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 방법이 MALDI 질량분석이미징을 사용하면, 샘플상의 매트릭스 증착의 균질도를 분석하는 단계를 기대할 수 있다. 실제로, 사용된 매트릭스에 대응되는 신호는 상기 매트릭스의 증착의 품질/균일성을 나타낼 수 있다. 이때, 샘플의 표면상 매트릭스 결함은 연구된 샘플 내 표적분자의 신호의 강도 손실 또는 검출의 부족과 연관될 수 있다.
매트릭스의 균질도는 샘플의 표면상의 증착의 균질도를 광학 현미경 하에서 관찰함으로써 정성적 기준에 따라 평가되거나, 및/또는 샘플 상의 매트릭스 자체에 대한 신호의 차이를 관찰함으로써 정량적 기준에 따라 평가될 수 있다.
정성적 기준에 있어서, 연구하의 표면상에 매트릭스가 가능한 한 균일하게 증착되고, 매트릭스가 결핍된 구역이 없으며, 결정화가 최적이라는 것이 보장되어야 한다. 매트릭스 증착의 균질도의 정량적 평가에 있어서, 매트릭스는 샘플 분석 동안에 표적분자 신호와 같은 방법으로 검출되는 신호를 갖는 분자 자체로 여겨진다. 이때, 매트릭스 분자의 신호는 이의 기준신호와 비교된다. 이와 같은 경우에 매트릭스의 기준신호는 기준 매트릭스의 증착물에서, 즉 매트릭스의 기준신호를 측정하기 위해 특이적으로 사용되는 샘플 지지체 및 샘플에서, 매트릭스에 의해 방출된 신호에 대응된다.
추가적인 이들 단계에 의해, 매트릭스 증착의 스펙트럼 특성에 영향을 줄 수 있는 매트릭스 증착의 품질의 차이를 고려하기 위해 표적분자의 신호가 확인되고 정규화된다.
매트릭스 증착 품질이 샘플별로 다를 수 있기 때문에, 시간에 따른 표적분자의 존재의 차이를 관찰하는 경우에 매트릭스 효과의 이와 같은 고려가 특히 유리할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 핵산, 지질, 대사물질 등과 같이 임의의 종류의 분자, 및 일반적으로 약학적으로 또는 다른 방법으로 활성이고 질량분석법에 의해 이온화될 수 있는 임의의 분자를 분석하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 소분자(특히 약물), 즉 분자량이 2000　Da 미만인 분자의 분석에 대해 특히 유리하다.
표적분자가 고분자량의 단백질이면, 표적분자를 효소적 및/또는 화학적으로 전처리하여 다수의 펩티드로 절단하는 것이 가능하다(도 2). 그 후, 검출 및 정량이 상기 단백질을 나타내는 효소 소화 및/또는 화학적 분해/변질로부터 유래되는 하나 이상의 펩티드에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 트립신이 표적 단백질을 앞서 식별된 다수의 펩티드로 절단하는 효소로 사용될 수 있다. 화학적 전처리는 산 또는 염기에 의한 화학적 가수분해, 마이야르(Maillard) 반응, 이소펩티드 또는 리시노알라닌(lysinoalanine)의 형성 등으로 구성된다.
유사하게, 표적분자의 검출을 최적화하기 위해 분석대상인 샘플을 하나 이상의 용매 및/또는 하나 이상의 세제에 의해 검출 단계 b) 전에 처리할 수 있다. 예를 들어, 클로로포름에 의한 세척(도 1-a)은 특정 군의 지질을 제거한다. 에탄올에 의한 세척(도1-b)은 저중량 분자의 더 뛰어난 검출을 가능하게 한다. 이들 두 가지의 세척은 도 1에 도시된 실험에서 특정 분자, 특히 지질을 제거하여, 조직에 새로운 이온의 직접적인 검출을 촉진한다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 동일한 샘플 내 2 이상의 다른 표적분자를 동시에 또는 순차적으로 검출하고 정량하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 생물학적, 식물 또는 동물 조직의 박편 상의 표적분자의 검출 및 정량에 특히 적합하다. 특히, 전체 동물(whole animal)의 박편은 동일 샘플 상에서 상기 동물의 다양한 조직의 표적분자의 분포를 비교할 수 있게 한다.
