ES2693037T3 - Método para evaluar la acción selectiva de una molécula de interés por un tejido - Google Patents
Método para evaluar la acción selectiva de una molécula de interés por un tejido Download PDFInfo
- Publication number
- ES2693037T3 ES2693037T3 ES14706597.3T ES14706597T ES2693037T3 ES 2693037 T3 ES2693037 T3 ES 2693037T3 ES 14706597 T ES14706597 T ES 14706597T ES 2693037 T3 ES2693037 T3 ES 2693037T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tissue
- molecule
- candidate molecule
- interest
- distribution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
Abstract
Método para evaluar ex vivo o in vitro si una molécula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario, que comprende la visualización y la comparación mediante la toma de imágenes moleculares por espectrometría de masas de la distribución de la molécula candidata y de al menos un compuesto control en la superficie de al menos un corte de tejido destinatario anteriormente obtenido por muestreo en al menos un animal que ha recibido con anterioridad la molécula candidata, y optativamente el compuesto de control.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Metodo para evaluar la accion selectiva de una molecula de interes por un tejido Campo de la invencion
La invencion se refiere a un metodo para valorar la distribucion de una molecula de interes en un tejido destinatario. Mas en concreto, la invencion da a conocer un metodo para evaluar si una molecula de interes se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario predeterminado mediante la comparacion con al menos un compuesto de control. El metodo de la invencion permite, en otras palabras, evaluar la especificidad, la adsorcion, la distribucion, la vectorizacion, el metabolismo de una molecula de interes y/o de sus metabolitos sobre un tejido destinatario.
El metodo de la invencion halla su aplicacion en todos los dominios que implican el estudio del comportamiento de una molecula de interes en un sistema experimental, a saber, en uno o varios tejidos biologicos. El metodo de la invencion se puede utilizar ventajosamente en la proteomica, en la lipidomica o en la investigacion farmaceutica para escrutar las moleculas candidatas y evaluar su potencial terapeutico o diagnostico.
Antecedentes de la invencion
El desarrollo de un farmaco, desde el descubrimiento de la primera molecula candidata hasta poner el producto en el mercado, es un procedimiento largo y costoso, que implica una inversion significativa de recursos humanos y de equipamiento. En especial, los ensayos clmicos que implicaban la experimentacion con humanos podfan durar varios anos. El objetivo de estos ensayos es garantizar la eficacia del farmaco, poner de relieve los posibles efectos secundarios y evaluar los problemas relativos a la seguridad de los medicamentos.
Antes de realizar estos ensayos clmicos, los ensayos preclmicos tienen gran importancia. Durante este desarrollo preclmico es cuando se consigue identificar, seleccionar y validar la molecula candidata. El desarrollo preclmico utiliza espedficamente ensayos con animales para estudiar la farmacologfa de una molecula candidata. En particular, el proposito de estos estudios farmacologicos es validar in vitro e in vivo el mecanismo de accion y medir la actividad de la molecula candidata en los modelos de enfermedad en los animales. Ademas, proporcionan una evaluacion del comportamiento de la molecula candidata y de su posible transformacion en un organismo vivo, y ayudan a establecer sus organos o tejidos destinatarios y la dosis toxica para el modelo.
Por consiguiente, la relevancia de los ensayos clmicos esta relacionada con los estudios preclmicos previos durante los cuales una gran cantidad de moleculas, interesantes a primera vista, quedan descartadas al final. Los estudios preclmicos deben permitir una seleccion fiable, entre docenas de moleculas candidatas, de la mas prometedora que podra ser un ingrediente activo en una formulacion farmacologica para el tratamiento de una enfermedad dada. Una evaluacion preclmica deficiente puede conducir a la seleccion de una molecula candidata que mostrara su ineficacia en las fases clmicas, lo que provoca perdidas en terminos de tiempo y costes.
Por lo tanto, es importante disponer de investigaciones fiables para evaluar si una molecula candidata actua sobre la diana correcta, sobre todo en un tejido determinado, y no acarrea efectos secundarios ni queda bloqueada por una barrera biologica. Por ejemplo, numerosas moleculas identificadas in vitro como posibles compuestos activos para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) acaban por no ser capaces, durante los ensayos in vivo, de atravesar la barrera hematoencefalica y, por lo tanto, resultan totalmente ineficaces.
Hoy dfa, mas del 35% de las moleculas candidatas descartadas en los ensayos clmicos se han seleccionado de manera erronea en las fases preclmicas tras la evaluacion incorrecta de su accion sobre el tejido destinatario.
Por esa razon, existe la necesidad real de metodos fiables para la seleccion de moleculas candidatas que garanticen su alta especificidad de fijacion por un tejido destinatario dado, lo que permitira la evaluacion fidedigna de su farmacocinetica dentro de este tejido. Tambien hay una necesidad, en el caso del desarrollo de productos fitosanitarios, de tener mas datos sobre la posible toxicidad o no del producto en el organismo vivo mediante el uso de un metodo para evaluar si una molecula candidata se fija o se incorpora a al menos un tejido destinatario.
Compendio de la invencion
En este contexto, los inventores desarrollaron un metodo para valorar la eficacia de la accion selectiva de una molecula de interes en un tejido dado. El metodo de la invencion permite validar la capacidad que tiene esta molecula para atravesar una o varias barreras biologicas despues de la administracion hasta alcanzar dicho tejido, pero tambien para valorar la especificidad de la molecula por dicho tejido. De forma mas general, el metodo de la invencion permite la evaluacion ex vivo o in vitro de parametros biologicos de la molecula de interes, tales como su absorcion, su vectorizacion y/o su metabolismo en funcion del tejido destinatario o del sistema experimental elegido.
Asf pues, el metodo de la invencion se puede utilizar para conseguir un cribado rapido y fiable de las moleculas con un posible efecto terapeutico y para ser capaz de seleccionar la que podra entrar en una formulacion farmacologica para tratar una enfermedad dada en funcion del tejido destinatario. El metodo de la invencion tambien se puede aplicar para verificar los posibles efectos secundarios que tiene la molecula de interes, por ejemplo, en uno o varios
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tejidos a los que la molecula se puede fijar y que no son los destinatarios. De igual forma, el metodo de la invencion se puede utilizar en la proteomica, por ejemplo, para el escrutinio de biomarcadores con el que seleccionar una o varias moleculas diagnosticas fiables para una enfermedad dada.
Hoy d^a, se han descrito un gran numero de moleculas y se las ha clasificado segun su tejido destinatario, su especificidad o no por dicho tejido, etc. En la presente invencion, los inventores proponen la utilizacion de sus conocimientos previos para seleccionar nuevas moleculas candidatas. Mas en concreto, el metodo de acuerdo con la invencion propone utilizar, como marcador, una molecula con propiedades bien conocidas en el tejido destinatario y comparar su distribucion en dicho tejido con la distribucion de la molecula candidata. Se puede utilizar cualquier metodo que permita la visualizacion ex vivo o in vitro de la distribucion de una molecula dentro de un tejido. En concreto, la localizacion del marcador y de la molecula candidata se puede realizar en el animal entero mediante la toma de imagenes por resonancia magnetica (RMN) o en cortes de tejido, por ejemplo, mediante la toma de imagenes por espectrometna de masas (EM).
El proposito de la invencion es un metodo para evaluar si una molecula de interes se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario, lo que comprende la visualizacion y la comparacion de la distribucion de la molecula de interes y de al menos un compuesto de control dentro del tejido destinatario o sobre la superficie del tejido destinatario de al menos un animal que ha recibido con anterioridad la molecula de interes y/o el compuesto de control.
El metodo de la invencion se puede utilizar para evaluar la distribucion de todas las moleculas medibles mediante el uso de tecnicas de toma de imagenes, sobre todo una protema, un peptido, un lfpido, un anticuerpo, un acido nucleico, un compuesto organico o inorganico, etc. Mas en concreto, la molecula de interes es una molecula candidata, por consiguiente exogena, que esta implicada o puede estar implicada en un desarrollo farmaceutico o fitosanitario. De acuerdo con la invencion, la molecula candidata tambien se refiere a una molecula con un potencial farmaceutico o fitosanitario, o uno de sus metabolitos.
El tejido destinatario estudiado puede ser un organo completo, una region espedfica dentro de un organo, una barrera biologica, etc. Por ejemplo, el tejido destinatario es un organo tal como un pulmon, un ojo, un tngado, un rinon, un corazon, etc., o una barrera biologica tal como la barrera hematoencefalica, o una region espedfica de un organo, tal como un tejido tumoral, sobre todo un tejido tumoral encefalico, etc.
De acuerdo con la invencion, el compuesto o compuestos de control y la molecula de interes se pueden coadministrar al animal con anterioridad.
Ventajosamente, la concentracion del compuesto o compuestos de control y de la molecula de interes esta adaptada al modelo de animal estudiado. En algunas realizaciones, estas concentraciones son identicas.
La administracion se puede realizar por una via enteral o parenteral.
En una realizacion concreta, la visualizacion y comparacion de la distribucion de la molecula de interes y del compuesto de control se realizan sobre la superficie de al menos un corte del tejido destinatario obtenido de un muestreo anterior del tejido del animal, o de la retirada del tejido.
Cuando se utiliza la tecnica de toma de imagenes por espectrometna de masas, se puede anadir una etapa de normalizacion de las senales que estan asociadas, respectivamente, a los espectros de masas de la molecula de interes y al compuesto de control sobre la superficie del corte del tejido destinatario. Con este fin, las caractensticas espectrales seleccionadas, tal como la senal para la molecula escogida en la muestra, se pueden ponderar mediante un coeficiente de extincion de tejido (CET) espedfico tanto para la molecula como para el tejido destinatario. Esta ponderacion normaliza la senal y la hace dependiente unicamente de la cantidad de la molecula en el origen de la senal. Ademas, cuando se utiliza una matriz de MALDI, se puede ponderar la senal asociada a los espectros de masas de la molecula escogida y de los compuestos de control en dicho tejido para tener en cuenta la homogeneidad del deposito de la matriz de MALDI.
Ventajosamente, el metodo de la invencion se aplica a un tejido de un animal al que se le ha administrado con anterioridad la molecula de interes y tanto un compuesto de control positivo como un compuesto de control negativo.
