CN114088855B - 一种肉鸡胫骨软骨发育不良早期诊断粪便生物标志物及其应用 - Google Patents

一种肉鸡胫骨软骨发育不良早期诊断粪便生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测与诊断技术领域，具体涉及一种肉鸡胫骨软骨发育不良早期诊断粪便生物标志物及其应用，本发明基于代谢组学方法筛选得到可以区分TD肉鸡与健康肉鸡的差异代谢物4‑羟基苯甲醛，可用于指示肉鸡早期TD，与现有的TD临床诊断方法相比较，本发明创新性选取粪便样本进行非侵入性生物标志物的临床检测，达到了无创，简便，无应激反应的目的；且样本容易采样，可以在无应激的条件下采集检测样本，避免肉鸡应激反应，能够简便，无侵入性的进行TD的临床诊断；对TD早期诊断敏感性高，能够检测出亚临床型发病肉鸡，有利于在发病早期进行干预和治疗。

Description

一种肉鸡胫骨软骨发育不良早期诊断粪便生物标志物及其 应用
技术领域
本发明属于生物检测与诊断技术领域，具体涉及一种肉鸡胫骨软骨发育不良早期诊断粪便生物标志物及其应用。
背景技术
胫骨软骨发育不良(TD)是一种常见的代谢性软骨疾病，多发于家禽，尤其是肉鸡和火鸡中最为多见。其特征是骨生长板发育异常，引起肉鸡胫骨畸形，导致行走跛行。据统计，全世界每年有125亿只禽类有腿部问题。研究表明TD对肉鸡和火鸡骨骼系统的影响分别高达30％和90％，家禽骨骼的生长发育异常会间接导致家禽业利润减少约10～40％，给家禽业带来极大的经济损失。
众所周知，代谢性和发育性疾病的早期诊断对治疗是至关重要的。在实际的肉鸡管理中，TD多为亚临床发病，症状不明显，尤其是在患病早期很难准确评估TD的患病率，从而进行干预和治疗。而在TD发病后期，病情普遍较为严重，给家禽带来不可逆的损伤，大都已经失去了治疗的价值。因此，若能在无症状或症状不明显的早期发现肉鸡TD，从而及时的进行针对性的预防和治疗，对家禽业的发展具有极大的经济意义。
目前，诊断肉鸡TD最有效的方法主要是基于侵入性的方法，即观察胫骨生长板的形态变化。此外，放射学方法也用于评估肉鸡TD，但这些检测方法对肉鸡亚临床TD的早期诊断都存在延迟的问题，且对养殖场来说复杂、耗时，没有实际经济价值。因此，开发出一项无创、低应激或无应激的肉鸡TD早期诊断方法具有重大的临床应用价值和社会经济意义。
近年来，应用代谢组学技术挖掘生物标志物，成为开发新临床检测方法的研究热点，有利于检测实现标准化，是识别潜在疾病相关代谢物的成熟策略。当前，多数生物标志物针对的检测对象主要为血液样本，鲜有粪便生物标记物的研究。胃肠道内的微生物组成反映了机体的生理和代谢特性。这些微生物与宿主共生，产生微生物代谢物，形成宿主-微生物代谢轴，在动物营养代谢和免疫稳态，包括疾病的发生和发展中发挥着重要的作用。与血液样本相比，粪便标本更容易获得，且不会引起肉鸡产生应激。因此，筛选诊断肉鸡TD的早期诊断粪便生物标记物，利用这些生物标志物，更有利于农户评估TD患病率，在TD发病早期进行临床诊断和治疗。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明创新性的选取肉鸡粪便样本进行代谢组学分析，筛选得到可用于指示肉鸡胫骨软骨发育不良早期诊断粪便生物标志物，即4-羟基苯甲醛，与血液样本相比，粪便标本更容易获得，且不会引起肉鸡产生应激。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种肉鸡胫骨软骨发育不良诊断粪便生物标志物，所述粪便生物标志物为粪便代谢物4-羟基苯甲醛。
优选地，所述粪便生物标志物可用于指示肉鸡早期胫骨软骨发育不良。
本发明以代谢组学为基础，通过高效液相色谱-质谱技术对家禽粪便进行代谢组学分析，共筛选出3种粪便代谢物，其中4-羟基苯甲醛对TD和正常肉鸡具有极高的特异性，优于血清骨标志物，可更加快速、精准有效的检测临床中TD疾病的发生，提醒养殖企业及时进行干预和治疗，降低经济损失。本发明创新性选取肉鸡粪便作为检测生物标志物的样本，可操作性强，在实际生产中能够在无侵入性，无应激反应的情况下进行肉鸡TD早期诊断粪便生物标记物的筛选和应用，操作简便。本发明对TD早期诊断敏感性高，能够检测出亚临床型发病肉鸡，有利于在发病早期进行干预和治疗，优于侵入性检测方法及放射学检测方法。