본 발명에 따르면, 소스데이터(source data), 즉, 표적분자 및 매트릭스 효과의 TEC는 이들 인자 모두 또는 부분을 통합하는 컴퓨터 프로그램에 의한 정량의 측면에서 정규화될 수 있다. 이와 같은 컴퓨터 프로그램 또는 데이터 분석 소프트웨어는 유리하게는 질량분석이미징의 경우에 이미지를 프로세싱하는 동안에 매트릭스 효과에 의해 필요에 따라 가중된 TEC 값을 사용한다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 예를 들어 질량분석으로부터 유래된 미가공 데이터의 판독, 및/또는 TEC의 결정, 및/또는 검량선의 결정, 및/또는 표적분자에 대한 정량값을 획득하기 위해 상기 TEC 또는 상기 검량선을 사용하여 미가공 데이터의 정규화와 같은 컴퓨터-실행가능 명령을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이터 매체에 관한 것이다. 유리하게는, 이들 컴퓨터-실행가능 명령은 컴퓨터 시스템이 본 발명에 따른 방법의 적어도 c) 단계를 수행하도록 하는데 적합하다.
데이터 매체는 유리하게는 2 이상의 다른 샘플 종류 내 하나 이상의 표적분자에 대한 하나 이상의 TEC 데이터베이스를 포함한다. 바람직하게는, 전체 동물의 박편과 같은 생물학적 샘플의 경우, 데이터베이스는 상기 샘플의 다양한 조직 내의 하나 이상의 표적분자의 TEC를 나열한다.
또한, 데이터 매체는 질량분석이미징에서 사용되는 하나 이상의 매트릭스의 기준신호의 데이터 베이스를 포함할 수 있다. 따라서, 데이터 매체를 이용하는 이미징 방법을 사용함으로써, 샘플의 분석 동안 매트릭스 효과를 고려하는 것이 가능하다.
도 1. 심장 조직의 질량분석에 의한 직접적인 분석에서 두 가지의 세척의 실시예. (a): 매트릭스 증착물의 어떠한 예비적인 세척도 없이 심장 조직으로부터 획득된 신호. (b): 매트릭스의 증착 전에 90% 에탄올 세척에 의해 (a)에 인접한 박편 상의 심장 조직으로부터 획득된 신호. (c): 매트릭스의 증착 전에 100% 클로로포름으로 세척한 (a)에 인접한 박편 상의 위 조직으로부터 획득된 신호.
도 2. (a) 기준지지체(슬라이드) 및 (b) 조직(래트 간) 상의 소화된 모델 단백질의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(소화 효소로서 트립신을 갖는 소 혈청 알부민. m/z 928 단편(YLYEIAR)의 실시예: 1.62의 TEC를 갖는 조직 상의 펩티드에 관한 질량 신호의 소멸의 관찰.
도 3. 질량분석이미징을 사용하는 실시예에 따른 본 발명에 따른 방법의 주요단계의 도식적 표현.
도 4. 마우스의 전신에서 프로프라놀롤 분포에 관한 연구에서 조직 흡광계수를 계산하는 방법론. (a) 다양한 기관 또는 표적 구역을 시각화하기 위한 제어 마우스의 시상단면(sagittal section)의 광학적 이미지(1-슬라이드만, 2-뇌, 3-신장, 4-폐, 5-간, 6-심장). (b) 샘플 내 및 샘플 외에서 매트릭스와 혼합된 내부표준(프로프라놀롤, m/z 260의 [M+H]+ 이온)의 분포의 질량분석 이미지, 및 강도 스케일.
도 5. 신장에서 프로프라놀롤의 조직 흡광계수를 계산하기 위한 방법론. 도 5a: 신장의 광학적 이미지, 표적기관 내 동일한 크기의 지점의 구역 또는 몇몇 관심영역의 경계. 도 5b: ROI에서 및 ROI 사이에서(ROI 평균) 내부표준의 평균 강도의 표.
도 6. 도 6a: 기관 또는 표적구역에 의해 프로프라놀롤 강도를 요약하는 표. 도 6b: 기관 또는 표적구역에 의한 프로프라놀롤 강도의 히스토그램(histogram).
도 7. 조직 흡광계수의 계산. 도 7a: 수학적 관계: 표적기관에 의한 프로프라놀롤에 대해 계산된 TEC를 요약하는 표. 도 7b: 표적기관에 의한 프로프라놀롤에 대해 계산된 TEC의 히스토그램.
도 8. 표적분자에 대한 검량선의 결정. 도 8a: 표준 범위 증착의 광학적 이미지. 도 8b: 표준 범위의 질량분석 이미지, 표적분자 분포.