El metodo de la invencion tambien se puede utilizar con una muestra de tejido de un animal al que se le ha administrado con anterioridad la molecula de interes y un compuesto intermedio de control.
Preferiblemente, la etapa de visualizacion para obtener la distribucion de la molecula de interes se consigue mediante el uso de una tecnica de toma de imagenes, en especial mediante el uso de la toma de imagenes por espectrometna de masas y sobre todo la toma de imagenes por MALDI.
De acuerdo con la invencion, se puede evaluar la especificidad de una molecula de interes por el tejido destinatario al comparar la distribucion de dicha molecula dentro del tejido destinatario con la distribucion de dicha molecula de interes en al menos otro tejido que no es el destinatario.
De acuerdo con la invencion, se puede evaluar la proporcion de penetracion tisular de la molecula de interes en el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
tejido destinatario al comparar la distribucion de dicha molecula dentro del tejido destinatario con la distribucion de un compuesto de control dentro del mismo tejido destinatario.
El metodo de la invencion tambien permite calcular un coeficiente de selectividad por un tejido que tiene la molecula de interes por el tejido destinatario, que tiene en cuenta la especificidad de la molecula por dicho tejido y la proporcion de penetracion tisular de dicha molecula en dicho tejido.
En una realizacion concreta, el metodo de la invencion puede comprender una etapa de evaluacion de la de la cinetica de eliminacion de la molecula de interes en el tejido destinatario que compara la distribucion de dicha molecula en al menos dos cortes del tejido destinatario que se obtuvieron anteriormente mediante muestreo, en diferentes tiempos (t1) y (t2), de los animales a los que se habfa administrado con anterioridad la molecula de interes y el compuesto de control.
La invencion tambien hace referencia a un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones informaticas ejecutables idoneas para permitir que un sistema informatico ejecute la comparacion de la distribucion de la molecula de interes con la distribucion del compuesto de control segun el metodo de la invencion.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1: representacion esquematica de la distribucion de tres moleculas de interes M1, M2 y M3 y de dos compuestos de control, M+ es el control positivo y M- es el control negativo, obtenida durante el experimento de toma de imagenes por espectrometna de masas sobre cortes de tejido que comprenden el tejido destinatario (T1) y un tejido periferico, que no es el destinatario. La especificidad de cada molecula de interes se valora al comparar la distribucion (firma espectral) de las moleculas de interes con la distribucion (firma espectral) de los compuestos de control positivo (M+) y negativo (M-), en dichos tejidos destinatario y que no es destinatario.
Figura 2: representacion esquematica de la distribucion de las tres moleculas de interes M1, M2 y M3 y de los dos compuestos de control, el positivo (M+) y el negativo (M-), obtenida durante el experimento de toma de imagenes por espectrometna de masas en cortes de tejido que comprenden el tejido destinatario (T1) y un tejido periferico, que no es el destinatario. La similitud y/o disimilitud de la distribucion de cada una de las moleculas de interes en comparacion con la distribucion de los compuestos de control permite apreciar las similitudes espaciales de la distribucion de cada molecula dentro del tejido destinatario. La proporcion de penetracion tisular para las moleculas de interes se evalua al comparar los mapas de intensidad de dichas moleculas de interes y de los compuestos de control en relacion con la cantidad de los compuestos de control en dicho tejido destinatario.
Figura 3: imagenes relacionadas con la tincion histologica (figura 3A), distribucion molecular (figura 3B) y vista esquematica (figura 3C) de un corte de tejido renal de un raton, en donde se han inyectado con anterioridad olanzapina (molecula de interes Mc), posaconazol (compuesto de control positivo M+) y metsuximida (compuesto de control negativo M-). La imagen molecular muestra con claridad dos areas diferentes (figura 3B) relacionadas, respectivamente, con el compuesto de control positivo (centro de la figura 3B) y con el compuesto de control negativo (en torno al area del control positivo de la figura 3B). Esto permite delimitar con facilidad el tejido destinatario, a saber, la region media del rinon, o medula (tejido 1 en el centro de la figura 3C) con respecto a un tejido que no es el destinatario, a saber, la region externa del rinon, o corteza renal (tejido periferico 2 de la figura 3C).
Figura 4: espectro de masas de olanzapina (A), metsuximida (B) y posaconazol (C), que corresponde, respectivamente, a la coordenada de imagenes no solapantes a nivel del area de tejido de intensidad alta de la olanzapina (A), de tejido que no es elvdestinatario (B) y de tejido destinatario (C). Tambien se presenta el patron de isotopos de cada ion que corresponde a dichas moleculas (veanse los insertos que hay encima de los correspondientes espectros de masas).
Figura 5: visualizacion, en un corte de tejido renal de raton, de la distribucion del posaconazol (compuesto de control positivo M+) a nivel de la region de la medula (imagen de la izquierda de la figura 5), de la olanzapina (molecula de interes Mc) en el rinon completo (imagen en el centro de la figura 5), de la metsuximida (compuesto de control negativo M-) a nivel de la corteza renal (imagen de la derecha de la figura 5) mediante el uso de imagenes por espectrometna de masas. Las lmeas discontinuas indican las regiones periferica y media del rinon.
Figura 6: superposicion de la distribucion, sobre las imagenes de cortes de tejido renal de raton, de la molecula de interes, Mc, y del compuesto de control positivo, M+, (imagen de la izquierda de la figura 6); de la molecula de interes, Mc, y del compuesto de control negativo, M-, (imagen en el centro de la figura 6) y de los dos compuestos de control, M+ y M- (imagen de la derecha de la figura 6). La evaluacion precisa de la similitud/disimilitud de estas distribuciones se obtiene con facilidad mediante la superposicion de imagenes sucesivas.
Figura 7: representacion esquematica de una estrategia para valorar la eficacia de afinidad del agonista de acuerdo con una realizacion del metodo de la invencion en el caso de un estudio de ocupacion de receptor.
Figura 8: representacion esquematica de una estrategia para valorar la eficacia de afinidad del agonista de acuerdo con otra realizacion del metodo de la invencion en el caso de un estudio de ocupacion de receptor.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Descripcion detallada de la invencion
El metodo de la invencion se basa en la comparacion del comportamiento que tiene un compuesto de control en un tejido destinatario espedfico en el que ya se conocen las propiedades de compartimentacion para dicho tejido, con una molecula de interes que tiene propiedades de compartimentacion desconocidas para dicho tejido y que se tienen que estudiar. Despues de la administracion de estas moleculas a un animal y comparar la distribucion de estas moleculas en el tejido destinatario del animal, se puede validar si la presencia de la molecula de interes dentro de dicho tejido es significativa o no es significativa, pero tambien la especificidad de la accion selectiva sobre el tejido, su proporcion de penetracion tisular, la cantidad relativa o absoluta en dicho tejido, asf como su metabolismo, regulacion, etc.
En funcion de la molecula de interes y del tejido destinatario, se puede evaluar la mejor via de administracion, para verificar la buena vectorizacion de la molecula en el organismo o para validar su capacidad para atravesar barreras biologicas hasta alcanzar el tejido destinatario.
Eleccion de los compuestos de control
Antes del estudio de los parametros biologicos que tiene la molecula de interes, es importante elegir con gran precision los compuestos de control con una especificidad predeterminada por un tejido destinatario que serviran de referencia.
Un compuesto de control es una molecula de la que ya se conocen sus propiedades por un tejido destinatario, a saber, su biodisponibilidad (capacidad para actuar selectivamente sobre un tejido), su vectorizacion (presencia/concentracion en el tejido destinatario/capacidad para atravesar la barrera biologica) y/o su regulacion (comportamiento de la molecula dentro del tejido destinatario). El compuesto de control suele ser un compuesto exogeno al tejido destinatario estudiado. Asf pues, un «compuesto de control positivo» es una molecula que se sabe que se distribuye espedficamente en el tejido destinatario despues de la administracion al animal elegido como modelo de estudio. Preferiblemente, para ayudar a la explicacion de mas datos, un compuesto de control positivo no se localiza/distribuye en los tejidos que no son los destinatarios pero que estan adyacentes al tejido destinatario. Por el contrario, un «compuesto de control negativo» es una molecula que se sabe que esta ausente en el tejido destinatario despues haberle sido inyectada al animal. De acuerdo con la invencion, tambien se puede utilizar un compuesto de control «intermedio» que pone de relieve las propiedades intermedias en el tejido destinatario, en comparacion con los compuestos de control positivo y negativo. En especial, un compuesto de control intermedio puede ser una molecula que actua selectivamente sobre dos tejidos diferentes con la misma proporcion o una proporcion diferente (por ejemplo, 60/40, 70/30, etc.). En adelante, «molecula de control», «control» o «marcador» se pueden utilizar indistintamente para hacer referencia a un «compuesto de control».
La eleccion de los compuestos de control esta relacionada con el tejido destinatario estudiado mediante el uso del metodo de la invencion. Por ejemplo, el diazepam se sabe que se localiza en el cerebro despues de la inyeccion, mientras que su distribucion es muy escasa en el rinon. Por consiguiente, esta molecula puede utilizarse como un compuesto de control positivo para el cerebro, asf como un compuesto de control negativo para el rinon. De igual forma, la olanzapina se localiza en el cerebro, mientras que no se localiza en el pulmon. Por consiguiente, la olanzapina puede utilizarse como un compuesto de control positivo para el cerebro al igual que como un compuesto de control negativo para el pulmon.
Las propiedades de la molecula pueden depender tambien del modelo de animal estudiado. Asf pues, para un estudio dado, las propiedades de la molecula de interes y de los compuestos de control se tendran en cuenta siempre preferiblemente para el tejido destinatario del mismo modelo de animal.
Ventajosamente, para el estudio de una molecula de interes dada en un tejido destinatario dado, se utilizan al menos un compuesto de control positivo y un compuesto de control negativo para comparar la distribucion de la molecula de interes con la distribucion de estos dos compuestos de control. Naturalmente, tambien se puede utilizar solo un compuesto de control. En este caso, se prefiere un compuesto de control positivo.
Para ayudar a conocer mejor la distribucion de las moleculas en el tejido destinatario, se utilizan ventajosamente las moleculas de control que se pueden diferenciar con facilidad de la molecula de interes. Por ejemplo, en el caso de un estudio de imagenes por espectrometna de masas, se eligen ventajosamente los compuestos de control con una proporcion de masa por carga lejos de la proporcion de masa por carga de la molecula de interes. De igual forma, los compuestos de control y la molecula de interes se pueden marcar antes de la administracion, por ejemplo, mediante el uso de diferentes marcadores fluorescentes.
