CN111208229B - 蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的筛选方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选蛋鸡低骨密度血清代谢标志物的方法，以及从老年笼养蛋鸡中筛选得到的一组用于联合诊断低骨密度的血清代谢标志物，所述标志物包括与骨密度正相关的七种代谢物和与骨密度负相关的一种代谢物。本发明可通过检测蛋鸡血清或血浆中这八种代谢标志物联合预测笼养蛋鸡低骨密度的风险，进而实现笼养蛋鸡骨质疏松症的有效预防，在蛋鸡养殖行业提高经济效益及动物福利方面具有重要意义。

Description

蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的筛选方法及其应用

技术领域

本发明属于生物检测和诊断领域，具体涉及一种蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的筛选方法，本发明还涉及一组用于蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物及其检测方法。

背景技术

笼养蛋鸡骨质疏松症是一种在高产笼养蛋鸡群常见的骨代谢疾病，表现为骨骼脆性增加、骨骼强度和骨密度的下降。笼养蛋鸡骨质疏松症对蛋种鸡的影响更大，蛋种鸡平均人工授精1次/5-6天，每次抓取种鸡双腿进行人工授精，极易造成蛋种鸡骨折彻底丧失种用性能。此外，蛋鸡发生骨质疏松时不仅容易发生骨折，产蛋中后期的蛋壳品质也会显著下降引起破蛋率大大增加，还会造成产蛋率下降和死淘率增加，对蛋鸡养殖产业造成巨大的经济损失。

许多手段已经被应用到笼养蛋鸡骨质疏松症防控方面，例如营养调控、加强运动和药物治疗等，但是这些手段尚未取得令人满意的效果。由于笼养蛋鸡骨质疏松症的发病之前无明显特征变化，且发病后难以恢复至正常水平。如果能更早期观测到发病的迹象，通过早干预、早预防等手段完全可以避免或延缓笼养蛋鸡骨质疏松症发生和发展，这对于蛋鸡养殖行业提高经济效益及动物福利方面具有重要的意义。

作为一种快速出现的“组学”工具，代谢组学旨在定性和定量测量组织，细胞或生物体液中的小内源性代谢物，并作为诊断工具检测代谢状态的变化。代谢组学可以获取整体代谢谱并找到差异代谢物及相关代谢途径，然后进一步揭示该疾病的病理过程。代谢组学已广泛应用于代谢性疾病研究，是一种用于生物标志物鉴定和定量的可行而强大的工具。

发明内容

本发明的目的在于提供蛋鸡低骨密度联合诊断的血清代谢标志物，通过检测标志物的水平，可以预测蛋鸡低骨密度的风险，从而为笼养蛋鸡骨质疏松症的早期诊断和预防提供一种新的手段。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种筛选蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，收集正常和低骨密度蛋鸡的血清或血浆样本；

步骤2，采用液相色谱-质谱联用代谢组学方法对采集的样本进行分析，得到各样本的原始质谱数据；

步骤3，使用代谢组学处理软件对原始质谱数据进行预处理，得到包含质荷比、保留时间和质谱峰强度/峰面积等代谢物信息的二维矩阵，用于下一步统计分析；

步骤4，将步骤3中得到的二维矩阵依次进行主成分分析和正交-偏最小二乘法判别分析，得到多维统计分析OPLS-DA模型；

步骤5，在多维统计分析OPLS-DA模型中应用不同的筛选标准，比如变量投影重要度大于1.0及单维统计分析的P值小于0.05，得到初步差异代谢物；

步骤6，在步骤5得到的初步差异代谢物的基础上，结合初步差异代谢物的一级质谱信息、准分子离子信息、加合峰信息和同位素分布，计算差异代谢物的分子量和分子式，考察代谢物的二级质谱信息，与数据库上的比对确定其结构，部分代谢物进一步采用标准品进行确认；

步骤7，对步骤6中确定的差异代谢物进行与蛋鸡骨密度的相关性分析，选取P值小于0.05的差异代谢物进行下一步分析；

步骤8，对步骤7中P值小于0.05的差异代谢物进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，选取曲线下面积大于0.80的作为候选血清代谢标志物。