도 9. 도 9a: 표적분자의 표준범위의 ROI의 평균 강도를 요약하는 표. 도 9b: 검량선 그래프. 도 9c: 상관계수(Correlation coefficient) 및 직선 방정식.
도 10. 전신에서 표적분자(프로프라놀롤)의 질량분석 이미지 상의 정량. 도 10a: 표적분자의 주사 후 20분에 마우스의 시상단면의 광학적 이미지, 및 다양한 기관 또는 표적 구역의 시각화(2-뇌, 3-신장, 4-폐, 5-간, 6-심장). 도 10b: 강도에 의한 표적분자(m/z 260의 [M+H]+ 이온)의 주사 후 t=60분에서 분포의 질량분석 이미지. 도 10c: TEC에 의해 정규화하고 검량선과 연관시킨 후 표적분자의 주사 후 t=20분에 분포의 질량분석이미지, 표적분자의 면적 단위 당 양에 대한 액세스(access).
도 11. 표적분자의 MS 이미지에 대한 정량, 다양한 기관에서 표적분자의 양을 요약하는 표. TEC를 사용하여 기관 및 픽셀(pixel)에 의한 평균강도로부터 표적분자의 양을 계산하는 방법론의 설명.
도 12. 신장 내 올란자핀의 조직 흡광계수를 계산하는 방법론. 도 12a: 대조 마우스 신장의 시상단면의 이미지. 도 12b: 샘플 내 및 샘플 외에서의 매트릭스와 혼합된 내부표준(올란자핀, m/z 313.3의 [M+H]+ 이온) 분포의 질량분석 이미지. 도 12c: 신장 내 올란자핀에 대해 계산된 TEC의 히스토그램.
도 13. 표적분자에 대한 검량선의 결정. 도 13a: 표준범위의 질량분석이미지, 표적분자의 분포. 도 13b: 올란자핀의 MS 이미지에 대한 검량선의 제시, 이의 방정식, 이의 상관계수 및 fmol/mm2로 나타낸 이의 검출한계 및 정량한계.
도 14. 2시간 동안 처리된 신장에서 표적분자(올란자핀)의 질량분석이미지를 사용한 정량. 도 14a: 표적분자의 투여 후 2시간에 마우스 신장의 시상단면의 광학적 이미지. 도 14b: 강도에 따른 표적분자(m/z 313.3의 [M+H]+ 이온)의 투여 후 t=2시간에서 분포의 질량분석이미지.
본 발명은 이제 특이적인 실시예 및 하기에 나타난 도면을 사용하여 더욱 자세하게 설명된다. 이들 실시예는 설명의 목적을 위해서만 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
실시예 1에서, 마우스의 다양한 기관에서 약물(프로프라놀롤)의 분포는 MALDI 질량분석이미징에 의해 연구된다. 물론, 거의 동일한 방법으로 MALDI 외에 예를 들어 하기와 같은 다른 이미징 장치가 사용될 수 있다: SIMS, DESI, DIOS, ICP, MALDI 현미경, SNOM, SMALDI, LA-ICP, ESI(조직에서 액체 추출), MILDI, JEDI, ELDI 등.
재료 및 방법
재료:
- 2,5-디히드록시벤조산(DHB)(Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France)
- 트리플루오로아세트산(TFA)(Sigma-Aldrich)
- 메탄올(Sigma-Aldrich)
- 프로프라놀롤(Sigma-Aldrich)
동물:
25-40　g 무게의 수컷 스위스 마우스(Charles River, France)가 사용되었다. 0.9% NaCl 용액에 포함된 프로프라놀롤이 정맥 내 경로에 의해 7.5　mg/kg의 농도로 주사되었다.
주사 후 20분에 상기 동물은 CO2 질식(asphyxiation)에 의해 희생되었다.
그 후, 상기 동물을 급속 냉동을 위한 액체 질소에 의해 냉각된 100% 이소펜탄 용액에 담갔다.
그 후, 상기 동물은 -80　℃에서 보관되었다.
질량분석을 위한 샘플의 제조:
샘플(대조 및 투여된 조직)이 -26　℃로 냉각된 CM1510S 저온유지장치(cryostat)(Leica Microsystems, Nanterre, France)를 사용하여 20　㎛ 두께의 막으로 박편화되었다. 그 후, 박편을 전도성 ITO(인듐 주석 산화물) 슬라이드(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)에 증착시켰다.
마지막으로, 박편을 20분 동안 건조기(desiccator)에 놓았다.