Para facilitar y optimizar la eleccion de las moleculas de control y hacer posible la automatizacion del metodo, toda la informacion disponible sobre las moleculas que se podnan utilizar en potencia como compuestos de control se recogen ventajosamente en una base de datos. Estos datos pueden proceder de la bibliograrta (artfculos cienrtficos, patentes...), de un estudio farmaceutico anterior, etc.
Los ejemplos de datos que se pueden introducir en esta base de datos figuran en la tabla que viene a continuacion para las moleculas y tejidos espedficos.
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 1: Ejemplos de datos a tener en cuenta en la eleccion de los compuestos de control positivo y negativo en funcion de los tejidos u organos.
- Tejido destinatario
- Controles +/- m/z
- Cerebro
- +: Olanzapina 313
- -: Atenolol
- 267
- Rinon
- +: Oxaliplatino 398
- -: Diazepam
- 285
- Hfgado
- +: Propranolol 260
- -: Floroquinolona
- 402
- Pulmon
- +: Tiotropio 432
- -: Olanzapina
- 313
+: control positivo; -: control negativo; m/z: proporcion de masa por carga
Administracion de la molecula de control y de la molecula escogida:
Una vez que se han seleccionado los controles, las moleculas de control y escogida tienen que administrate al animal utilizado como modelo de estudio.
En funcion del estudio deseado, el modelo animal puede cambiar. El experto en la tecnica sabe que modelo de animal se adapta mejor en funcion del tejido destinatario, de la molecula de interes, de las propiedades biologicas a evaluar, etc. Por ejemplo, en el caso de los ensayos preclmicos sobre una molecula candidata que requiere el sacrificio del animal, se utilizan preferiblemente mairnferos no humanos, tales como los roedores (ratones, ratas, conejos, hamster, etc.). Se pueden utilizar otros mamfferos no humanos, sobre todo monos, perros, etc. En algunos casos, cuando los tejidos destinatarios se pueden obtener mediante una biopsia sencilla, podna ser interesante utilizar un mamffero humano como modelo animal. Tambien se pueden utilizar otros modelos animales, tales como peces, insectos, por ejemplo, para estudiar el impacto que tiene una molecula sobre el medio ambiente o sobre un medio ecologico concreto.
De acuerdo con una realizacion, se sacrifica dicho animal despues de la administracion de la molecula de interes y del compuesto o compuestos de control al animal no humano. De acuerdo con la invencion, el metodo se realiza ventajosamente ex vivo y/o in vitro.
De acuerdo con la invencion y en terminos generales, se pueden utilizar todas las vfas de administracion de las moleculas de control y escogida, tales como la via enteral (a saber, la administracion del farmaco mediante el proceso de digestion en un tubo digestivo) o la via parenteral (a saber, otra via de administracion que no es el tubo digestivo). Por ejemplo, las moleculas se pueden administrar por vfas diferentes, tales como epicutanea, epidural, intraarterial, intravenosa, subcutanea (con una localizacion espedfica), intracardfaca, inyeccion intracavernosa, intracerebral, intradermica, intramuscular, infusion intraosea, intraperitoneal, intratecal, intravesical, intravftrea, nasal, oral, rectal o intravaginal.
La via de administracion se puede elegir en funcion de la molecula de interes, del tejido destinatario del metodo, etc.
El metodo de la invencion tambien puede permitir la seleccion de la via de administracion mas adaptada. De hecho, el metodo de la invencion permite evaluar la capacidad que tiene una molecula de interes para atravesar una barrera biologica hasta alcanzar el tejido destinatario. En este caso, se realizan ventajosamente experimentos en paralelo en las mismas condiciones (a saber, mismos compuestos de control, mismas concentraciones), y solo se cambia la via de administracion.
De acuerdo con la invencion, se pueden administrar al mismo animal varias moleculas de interes para estudiar simultaneamente el potencial de estas moleculas.
En una realizacion concreta, la molecula de interes y el compuesto o compuestos de control se coadministran al animal, a saber, se inyectan mediante el uso de un mismo medio, que incluye todas estas moleculas. Asf pues, es cierto que la administracion de todas las moleculas al animal tiene lugar en el mismo momento (t0). De lo contrario, se pueden administrar estas moleculas de manera independiente las unas de las otras, o la molecula de interes con independencia de los compuestos de control. En este caso, las moleculas se administran preferiblemente al animal al mismo tiempo (T0), por ejemplo, gracias a varias inyecciones simultaneas.
En otra realizacion, el compuesto de control se puede administrar a un animal diferente del animal al que se le administra la molecula de interes. Por ejemplo, se puede administrar la molecula de control positivo a un primer
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
animal, el compuesto de control negativo a un segundo animal, y la molecula de interes a un tercer animal. Sin embargo, debido a la variabilidad biologica entre los animales, estos experimentos se realizan preferiblemente en paralelo para hacer disminuir esta variabilidad.
En una realizacion espedfica, al animal se le administra la misma dosis de la molecula de interes y de cada compuesto de control. Asf pues, se puede alcanzar ademas con facilidad la etapa de evaluacion de la proporcion de penetracion.
En algunos casos, puede ser interesante la administracion de dosis o concentraciones diferentes, en funcion de las moleculas, para tener en cuenta su especificidad biologica por el modelo animal estudiado. Ventajosamente, las propiedades del compuesto o compuestos de control en el modelo de animal ya son conocidas de tal manera que el experto en la tecnica sabe si se deben adaptar las dosis. Tambien se puede adaptar la dosis de la molecula de interes, por ejemplo, mediante la comparacion con un compuesto analogo (con similitudes estructurales) cuyas propiedades en dicho modelo animal ya se han evaluado.
Estudio del caso de la barrera hematoencefalica
El metodo de la invencion tambien se puede utilizar para seleccionar las moleculas candidatas durante el desarrollo farmaceutico de farmacos que actuan selectivamente sobre el sistema nervioso central, asf como sobre una region histologica espedfica del cerebro, sobre todo tejido tumoral. De hecho, tales moleculas deben ser capaces, tras la administracion (por ejemplo, por inyeccion) al paciente, de atravesar la barrera hematoencefalica (bBb, del ingles blood-brain barrier). Esta barrera fisiologica, compuesta principalmente por las celulas endoteliales que revisten los capilares sangumeos, separa el torrente circulatorio del lfquido cefalorraqmdeo. La barrera hematoencefalica protege al cerebro ante los agentes patogenos, toxinas y hormonas que circulan por la sangre, pero puede tambien limitar la penetracion de algunos farmacos. La evaluacion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica para las moleculas candidatas es un factor decisivo de la medicion de la eficacia de un posible tratamiento relacionado.
Ventajosamente, el tal caso, el metodo de la invencion se realiza mediante la toma de imagenes por espectrometna de masas (EM), utilizada ampliamente para estudiar el sistema nervioso central desde que empieza a desarrollarse. La mejora continua de la resolucion espacial disponible durante el experimento de EM da acceso a una estructura histologica y biologica tan delicada como puede serlo la barrera hematoencefalica.
El metodo de la invencion permite obtener un modelo de estudio de la barrera hematoencefalica mediante el uso del compuesto de control positivo que atraviesa la barra hematoencefalica (por ejemplo, el diazepam) y un compuesto de control negativo que no atraviesa la barrera hematoencefalica (por ejemplo, el atenolol). Estos marcadores, despues de la administracion al animal, se siguen mediante EM directamente sobre el corte del tejido cerca de los vasos sangumeos. Asf pues, se puede evaluar la eficacia de la accion selectiva de la molecula de interes, tal como un farmaco contra el cancer, por ejemplo para el tratamiento de un glioblastoma multiforme, mediante la comparacion de la distribucion de la molecula de interes (o de sus metabolitos) con la distribucion de los marcadores positivo y/o negativo en dicho tejido.
Estudio del caso de adsorcion: ejemplo de ocupacion del receptor
En farmacologfa, la ocupacion del receptor se define por la capacidad que tiene un agonista (una molecula pequena o grande, tal como un farmaco) para fijarse a un receptor o enzima espedficos dentro del tejido biologico. Esta fijacion implica una respuesta funcional en el organismo que conduce a un tratamiento eficaz de una patologfa o enfermedad. Se pueden utilizar diferentes mecanismos para conseguir la fijacion, por ejemplo, enlace covalente, interaccion ionica, fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrogeno, etc. La afinidad de un agonista por un receptor se puede evaluar para elegir el mejor farmaco candidato para dicho receptor, que muestra por ejemplo un grado alto de fijacion y una eficacia de accion completa. Se puede producir una fijacion competitiva que implica, por ejemplo, un agonista y un antagonista, que tienen diferente afinidad por el mismo receptor. En este caso, hay una competicion entre dos moleculas diferentes ya que el receptor solo puede estar fijado a una molecula en cada momento.
Ventajosamente, el metodo de la invencion se puede utilizar para valorar esta competicion directamente dentro de los cortes de tejido, con la EM o con cualquier tecnica de toma de imagenes moleculares para evaluar la afinidad de una molecula de interes (el agonista) por un receptor o enzima espedficos mediante la comparacion con un marcador positivo (el antagonista) con una gran afinidad de fijacion.
Segun una realizacion, despues de la administracion de la molecula de interes al modelo biologico y la toma de muestras, el tejido destinatario se puede lavar con una solucion que contiene el antagonista (el marcador positivo) y se deja incubar. Como alternativa, el experimento se puede realizar mediante una coadministracion de las moleculas (agonista y antagonista). El marcador positivo (el antagonista competitivo) competira con la molecula de interes (agonista) que ya esta fijada al receptor. Se puede utilizar entonces la EM para seguir al agonista y al antagonista en el corte de tejido que recibio las dosis. La eficacia del candidato se puede evaluar al comparar la intensidad y la localizacion de las dos moleculas competidoras sobre las imagenes moleculares resultantes. Se pueden registrar diferentes parametros, tales como la concentracion del agonista/antagonista, la duracion de la incubacion, etc. Se puede valorar la localizacion del propio receptor sobre el corte del tejido en funcion de su potencial de ionizacion,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
sobre todo para las especies moleculares grandes. Se pueden aplicar diferentes estrategias para detectar el receptor o las enzimas en el tejido (digestion, marcacion, etiquetas para EM...). Por ejemplo, se pueden aplicar diferentes estrategias para valorar la ocupacion del receptor, al combinar el protocolo in vivo/ex vivo. Por ejemplo, se puede incubar el agonista y el antagonista en el corte de tejido, asf como administrar ambos compuestos al mismo tiempo, etc. No hay ninguna limitacion a la hora de realizar esta clase de evaluacion mediante la toma de imagenes moleculares.
