CN110044997B - 一种体内药物的离子强度虚拟校正和定量质谱成像分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种药物离子强度的虚拟校正和定量质谱成像分析方法，可用于探究药物分子在生物体内不同空间位置的准确含量。该发明开发的方法无需同位素标记药物作为内标，利用每一个质谱图像采集像素点的内源性代谢物离子作为“天然内标”，建立了“内源性代谢物离子‑药物相对基体效应”多元回归预测模型，实现了生物组织特异性基体效应的虚拟校正，并通过标准参考样本构建的一条标准曲线完成整个生物组织样本内任意区域药物含量的定量计算。为快速获取候选药物在机体内的吸收、分布、代谢、排泄信息及潜在毒副作用预测等提供了一种直观、可视化的定量成像方法。

Description

一种体内药物的离子强度虚拟校正和定量质谱成像分析方法
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种体内药物离子强度的虚拟校正和定量质谱成像分析方法，可以应用于探究药物分子在生物组织不同空间位置的准确含量。
技术背景
质谱成像(Mass Spectrometry Imaging,MSI)是一种将解吸离子化技术与质谱检测分析相结合的新型分子影像技术。通过对待测样本表面(多为生物组织)进行逐行/点的解吸离子化与质谱数据采集，将不同质荷比离子的强度值按空间位置依次重构出二维数据阵并以图像形式展示。它无需放射性同位素、荧光或免疫标记，不仅可以直接获得生物样本内药物及其代谢产物的空间分布信息，还可以提供复杂生物基质中内源性代谢物分子组成信息。因此在探究体内药物分布、药效与毒副作用及分子机制等药物研发领域具有重要的应用价值。
目前的质谱成像技术，通常是将待测目标分子(药物及其代谢产物、内源性代谢物等)在不同空间位置的离子强度，以一定色阶范围的颜色强度来进行可视化，进而定性地表征目标分子在样品中的空间分布信息。然而，由于目标分子的化学结构、分子量、溶解度等理化性质不同，其离子化程度具有很大的差异。因此不同类型的目标分子在生物组织内的含量高低，无法用离子强度来进行客观比较。其次，在利用质谱成像技术进行药物的组织分布研究时，相比于离子强度，获取药物在靶器官或非靶器官组织特定部位的含量信息，能够为预测其药效或者毒副作用提供更为直接的依据。因此，建立定量质谱成像分析方法(Quantitative Mass Spectrometry Imaging,QMSI)，成为质谱成像分析领域的研究热点之一。
建立药物离子强度(原始强度或经校正强度)与其在生物组织内含量(常以pmol/mm2,pmol/pixel,μg/g,ng/mg等单位表征)之间的转换关系，是定量质谱成像分析方法拟解决的关键核心问题。药物的含量在一定的范围内与其离子强度之间会保持理想的线性关系。然而，在利用质谱成像技术对实际生物组织内的药物分布进行分析时，药物的离子强度，除了取决于其在生物组织中的含量外，还与其所处的组织微环境密切相关。生物组织样品具有明显的异质性特点，例如肾(具有肾皮质、髓质、肾盂等亚结构)、脑(具有皮质、髓质、黑质-纹状体、海马回路、延髓等亚结构)、肿瘤组织(新生区、坏死区、乏氧区等)以及整体动物样本(具有心、脑、肝、肺、肾、脾、胃、肠道、皮肤、肌肉等不同器官组织)。不同器官之间由于在内源性分子组成、组织拓扑结构、组织密度等方面具有显著差异，同一目标分子在不同区域中的解吸与离子化程度并不相同，这种现象称为组织特异性基体效应，组织特异性基体效应的存在是导致药物含量与离子强度之间线性范围较窄或偏离线性关系的重要原因。因此在建立定量质谱成像分析方法过程中，采用合适的校正方法，去补偿组织特异性的离子化抑制程度差异，是保证定量准确性的一个至关重要的步骤。
