CN110221079B - 粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测在林麝肠道炎症性疾病诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测在林麝肠道炎症性疾病诊断中的应用。本发明提供了用于检测林麝粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量的物质在制备用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品中的应用。本发明证实检测林麝肠道疾病应选取钙卫蛋白和乳铁蛋白等具有对炎症性疾病有高诊断价值的指标。本发明为圈养林麝肠道炎症性疾病临床诊断提供一定依据。

Description

粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测在林麝肠道炎症性疾病诊断中 的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测在林麝肠道炎症性疾病诊断中的应用。

背景技术

林麝是中小型食草动物，生命活动所需的能量全部来源于对草本食物的消化吸收所获得的能量。这要求林麝有一套强大的消化系统，尤其是肠道。林麝的肠炎性疾病一直是人工规模化养殖的技术瓶颈，严重限制了人工养麝的快速发展(罗茜，2014；何迟酩等，2011；Xu et al.,2003；He et al.,2014；Wei et al.,2016)。因此加强对林麝疾病防治方面的研究，从根本上解决困扰人工规模化养麝的疾病问题，是目前林麝人工养殖研究的主要方向。

研究林麝肠道是否患有疾病，首先要找到理想的检测方法和指示类物质。在实际生产中由于林麝的应激性非常强，这对于林麝血液的采集和肠道镜检造成了极大的障碍，进而无法采用最直接反应肠道疾病的常规肠道疾病检测办法。兽医只能通过粪便的外观和粪便连续异常的时间来判断是否患有肠道性疾病。兽医通常的诊断步骤是，个体排泄粪便持续异常达到三天，即判定为患有肠道疾病。并采用在饲料中添加广谱抗生素和蒙脱石散来进行治疗。这种诊断和治疗方式常常造成误诊和抗生素的滥用，长期用药还会造成林麝机体对抗生素等药物的抗药性，影响机体的正常免疫机能。因此选定合理的检测方式和检测指标，对林麝肠道疾病的诊断和后续治疗有着举足轻重的意义。

发明内容

本发明的目的是提供粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测在林麝肠道炎症性疾病诊断中的应用。

第一方面，本发明要求保护用于检测林麝粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量的物质在制备用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品中的应用。

进一步地，所述应用可为用于检测林麝粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量的物质和记载有如下(A1)所示的可读性载体在制备用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品中的应用：

(A1)所述粪便中钙卫蛋白含量的生理常值为8223～10478μg/g；所述粪便中乳铁蛋白含量的生理常值为5000～7511μg/g。上述各含量为每g干粪便中的含量。相应的，各指标不落入生理常值则判定该指标异常。

更进一步地，所述应用也可为用于检测林麝粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量的物质和记载有如下(A2)所示的可读性载体在制备用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品中的应用：

(A2)若待测林麝的粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量两项指标中至少一项高于生理常值，则所述待测林麝患有肠道炎症性疾病；反之，则所述待测林麝不患有肠道炎症性疾病(说明：两项指标低于生理常值，判定不患有肠道炎症性疾病)。

第二方面，本发明要求保护一种用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品。

本发明所提供的用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品，可含有用于检测林麝粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量的物质。

进一步地，所述产品中还可含有记载有前文第一方面中所述的可读性载体。

第三方面，本发明要求保护一种评估林麝肠道炎症性疾病的方法。

本发明所提供的评估林麝肠道炎症性疾病的方法，可包括前文第一方面中所述(A2)所示的步骤。

在上述各方面中，所述林麝具体可为圈养林麝。在本发明的一个实施例中，所述林麝具体为年龄3-7岁的圈养林麝。

本发明通过采集林麝粪便，提取其中的钙卫蛋白和乳铁蛋白作为指示类物质，通过检测粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白在健康林麝及兽医初判患有肠道炎症性疾病的林麝病期和康复后的相关性及变化，探索正常指标值的范围，评价粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白作为一种新兴的、非损伤、非入侵性的肠道疾病检测方法，比较粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白含量和传统外观异常诊断方法，从检测和诊断效果上来看，本发明的方法对于林麝肠道炎症性疾病有着很重要的诊断的意义。