Formas de iones de aductos
Para el experimento de toma de imagenes por espectrometna de masas, todos los marcadores o las moleculas escogidas se pueden detectar como protonados [M+H]+ o desprotonados [M-H]- para el modo de ionizacion positiva o negativa, respectivamente. No obstante, se pueden detectar en el espectro de masas como una forma de aducto con diferentes contraiones. Por ejemplo, podna ser potasio [M+K]+, sodio [M+Na]+, cloruro [M+Cl]-, etc. Esta lista no es exhaustiva.
Preparacion del tejido destinatario
El metodo de la invencion permite visualizar una molecula de interes en al menos un tejido destinatario dado de interes.
En el contexto de la invencion, el termino «tejido» se refiere a una serie de celulas funcionales agrupadas. El tejido destinatario puede ser un conjunto de celulas similares con el mismo origen, un organo, una parte de un organo, una region espedfica de un organo con, optativamente, aglomeraciones de muchas celulas. Por ejemplo, el tejido destinatario puede ser un tumor localizado dentro de un organo.
De acuerdo con la tecnica de visualizacion utilizada, puede ser necesario o util realizar etapas de preparacion previas en dicho tejido.
De acuerdo con el modelo de animal y/o tejido destinatario elegido, se puede realizar un analisis ex vivo, por ejemplo, en un corte de tejido. En tal caso, se muestrea el tejido o la muestra del tejido en un momento dado despues de la administracion (t1). El muestreo puede ser de una muestra de biopsia, sobre todo cuando el animal es un mairnfero humano. En el caso de un animal no humano, el sacrificio del animal se puede realizar antes del muestreo.
En una realizacion concreta, el analisis se puede conseguir sobre un corte de tejido. En este caso, el corte del tejido se puede obtener de tejido fresco, de tejido congelado o de tejido fijado/incluido, por ejemplo, en parafina. Se pueden utilizar todos los medios idoneos para obtener cortes delgados del tejido, con un grosor de unos pocos micrometros.
Si fuera necesario, los cortes de tejido pueden recibir un tratamiento previo, en particular segun las moleculas a detectar, la tecnica analttica, etc. Asf pues, se pueden utilizar agentes qmmicos o bioqmmicos sobre cortes de tejido para optimizar la deteccion de la molecula de interes y de los compuestos de control. Por ejemplo, se pueden utilizar solventes y/o detergentes para permitir la deteccion de determinadas clases de moleculas o para mejorar la extraccion directa de las moleculas desde el tejido. Tambien se pueden utilizar enzimas espedficas capaces de escindir peptidos o protemas para actuar selectivamente sobre, por ejemplo, fragmentos de digestion que tienen la misma localizacion y/o cantidad tisular que la molecula original. Tambien se puede realizar la marcacion con anticuerpos (conjugados o no a una etiqueta) sobre cortes de tejido, o utilizar moleculas marcadas con fluorescencia o radioactividad para permitir la deteccion de la molecula de interes y de los compuestos de control.
Tambien se puede cambiar el modelo usado de animal no humano y/o el tejido destinatario y/o el corte de tejido para modificar su capacidad a la hora de fijarse a la molecula de interes o de incorporarla. Asf pues, este tratamiento puede incluir una modificacion qrnmica o biologica del modelo animal y/o del tejido destinatario y/o del corte del tejido que permite incrementar o inhibir la penetracion o la capacidad de accion selectiva que tiene una molecula de interes sobre un tejido destinatario dado. Este tratamiento se puede realizar antes, despues o durante la administracion de la molecula de interes y/o del compuesto de control. Por ejemplo, en el caso de la barrera hematoencefalica, hay algunos transportadores expulsivos en la barrera que son capaces de sehacerse las moleculas que atraviesan la barrera hematoencefalica. El efecto de estos transportadores se puede modular (disminuir o suprimir) con inhibidores o con modificacion genetica, tal como una «genosupresion», del gen o de la expresion del gen de dichos transportadores.
Si las imagenes por espectrometna de masas que necesita una matriz se utilizan para estudiar el corte del tejido y, en especial, MALDI o ME-SIMS (espectrometna de masas de iones secundaria realzada con matriz), dicha matriz esta adaptada ventajosamente a la molecula de interes. Por ejemplo, la eleccion puede tener en cuenta el intervalo de masas cubierto. El experto en la tecnica sabe, a partir de las matrices existentes lfquidas o solidas, cual de ellas se puede utilizar en funcion de las moleculas estudiadas y/o del tejido destinatario. De igual forma, se puede utilizar el metodo de deposito de la matriz, sobre todo la pulverizacion manual, la pulverizacion automatica, la sublimacion, la tamizacion y el microgoteo.
Visualizacion de la distribucion molecular y tratamiento de los datos generados
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La etapa de visualizacion de la distribucion de las moleculas de interes y de los compuestos de control se puede realizar con cualquiera de las tecnicas que permite la identificacion exacta y la visualizacion, in vivo o ex vivo, de las moleculas de un tejido.
En el caso del analisis de un corte de tejido, se pueden utilizar tecnicas relacionadas con toma de imagenes por espectrometna de masas, tales como toma de imagenes por MALDI (desorcion e ionizacion por laser asistida por una matriz), LDI (desorcion e ionizacion por laser), DESI (desorcion por electropulverizacion), LESA (analisis de superficie por extraccion de lfquidos), LAESI (ionizacion por electropulverizacion con ablacion por laser), DART (analisis directo en tiempo real), SMIS (espectrometna de masas de iones secundarios), JEDI (ionizacion por electropulverizacion con desorcion a chorro), en combinacion con diferentes clases del analizadores de masas, tal como TOF (tiempo de vuelo), Orbitrap, FTICR (resonancia ciclonica ionica con transformada de Fourier), cuadruplos (simple o triple), etc.
Tambien se puede utilizar la fluorescencia, la inmunohistotincion o la qmmica, etc. Como regla general, se pueden utilizar todas las tecnicas que permiten visualizar la molecula en la superficie de un corte de tejido.
En el caso de un analisis por espectrometna de masas, se pueden utilizar varios modos de deteccion, tal como la espectrometna de masas directa (EM) o la espectrometna de masas en tandem (Msn, MRM, SRM...). Los parametros experimentales, tales como el intervalo de masas, la fluidez del laser, se fijan para optimizar la deteccion dirigida en terminos de intensidad, sensibilidad y resolucion. Asf pues, la adquisicion de los espectros de masas se realiza para obtener una senal. A partir del espectro de masas, se puede tener acceso a los datos utiles para estudiar las moleculas escogidas. Para el tratamiento de los datos, se pueden utilizar diferentes caractensticas espectrales, tales como la intensidad maxima en el espectro de masas, la relacion de senal por ruido (S/N, por su nombre en ingles), el area del maximo, etc. Por supuesto, para un estudio dado, se utilizan las mismas caractensticas espectrales para analizar la distribucion de la molecula de interes y los compuestos de control.
Se pueden obtener resultados a partir del mismo corte de tejido o de diferentes cortes de dicho tejido. En algunos casos, puede ser preferible utilizar tantos cortes de tejido como moleculas a estudiar.
De acuerdo con la invencion, la distribucion de la molecula de interes se visualiza directamente sobre la superficie del tejido destinatario.
Para validar estos resultados, la distribucion de la molecula de interes se compara con la distribucion de los compuestos de control positivo y/o negativo. De este modo se evita la consideracion de resultados que no sean significativos.
Al comparar la distribucion de la molecula de interes en un tejido destinatario con otro tejido que no es el destinatario, por ejemplo un tejido adyacente, se puede confirmar si la molecula se distribuye espedficamente en dicho tejido destinatario en vez del tejido adyacente. Por ejemplo, si la molecula se distribuye tanto en el tejido destinatario como en el tejido adyacente, esta molecula no es una buena candidata para un tratamiento dirigido que actua espedficamente/exclusivamente sobre dicho tejido destinatario.
Al comparar la distribucion de la molecula de interes en el tejido destinatario con otro tejido no destinatario y/o la distribucion de la molecula de interes con la distribucion del control positivo, se puede evaluar la relacion de penetracion o la cantidad relativa de la molecula de interes en el tejido destinatario. La biodisponibilidad de la molecula de interes, sobre todo la proporcion de dicha molecula que alcanza el tejido destinatario en comparacion con la dosis administrada, tambien se puede valorar de un modo fidedigno con las tecnicas de cuantificacion absoluta que se conocen.
La invencion tambien permite dar a conocer un coeficiente de selectividad de la molecula de interes por el tejido destinatario dado. Este coeficiente de selectividad tiene en cuenta la especificidad de la molecula de interes por dicho tejido diana y la relacion de penetracion de esta molecula en el tejido destinatario. Por lo tanto, se puede enumerar el coeficiente de selectividad por el tejido de varias moleculas, por ejemplo, las moleculas candidatas para un tratamiento terapeutico que actuan selectivamente sobre un tejido dado. Estos coeficientes de selectividad podnan compararse con rapidez para seleccionar la molecula candidata mas adaptada.
El metodo de la invencion tambien permite evaluar la cinetica de la eliminacion o el metabolismo de la molecula en dicho tejido. Con este proposito, las mismas moleculas (de interes y de control) se administran en las mismas dosis a varios animales identicos en el mismo momento de partida (t0). Se sacrifican despues los animales en diferentes tiempos (t1 a tn). A continuacion, la distribucion de la molecula de interes se compara directamente en los cortes de tejido del tejido destinatario muestreado de cada animal para tener acceso a la distribucion escalable de la molecula de interes entre t0 y tn.