本发明还提供了上述的肉鸡胫骨软骨发育不良诊断粪便生物标志物在制备肉鸡胫骨软骨发育不良诊断产品中的应用。
优选地，所述产品的类型包括但不限于试剂盒、试剂、检测仪器。
本发明还提供了一种用于诊断肉鸡胫骨软骨发育不良的产品，所述产品以粪便代谢物4-羟基苯甲醛作为诊断标志物。
优选地，4-羟基苯甲醛的检测方法包括但不限于液相色谱质谱联用(LC-MS)，气相色谱质谱联用(GC-MS)，核磁共振(NMR)等方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明基于代谢组学方法筛选得到可以区分TD肉鸡与健康肉鸡的差异代谢物4-羟基苯甲醛，可作为TD肉鸡患病的诊断生物标记物，尤其以TD早期临床检测敏感度最高，可用于指示肉鸡早期TD，具有较高临床使用和推广价值。与现有的TD临床诊断方法相比较，具有如下优势：
(1)本发明以代谢组学为基础，创新性选取粪便样本进行非侵入性生物标志物的临床检测，达到了无创，简便，无应激反应的目的。
(2)本发明筛选出的生物标志物容易采样，可以在无应激的条件下采集检测样本，避免肉鸡应激反应，能够简便，无侵入性的进行TD的临床诊断。
(3)本发明对TD早期诊断敏感性高，能够检测出亚临床型发病肉鸡，有利于在发病早期进行干预和治疗，可以有效避免严重发病时对机体产生不可逆损伤，失去治疗价值的情况。
附图说明
图1为PCA分析和OPLS-DA分析；
图2为TD肉鸡粪便中差异代谢产物的研究；
图2中，A为粪便代谢物的火山图分析，用火山图中FC≧2或FC≦0.5和VIP≧1的标准筛选出差异显著的代谢物，有显著差异的代谢物以红色(向上)或蓝色(向下)点显示，而灰色点表示代谢物没有显著差异，差异代谢物的数量用饼状图显示。B为基于CON组和TD组鸡粪便中显著差异代谢物的潜在代谢途径分析。气泡的大小表示该途径富集的显著差异代谢物的数量，颜色梯度不同的点(从红色到蓝色)表示p值的范围，每个圆的大小越大，富集程度越高，p值越低，富集程度越显著。
图2A中，Insignificant：不显著，Down：下调，Up：上调；图2B中，Rich factor：富集系数，Statistics of KEGG Enrichment：KEGG富集的数据统计，Vitamin digestion andabsorption:维生素消化吸收,Vascular smooth muscle contraction:血管平滑肌收缩,Tropane,piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis:托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成核黄素代谢,Riboflavin metabolism:核黄素代谢,Purine metabolism:嘌呤代谢,Proximal tubule bicarbonate reclamation Phototransduction:近端小管碳酸氢根再生光转导,Pertussis:百日咳,Oxytocin signaling pathway:催产素信号通路,Olfactorytransduction:嗅觉传导,Longevity regulating pathway:长寿调节途径,Histidinemetabolism:组氨酸代谢,Glycerophospholipid metabolism:甘油磷脂代谢,Cholinemetabolism in cancer:癌症中的胆碱代谢,Chagas disease(Americantrypanosomiasis)cGMP:恰加斯病(美国锥虫病)cGMP,-PKG signaling pathway:-PKG信号通路,Biotin metabolism:生物素代谢,Arginine biosynthesis:精氨酸生物合成,Amoebiasis:阿米巴病,Aldosterone synthesis and secretion:醛固酮的合成和分泌。
图3为肉鸡粪便中差异代谢物的筛选结果；
图3中，A显示CON组与TD组粪便中差异代谢物的log2转化读计数(|log2(FC)|≥2.5,p<0.05,FC代表fold-change)。B代表CON组和TD组肉鸡粪便中差异代谢物的随机森林分析，从上到下的y轴显示了按重要性(Mean Decrease Accuracy)对类群分类进行排序的类群(Top 20)。C为采用维恩分析通过log2FC和随机森林模型筛选差异粪便代谢物，维恩图的重叠部分表示不同组间共有的粪便微生物群的数量。