MALDI 이미징에 의한 획득을 위한 준비:
DHB 매트릭스가 조직 박편 내 표적분자(프로프라놀롤)의 분석을 위해 사용되었다. 이와 같은 매트릭스는 메탄올/0.1% TFA(1:1, v/v) 중 40　mg/ml의 농도로 제조되었다. 매트릭스 용액은 SunCollect 스프레이 시스템(SunChrome, Germany)을 사용하여 증착되었다.
동일한 슬라이드에 그러나 투여된 조직 박편과 떨어져서, 물에 포함된 다양한 범위의 프로프라놀롤의 희석액이 피펫(포인트 당 1　㎕)을 사용하여 수동으로 매트릭스의 증착 전에 증착되었다. 이와 같은 희석액의 범위는 10　pmol/㎕ 내지 0.02　pmol/㎕이고, 7개의 포인트를 포함한다.
TEC 의 계산을 위한 준비:
다른 전체 동물로부터의 대조 조직 박편에, ACN/0.1% TFA(7:3, v/v)의 CHCA 매트릭스 용액 10　mg/ml이 또한 제조되었고, 여기에 프로프라놀롤 용액 10　pmol/㎕가 첨가되었다. 매트릭스 용액을 SunCollect 스프레이 시스템(SunChrome, Germany)을 사용하여 증착하여 조직 박편의 표면을 덮었다.
MALDI 이미지 획득:
Smartbeam 레이저가 장착된 AutoFlex Speed MALDI-TOF 질량분석기(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 사용하여 이미지가 획득되었다. 데이터는 포지티브 리플렉트론(positive reflectron) 모드에서 생성되었다. 100　Da 내지 1000　Da의 질량 범위에서 300 x 300 ㎛2 이미지 공간 해상도 및 1000　Hz의 레이저 주파수를 갖는 각 스폿에 대해 총 700의 스펙트럼이 획득되었다. FlexImaging 버전 2.1 소프트웨어가 이미지를 재구축하기 위해 사용되었다.
1 - 대조 샘플상의 표적분자( 프로프라놀롤 )의 TEC 계산
전술한 바와 같이 제조되고 대조 샘플로 사용된 전체 동물의 시상단면이 슬라이드에 증착된다.
내부표준으로서 사용된 프로프라놀롤 용액이 대조 샘플에 생성 혼합물을 증착시키기 전에 상기 매트릭스와 혼합된다.
그 후, 대조 샘플은 대조 샘플 및 지지체 슬라이드에서 내부표준의 분포 이미지를 획득하기 위해 질량분석이미징에 의해 분석된다(도 4b).
유리하게는, 다양한 관심 기관의 위치를 대조 샘플의 광학적 이미징에 의해 미리 파악할 수 있다(도 4a).
그 후, 슬라이드상에서 각 기관에 대해 동일한 크기의 다수의 관심영역(ROI)이 대조 샘플의 질량분석 이미지상에 구분 지어진다. 질량 스펙트럼의 피크의 강도가 기준신호로서 선택되었다. 각 ROI 및 각 관심기관에 대한 내부표준의 평균 강도가 기록되었다. 각 기관에 대해, 평균 강도(ROI 평균)가 대응되는 모든 ROI에 대해 획득된 강도로부터 계산되었다. 이와 같은 평균 ROI는 연구된 각 기관에서 프로프라놀롤의 흡광계수를 계산하는 데 사용될 것이다.
도 5는 신장에 대한 이와 같은 다양한 단계의 도식적인 다이아그램을 나타낸다.
도 6a는 대조 샘플의 다양한 관심기관 내의 프로프라놀롤에 대해 획득된 평균 ROI를 요약하고, 도 6b는 획득된 대응되는 신호 강도의 히스토그램을 나타낸다.
그 후, TEC가 하기의 수학식에 따라, 슬라이드 및 각 기관으로부터의 평균 ROI 값을 사용하여 계산될 수 있다(도 7a):
Figure 112013095107987-pct00005
따라서, 프로프라놀롤의 동일한 농도에 대해, 예상된 신호, 즉 슬라이드 상의 신호와 비교하여 신장에서의 관련된 신호는 거의 13에 의해 나누어진다. 반면에, 신호는 간에서 4.82, 및 심장에서 7.96에 의해서만 나누어진다. 신호는 폐에서 8 미만, 및 뇌에서 6.18에 의해 나누어진다.