本发明通过采集林麝粪便这一非损伤性方法，对圈养状况下林麝粪便的一般性状(如形状、颜色、气味等)、粪便钙卫蛋白(或乳铁蛋白)两项生理生化指标进行了观察及检测。酶联免疫吸附检测(ELISA)结果分析后表明林麝粪便钙卫蛋白的生理常值为8223～10478μg/g，乳铁蛋白的生理常值为5000～7511μg/g。粪便乳铁蛋白对粪便外观初判结果的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.433(0.294～0.573)<0.5，表示完全无价值的诊断。相同的，传统的粪便外初判结果对跟变乳铁蛋白的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.559(0.431～0.687)>0.5，但<0.7，表示诊断价值较低。粪便钙卫蛋白对粪便外观初判结果的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.394(0.228～0.470)<0.5，表示完全无价值的诊断。相同的，传统的粪便外初判结果对跟变钙卫蛋白的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.375(0.057～0.693)<0.5，表示完全无价值的诊断。检测林麝肠道疾病应选取钙卫蛋白和乳铁蛋白等具有对炎症性疾病有高诊断价值的指标。

附图说明

图1为粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白数据系统聚类分析树形图以及含量测定结果。A为钙卫蛋白数据系统聚类分析树形图；B为粪便钙卫蛋白含量测定结果；C为乳铁蛋白数据系统聚类分析树形图；D为粪便乳铁蛋白含量测定结果。柱状图中a代表正常组；b代表异常组。

图2为粪便钙卫蛋白和粪便外观初判结果的诊断价值ROC曲线(采用IBM SPSSStatistics 20.0对检测得到的结果数据进行统计分析)：a.粪便钙卫蛋白对粪便外观初判结果的诊断价值的ROC曲线；b.粪便外观初判结果对粪便钙卫蛋白的诊断价值的ROC曲线。

图3为粪便乳铁蛋白和粪便外观初判结果的诊断价值ROC曲线：a.粪便乳铁蛋白对粪便外观初判结果的诊断价值的ROC曲线；b.粪便外观初判结果对粪便乳铁蛋白的诊断价值的ROC曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测评价林麝肠道炎症性疾病的方法的建立

一、材料与方法

1、动物

2016年6月至6月在陕西宝鸡片仔癀和达吉康两个麝场的所有可作为实验对象的同一年龄阶段的林麝为研究对象，共79头。其中雌性个体29头，雄性个体49头。

粪便样本在采集后1小时内标记密封后2～4℃冷藏保存，研磨、称量、分装、抽提粪便钙卫蛋白，抽提后放置在-20℃冻存，用于粪便钙卫蛋白的ELISA检测。

2、粪便蛋白类物质的提取和测定

林麝粪蛋白类物质的提取方法参照Peters等(2004)及Carlsson等(2007)的方法(Peters I R,Calvert E L,Hall E J,et al.Measurement of immunoglobulinconcentrations in the feces of healthy dogs[J].Clinical and DiagnosticLaboratory Immunology,2004,11(5):841-848；Carlsson H,Lyberg K,Royo F,etal.Quantification of stress sensitive markers in single fecal samples do notaccurately predict excretion of these in the pig[J].Ressarch in VeterinaryScience,2007,82(3):423-428)。

配制PBST缓冲溶液：称取8.50g氯化钠、0.30g磷酸氢二钠、2.20g磷酸二氢钠溶于1000ml微孔水，加入化50ml Tween(吐温)-20，轻轻振荡混匀，调节pH为7.20，即得所需缓冲溶液。

取1.00g烘干粪便研磨混合均匀后置于15ml塑料离心管中，加入pH7.2的PBS缓冲液10.0ml，用涡旋仪轻轻震荡10min混匀，2000rad/min低速离心机常温离心20min。取上清液2ml于2ml塑料离心管中，10000rad/min普通高速离心机离心10min。取上清液1.5ml于2ml离心管中，放置-20℃以下保存待测。