图3A中，Urocanic Acid:尿苷酸，Hydroquinone:对苯二酚，2,6-Dihydroxypurine:2,6-二羟基嘌呤，Dodecanedioic Aicd:十二烷二酸，1,4-Dihydro-1-Methyl-4-Oxo-3-Pyridinecarboxamide:1,4-二氢-1-甲基-4-氧代-3-吡啶甲酰胺，2-Picolinic Acid:2-吡啶甲酸，NAcetylmannosamine:N-乙酰丙酮胺，3-IndolepropionicAcid:3-吲哚丙酸，Deoxyguanosine:脱氧鸟苷，3-(3-Hydroxyphenyl)Propionate Acid:3-(3-羟基苯基)丙酸，Nicotinic Acid:烟酸，N-AcetyI-D-Glucosamine:N-乙酰-D-葡萄糖胺，Deoxycytidine:脱氧胞苷，Methyl isobutyl ketone:甲基异丁基酮，N-CaffeoylPutrescine:N-咖啡酰腐胺，N-Acetylglucosamine 1-Phosphate:N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸，Hexylamine:己胺，Caffeic Acid:咖啡酸，L-phenylalanyl-L-proline:L-苯丙氨酸基-L-脯氨酸，N-Acetylhistamine:N-乙酰组胺，Dethiobiotin:去硫鸟嘌呤，1-Methylxanthine:1-甲基黄嘌呤，Tryptamine:色胺，L-Arginine:L-精氨酸，1,3-Dimethyluric Acid:1,3-二甲基尿酸，2-Aminoethanesulfonic Acid:2-氨基乙磺酸，7,8-dihydro-L-Biopterin:7,8-二氢-L-生物蝶呤，Nicotinic Acid Adenine Dinucleotide:烟酸腺嘌呤二核苷酸，2-(Dimethylamino)Guanosine:2-(二甲氨基)鸟苷，2-Methylguanosine:2-甲基鸟苷，Homovanillic Acid:高香草酸，Carbamoyl phosphate:磷酸氨甲酰，Kynurenic Acid:犬尿酸，N6-Succinyl Adenosine:N6琥珀酰腺苷，Phenyllactate(Pla):苯乳酸(Pla)，D-Mannitol:D-甘露醇，Pyrrole-2-Carboxylic Acid:吡咯-2-羧酸，Indolelactic acid:吲哚乙酸，Sn-Glycero-3-Phosphocholine:Sn-甘油-3-磷酸胆碱，B-Nicotinamide Mononucleotide:B-烟酰胺单核苷酸，1-(4-Methoxyphenyl)-2-propanone:1-(4-甲氧基苯基)-2-丙酮，Hydroxyphenyllactic acid:羟基苯乳酸，4-Hydroxybenzaldehyde:4-羟基苯甲醛，Guanosine Monophosphate:一磷酸鸟苷，CyclicAmp:环腺苷酸，Indole-2-Carboxylic Acid:吲哚-2-羧酸，Urea:尿素，L-Sepiapterin:L-丝氨酸蝶呤，N-lsovaleroylglycine:N-异戊烯酰甘氨酸，Palmitoylcarnitine:棕榈酰肉碱，All-Trans-1314-Dihydroretinol:全反式-1314-二氢视黄醇，2'-Deoxycytidine-5'-Monophosphate:2'-脱氧胞苷-5'-单磷酸盐，Acetaminophen Glucuronide:对乙酰氨基酚葡糖苷酸，5-Methyluridine:5-甲基尿苷，Hydrocinnamic Acid:氢化肉桂酸，Guanosine3',5'-Cyclic Monophosphate:鸟苷3'，5'-环一磷酸，Oxindole:吲哚酮，Indole-3-AceticAcid:吲哚-3-乙酸，Oxaloacetic acid:草酰乙酸，N-Alpha-Acetyl-L-Asparagine:N-α-乙酰-L-天冬酰胺，Thiamine:硫胺素。图3B中，Random Forest Analysis:随机森林分析，MeanDecrease Accuracy:平均下降精度。