2 - 프로프라놀롤 검량선
도 8 및 도 9를 사용하여 여기에 기재된 실시예에서, 표적분자(프로프라놀롤)에 대한 기준신호는 프로프라놀롤의 7가지 농도의 표준범위에 대해 획득된 신호에 대응된다.
프로프라놀롤의 7가지의 다른 농도(0 내지 3　pmol/㎕)에 대응되는 7방울의 프로프라놀롤 및 매트릭스 용액이 피펫을 사용하여 슬라이드에 증착되고 건조된다. 결과를 판독하기 용이하게 하기 위해, 방울은 농도를 증가시키면서, 겹칠 위험을 방지하기 위해 충분히 공간을 두고 증착된다.
다양한 이들 농도에 대해 획득된 질량분석 이미지가 동일한 크기의 ROI를 사용하는 범위의 모든 점에서 정규화되고, 여기서 프로프라놀롤에 대한 평균 기준강도, 또는 기준신호가 정의된다. 그 후, 검량선(도 9b)을 그려서 분석하는 동안에 프로프라놀롤에 대해 획득된 임의의 신호 강도와 픽셀에 따른 농도의 연관관계를 나타낼 수 있게 한다.
3 - 샘플의 질량분석 이미지상에서 직접적인 프로프라놀롤의 정량
전술한 바에 따라 제조되고, 가능하면 TEC의 계산 동안에 대조 샘플로 사용되는 박편과 동일한 평면에서 제조된 전체 동물의 시상단면이 질량분석이미징에 의한 분석을 수행하기 위해 슬라이드에 증착된다(도 10b).
프로프라놀롤에 대해 획득된 신호 강도는 각 관심기관에서 각각에 대해 계산된 TEC의 함수에 따라 증가한다.
전체 동물의 박편의 질량분석 이미지가 획득되고, 여기서 신호 강도는 절대 강도, 즉 프로프라놀 농도만의 강도에 대응된다(도 10c). 이와 같은 이미지는 이미지를 시각화함으로써 직접적으로 샘플 내 프로프라놀롤의 양을 결정하기 위해, 프로프라놀롤에 대해 앞서 계산된 검량선과 연관될 수 있다.
따라서, 여기에 기재된 실시예에서, 표적분자의 총량이 약 5　ng으로 프로프라놀롤의 분포가 가장 큰 뇌와는 반대로, 프로프라놀롤이 간 및 폐에는 실제로 존재하지 않는다는 점이 주목된다. 또한, 프로프라놀롤은 신장 및 폐에서 1.28　ng 내지 2　ng의 양으로 관찰된다.
실시예 2
두번째 실시예에서, 마우스의 신장에서의 다른 약물(올란자핀(olanzapine))의 분포가 MALDI 질량분석이미징에 의해 연구된다. 다른 어떠한 이미징 장치도 실제로 동일한 방법으로 사용될 수 있다.
재료 및 방법
재료:
- 히드록시신남산(CHCA)(Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France)
- 트리플루오로아세트산(TFA)(Sigma-Aldrich)
- 아세토니트릴, DMSO, 물(Sigma-Aldrich)
- 올란자핀(Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN)
동물:
25-40　g 무게의 수컷 스위스 마우스(Charles River, France)가 사용되었다. 올란자핀이 8　mg/kg의 농도로 경구로 투여되었다.
투여 후 2시간에 상기 동물은 CO2 질식에 의해 희생되었다.
그 후, 상기 동물을 급속 냉동을 위한 액체 질소에 의해 냉각된 100% 이소펜탄 용액에 담갔다.
그 후, 상기 동물은 -80　℃에서 보관되었다.
질량분석을 위한 샘플의 제조:
상기 실시예 1과 동일한 조건 하에서, 샘플이 10　㎛ 두께의 막으로 박편화되었다(대조 및 투여된 신장 박편).
MALDI 이미징에 의한 획득을 위한 준비:
투여된 조직 박편에서 표적분자(올란자핀)의 분석을 위해 CHCA 매트릭스가 사용되었다. 이와 같은 매트릭스는 ACN/0.1% TFA(7:3, v/v) 중 10　mg/ml의 농도로 제조되었다. 매트릭스 용액은 SunCollect 스프레이 시스템을 사용하여 증착되었다.
동일한 슬라이드에 그러나 투여된 조직 박편과 떨어져서, DMSO에 포함된 다양한 범위의 올란자핀의 희석액이 피펫(포인트 당 1　㎕)을 사용하여 수동으로 매트릭스의 증착 전에 증착되었다. 이와 같은 희석액의 범위는 60　pmol/㎕ 내지 1　pmol/㎕이고, 7개의 포인트를 포함한다.