另一方面，本发明提供了一组用于蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物，所述代谢标志物包括与骨密度正相关的七种代谢物，即牛磺酸(Taurine)、尿苷(Uridine)、棕榈酸(Palmitic acid)、肾上腺酸(Adrenic Acid)、非索非那定(Fexofenadine)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC(18:1))、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE(20:3/0:0))，以及与骨密度负相关的一种代谢物，即3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(3-Acetyl-11-keto-beta-boswellic acid)。

第三方面，本发明还提供了一种非诊断目的检测蛋鸡血清或血浆中八种代谢标志物的方法，所述八种代谢标志物包括与骨密度正相关的七种代谢物，即牛磺酸(Taurine)、尿苷(Uridine)、棕榈酸(Palmitic acid)、肾上腺酸(Adrenic Acid)、非索非那定(Fexofenadine)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC(18:1))、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE(20:3/0:0))，以及与骨密度负相关的一种代谢物，即3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(3-Acetyl-11-keto-beta-boswellic acid)，所述检测方法包括将蛋鸡血清或血浆样本经提取后采用液相色谱-质谱联用进行分析的步骤。

优选地，所述液相色谱的固定相为UPLC BEH Amide色谱柱，流动相A为25mM乙酸铵及25mM氨水混合溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，进样体积为2μL，流速为500μL/min。

优选地，所述梯度洗脱程序如下：

优选地，所述质谱的条件为：轰击能量：30eV，15张二级谱图每50ms，ESI离子源参数设置如下：雾化气压：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：600℃，喷雾电压：5000V(正离子模式)或-4000V(负离子模式)。

本发明使用的术语“代谢标志物”或短的“标志物”被定义为蛋鸡体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。“代谢标志物”或“标志物”通常在本发明的上下文中同义使用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次同时公开了与蛋鸡低骨密度正相关和负相关的八种代谢标志物，同时利用这八种与骨密度正相关和负相关的标志物，可以联合预测蛋鸡患骨质疏松的风险，从而为笼养蛋鸡骨质疏松症的早期诊断和预防提供一种新的手段，这对于蛋鸡养殖行业提高经济效益及动物福利方面具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1中正常对照组与低骨密度组老年笼养蛋鸡的股骨骨密度和胫骨骨密度(n＝5，

)。

图2为正常对照组与低骨密度组老年笼养蛋鸡血清代谢谱PCA和OPLS-DA分类图，其中图A是正离子模式下的PCA图，图B是负离子模式下的PCA图，图C是正离子模式下的OPLS-DA图，图D是负离子模式下的OPLS-DA图。

图3为八种差异代谢物的相对定量，其中AKBA为3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸。

图4为八种差异代谢物的ROC分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域的常规方法。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域专业人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1筛选蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物

1、材料与试剂

表1仪器

表2试剂

2、试验方法

2.1样本的收集

通过双能X射线骨密度仪测定老年笼养蛋鸡股骨和胫骨骨密度(图1)，选取正常和低骨密度笼养蛋鸡各6只，空腹翼下静脉采血，3000r/min离心10min制备血清，-80℃保存。

2.2代谢物的提取

1)取100μL血清样本，加入400μL含有内标L-2-氯苯丙氨酸的提取液(甲醇乙腈体积比＝1:1,内标浓度2μg/ml)，涡旋混匀30秒；

2)超声5min(冰水浴)；

3)零下20℃静置一小时；

4)将样本4℃，12000rpm离心15min；

5)小心地取出425μL上清于EP管中；

6)在真空浓缩器中干燥提取物；

7)向干燥后的代谢物加入200μL提取液(乙腈水体积比：1:1)复溶；

8)涡旋30秒，冰水浴超声10分钟；

9)将样本4℃，12000rpm离心15min；

10)小心地取出75μL上清于2mL进样瓶，每个样本各取10μL混合成质控(QC)样本，再取75μL上机检测。

2.3液相色谱-质谱联用仪检测

1)液相条件：安捷伦1290超高效液相控制下按照表3中的流动相参数进行分析。所使用的色谱柱为购自Waters的UPLC BEH Amide色谱柱(1.7μm*2.1*100mm)。进样体积为2μL。

表3液相色谱梯度洗脱程序

2)质谱条件：AB 6600Triple TOF质谱仪能够在控制软件(Analyst TF 1.7,ABSciex)控制下基于IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。轰击能量：30eV，15张二级谱图每50ms。ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：600℃，喷雾电压：5000V(正离子模式)或-4000V(负离子模式)。