目前，针对组织特异性基体效应的校正，主要有内标校正、换算因子校正、总离子流强度校正等。合适内标的选取，对于待测药物的强度校正至关重要，理想的内标应该具有与待测药物相同或相近的离子化效率，因此，稳定同位素标记的药物分子是最常用的校正内标。然而，对处于临床前药物发现阶段的大量候选化合物，由于其结构新颖，往往缺乏市售的同位素标记化合物作为校正内标。若采用经验常数校正，则需要通过构建多条不同器官组织相应的标准曲线，来获得候选药物在每一种器官组织中的“含量-离子强度”量化换算因子，该过程费时费力，且对于整体动物体内一些未建立相应标准曲线的组织区域，则无法实现校正与准确定量。
因此，本发明拟建立一种基于模拟生物组织和内源性代谢物离子的药物离子强度虚拟校正和定量质谱成像分析方法，可以无需同位素标记药物内标的添加，且无需建立多条不同类型组织的定量标准曲线，即可实现生物组织内任意区域的药物离子强度校正与定量，且通过组织特异性内源性离子特征，实现每一个像素点所属区域类型的准确判定，以替代传统的光学图像辅助区域判断与选定，提高了定量质谱成像分析的自动化程度，生物组织内药物离子强度的虚拟校正与定量质谱成像分析方法整体流程如图1所示。
发明内容
本发明要解决三方面的技术问题：(1)建立药物的量与离子强度之间的定量换算关系；(2)实现生物组织不同区域间相对基体效应的虚拟校正补偿；(3)实现生物组织内同质区域的自动识别和药物离子区域归属。为解决上述技术问题，本发明提供技术方案步骤如下：
相对基体效应：是指不同类型生物组织之间由于组织结构、组织密度、内源性分子组成差异造成的离子化抑制相对高低水平。
校正因子：即用来表征和补偿这种组织特异性离子化抑制差异的系数。
虚拟校正：是指校正因子并非质谱采集原始数据中所存在的，而是从原始数据中提取内源性代谢物离子强度信息，并经过数学模型计算给出的预测值。
同质区域：包括整体动物组织样本中属于同一类型的区域，或某一器官内的亚结构区域，或某一组织内的微区域。
步骤(1)含药物生物组织标准样本的制备
本步骤包括两部分样本的制备：(i)用于建立相对基体效应预测模型的一系列相同药物掺入量的不同器官组织标准样本，器官可选取整体动物体内心、肝、肾、脑、脾、肺；(ii)用于建立定量标准曲线的一系列不同药物掺入量的模拟生物组织标准样本，可选取均质性程度相对较高的肝脏组织作为参比组织。
本步骤的操作如下：将不同浓度的药物与一定浓度的细胞悬液、生物组织匀浆充分混合，注入具有一定规则外形的赋形模具中，通过触发高分子材料的聚合反应，将构成生物组织的上述组成模块重新塑造成具有一定机械强度和弹韧性的三维模拟生物组织块，再使用冰冻切片机将该三维模拟生物组织块切制成一定厚度的模拟生物组织标准样本。
步骤(2)质谱成像数据采集与前处理
采用真空或常压敞开式离子源例如空气动力辅助离子化(AFAI)、解吸电喷雾离子化(DESI)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)、二次离子质谱(SIMS)，对步骤(1)制备不同器官标准样本进行解吸离子化，经过靶向选择离子检测(t-SIM)、多反应监测(MRM)、全扫描(Full MS)、靶向离子检测/全扫描交替采集(t-SIM/Full MS)等方法收集质谱采集数据。
生物样本采集到的质谱成像数据结构，是一个由采集行、采集列、不同质荷比所组成的三维数据体。首先，对三维数据体进行降维，转变成由像素点-质荷比信息组成的二维数据阵，并对每一个像素点所在采集行、列索引进行编码，以进行图像重构，选择药物离子和相对丰度大于1％的内源性代谢物离子进行离子图像数据提取，并将各离子通道下的模拟器官区域像素点进行数据提取与降维，形成“生物组织像素点-内源性代谢物离子”二维数据阵，作为输入样本训练集；以各生物组织区域像素点内的药物离子强度值形成的一维数据，作为输出目标向量，整个数据降维和训练集数据结构如图2和图3所示。
将输入样本训练集和输出目标向量进行归一化、标准化等数据前处理，以消除数量级和系统波动的影响。
步骤(3)相对基体效应预测模型建立
该项为实现生物组织任意区域相对基体效应预测的核心，主要分为模型的建立与验证两个步骤：
(i)相对基体效应回归模型的建立。
在建立多个自变量(Xi,i＝1,2,3…)与一个因变量(Y)之间的回归模型时，多元线性回归、偏最小二乘回归、主成分回归、人工神经网络、支持向量回归、Lasso回归和岭回归为主的弹性网络等方法，均可以作为选择对象。