TEC 의 계산을 위한 준비:
(다른 전체 동물로부터의) 신장의 대조 조직 박편에, ACN/0.1% TFA(7:3, v/v) 중 CHCA 매트릭스 용액 10　mg/ml이 또한 제조되었고, 여기에 프로프라놀롤 용액 10　pmol/㎕가 첨가되었다. 조직 박편의 표면을 덮기 위해, 매트릭스 용액이 SunCollect 스프레이 시스템을 사용하여 증착되었다.
MALDI 이미지 획득:
이미지가 실시예 1과 동일한 방법으로, 다만 200 x 200 ㎛2의 이미지 공간 해상도를 갖도록 획득되었다.
1 - 대조 샘플의 표적분자( 올란자핀 )의 TEC 계산
전술한 바와 같이 제조되고 대조 샘플로 사용된 신장의 대조 시상단면이 슬라이드에 증착된다. 내부표준으로서 사용된 올란자핀 용액이 대조 샘플에 생성 혼합물을 증착하기 전에 상기 매트릭스와 혼합된다.
그 후, 대조 샘플 및 지지 슬라이드 상의 내부표준의 분포 이미지를 획득하기 위해, 대조 샘플이 질량분석이미징에 의해 분석된다(도 12b). 도 12a에 나타난 대조 샘플의 광학적 이미지가 관심 기관, 즉 신장을 시각화할 수 있게 한다.
신장 및 슬라이드 상의 동일한 크기의 다수의 관심영역(ROI)이 대조 샘플의 질량분석 이미지상에 구분 지어진다. 질량 스펙트럼의 피크의 강도가 기준신호로서 선택되었다. 평균 강도(ROI 평균)가 실시예 1과 같이 계산된다. 이와 같은 평균 ROI는 신장에서 올란자핀의 흡광계수를 계산하는 데 사용될 것이다.
TEC(도 12c)가 실시예 1과 동일한 방법론에 따라 계산된다. 따라서, 동일한 농도의 올란자핀에 대해 예상된 신호, 즉 슬라이드 상의 신호와 비교하여 신장의 관련된 신호는 거의 22.2에 의해 나누어진다는 것이 관찰된다.
2 - 올란자핀 검량선
도 13에 나타난 올란자핀에 대한 기준신호는 올란자핀의 7가지 농도의 표준범위에 대해 획득된 신호에 대응된다.
올란자핀의 7개의 다른 농도(0 내지 60　pmol/㎕)에 대응되는 7방울의 올란자핀 및 매트릭스 용액이 피펫을 사용하여 슬라이드에 증착되고 건조된다. 결과를 판독하기 용이하게 하기 위해, 방울은 농도를 증가시키면서, 겹칠 위험을 방지하기 위해 충분히 공간을 두고 증착된다.
다양한 이들 농도에 대해 획득된 질량분석 이미지(도 13a)가 동일한 크기의 ROI를 사용하는 범위의 모든 점에서 정규화되고, 여기서 올란자핀에 대한 평균 기준강도, 또는 기준신호가 정의된다. 그 후, 검량선(도 13b)을 그려서, 분석하는 동안에, mm2 당 pmol의 농도와 올란자핀에 대해 획득된 임의의 신호 강도의 연관관계를 나타낼 수 있게 한다.
3 - 샘플의 질량분석 이미지를 사용한 올란자핀의 정량
전술한 바에 따라 제조되고, 가능하면 TEC의 계산 동안에 대조 샘플로 사용되는 박편과 동일한 평면에서 제조된, 올란자핀에 의해 처리된 신장의 시상단면이 질량분석이미징에 의한 분석을 수행하기 위해 슬라이드에 증착된다(도 14a). 신장의 질량분석 이미지가 이에 따라 획득되고, 여기서 주로 수질(medulla) 내의 m/z 313.3 이온(도 14b)의 검출을 통해 올라자핀의 위치가 파악된다.
올란자핀에 대해 획득된 신호 강도는 미리 계산된 TEC의 함수에 따라 신장에서 정규화된다. 그 후, 이와 같은 데이터는 신장에서 이의 총농도를 pmol/mm2로 획득하기 위해 올란자핀에 대해 미리 계산된 검량선과 연관시킬 수 있다.
분석된 신장 박편의 두께 및 표면적에 대한 지식으로, 샘플 내 조직의 그램 당 그램으로 올란자핀의 양을 결정할 수 있다.