图4为TD肉鸡粪便代谢物生物标志物的诊断结果；
图4中，A为TD肉鸡粪便中差异菌群与代谢物、差异代谢物与胫骨相关参数的Pearson相关性分析，星号表示差异有统计学意义，分别对应p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，p值高于0.05表示无统计学意义。B为独立测试集中鉴别代谢物生物标志物诊断TD的受试者工作特征曲线(ROC)，AUC接近1.0表示敏感性和特异性较高，采用Student’st检验对三种差异代谢物的相对丰度进行统计分析，p值小于0.05具有显著性。C为血清ALP和TRACP诊断TD的ROC曲线。
图4A中，Clostridiales:梭菌目，Lachnospiraceae:毛螺旋菌科，Ruminococcaceae:瘤胃菌科，Enterobacteriaceae:肠杆菌科，[Ruminococus]:[瘤胃球菌属]，Ruminococcus:瘤胃球菌属，oscillospira:颤螺菌属，Dorea:多尔氏菌属，RF39:RF39，Ochrobactrum:苍白杆菌属，Sediminibacterium:土壤杆菌属，Klebsiella:克雷伯杆菌属。TW:胫骨重量，TL:胫骨长度，TMD:胫骨平均直径，TGP:胫骨生长板，TGPI:胫骨生长板指数。
图5为验证和评估三种代谢物的预测能力。
图5中，A-C为整个试验期间诊断TD的差异代谢物-生物标志物的ROC曲线，AUC接近1.0表示敏感性和特异性高，p值小于0.05具有显著性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1肉鸡TD早期诊断粪便生物标记物的筛选
(1)样本选择：选用TD肉鸡的粪便样本(河南农业大学学校动物房，许昌教学实践基地)，并选用健康肉鸡(购自开封市兴达鸡场)的粪便作为对照。使用福美双诱导TD发病，建立动物模型(田文霞,李家奎,毕丁仁,等.福美双对肉鸡胫骨软骨发育不良发生的影响[J].畜牧与兽医,2006(08):48-49.)。其中，CON标记为对照组粪便，TD标记为TD组粪便。
(2)代谢组学测序：用1000μL甲醇/水(冰点，70％，v/v)和5μL 2-氯苯丙氨酸(1μg/mL)处理50mg粪便样品。在-20℃向试样混合物中加入两个预冷的无菌钢球，2min后在30Hz下均质3min。将样品混合物置于4℃下12000g离心10min，收集上清液，通过0.22μm滤膜过滤后进行UPLC-MS/MS分析(中国武汉迈维生物技术有限公司)。
(3)差异代谢产物的分析：所有数据分析均基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建的MWDB数据库进行。为了探究粪便代谢物的组成，使用UPLC-MS/MS对粪便样品进行代谢组分析。结果表明，CON组和TD组共鉴定出531个代谢物。由PCA分析结果显示，两组的三个生物重复在不同区域聚在一起，说明两组的代谢存在显著差异(图1A)。此外，采用监督OPLS-DA方法对粪便样本进行评估，通过排列检验(Q2Y＝0.998)，CON组和TD组之间的OPLS-DA评分图分离明显，可靠性高(图1B)。对两组的差异代谢物进行筛选，如火山图和饼图所示的结果表明，共有189明显差异的代谢物，包括80个代谢物下调，109个上调(图2A)。同时，将两组差异代谢物映射到KEGG数据库进行功能聚类分析，结果显示差异表达代谢物主要富集在嘌呤代谢、维生素消化吸收、甘油磷脂代谢、cGMP-PKG信号通路、生物素代谢等(图2B)。采用差异分析对差异代谢物进行比较，结果如图3A所示，与CON组相比，TD组差异代谢物最丰富的是硫胺素、N-乙酰-L-天冬酰胺、草酰乙酸、吲哚-3-醋酸、羟吲哚、鸟苷3',5'环一磷酸、氢肉桂酸、5-甲基尿苷、对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸、2'-脱氧胞苷-5'-磷酸，而尿烷酸、对苯二酚、2,6-二羟基嘌呤和十二烷基二酸的丰富度较低，这些结果表明，肉鸡粪便代谢产物发生了显著变化。