内源性代谢离子的选择，对相对基体效应预测模型的建立至关重要。特征离子的选择主要基于以下几点原则：(A)高丰度，只有具有较强离子化响应的高丰度内源性代谢物离子，才能对药物的离子化抑制产生更为显著的影响；(B)宽覆盖，考虑到待测药物的分子量往往在m/z 100-1000不等，待选内源性代谢物离子应尽可能在m/z 100-1000范围内均匀分布；(C)特异性，内源性特征离子的选择，应挑选能反映器官特异性或组织微区特异性分子组成的离子；(D)相关性：应从大量内源性代谢物离子当中，挑选与药物在多器官模拟组织中离子化响应变化趋势尽可能一致的离子。(E)多重共线性检查：在利用多个内源性代谢物离子作为自变量建立回归模型时，变量之间的多重共线性问题，是导致回归模型拟合失真的重要原因，为此，可以通过计算各个变量的方差膨胀因子(variance inflationfactor,VIF)的方式进行变量筛选，当某变量的VIF值大于10时，表明该变量的共线性严重，应予以剔除。
(ii)相对基体效应回归模型的验证。在建立内源性代谢物离子与药物离子相对基体效应之间的回归模型过程中，为保证建立的回归模型对组内数据具有良好的拟合能力，并对组外数据具有理想的预测能力，将(ii)项构建的二维数据矩阵按照一定的比例随机划分为训练集、验证集和测试集，以最小化均方误差(Mean Square Error,MSE)为训练目标，通过采交叉验证的方法来评价回归模型的稳健性。最后将建模后得到的各像素点内药物相对基体效应预测值进行图像重构，圈定各模拟组织样本区域，求得各模拟器官的平均相对基体效应值，与(i)项中实验测得的实际值进行比对，以验证模型拟合结果的正确性。
步骤(4)药物离子的定量标准曲线建立
按照(1)项所述方法，制备一系列不同药物含量的模拟肝组织标准样本，从模拟肝组织样本的质谱成像采集数据中提取步骤(2)中(ii)项所选特征离子的相对强度值，并代入到步骤(2)中(iii)项建立的相对基体效应回归模型中，以得到每一个模拟肝组织样本的相对基体效应预测值；以模拟肝组织内药物的平均离子强度I(counts/pixel)除以该样本的相对基体效应平均值f，作为药物离子强度校正值I’，以该药物离子强度校正值I’对药物的平均分布密度值C(pmol/pixel)进行线性拟合，建立参比组织内药物的定量标准曲线I’＝aC+b。步骤(5)实际生物样本各像素点的相对基体效应预测
将实际生物组织样本进行AFAI-MSI非靶向数据采集，将每个像素点采集到的内源性代谢物离子信息为输入变量，代入到步骤(2)建立的预测模型中，计算各像素点的药物相对基体效应预测值(f)，即组织特异性相对基体效应的校正因子。
步骤(6)实际生物样本内药物离子强度的虚拟校正
以实际生物样本每个像素点内的药物离子原始强度值I除以步骤(5)得到的各点相对基体效应值即校正因子值f，得到药物离子的校正强度值(I’＝I/f)。步骤(7)实际生物样本内药物的量的计算
将步骤(6)得到的生物组织内所有像素点的药物离子校正强度值代入到步骤(4)建立的定量标准曲线中，计算相应像素点中药物的含量。
步骤(8)实际生物组织同质区域的自动识别
整个二维数据矩阵通过特征提取和模式识别方法，根据内源性代谢物综合特征差异完成聚类分析和同质区域划分，实现对每个质谱成像数据采集点的同质区域归属的判定。
步骤(9)实际生物组织同质区域内药物的量的计算
将由步骤(7)得到的像素点内药物的含量信息，按照步骤(8)得到的聚类和同质区域划分结果进行药物离子区域归属与统计分析(求和或计算平均值)，得到药物在某一类型区域内的总量。
有益技术效果：