따라서, 전술된 실시예에서, 41.1　㎍/g 조직의 올란자핀의 평균 농도(세 개의 실험을 걸쳐)를 계산할 수 있다.

Claims (20)

  1. 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법으로서,
    a) 분석대상인 샘플을 지지체에 증착시키는 단계;
    b) 질량분석법에 의해 샘플을 분석하여, 상기 샘플 내 표적분자의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계;
    c) 표적분자 및 샘플에 특이적인 흡광계수(TEC)에 의해 상기 샘플 내 표적분자의 질량 스펙트럼에 관련된 신호를 가중시키는 단계; 및 선택적으로
    d) 표적분자의 가중된 신호를 사용하여 샘플 내 표적분자의 양을 결정하는 단계를 포함하고,
    분석대상인 샘플 내 표적분자의 흡광계수(TEC)는
    - 기준매질 내 표적분자의 신호 대 샘플 내 표적분자의 신호의 비, 또는 이의 역(inverse)에 대응되거나, 또는
    - 샘플 내 표준분자의 신호 대 샘플 내 표적분자의 신호의 비, 또는 이의 역에 대응되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    동위원소에 의해 표지되고 농도가 알려진 표적분자가 표준분자로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    질량분석이미징이 사용되고, 샘플 및 지지체 모두에 생성 혼합물을 스프레딩하기 전에 동위원소에 의해 표지되고 농도가 알려진 표적분자가 매트릭스와 혼합되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    동위원소에 의해 표지되고 농도가 알려진 표적분자가 샘플 및 지지체 모두에 증착되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    TEC는 분석대상인 특정 종류의 샘플 내 특정 표적분자에 대해 한 번만 계산되고, 특정 종류의 샘플 내의 상기 표적분자의 각 정량을 위해 재사용되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자는 단백질, 펩티드, 지질, 대사물질, 소분자 또는 질량분석법에 의해 이온화될 수 있는 분자인 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 분석대상인 샘플은 유기 또는 무기 샘플인 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자는 단백질이고, 검출 단계 b) 이전에 상기 표적분자의 효소적 및/또는 화학적 전처리가 수행되며, 검출 및 정량은 상기 전처리로부터 생성된 하나 이상의 펩티드에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    분석 단계 b) 이전에 샘플을 하나 이상의 용매 및/또는 하나 이상의 세제에 의해 처리하여, 표적분자의 검출을 최적화하는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자의 질량 스펙트럼에 관련된 신호는 상기 질량 스펙트럼의 신호 대 잡음 비, 피크의 면적 또는 피크의 강도에 대응되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    질량분석이미징이 사용되고, 표적분자의 신호 강도는 분석대상인 샘플에 대해 직접적으로 가중되어 상기 샘플 내 표적분자의 분포 및 농도를 동시에 시각화하는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    질량분석이미징이 사용되고, 분석 단계 b) 이전에 샘플 상의 매트릭스 증착의 균질도가 기준 매트릭스의 증착에 대해 평가되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 내 2 이상의 다른 표적분자가 동시에 검출되고 정량되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석이미징에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 하나 이상의 조직의 박편(section)이고, 상기 표적분자는 질량분석이미징에 의해 조직에서 직접적으로 검출되고 정량되는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석법에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 전체 동물(whole animal)의 박편이고, 상기 표적분자는 상기 박편에서 직접적으로 질량분석이미징에 의해 검출 및 정량되어 동물의 다양한 조직 내 상기 표적의 분포를 동시에 비교하는 것을 특징으로 하는, 샘플 내 하나 이상의 표적분자를 질량분석이미징에 의해 검출하고 정량하는 방법.
  16. 제1항에 따른 방법의 c) 단계를 컴퓨터 시스템이 실행할 수 있도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이터 매체.
  17. 제16항에 있어서,
    2 이상의 다른 종류의 샘플 내 하나 이상의 표적분자에 대한 TEC 데이터베이스를 포함하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터-판독가능 데이터 매체.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    질량분석이미징에 사용되는 하나 이상의 매트릭스의 기준신호의 데이터베이스를 포함하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터-판독가능 데이터 매체.