3、数据分析

3.1数据预处理

使用ProteoWizard将MS原始数据(.wiff)文件转换为mzXML格式，并通过R包XCMS(3.2版)进行处理。预处理结果生成了一个数据矩阵，该数据矩阵由保留时间(RT)，质荷比(m/z)值和峰强度组成。R软件包CAMERA用于XCMS数据处理后的峰注释并结合二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。

3.2主成分分析(PCA)

采用无监督的PCA来考察样本的总体分布情况，正离子和负离子模式下均能观察到正常对照组和低骨密度组笼养蛋鸡血清代谢谱有较明显的分离趋势(图2)。

3.3正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

然后采用有监督的OPLS-DA来区正常对照组和低骨密度组笼养蛋鸡间的代谢轮廓差异；如图3所示，正离子和负离子模式下，正常对照组和低骨密度组之间具有显著的代谢差异和组间分类趋势。

3.4差异代谢物的筛选

在OPLS-DA模型中，首先选取第一主成分的变量投影重要度(VIP)大于1.5的变量，然后进一步采用student's t检验，筛选有显著性差异(P＜0.05)的变量作为差异代谢物。

根据上述步骤在正离子模式下筛选出79个差异代谢物(表4)，在负离子模式下筛选出91个差异代谢物(表5)

表4正离子模式下正常对照组和低骨密度组老年笼养蛋鸡的血清差异代谢物

表5负离子模式下正常对照组和低骨密度组老年笼养蛋鸡的血清差异代谢物

3.5差异代谢物与骨密度相关性分析

将上述血清差异代谢物分别与老年笼养蛋鸡股骨和胫骨骨密度进行Spearman相关性分析(表6)。

表6血清差异代谢物与胫骨和股骨骨密度的相关性

根据上表筛选出八种同时与股骨和胫骨骨密度相关系数大于0.80的差异代谢物(表7)，其中牛磺酸(Taurine)、尿苷(Uridine)、棕榈酸(Palmitic acid)、肾上腺酸(Adrenic Acid)、非索非那定(Fexofenadine)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC(18:1))和溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE(20:3/0:0))7种差异代谢物与骨密度正相关，3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(3-Acetyl-11-keto-beta-boswellic acid)与骨密度负相关。图3列出了八种差异代谢物的相对含量差异。

表7同时与股骨和胫骨骨密度相关的八种差异代谢物

3.6ROC分析

图4为八种差异代谢物的ROC曲线，AUC值都大于0.80，可见其均具有较高的诊断准确性。可作为诊断老年笼养蛋鸡低骨密度的血清代谢标志物。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.一组用于蛋鸡低骨密度联合诊断血清代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为与骨密度正相关的七种代谢物，即牛磺酸Taurine、尿苷Uridine、棕榈酸Palmitic acid、肾上腺酸Adrenic Acid、非索非那定Fexofenadine、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(18:1)、溶血磷脂酰乙醇胺LysoPE(20:3/0:0)，以及与骨密度负相关的一种代谢物，即3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸3-Acetyl-11-keto-beta-boswellic acid。

2.一种非诊断目的检测蛋鸡血清或血浆中八种代谢标志物的方法，其特征在于：所述八种代谢标志物为与骨密度正相关的七种代谢物，即牛磺酸Taurine、尿苷Uridine、棕榈酸Palmitic acid、肾上腺酸Adrenic Acid、非索非那定Fexofenadine、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(18:1)、溶血磷脂酰乙醇胺LysoPE(20:3/0:0)，以及与骨密度负相关的一种代谢物，即3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸3-Acetyl-11-keto-beta-boswellic acid，所述方法包括将蛋鸡血清或血浆样本经提取后采用液相色谱-质谱联用进行分析的步骤，

所述液相色谱的固定相为UPLC BEH Amide色谱柱，流动相A为25mM乙酸铵及25mM氨水混合溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，进样体积为2μL，流速为500μL/min，所述梯度洗脱程序如下：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述质谱的条件为：轰击能量：30eV，15张二级谱图每50ms，ESI离子源参数设置如下：雾化气压：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：600℃，喷雾电压：5000V或-4000V。

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