本发明建立的生物组织内药物的离子强度虚拟校正和定量质谱成像分析方法，可以获得如下有益的技术效果：(1)无需同位素标记药物作为内标，即可完成组织特异性基体效应的校正，对于结构新颖、缺乏同位素标记对照品供应的候选药物，可以满足临床前研究对于定量分析的基本要求；(2)仅通过一条标准曲线即可完成整体动物体内多器官区域的药物准确定量，避免了多个不同器官组织相应标准曲线的建立，极大地缩短了样本制备与分析周期；(3)通过内源性代谢物离子为特征的无监督模式识别，实现了对每个样本采集点的区域自动识别，替代了光学图像指导下的区域识别与手工圈定，使不同器官区域的选取更加准确可靠，减少了因人工识别与圈定造成对定量分析造成的误差；(4)保证了同一实验室不同时期、不同实验室及质谱成像仪器平台间检测结果的可重现性，并可以实现多个候选新药之间的横向比较；(5)可以直观、准确地反映药物在不同生理组织区域中的含量差异，获取与药效、毒副作用关联更密切的药物含量信息。
附图说明
图1.整体动物体内药物的定量质谱成像分析策略
图2.质谱成像采集数据的降维和前处理流程示意图
(A)质谱成像采集的原始数据结构，每个二维平面代表一行质谱采集文件，每行质谱采集文件包含多张采集质谱图；
(B)按照药物和内源性代谢物离子进行图像重构后的质谱成像三维数据体，每个二维平面代表一张离子图像；
(C)对质谱数据三维体进行降维后的像素点-内源性离子二维数据阵；
(D)每行经过归一化处理后的像素点-内源性离子二维数据阵；
(E)每一列经过归一化处理后的像素点-内源性离子二维数据阵；
(F)从内源性代谢物离子中选取出若干列作为输入特征，并剔除掉非生物组织区域冗余像素点后的精简二维数据阵；
图3.用于建立“内源性代谢物离子-相对基体效应”回归模型的输入/输出数据集结构
图4.药物相对基体效应的神经网络预测模型训练结果
图5.基于分子轮廓特征的整体动物体内生理区域自动归属
(A)整体动物样本全部采集像素点按照无监督模式识别结果进行图像重构验证结果；
(B)整体动物样本全部采集像素点在综合特征空间中的聚类结果；
(C)整体动物样本全部像素点的同质区域归属结果
图6.整体动物体内药物定量分析结果
(A)用于构建定量标准曲线的模拟肝组织样本内药物离子图像([LXY6006+Na]+m/z 725.33)；
(B)用于建立相对基体效应预测模型用的多器官生物组织标准样本内的药物离子图像([LXY6006+Na]+m/z 725.33)；
(C)实际生物组织样本的相对基体效应(校正因子)的预测图像；
(D)整体动物体内同质区域的无监督模式识别与区域划分图；
(E)整体动物体内药物的定量计算及可视化分析结果；
(F)定量标准曲线；
(G)主要器官的相对基体效应预测结果；
(H)整体动物体内各器官内的药物的量的定量计算结果。
具体实施方式
本发明以整体动物体内抗肿瘤候选药物LXY6006的定量质谱成像分析为实施例，定量分析的总体流程如图1所示，将具体实现步骤做详细说明，但本实施例不以任何方式限定本发明。
1.整体动物样本的制备
选取一只荷瘤Balb/C裸鼠，尾静脉注射给予LXY6006/HP-β-CD包合物制剂，给药剂量6.0mg/kg，并于给药后30min时，置于乙醚环境中麻醉处死，Leica CM3600大型冰冻切片机制备厚度为25μm的整体动物冰冻切片，供AFAI-MSI分析。
2.模拟组织样本的制备
2.1空白生物组织的制备：称取适量的新鲜的器官/组织，按照每0.5g/1.0mL～1.0g/1.0mL的料液比，加入一定浓度的低熔点琼脂糖透明溶液(40℃)，进行组织匀浆操作，制成生物组织料液，待用。将预先制备好的某器官组织来源的细胞悬液、生物组织料液按照1:1体积比充分混合后，快速注入赋形模具(长×宽×高,2.0mm×5.0mm×20mm)中，并置于-20℃低温环境下，利用低温环境触发水凝胶聚合塑形，脱模后，即可形成均质化的3D生物组织模型。临用时将该组织模型采用Leica CM1860型切片机切制成与实际组织相同厚度的模拟组织切片。
2.2含药生物组织的制备：分别向低熔点琼脂糖溶液中加入不同浓度的LXY6006标准溶液(SD1-SD5)，按照“2.1空白生物组织的制备”方法，构建一系列不同药物量的模拟肝组织样本，并分别切制成的厚度20μm的模拟组织切片(药物的量：0.71、1.78、3.56、7.12、14.24pmol/mm2)，进行AFAI-MSI数据采集，以作为建立定量质谱成像标准曲线的标准参照样本。另外按照“2.1空白生物组织的制备”方法，分别制备相同药物含量的心、肝、肾、肺、脾、脑六个模拟生物组织切片(药物的量：3.56pmol/mm2)，以作为建立相对基体效应预测模型的多器官标准参照样本。