林麝粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白的测定，采用的酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(Cat.CK-E925200B,96T，北京冬歌博业生物科技有限公司，中国)。试剂盒主要性能如下：(1)钙卫蛋白：最低检测浓度＜1.0ug/ml；乳铁蛋白：最低检测浓度＜1.0μg/ml。(2)所有试剂盒批内、批间的变异系数＜7％，板内、板间变异系数均＜15％；(3)不与其它可溶性结构类似物产生交叉反应；(4)2-8℃，避光防潮保存。(5)标准品线性回归与预期浓度相关系数R值≥0.9900。

检测步骤：

(1)将标准品稀释，分别稀释成浓度为0、25、50、100、200、400μg/mL的标准品。

(2)20×洗涤缓冲液：蒸馏水按1:20进行稀释，即25mL的20×洗涤缓冲液中加入475mL的蒸馏水。

(3)将保存在2-8℃的试剂盒放置在室温中，平衡20min。若浓缩洗涤液有结晶，则水浴加热使结晶完全溶解后在使用。

(4)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条。

(5)设置标准品孔和样本孔，标准品孔内分别加浓度为0、25、50、100、200、400μg/mL的标准品50μL。

(6)样本孔先加待测样本10μL，再加入样本稀释液40μL；空白孔内不加。

(7)除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板摸封住反应孔，37℃水域温育60min。

(8)弃掉液体，用吸水纸排干；再用洗板机每孔注入洗液350μL，浸泡1min，重复洗板5次，最后一次洗板后用吸水纸排干。

(9)每孔加入底物A、B各50μL，37℃条件下，恒温避光孵育15min。

(10)每孔加入终止液50μL，在15min内，用酶标仪测定各孔的OD值，酶标仪根据吸光度自动生成提取液中样品的含量。

(11)称取5g左右采得的湿粪(M)样品置于烘箱，60℃烘干至恒重，再称量粪样干重(m)，按照公式计算每份粪样含水量：WC＝M-m。

(12)将检测的提取液中粪便蛋白的含量和粪便含水量相结合，最终得到每克干粪中蛋白的含量。

每克干粪中的含量W(μg/g)＝提取液浓度×稀释倍数/干粪重量

3、初判林麝肠道疾病的传统方法将个体进行分类

为便于比较与分析，粪便样品的各个性状均给予可辨识的4个等级并按百分制为相对应的性状特点赋值，相关的赋值标准参照猪、奶牛等物种的研究方法执行(易贤明,雷宣会,廖新俤,等.饲喂杂交狼尾草对妊娠母猪粪便形态特性与成分的影响[J].养猪,2009,(3):15-16；毛春瑕,石显亮,何余湧,等.补饲发酵芦笋下脚料对母猪粪便形态和乳汁质量的影响[J].动物营养学报,2016,28(6),1867-1876.；胡红莲,于朝晖,孙海洲,等.奶牛粪便检测试验[J].畜牧与饲料科学,2006,27(3):1-2.)。其中，形状按成形程度和粘连状态划分等级，颜色按深浅和区别划分等级，气味按异常程度划分等级(孙晓宁.圈养林麝消化道健康状况的非损伤诊断及评价[D].北京林业大学，2018.)。根据赋值结果计算出每份粪样的得分。每份粪样的得分＝100－(形状赋值+颜色赋值+气味赋值)/3)，连续三天得分高于0分的即初步判定为换患肠道疾病个体。林麝粪样的性状等级划分及赋值具体见表1。