Normalizacion de la senal
Durante un experimento de toma de imagenes por espectrometna de masas puede ser importante normalizar los espectros de masas relacionados con cada molecula para tener en cuenta el coeficiente de extincion del tejido (CET). Adicionalmente, puede ser util una etapa de normalizacion para tener en consideracion el efecto de la matriz
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
cuando, para visualizar las moleculas, se utilicen las imagenes por espectrometna de masas que requieren un compuesto de la matriz.
Mas en concreto, una molecula dada a una concentracion dada no emite una senal de la misma intensidad en funcion del tejido en el que se detecta. De igual forma, dos moleculas diferentes a una concentracion identica en un tejido dado tienen diferente intensidad de senal. Segun la naturaleza del tejido y/o la localizacion de la molecula en dicho tejido, se puede observar una perdida o ganancia de intensidad de la senal de la molecula en comparacion con su senal en un soporte de muestra inerte o con la senal de una molecula estandar. Este coeficiente de extincion del tejido se puede calcular para cada molecula (y para cada tejido destinatario) y, por consiguiente, se puede utilizar para ponderar la senal obtenida para cada molecula.
De igual forma, cuando el corte del tejido estudiado se cubre con un compuesto de matriz, puede inducir una perdida de la intensidad de la senal relacionada con la molecula de interes. Para impedirlo, se puede calcular el coeficiente de extincion con respecto al efecto de la matriz y utilizarlo para ponderar la senal obtenida para cada molecula estudiada en el corte del tejido analizado.
Al tener en cuenta el CET y/o el efecto de la matriz y la correspondiente normalizacion de la intensidad de la senal, se pueden obtener senales fiables relacionadas con la concentracion real de cada molecula, independientemente de la clase de tejido y/o del compuesto de matriz que se utilicen. Se puede realizar entonces una cuantificacion directa de las moleculas a partir de los resultados normalizados de la espectrometna de masas.
En la solicitud de patente internacional WO 2012/126873 se describe un metodo para calcular el coeficiente de extincion de tejido y el coeficiente del efecto de la matriz. Ademas, describe como tener en cuenta estos coeficientes para la deteccion de una molecula dentro de un tejido. Este metodo se puede aplicar ventajosamente con el metodo de la invencion para normalizar las senales obtenidas de la molecula de interes y los compuestos de control. Por lo demas, o ademas, se pueden utilizar otros metodos de calculo que permiten tal normalizacion de los espectros de masas con respecto a la senal de las moleculas estudiadas.
Ventajosamente, la etapa de normalizacion de la senal se realiza antes de la comparacion de la distribucion de las moleculas.
Analisis de las imagenes de espectrometna de masas
El metodo de la invencion puede aplicarse con facilidad con el experimento de toma de imagenes por espectrometna de masas. En este caso, se visualizan y se comparan la intensidad maxima, el area del maximo o la relacion de la senal por el ruido entre cada molecula de interes y los compuestos de control.
La aplicacion de la etapa de analisis de la distribucion de la molecula de interes de acuerdo con la invencion se ilustra mas adelante, en terminos generales, basandose en el uso de la EM sobre un corte de tejido que comprende el tejido destinatario y un tejido no destinatario adyacente que rodea dicho tejido. Se estudian las caractensticas espectrales, sobre todo la intensidad maxima de las tres moleculas de interes (M1, M2 y M3), asf como de un compuesto de control positivo (M+) y de un compuesto de control negativo (M-).
a) Analisis de la distribucion de la molecula de interes en el tejido destinatario
En la figura 1 se muestran de manera esquematica las intensidades obtenidas con la toma de imagenes por espectrometna de masas del tejido destinatario, para las tres moleculas de interes (M1, M2 y M3), y las moleculas de control M+ y M-. Estas intensidades reflejan su distribucion en el tejido.
A partir de los datos espectrales visualizados directamente en los cortes de tejido, se puede confirmar la presencia o la ausencia de cada molecula de interes dentro del tejido destinatario. Ademas, comparando las caractensticas
espectrales de las moleculas de interes y de los compuestos de control, es facil confirmar si esta distribucion es
significativa o no.
Para simplificar los resultados, las diferentes areas de tejido se definen como dos cuadrados concentricos, en donde el tejido destinatario corresponde al cuadrado del centro (segunda columna de imagenes en la figura 1). Los valores indicados en los cuadrados pequenos sobre la imagen corresponden a los valores de intensidad normalizados de cada molecula. La media de estos valores normalizados se calcula para cada molecula, para el tejido destinatario (firma espectral global de la region T1) y para el tejido adyacente (firma espectral global de la region T-T1).
Para evaluar la eficacia de la accion de la molecula de interes sobre el tejido destinatario, su accion se pondera al tener en cuenta su presencia o ausencia en el corte del tejido que no es destinatario, a saber, el tejido adyacente denominado T. Para esto, se unen la intensidad media de la molecula de interes dentro y fuera del tejido destinatario con la intensidad media de los compuestos de control positivo y negativo en los mismos tejidos.
Tal y como se ilustra en la figura 1, la molecula M2 pone de relieve una intensidad alta en todo el tejido (tejido
destinatario y tejido no destinatario) y es globalmente inespedfica del tejido destinatario T1. Por el contrario, la
molecula M1 muestra una intensidad elevada unicamente en el tejido destinatario T1 y casi no se detecta en el tejido
5
10
15
20
25
30
35
adyacente T. Su distribucion es mas bien como la de la molecula M+.
Asi pues, se puede evaluar un primer factor F1 representativo de la especificidad de la distribucion de la molecula de interes en el tejido destinatario con el uso, como valor de referencia, de la intensidad normalizada de los maximos en los espectros de masas de cada molecula de interes, dentro y fuera del tejido destinatario, que se comparan con la intensidad normalizada de los maximos de los compuestos de control positivo y negativo dentro y fuera del tejido destinatario. Para simplificar el calculo, el factor F1 del compuesto de control positivo se considera que es el 100% y el factor F1 del compuesto de control negativo es el 0%.
En la tabla 2 que viene a continuacion recogen los resultados de la intensidad obtenidos para cada molecula.
Tabla 2: Resumen de los valores de intensidad media por molecula y area del tejido
- Intensidad media
- T1 T-T1 F1 (%)
- M+
- 6,51 0,3 100%
- M-
- 1,03 3,66 0%
- M1
- 5,97 0,53 90%
- M2
- 6,29 3,28 61%
- M3
- 0,90 2,46 22%
El factor F1 permite clasificar las moleculas de interes segun su especificidad por el tejido destinatario.
Basandose unicamente en este factor, ya se pueden ordenar las moleculas de interes segun la especificidad por el tejido destinatario. Asi pues, en el presente caso, la molecula M3, con menos del 25% de eficacia espectral, se puede eliminar de las moleculas candidatas para un tratamiento que tiene por destino el tejido T1.
b) Analisis de la parte de la molecula de interes en el tejido destinatario
De acuerdo con la invencion, tambien se puede evaluar la proporcion de la molecula de interes que alcanza el tejido destinatario con respecto a la dosis administrada y compararla con el compuesto de control positivo.
Mas espedficamente, tal y como se ilustra en la figura 2, el metodo de la invencion permite evaluar las similitudes y disimilitudes de la distribucion de la molecula de interes en comparacion con el compuesto de control positivo en el tejido destinatario.
Se tienen en cuenta las similitudes espaciales de la distribucion de las moleculas para evaluar la accion espedfica de cada una sobre el tejido destinatario. Por ejemplo, a partir del mapa de intensidades obtenido para cada molecula (columnas 1 y 2 en la figura 2), la desviacion estandar, o la varianza, del valor de la molecula de interes se calcula en comparacion con el valor del compuesto de control positivo para cada posicion (a saber, para cada cuadrado que tiene una posicion xiyj).
La desviacion estandar se puede calcular segun la ecuacion matematica que viene a continuacion:
OMi: Desviacion estandar de la molecula de interes Mi en comparacion con el marcador positivo M+.
Xmi: Valor de la intensidad de la molecula de interes Mi en las coordenadas (xi, yj).
Xm+: Valor de la intensidad del compuesto de control positivo M+ en las coordenadas (xi, yj).
(Xm): Intensidad media de la molecula de interes y del compuesto de control positivo en las coordenadas (xi, yj).
A partir de estos valores de desviacion estandar, el metodo de la invencion permite calcular un segundo factor F2 que pone de relieve la relacion de penetracion de la molecula de interes en el tejido destinatario. El factor F2 corresponde al porcentaje de similitud entre la distribucion de la molecula de interes y el compuesto de control positivo (F2 = 100%). Hablando en terminos generales, el factor F2 del compuesto de control negativo es el 0%. Al comparar la desviacion estandar de la molecula de interes con el compuesto de control positivo (y finalmente del compuesto de control negativo), se puede evaluar el coeficiente de F2 para dicha molecula de interes.
En la figura 2 se describen estos valores del factor F2 obtenidos para cada molecula de interes M1, M2 y M3. Mas
11
5
10
15
20
25
30
35
en concreto, este experimento permite ver que la molecula M1 muestra un porcentaje de recuperacion elevado con el compuesto de control positivo M+. En cuanto a la molecula M2, incluso aunque la M2 se detecte en el area del tejido destinatario, no muestra una distribucion parecida a la del compuesto de control positivo M+. Y la distribucion de M3 es parecida a la del compuesto de control negativo. Su porcentaje de recuperacion con M+ es casi cero.
c) Calculo del coeficiente de selectividad de una molecula de interes por un tejido dado
De acuerdo con la invencion, se puede calcular un coeficiente de selectividad de una molecula de interes dada por un tejido destinatario dado. Este coeficiente de selectividad refleja la especificidad de dicha molecula por dicho tejido, asf como su distribucion espacial (o relacion de penetracion) en dicho tejido.
Por ejemplo, el coeficiente de selectividad corresponde a la media de los valores obtenidos para los factores F1 y F2 para dicha molecula en dicho tejido.
El coeficiente de selectividad (o porcentaje de selectividad) para cada una de las moleculas de interes M1, M2 y M3 se describe en la tabla 3 que viene a continuacion. Asf pues, se pueden ordenar jerarquicamente las moleculas de interes segun su accion mas o menos eficaz y mas o menos espedfica de dicho tejido.