3.质谱成像数据采集与处理
采用AFAI-Q-Orbitrap质谱成像系统进行数据采集与成像分析，喷针电压与传输管电压分别设置为7.5kV和3.0kV。喷雾溶剂为：异丙醇-乙腈-水(4:4:2,v/v/v)，喷雾溶剂流速10μL/min。全扫描/靶向选择离子监测(Full MS/t-SIM)交替采集方法，分别对内源性代谢物离子(m/z 100-1000)和药物离子([M+Na]+,m/z725.3302)进行数据采集，全扫描采集通道的AGC参数设定为3E6，最大注入时间100ms，靶向选择离子监测的AGC参数设定为3E6，最大注入时间200ms。电动平移台以0.3mm/sec的横向移动速度进行采集，行间距0.3mm/sec。
采用MassMatrix MS Data file conversion格式转换器，将QExactive型质谱采集的系列*.raw格式文件转换为*.mzXML格式文件，并导入MATLAB进行批量读取与保存，按照表1列出的质荷比离子依次进行图像重构。
表1.从模拟生物组织和实际生物组织样本中挑选的特征内源性代谢物离子和药物离子
*The drug’s ion[LXY6006+Na]+m/z 725.32
将各离子通道下的模拟器官区域像素点进行数据提取与降维，形成模拟组织样本像素点-内源性代谢物离子二维数据阵(图2)，作为输入样本训练集；以各样本区域像素点内的药物离子强度值形成的一维数据，作为输出目标向量，整个基于模拟组织样本的训练集数据结构如图3所示。
4.相对基体效应校正模型的建立与验证
在MATLAB软件的神经网络工具箱中，采用Leverberg-Marquardt算法，通过9次迭代快速得到了内源性代谢物离子-药物相对基体效应的回归拟合模型，将多器官模拟组织样本点构建的二维数据矩阵按比例(7.0:1.5:1.5)随机划分为训练集、验证集、测试集，以进行模型构建、组内及组外验证，结果如图4所示，无论训练集、验证集，还是测试集，采用人工神经网络模型对药物相对基体效应系数的预测值与实际值之间均具有较高的一致性(r>0.90)，表明该方法构建的相对基体效应回归模型稳健。
5.定量标准曲线的建立
重构目标离子的质谱图像，圈定各模拟生物组织样本的感兴趣区域(ROI1～ROI5)；计算各模拟生物组织区域内目标离子的平均离子强度对相应区域内已知的目标分子的物质的量(pmol/pixel)进行回归拟合，建立定量质谱成像标准曲线。
6.整体动物体内药物离子强度的校正与定量可视化
将整体动物样本经过AFAI-MSI采集到的质谱数据，按照“3.质谱成像数据采集与处理”所述，对内源性特征离子和药物离子进行数据提取，并根据整体动物样本内各像素点的内源性代谢物离子强度信息，代入“4.相对基体效应校正模型的建立与验证”建立的回归模型中，计算各空间部位的药物相对基体效应预测值(fr)。以各像素点内的药物离子原始强度I除以各部位的相对基体效应值fr，得到校正后的离子强度(I’＝I/fr)，将该校正强度值代入参比组织内药物的定量标准曲线，得到各像素点内药物的含量信息(pmol/pixel)。
7.基于特征内源性代谢物离子的空间区域识别
在MATLAB环境下，利用t分布邻域嵌入(t-SNE)开源工具箱(链接网址：http://lvdmaaten.github.io/tsne/)，完成对每一个整体动物形成的二维数据矩阵进行非线性降维和综合特征提取。
将整体动物样本的整个二维数据矩阵通过t-SNE方法，提取到3个综合化学特征(t-SNE1～t-SNE3)，并在3个综合化学特征构建的三维特征空间内，通过K均聚类的无监督模式识别方法，完成心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤、肠道等器官组织区域像素群的归属指认，(结果如见图5)
8.定量分析结果