  19. 삭제
  20. 삭제
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2976076B1 (fr) 2011-05-31 2015-02-27 Imabiotech Procede de detection et de quantification d'une molecule cible dans un tissu
CA2899994C (en) * 2013-02-25 2022-08-30 Imabiotech Method to evaluate the tissue targeting of a molecule of interest
FR3016461B1 (fr) * 2014-01-10 2017-06-23 Imabiotech Procede de traitement de donnees d'imagerie moleculaire et serveur de donnees correspondant
CN103901093B (zh) * 2014-03-13 2017-01-04 华东理工大学 制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法
CN104198572A (zh) * 2014-08-26 2014-12-10 宜昌捷诺威医药科技有限公司 用于检测脂类组合物c18：2ce和sm22：0含量的方法
CN105574474B (zh) * 2014-10-14 2019-03-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于质谱信息的生物特征图像识别方法
CN105572212B (zh) * 2014-10-14 2018-12-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于可视化质谱信息的生晒参和红参快速识别方法
US10441668B2 (en) 2014-12-08 2019-10-15 University Health Network System and method for enhanced mass spectrometry imaging
EP3234582B1 (en) * 2014-12-17 2021-02-17 Ventana Medical Systems, Inc. Accurately calculating acoustic time-of-flight
WO2016125120A1 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Lipid screening platform allowing a complete solution for lipidomics research
EP3262194B1 (en) * 2015-02-25 2020-04-08 Agency for Science, Technology and Research Device and method for detecting target molecules
GB2601669B (en) * 2015-03-06 2022-08-31 Micromass Ltd Collision surface for improved ionisation
KR101746535B1 (ko) 2015-07-27 2017-06-13 서강대학교산학협력단 Maldi-tof 질량분석방법을 이용한 고분자내 올리고머의 정량분석 방법
WO2017049403A1 (en) * 2015-09-22 2017-03-30 University Health Network System and method for optimized mass spectrometry analysis
BR112018010156A8 (pt) * 2015-11-20 2019-02-26 Treat4Life Ab método para análise de adesão de fármaco em uma amostra de tecido
EP3469623A4 (en) 2016-06-10 2020-01-22 University Health Network SOFT IONIZATION SYSTEM AND METHOD OF USING THE SAME
KR102535976B1 (ko) * 2016-06-13 2023-05-23 건국대학교 산학협력단 형광이미지 및 질량 분석을 이용한 의약품의 생체분포도를 상호보완적으로 확인하는 방법
CN115876735A (zh) * 2017-04-13 2023-03-31 豪夫迈·罗氏有限公司 荧光图像中靶分子密度的确定
AU2018282883B2 (en) * 2017-06-12 2024-03-28 Protein Dynamic Solutions, Inc. Method and system for analysis of crystals and crystallization
SE1750924A1 (sv) * 2017-07-14 2018-10-02 A method for analyzing the 3d structure of biomolecules
CN113330312A (zh) * 2019-01-22 2021-08-31 Ima生物科技公司 评估生物样品中与分子效应相关的分子变化的方法
WO2020217335A1 (ja) * 2019-04-24 2020-10-29 株式会社島津製作所 イメージング分析装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005267042A (ja) 2004-03-17 2005-09-29 Sysmex Corp 糖尿病診療支援システム

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPR892101A0 (en) * 2001-11-16 2001-12-13 Proteome Systems Ltd High resolution automated maldi data analysis
EP2186879B1 (en) * 2002-10-03 2016-11-23 Norman Leigh Anderson High sensitivity quantitation of peptides by mass spectrometry
CN101310177B (zh) * 2005-11-08 2011-12-21 国立大学法人东北大学 用质谱仪定量膜蛋白质的方法
ES2531164T3 (es) * 2007-02-21 2015-03-11 Volvo Lastvagnar Ab Método de trabajo de un sistema de tratamiento final de gases de escape y sistema de tratamiento final de gases de escape
WO2008126151A1 (ja) * 2007-04-04 2008-10-23 Shimadzu Corporation 質量分析データ解析方法及び装置
JP2009009684A (ja) * 2007-06-01 2009-01-15 Fujifilm Corp 光情報記録媒体および情報記録方法
EP2391886A4 (en) * 2009-04-10 2013-04-17 Canon Kk METHOD FOR FORMING MASS IMAGE
JP5478998B2 (ja) * 2009-09-02 2014-04-23 公益財団法人野口研究所 分析方法
WO2011073740A1 (en) * 2009-12-15 2011-06-23 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Matrices for mass spectrometry imaging

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005267042A (ja) 2004-03-17 2005-09-29 Sysmex Corp 糖尿病診療支援システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Qualitative and quantitative analysis of low molecular weight compounds by ultraviolet matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using ionic liquid matrices(2003.12.18.)

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