Tabla 3: Resumen de los coeficientes de selectividad de las moleculas de interes y de los compuestos de control por el tejido destinatario T1
- F1 (%) F2 (%) % de selectividad
- M+
- 100% 100% 100%
- M-
- 0% 0% 0%
- M1
- 90% 75% 83%
- M2
- 61% 48% 54%
- M3
- 22% 0% 11%
En el presente caso, la molecula M1 es el mejor candidato para el tejido destinatario T1 ya que tiene una accion mas selectiva y espedfica que la molecula M2. La molecula M3, tal y como se valoro anteriormente, no es una buena candidata para el tejido T1.
Ejemplos
El metodo de la invencion se describira a continuacion con mas detalle mediante el uso de ejemplos espedficos y las figuras presentadas mas arriba. Estos ejemplos se dan solo con el proposito de ilustrar y de ninguna manera pretenden restringir el alcance de la invencion. Por supuesto, de una manera casi identica, se puede utilizar un dispositivo de toma de imagenes diferente al MALDI, tal como, por ejemplo, las siguientes fuentes: SIMS, DESI, DIOS, ICP, microscopio con MALDI, SNOM, SMALDI, LA-ICP, EsI (extraccion lfquida en el tejido), MILDI, JEDI, ELDI, etc.
Ejemplo 1: Evaluacion de la fijacion de la olanzapina en regiones histologicas del rinon
En el ejemplo 1, el metodo de la invencion se utiliza para evaluar la distribucion de la olanzapina en el rinon de raton y para estudiar su accion selectiva sobre una region espedfica del rinon.
Material y metodos
Acido hidroxicinamico (CHCA) de Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, Francia).
Acido trifluoroacetico (TFA) de Sigma Aldrich.
Acetonitrilo/DMSO/Agua de Sigma Aldrich.
Olanzapina de Lilly Research Laboratories (Eli Lilly y Co, Indianapolis, IN).
Compuesto de control positivo: posaconazol de Sigma Aldrich.
Compuesto de control negativo: metsuximida de Sigma Aldrich.
Delimitacion del tejido destinatario
El tejido destinatario, de aqrn en adelante «tejido 1», comprende la medula y Tambien se considera el tejido adyacente que no es destinatario, de aqrn
los calices renales.
en adelante «tejido 2», y comprende la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
region de la corteza renal.
Molecula de interes y seleccion de los compuestos de control positivo y negativo
La olanzapina es un farmaco que se utiliza en el tratamiento de determinadas formas de esquizofrenia y trastorno bipolar. Es uno de los antipsicoticos utilizados mas habitualmente. Pertenece a la clase de las tienobenzodiazepinas. La olanzapina ya se sabe que es una molecula que actua selectivamente sobre el cerebro. Los estudios farmacocineticos han demostrado que la olanzapina se absorbfa rapidamente en el organismo y que se acumulaba sobre todo en el tngado, en el bazo o en el rinon. Ademas, la distribucion de la olanzapina es muy espedfica de algunas clases de tejido dentro del mismo organo y permite, por ejemplo para el rinon, una diferenciacion prominente de la corteza y de la region de la medula. En este ejemplo, los inventores han estudiado las propiedades de selectividad por tejido que tiene la olanzapina dentro del rinon.
Dos compuestos de control positivo y negativo se seleccionan por sus propiedades para actuar selectivamente sobre los tejidos 1 y 2, respectivamente.
El posaconazol, que se sabe que se fija espedficamente al tejido 1 y no al tejido 2, se elige como el compuesto de control positivo.
La metsuximida, que se sabe que se fija espedficamente al tejido 2 y no al tejido 1, se elige como el compuesto de control negativo.
Preparacion del animal
Se utilizaron ratones de tipo silvestre de la cepa Swiss de Charles River que pesan de 25 a 40 g. La olanzapina y los compuestos positivo y negativo captados en una solucion de NaCl al 0,9% se administraron por via oral a una concentracion de 8 mg/kg. Se sacrifico el raton por asfixia con CO2. A continuacion, se retiraron los rinones y se sumergieron en una solucion de isopentano al 100% enfriada con nitrogeno lfquido para que la congelacion fuera rapida. Finalmente, los rinones se conservaron a -80 °C.
Preparacion de las muestras para la toma de imagenes por espectrometna de masas
El rinon se corto en capas con un grosor de 10 pm (cortes sagitales) en un Microm HM560 (Thermo Scientific, Francia) enfriado a -21 °C. A continuacion, los cortes se depositaron en placas conductivas de ITO (oxido de estano e indio) (Delta Technology, EE. UU.). Finalmente, los cortes se mantuvieron en la camara del criostato 30 min para el criosecado y luego se colocaron en un desecador durante 30 minutos.
Se utilizo una matriz de CHCA para el analisis de todos los cortes de los tejidos de rinon. Esta matriz se preparo a una concentracion de 10 mg/ml en acetonitrilo/agua + TFA al 0,1% (6:1, v/v). La solucion de la matriz se deposito mediante el sistema de pulverizacion SunCollect (SunChrom, Alemania) siguiendo el protocolo optimizado.
Adquisicion de imagenes por MALDI
Las imagenes se obtuvieron en un espectrometro de masas en MALDI-TOF AutoFlex Speed (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) equipado con un laser Smartbeam II. Los datos se generaron en un modo de reflectron positivo. Se obtuvieron 500 espectros para cada deposito con una frecuencia de laser de 1000 Hz y una resolucion espacial de imagenes de 200 * 200 pm2 en un intervalo de masas de 100 a 1000 Da. Se utilizo el programa informatico FlexImaging version 4.0 para reconstruir las imagenes y el programa informatico Quantinetix 1.6 (ImaBiotech, Loos, Francia) permite la extraccion de la intensidad espectral de los iones que corresponden a cada molecula estudiada.
Localizacion de la molecula de interes y de los compuestos de control
Primero, es necesario realizar experimentos de toma de imagenes por espectrometna de masas para localizar los iones de interes dentro de los tejidos (figura 3).
Se consiguieron imagenes de todo el rinon. La resolucion espacial utilizada fue de 200 pm, lo que permite distinguir con facilidad las subestructuras renales.
En la figura 3 se muestra un corte de tejido de rinon que pone de relieve sus diferentes areas histologicas (figura 3A). Se han tomado cortes del centro del rinon.
A partir de esto, se puede observar con fidelidad el tejido destinatario. En especial, la figura 3B muestra la distribucion solapante de los compuestos de control positivo y negativo, asf como de la molecula de interes, la olanzapina. Se ve con claridad la distincion entre el tejido 1 (area central del corte de tejido) y el tejido 2 (area periferica del corte de tejido), tal y como se presenta en el esquema de la figura 3C.
Estos resultados permiten evaluar la eficacia de los compuestos de control positivo y negativo por la region histologica destinataria. Tambien es importante poner de relieve la molecula de interes dentro del tejido, lo cual es el caso en el presente caso.
5
10
15
20
25
30
35
40
En la figura 4 se muestran tres espectros de masas que corresponden a las areas histologicas de interes, el tejido 1 para el compuesto de control positivo (m/z 204, figura 4C), el tejido 2 para el compuesto de control negativo (m/z 725, figura 4B) y un area con la olanzapina muy concentrada (m/z 313, figura 4A).
Resultados
Calculo del factor F1
Para calcular el F1 que esta relacionado con la especificidad de la distribucion espacial de la molecula de interes dentro del tejido destinatario, primero hay que extraer la intensidad de todas las moleculas de interes y de los compuestos de control desde la imagen por espectrometna de masas (imagen de EM).
La figura 5 permite visualizar por separado la distribucion con respecto a los compuestos de control positivo y negativo, asf como la olanzapina.
La representacion policromada ofrece informacion relacionada con la intensidad relativa de los iones de interes. El valor maximo de cada escala es diferente y corresponde al valor mas alto de intensidad de cada ion independiente en la imagen de EM.
Cada region histologica de interes esta delimitada en las imagenes moleculares y se ilustra en la figura 4 y en la 5 con lmeas discontinuas. El programa informatico de tratamiento datos de imagenes, Quantinetix, se utiliza para extraer la intensidad relativa de cada ion de interes y compuesto de control para cada posicion (o voxel) en cada region extrafda.
Las imagenes de EM de la figura 5 ilustran:
- La distribucion del compuesto de control positivo (M+) a nivel del tejido destinatario 1 (imagen molecular a la izquierda);
- La distribucion del compuesto de control negativo (M-) a nivel del tejido destinatario 2 (imagen molecular a la derecha);
- La distribucion de la olanzapina a nivel del tejido destinatario T1 y del tejido no destinatario T2 (imagen molecular central).
La siguiente etapa es normalizar el conjunto de datos totales para compararlos. La intensidad mas alta con respecto a cada ion se utiliza para normalizar la intensidad por posicion. Se calcula la intensidad media normalizada para cada ion y tipo de tejido.
Por definicion, se considera que el factor F1 del compuesto de control positivo es igual al 100%, mientras que el factor F1 del compuesto de control negativo es igual al 0%.
Los resultados obtenidos para la olanzapina se describen a continuacion en la tabla 4.
Tabla 4: Resumen de la intensidad media y del valor del factor F1 por molecula y area de tejido.
- Intensidad normalizada media por tejido
- T1 T2 Fi (%)
- M+
- 0,281 0,055 100%
- M-
- 0,062 0,241 0%
- Me
- 0,161 0,117 52,2%
T1: tejido destinatario; T2: tejido no destinatario; Mc: olanzapina; M+: posaconazol; M-: metsuximida.
El factor F1 de la olanzapina refleja la eficacia promedio de la molecula escogida desde el punto de vista espectral y de la intensidad en los tejidos estudiados T1 y T2. Un valor de F1 del 50% describe un equilibrio global de la concentracion relativa de la olanzapina en ambos tejidos en comparacion con los compuestos positivo y negativo.
Calculo del factor F2
La segunda etapa de la evaluacion de la accion selectiva sobre tejidos tiene en cuenta el aspecto espacial de la distribucion de la olanzapina en el rinon y lo compara con los compuestos de control.
El factor F2 permite comparar la distribucion espacial de los compuestos de control con la molecula de interes, lo que proporciona informacion sobre sus similitudes o disimilitudes a nivel del tejido destinatario.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Para visualizar estas propiedades en las imagenes de EM, en la figura 6 se muestra el solapamiento de la distribucion de la olanzapina y de los compuestos de control. Esto permite comparar la distribucion de la olanzapina en el tejido destinatario (T1) con el tejido adyacente no destinatario (T2).