通过建立的内源性代谢物离子-药物相对基体效应回归模型，对实际整体动物样本采集到的质谱数据逐像素点地进行相对校正因子预测、药物离子原始强度校正与定量、生理区域识别与药物含量统计计算，最终LXY6006在整体动物体内分布的定量质谱成像检测结果见图6。

Claims (15)

1.一种体内药物的离子强度虚拟校正和定量质谱成像分析方法，主要包括以下步骤：
(i)含药生物组织标准样本的制备：将药物、游离细胞、生物组织匀浆置于赋形模具中，通过高分子材料重新聚合成模拟生物组织，并制备冰冻切片，用于模拟药物在实际组织中的存在状态和解吸离子化环境的标准样本；
(ii)质谱成像数据的采集与数据处理：采用真空或常压敞开式离子源对生物组织样本进行解吸离子化和质谱数据采集，将获得的质谱数据进行药物离子和内源性代谢物离子的图像重构，并将上述图像数据整理为“生物组织像素点-药物及内源性代谢物离子”二维数据阵，对该二维数据进行数据前处理以消除数量级和系统波动的影响；
(iii)相对基体效应预测模型建立：按照步骤(i)项所述制备相同药物掺入量的多个器官组织标准样本，并进行步骤(ii)项所述质谱成像数据采集与数据处理，通过机器学习方法，建立起内源性代谢物离子和组织特异性相对基体效应之间的多元回归模型，用于预测生物组织任意检测区域的相对基体效应值，即校正因子；
(iv)药物离子的定量标准曲线建立：按照步骤(i)项所述制备一系列不同浓度药物掺入的肝组织标准样本，进行步骤(ii)项所述的质谱成像数据采集，以步骤(iii)项建立的相对基体效应预测模型对每份肝组织的平均校正因子进行预测和计算，并以该校正因子对肝组织内药物离子强度做校正，将校正后药物离子的平均强度做回归曲线拟合，建立药物的量与离子强度校正值之间的换算关系；
(v)实际生物样本各像素点的相对基体效应预测：对实际生物样本按照步骤(ii)项所述方法进行质谱成像数据采集和数据处理后，将每个像素点采集到的内源性代谢物离子相对强度为输入变量，代入到步骤(iii)项所述的生物组织相对基体效应预测模型中，对该像素点的相对基体效应值进行预测；
(vi)实际生物样本内药物离子强度的虚拟校正：求算实际生物样本每个像素点内药物的离子强度值与步骤(v)项所述该像素点的定量校正因子间的比值，作为该像素点内的药物离子强度校正值；
(vii)实际生物样本内药物的量的计算：将步骤(vi)项所述的药物离子强度校正值，代入到步骤(iv)项所述的定量标准曲线中，计算该像素点中药物的含量；
(viii)实际生物组织同质区域的自动识别：对实际生物样本每个像素点采集到的内源性离子进行综合特征提取，并通过无监督模式识别方法，对实际生物样本的全部像素点进行聚类分析和组织同质区域划分；
(ix)实际生物组织同质区域内药物的量的计算：将步骤(vii)项所述的生物样本各像素点药物的含量计算值，按照步骤(viii)项所述聚类和同质区域划分结果进行归属与求和计算，得到药物在某一组织同质区域内的总量；
所述相对基体效应，是指不同类型生物组织之间由于组织结构、组织密度、内源性分子组成差异造成的离子化抑制相对高低水平；
所述校正因子，即用来表征和补偿这种组织特异性离子化抑制差异的系数；
所述的虚拟校正是指校正因子并非质谱采集原始数据中所存在的，而是从原始数据中提取内源性代谢物离子强度信息，并经过数学模型计算给出的预测值；
所述的同质区域，包括整体动物组织样本中属于同一类型的区域，或某一器官内的亚结构区域，或某一组织内的微区域。
2.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(i)所述的含药物生物组织标准样本的制备，所述的生物组织包括临床前试验动物来源的实质脏器或空腔脏器、异体移植实体瘤组织、整体动物全器官切片；所述实质脏器包括心、脑、肾、肝、脾、肺、胸腺，所述空腔脏器包括食管、胃、小肠、大肠。
3.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(i)所述的含药物生物组织标准样本的制备，所述药物包括化学合成小分子及其体内代谢产物。