然后采用随机森林分析筛选出前20个重要代谢产物，包括脱硫生物素(Dethiobiotin)、4-羟基苯甲醛(4-Hydroxybenzaldehyde)、邻氨基苯甲酸(Anthranilicacid)、1-氨基丙基-2-醇(1-Aminopropan-2-ol)、2,4-二羟基苯甲酸(2,4-Dihydroxybenzoic Acid)、溶血卵磷脂酰乙醇胺(16:0)(Lysope 16:0)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-Oxide)、溶血卵磷脂酰乙醇胺(18:0)(Lysope 18:0)、甘氨酸苯丙氨酸(Glycylphenylalanine)、3-(4-羟基苯基)丙酸(3-(4-Hydroxyphenyl)-Propionic Acid)、1-甲基组氨酸(1-Methylhistidine)、Nα-乙酰-l-谷氨酰胺(Nα-Acetyl-L-glutamine)、甘露糖醇(Dulcitol)、N-乳基苯丙氨酸(N-lactoyl-phenylalanine)、M-香豆酸(M-Coumaricacid)、溶血卵磷脂(18:0)(Lysopc 18:0)、D-(+)-苹果酸(D-(+)-Malic acid)、黄嘌呤(2,6-Dihydroxypurine)、芽糖醇(Maltol)和DL-o-酪氨酸(DL-o-Tyrosine)(图3B)。通过对OPLS-DA的维恩图分析，鉴定出61个特征代谢物，通过随机森林分析重要代谢物前20名，筛选出3个潜在的生物标志物，即4-羟基苯甲醛、脱硫生物素和黄嘌呤(图3C)。
(4)粪便代谢产物的预测能力：使用GraphPad PrismV.8软件进行回归分析，构建模型，获得ROC曲线，然后以ROC曲线下面积(AUC)表示ROC效应。P<0.05为显著性。通过Pearson分析，揭示了宿主3个差异粪便代谢物的丰度与胫骨相关参数之间的相关性(图4A)。结果表明，TD肉鸡胫骨生长板损伤指标(胫骨生长板和胫骨生长板指数)与差异代谢物脱硫生物素以及黄嘌呤呈负相关，与4-羟基苯甲醛呈正相关(图4A)。由此可见，TD肉鸡胫骨生长板的损伤与粪便差异代谢物的变化有关。筛选粪便差异代谢物中重要性评分较高的3种代谢物，即4-羟基苯甲醛、脱硫生物素和黄嘌呤，其ROC分析结果显示其敏感性、特异性和曲线下面积(AUC)均较高(AUC＝1，P＝0.049，图4B)。骨功能生物标志物中，血清碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)的AUC分别为0.83和0.89，这些血清生物标志物能够区分TD与正常肉鸡，但低于差异代谢物的预测能力。为了进一步验证这3种生物标志物的预测能力，基于代谢组学对正常肉鸡和TD肉鸡第7天和第15天的粪便也进行了测序。通过ROC曲线分析这3种潜在生物标志物在整个TD发生期间的预测能力进行验证和评价(图5)，结果显示，4-羟基苯甲醛、脱硫生物素和黄嘌呤的AUC分别为0.90(95％CI＝0.76-1.00；P＝0.004)，0.52(95％CI＝0.23-0.81；P＝0.895)、0.67(95％CI＝0.39-0.98；P＝0.233)。这些结果表明，粪便差异代谢物4-羟基苯甲醛，可作为评价和诊断TD肉鸡的有价值生物标志物。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.检测粪便代谢物4-羟基苯甲醛的试剂在制备肉鸡胫骨软骨发育不良诊断产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉鸡胫骨软骨发育不良包括肉鸡早期胫骨软骨发育不良。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品的类型包括试剂盒或检测仪器。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测粪便代谢物4-羟基苯甲醛的试剂包括采用液相色谱质谱联用法检测粪便代谢物4-羟基苯甲醛的试剂，或采用气相色谱质谱联用法检测粪便代谢物4-羟基苯甲醛的试剂，或采用核磁共振法检测粪便代谢物4-羟基苯甲醛的试剂。
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