El calculo del factor F2 se realiza con los valores de intensidad normalizados de la evaluacion del factor F1 anterior. Posicion por posicion, se valora la desviacion estandar del valor de intensidad de la molecula de interes y del control negativo con la del control positivo a nivel del tejido destinatario (T1). A continuacion, se les calcula a la olanzapina y al compuesto de control negativo el valor medio de la desviacion estandar.
Por definicion, el factor F2 del compuesto de control positivo se considera igual al 100% mientras que el factor F2 del compuesto de control negativo es igual al 0%.
Tabla 5: Resumen de los valores de los factores F1 y F2 y del coeficiente de selectividad global (%Select) de cada molecula por el tejido destinatario.
- T1
- F1 (%) F2 (%) %Select
- M+
- 100% 100% 100%
- M-
- 0% 0% 0%
- Me
- 52,2% 27% 40%
T1: tejido destinatario; Mc: olanzapina; M+: posaconazol; M-: metsuximida
El factor F2 para la olanzapina se evalua al 27%, lo que refleja disimilitud con la distribucion del control positivo en el tejido destinatario. Esto se pone de relieve sobre todo en la figura 6, donde la distribucion de la olanzapina esta localizada principalmente en la mitad derecha del corte de la medula renal (imagen central en la figura 6), mientras que el compuesto de control positivo esta distribuido de forma homogenea en el tejido 1 (imagen derecha en la figura 6).
Resumen
La olanzapina muestra una afinidad media por la region de la medula renal. Los resultados obtenidos con el metodo permiten concluir que la olanzapina tiene un comportamiento medio de selectividad por una clase de tejido en el rinon en vez de otro, y se fija preferiblemente a una area limitada a la region de la medula renal.
Ejemplo 2: Calculo de la adsorcion
En la figura 7 se explica la metodologfa de la adsorcion de una molecula en un tejido mediante el uso del ejemplo del proceso de ocupacion del receptor. De este modo, se puede medir la eficacia que tiene el farmaco (agonista) por la ocupacion del receptor cuando se le administra al animal en comparacion con una molecula antagonista. En este ejemplo se describen todas las etapas de la metodologfa, el analisis solo del tejido que recibe la dosis, la etapa de lavado con la solucion del antagonista del tejido de control y la combinacion del analisis de dosificado/lavado en la muestra administrada. No se requiere ningun marcador negativo para esta clase de experimento.
En este ejemplo se evalua la fijacion competitiva de dos compuestos de tipo benzodiazepina, el diazepam (el agonista) y el lorazepam (el antagonista) que actuan selectivamente sobre el mismo receptor del cerebro (GABA). Esta bien establecido que el lorazepam tiene una mayor afinidad por este receptor. Esta es la razon por la que el bien conocido lorazepam se utiliza para estudiar la afinidad y la eficacia que tiene el diazepam para fijarse a los receptores en el cerebro. La distribucion del agonista (diazepam) y el antagonista (lorazepam) en un cerebro de una rata se estudia mediante la toma de imagenes por espectrometna de masas de tipo MALDI. Por supuesto, de una manera casi identica se puede utilizar un dispositivo de toma de imagenes diferente al MALDI, tal como, por ejemplo, las fuentes siguientes: SIMS, DESI, DIOS, iCp, microscopio de MALDI, SNOM, SMALDI, LA-ICP, ESI (extraccion de lfquido en el tejido), MILDI, JEDI, ELDI, etc.
Material y metodos
Material
- Acido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia).
- Acido trifluoroacetico (TFA) (Sigma-Aldrich).
- Metanol (Sigma-Aldrich).
- Diazepam (LGC Standard).
- Lorazepam (LGC Standard).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Animales
Se utilizaron ratas de tipo silvestre que pesaban de 35 a 40 g. El diazepam captado en la solucion de NaCI al 0,9% se inyecto por v^a intravenosa a una concentracion de 15 mg/kg. Los animales (ratas con dosis y de control) se sacrificaron por asfixia con CO2. A continuacion, se les retiro el cerebro y se sumergieron en una solucion de isopentano al 100% enfriada por nitrogeno Kquido para la congelacion rapida. Finalmente, los cerebros se conservaron a -80 °C.
Preparacion de muestras para la espectrometna de masas
El cerebro (tejidos de control y con dosis) se corto en capas con un grosor de 10 pm (corte frontal) mediante el uso de un Microm HM560 (Thermo Scientific, Francia) enfriado a -20 °C. Los cortes se depositaron luego en placas de portaobjetos conductivos con ITO (oxido de estano e indio) (Delta Technology, EE. uU.). Finalmente, los cortes se mantuvieron en la camara del criostato durante 15 minutos para el criosecado y luego se colocaron en una desecadora durante 20 minutos.
Etapa de lavado/incubacion con la solucion de antagonista
La solucion de antagonista se preparo a partir de una solucion concentrada de lorazepam a 1 mg/ml en metanol (100%). La concentracion final de la solucion del lavado se ajusto a 100 pmol/pl en metanol/agua + TFA al 0,1% (7:3). La concentracion del antagonista es un factor crucial para la ocupacion del receptor, lo que mejora la capacidad de fijacion de la molecula. Se depositaron 20 pl de la solucion en un punto del corte del tejido (una muestra con dosis y una de control) y a continuacion se incubaron durante 1 hora a 37 °C en una caja dentro de la incubadora Incu-line (VWR, Francia). Tambien se coloco en la incubadora un corte de cerebro dosificado sin lavar.
Despues de la incubacion, los tejidos se lavaron en 2 etapas para retirar la molecula sin fijar del tejido, primero con una solucion de metanol/agua + TFA al 0,1% (7:3) que corresponde a la solucion de lavado del antagonista. Segundo, el tejido se lava tan solo con la solucion de agua (10 ml) y a continuacion se coloca en una desecadora durante 15 min.
Preparacion para la adquisicion de imagenes tomadas por MALDI
Se utilizo una matriz de DHB para el analisis de todos los cortes de tejido encefalico con o sin el lavado con la solucion de lorazepam. Esta matriz se preparo a una concentracion de 40 mg/ml en metanol/agua + TFA al 0,1% (1:1, v/v). La solucion de la matriz se deposito con el sistema de pulverizacion SunCollect (SunChrome, Alemania).
Adquisicion de imagenes por MALDI
Las imagenes se obtuvieron con un espectrometro de masas de MALDI-TOF AutoFlex Speed (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) equipado con un laser Smartbeam. Los datos se generaron en el modo de reflectrones positivos. Se obtuvieron 700 espectros de cada deposito puntual con una frecuencia de laser de 1000 Hz y una resolucion espacial de imagenes de 150 * 150 pm2 en un intervalo de masas de 0 a 1000 Da. Se utilizo el programa informatico FlexImaging version 4.0 para reconstruir las imagenes.
Resultados
En la figura 8 se muestran las imagenes obtenidas mediante MSI en las diferentes condiciones y siguiendo la metodologfa de evaluacion de la adsorcion.
El cerebro que recibio la dosis del agonista sin lavado pone de relieve una localizacion espedfica del diazepam (m/z 285) a nivel de la sustancia blanca del cerebro. La segunda etapa que implica el lavado de un corte de tejido de control con la solucion de lorazepam permite observar el ion relacionado con el lorazepam (m/z 321) en el corte de cerebro, sobre todo en la sustancia blanca. Obviamente, no se observo ninguna deteccion del lorazepam ni del diazepam en el corte del cerebro con dosis y sin lavado, ni en el corte del cerebro de control con la etapa de lavado, respectivamente. Estos resultados ofrecen cierta informacion sobre los sitios de fijacion del receptor de las dos especies de benzodiazepam, a saber, la sustancia blanca. Finalmente, el ultimo experimento combina el tejido que recibe las dosis de diazepam con la etapa de lavado del lorazepam. Esta imagen se utiliza ademas para calcular la eficacia y la afinidad del diazepam de acuerdo con la respuesta del lorazepam.
En resumen, el experimento da a conocer:
- La distribucion de la molecula escogida (Mc), el diazepam
- La distribucion del marcador positivo (M+), el lorazepam
- El area destinataria (T1), la sustancia blanca (sitio de fijacion del receptor) y el area no destinataria (T2), el resto del cerebro.
Factor F1; factor de intensidad
5
10
15
20
25
Para calcular el factor 1 que esta relacionado con los parametros espectrales de la molecula escogida a nivel del tejido destinatario, se necesita primero extraer la intensidad de los iones de diazepam y de lorazepam en el area espedfica del cerebro.
A continuacion, se aplica la metodologfa para calcular el F1 en el conjunto de datos.
Tabla 6: Resumen de los valores medios de la intensidad y el factor F1 correspondiente por molecula y tejido
- Intensidad media normalizada/tejido
- T1 T2 Fi (%)
- M+
- 0,821 0,21 100%
- Mc
- 0,692 0,117 85,1%
T1: area destinataria; T2: area no destinataria; Mc: diazepam; M+: lorazepam.
Factor F2; factor espacial
La segunda etapa de la valoracion de la afinidad del diazepam tiene en cuenta su distribucion espacial a nivel del area destinataria frente a la localizacion del marcador positivo. El factor F2 permite comparar la localizacion precisa del agonista y del antagonista en la region de la sustancia blanca y ofrece informacion sobre su similitud o disimilitud.
Tabla 7: Resumen de los valores de F1 y F2 y el correspondiente coeficiente de selectividad (%Select) para el diazepam en el area destinataria (receptor)
- T1
- F1 (%) F2 (%) %Select
- M+
- 100% 100% 100%
- Mc
- 85,1% 72,5% 78,8%
T1: Area destinataria; Mc: diazepam; M+: lorazepam.
El factor F2 es igual al 72,5%, lo que se traduce en una alta similitud de la distribucion del diazepam y del lorazepam en el area destinataria (sitio del receptor). El lorazepam esta muy localizado en la sustancia blanca del cerebro, asf como su antagonista, el lorazepam.
Conclusion
En conclusion, los dos factores se pueden combinar para estimar el factor de selectividad global del agonista tal y como se presenta en la tabla 7. El diazepam muestra una gran afinidad por el sitio del receptor de benzodiazepina con respecto al marcador positivo estudiado. La selectividad del diazepam es muy eficaz por la region de la sustancia blanca del cerebro.