4.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(i)所述的含药物生物组织标准样本的制备，所述高分子材料包括低熔点琼脂糖，对包括生物组织、游离细胞起到支撑、缓冲、连结、固定作用。
5.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(ii)所述的质谱成像数据的采集与数据处理，所述真空或常压敞开式离子源，包括空气动力辅助离子化、解吸电喷雾离子化、基质辅助激光解吸离子化、二次离子质谱。
6.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(ii)所述的质谱成像数据的采集与数据前处理，所述质谱数据采集，用于采集药物离子和内源性代谢物离子的信息，包括靶向选择离子检测、多反应监测、全扫描采集、靶向选择离子检测与全扫描交替采集。
7.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(ii)所述的质谱成像数据的采集与数据前处理，所述数据前处理，包括归一化、标准化。
8.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(iii)所述的相对基体效应预测模型建立，所述预测模型是利用质谱采集到各像素点中的内源性代谢物离子信息作为“天然内标组”，通过机器学习的方法，建立起的“内源性代谢物离子-相对基体效应”多元回归模型，该回归模型可以用来预测生物组织内任意区域像素点内药物的相对基体效应，即所述校正因子。
9.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(iii)所述的生物组织相对基体效应预测模型建立，所述机器学习包括多元线性回归、主成分回归、偏最小二乘回归、岭回归、Lasso回归、人工神经网络、支撑向量机回归。
10.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(iv)所述的药物离子的定量标准曲线建立，所述药物的量，是指单位物理尺寸中药物的物质的量或质量、或感兴趣区域内药物的物质的量或质量，或上述组织区域内药物的含量。
11.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(vi)所述实际生物样本内药物离子强度的虚拟校正，所述的虚拟校正是指校正因子并非质谱采集原始数据中所存在的，而是从原始数据中提取内源性代谢物离子强度信息，并经过数学模型计算给出的预测值；所述定量是指将质谱成像分析采集到的药物离子强度通过校正与换算，得到生物组织任意检测区域内药物的量。
12.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，所述的同一类型的区域包括心、肝、肾、脾、脑、肺、肠道、胃、皮肤、生殖腺、胸腺、食管、器官；所述的某一器官内的亚结构区域包括脑或肾的皮质和髓质区域；所述的某一组织内的微区域包括肿瘤组织的新生区域或坏死区域。
13.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(viii)所述的实际生物组织同质区域的自动识别，所述自动识别，是指生物样本内不同类型区域的识别，不需要借助于光学图像的辅助和认为判定，即可完成每一个像素点所属区域的自动划分。
14.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(viii)所述的实际生物组织同质区域的自动识别，所述综合特征提取，是指从内源性代谢物离子中通过线性或非线性组合，生成可以反映原始代谢物轮廓差异的新变量的过程，包括t-分布邻域嵌入。
15.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在步骤(viii)所述的实际生物组织同质区域的自动识别，所述无监督模式识别，包括K均聚类分析。
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