Claims (14)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario, que comprende la visualizacion y la comparacion mediante la toma de imagenes moleculares por espectrometna de masas de la distribucion de la molecula candidata y de al menos un compuesto control en la superficie de al menos un corte de tejido destinatario anteriormente obtenido por muestreo en al menos un animal que ha recibido con anterioridad la molecula candidata, y optativamente el compuesto de control.
- 2. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el animal es un mairnfero no humano.
- 3. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde al animal se le ha administrado con anterioridad un compuesto de control positivo y un compuesto de control negativo.
- 4. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al animal se le han coadministrado con anterioridad la molecula candidata y el compuesto de control.
- 5. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al animal se le ha administrado con anterioridad una misma concentracion del compuesto de control y de la molecula candidata.
- 6. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molecula candidata y optativamente el compuesto de control han sido administrados al animal con anterioridad por via enteral o parenteral.
- 7. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de visualizacion de la distribucion de la molecula candidata y del compuesto de control se consigue con el uso de imagenes por MALDI.
- 8. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las senales relacionadas con los espectros de masas de la molecula candidata y/o del compuesto de control se normalizan para tener en cuenta un coeficiente de extincion del tejido (CET) y/o un efecto de la matriz biologica.
- 9. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la especificidad de la molecula candidata por el tejido destinatario se valora al comparar la distribucion de dicha molecula candidata en el tejido destinatario con la distribucion de dicha molecula candidata en al menos un tejido que no es el destinatario.
- 10. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una relacion de penetracion de la molecula candidata por el tejido destinatario se evalua al comparar la distribucion de dicha molecula candidata dentro del tejido destinatario con la distribucion del compuesto control dentro de dicho tejido destinatario.
- 11. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que ademas comprende una etapa de evaluacion de la cinetica de la molecula candidata que compara la distribucion de dicha molecula candidata en al meno dos cortes del tejido destinatario anteriormente obtenido mediante el muestreo en diferentes tiempos (t1) y (t2) de animales a los que se ha administrado con anterioridad la molecula candidata.
- 12. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molecula candidata es una molecula terapeutica o fitosanitaria en potencia o uno de sus metabolitos o una molecula diagnostica en potencia.
- 13. Metodo para evaluar ex vivo o in vitro si una molecula candidata se fija o se incorpora en al menos un tejido destinatario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho animal o tejido destinatario o corte de tejido se trato con anterioridad para modificar su capacidad para fijar y/o incorporar la molecula candidata en el interior del tejido destinatario.
- 14. Un medio de datos legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por ordenador idoneas para permitir que un sistema informatico ejecute la comparacion de la distribucion de la molecula candidata con un compuesto control del metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP13305211 | 2013-02-25 | ||
| EP13305211 | 2013-02-25 | ||
| PCT/EP2014/053654 WO2014128309A1 (en) | 2013-02-25 | 2014-02-25 | Method to evaluate the tissue targeting of a molecule of interest |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2693037T3 true ES2693037T3 (es) | 2018-12-07 |
Family
ID=47998360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14706597.3T Active ES2693037T3 (es) | 2013-02-25 | 2014-02-25 | Método para evaluar la acción selectiva de una molécula de interés por un tejido |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9645138B2 (es) |
| EP (1) | EP2959294B1 (es) |
| JP (1) | JP6389479B2 (es) |
| CA (1) | CA2899994C (es) |
| DK (1) | DK2959294T3 (es) |
| ES (1) | ES2693037T3 (es) |
| WO (1) | WO2014128309A1 (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2976076B1 (fr) | 2011-05-31 | 2015-02-27 | Imabiotech | Procede de detection et de quantification d'une molecule cible dans un tissu |
| WO2016196312A1 (en) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Purdue Research Foundation | Methods for analyzing a tissue sample |
| JP2017040520A (ja) * | 2015-08-19 | 2017-02-23 | 株式会社島津製作所 | 分析データ表示処理装置及び表示処理プログラム |
| CN108431601B (zh) * | 2015-11-20 | 2021-04-27 | 特里特福尔莱弗公司 | 组织样本中药物结合分析的方法 |
| US10597118B2 (en) | 2016-09-12 | 2020-03-24 | Kai Concepts, LLC | Watercraft device with hydrofoil and electric propeller system |
| JPWO2018143357A1 (ja) * | 2017-02-01 | 2019-11-21 | 国立大学法人浜松医科大学 | 標的物質と親和性の高い物質をスクリーニングする方法 |
| CN110044997B (zh) * | 2018-01-15 | 2023-08-04 | 中国医学科学院药物研究所 | 一种体内药物的离子强度虚拟校正和定量质谱成像分析方法 |
| JP7116937B2 (ja) * | 2018-03-06 | 2022-08-12 | 株式会社Section-Lab | イメージング質量分析に好適な試料作製法及び導電性粘着フィルム |
| JP7193114B2 (ja) * | 2018-08-29 | 2022-12-20 | 学校法人同志社 | 胆汁酸サイクルの観察方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5059415A (en) * | 1989-02-21 | 1991-10-22 | The State Of Oregon Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon Health | Method for diagnostically imaging lesions in the brain inside a blood-brain barrier |
| US6689607B2 (en) * | 1997-10-21 | 2004-02-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2 |
| JP4547173B2 (ja) | 2004-03-17 | 2010-09-22 | シスメックス株式会社 | 糖尿病診療支援システム |
| EP1891426B1 (en) | 2005-06-07 | 2011-10-12 | Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs- | Use of ionic matrices for maldi mass spectrometry analysis of tissue sections |
| EP2163900A1 (en) | 2008-09-04 | 2010-03-17 | Commissariat A L'energie Atomique | New method of imaging by mass spectrometry and new mass tag associated trityl derivatives |
| WO2011073740A1 (en) | 2009-12-15 | 2011-06-23 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Matrices for mass spectrometry imaging |
| CN108744262A (zh) | 2010-11-23 | 2018-11-06 | 普莱萨格生命科学公司 | 用于实体递送的治疗方法和组合物 |
| FR2973112B1 (fr) | 2011-03-21 | 2018-05-25 | Imabiotech | Procede de detection et de quantification d'une molecule cible dans un echantillon |
| FR2976076B1 (fr) | 2011-05-31 | 2015-02-27 | Imabiotech | Procede de detection et de quantification d'une molecule cible dans un tissu |
| EP2767832A1 (en) | 2013-02-18 | 2014-08-20 | Imabiotech | Photo or chemolabile conjugates for molecules detection |
-
2014
- 2014-02-25 US US14/769,550 patent/US9645138B2/en active Active
- 2014-02-25 EP EP14706597.3A patent/EP2959294B1/en active Active
- 2014-02-25 ES ES14706597.3T patent/ES2693037T3/es active Active
- 2014-02-25 JP JP2015558493A patent/JP6389479B2/ja active Active
- 2014-02-25 DK DK14706597.3T patent/DK2959294T3/en active
- 2014-02-25 WO PCT/EP2014/053654 patent/WO2014128309A1/en active Application Filing
- 2014-02-25 CA CA2899994A patent/CA2899994C/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2899994A1 (en) | 2014-08-28 |
| WO2014128309A1 (en) | 2014-08-28 |
| EP2959294B1 (en) | 2018-08-08 |
| DK2959294T3 (en) | 2018-11-19 |
| US9645138B2 (en) | 2017-05-09 |
| JP2016511402A (ja) | 2016-04-14 |
| CA2899994C (en) | 2022-08-30 |
| EP2959294A1 (en) | 2015-12-30 |
| US20150377862A1 (en) | 2015-12-31 |
| JP6389479B2 (ja) | 2018-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2693037T3 (es) | Método para evaluar la acción selectiva de una molécula de interés por un tejido | |
| Bodzon‐Kulakowska et al. | Imaging mass spectrometry: instrumentation, applications, and combination with other visualization techniques | |
| Nilsson et al. | Mass spectrometry imaging in drug development | |
| Castellino et al. | MALDI imaging mass spectrometry: bridging biology and chemistry in drug development | |
| Zhang et al. | Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging | |
| Swales et al. | Quantitation of endogenous metabolites in mouse tumors using mass-spectrometry imaging | |
| ES2745648T3 (es) | Método para detectar y cuantificar una molécula diana en una muestra | |
| Hansen et al. | Aspects of quantitation in mass spectrometry imaging investigated on cryo-sections of spiked tissue homogenates | |
| Anderson et al. | High spatial resolution imaging mass spectrometry of human optic nerve lipids and proteins | |
| Carter et al. | Inflation-fixation method for lipidomic mapping of lung biopsies by matrix assisted laser desorption/ionization–mass spectrometry imaging | |
| Vallianatou et al. | A mass spectrometry imaging approach for investigating how drug-drug interactions influence drug blood-brain barrier permeability | |
| He et al. | MALDI-MSI analysis of cancer drugs: Significance, advances, and applications | |
| Zecchi et al. | Impact of drug administration route on drug delivery and distribution into the lung: an imaging mass spectrometry approach | |
| Rossini et al. | Better to keep in touch: investigating inter‐organelle cross‐talk | |
| Ferguson et al. | Mass spectrometry-based tissue imaging of small molecules | |
| Ajith et al. | Chemical analysis of the human brain by imaging mass spectrometry | |
| Ferguson et al. | Mass spectrometry-based tissue imaging of small molecules | |
| Jacobsen et al. | Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging of Cimbi-36, a 5-HT 2A Receptor Agonist, with Direct Comparison to Autoradiography and Positron Emission Tomography | |
| Chen et al. | Advances in mass spectrometry imaging for toxicological analysis and safety evaluation of pharmaceuticals | |
| Patel et al. | MALDI-MS imaging for the study of tissue pharmacodynamics and toxicodynamics | |
| Irie et al. | Analysis of spatiotemporal metabolomic dynamics for sensitively monitoring biological alterations in cisplatin-induced acute kidney injury | |
| Grey | MALDI imaging of the eye: Mapping lipid, protein and metabolite distributions in aging and ocular disease | |
| Chughtai et al. | Mass spectrometric imaging of red fluorescent protein in breast tumor xenografts | |
| ES2781374T3 (es) | Método para el análisis de la unión de fármacos en una muestra de tejido | |
| Goodwin et al. | Mass spectrometry imaging of pharmacological compounds in tissue sections |