表1林麝粪样的性状等级划分及赋值

二、统计分析

粪便正常和异常个体含水量差异很大，每克新鲜粪便中的含量差异较大，故比较每克干粪中的含量更有意义。采用IBM SPSS Statistics 20.0对检测得到的结果数据进行统计分析，所测得的每只个体数据首先用迭代法(Mean±1.5SE)将极值去除，然后用剩余的数据计算每只个体的平均值。所有数据均通过单一样本K-S检验(one-sample Kolmogorov-Smirnov test)，检验数据是否符合正态分布。将不符合正态分布的数据进行数据处理和转换，处理转换后的仍然不符合正态分布的数据在用非参数U检验(Mann-Whitney U test)分析；符合正态分布的数据，多组间数据使用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验，进行差异性检验和分析，两组间比较采用独立样本T检验(independent-samples T test)，两种检验的使用均进行了方差齐性检验。以上所有检验的显著水平设置为α＝0.01，蛋白含量均以“Mean±SE”形式表示。使用Pearson两两相关分析成麝粪便的各项生理指标。用Excel 2010和SigmaPlot 12.5软件对处理完的数据进行整合作图。

三、实验结果

1、圈养林麝粪便乳铁蛋白和钙卫蛋白含量的检测

遴选两个麝厂的雌麝、雄麝，分别测定其粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白的含量。

粪便钙卫蛋白测定结果用系统聚类分析后将受检个体大致分为粪便钙卫蛋白含量低个体和含量高个体这两类(图1中A)。进一步通过K-Means cluster初步分析出每类的粪便钙卫蛋白的参考范围。其中雌性个体粪便钙卫蛋白低浓度为8863±816.50μg/g(22头)，高浓度为11842±1232.42μg/g(7头)，雄性个体粪便钙卫蛋白低浓度9581±1110.23μg/g(43头)，高浓度为15483±5027.30μg/g(6头)。但两组的粪便钙卫蛋白均没有显著的性别差异(F＝0.099，P＝0.437>0.01)。因此，分别将两组雌雄个体粪便钙卫蛋白含量合并，进一步分析后得出林麝粪便钙卫蛋白低含量的范围参考值为9351±1127.66μg/g，高含量范围参考值为14200±2473.37μg/g(图1中B，表2)。

粪便中乳铁蛋白检测数据，用系统聚类分析后将受检个体大致分为粪便乳铁蛋白含量低个体和含量高个体这两类(图1中C)。进一步通过K-Means cluster初步分析出每类的粪便乳铁蛋白的参考范围。其中雌性个体粪便乳铁蛋白低浓度为5719.87±3353.76μg/g(18头)，高浓度为10300.27±1990.42μg/g(11头)，雄性个体粪便乳铁蛋白低浓度6581.55±3934.20μg/g(39头)，高浓度为12148.12±4107.17μg/g(11头)。但两组的粪便乳铁蛋白均没有显著的性别差异(F＝0.098，P＝0.451>0.05)。因此，分别将两组雌雄个体粪便乳铁蛋白含量合并，进一步分析后得出林麝粪便乳铁蛋白低含量的范围参考值为6255.9±1255.15μg/g，高含量范围参考值为10758.2±1414.14μg/g(图1中D，表2)。

表2林麝粪便乳铁蛋白和钙卫蛋白含量的比较

注：N表示对应组的个体数，*表示有显著性差异(P<0.01)。

2、粪便中各检测蛋白含量的正常水平参考范围

钙卫蛋白和乳铁蛋白广泛存在于身体的各个部位(Lin WC、Wong JM等，2015；Levay PF、Viljoen M，1995)，当肠道发生炎症损伤后，中性粒细胞脱颗粒排放至肠腔，并可抵制肠道细菌的降解作用稳定存在于粪便中，其浓度与迁移至肠黏膜中的中性粒细胞数量成正比(Nancey S、Boschetti G等，2013；CHEN Li-ya、YUAN Bo-si等，2018；Baceye S、Elass E等，1999；Dai J、Liu WZ等，2006)。故聚类分析后的低浓度组的参考范围在理论上可以代表林麝粪便蛋白含量的正常水平参考范围。粪便钙卫蛋白的范围是8223～10478μg/g，乳铁蛋白的范围是5000～7511μg/g。

3、粪便钙卫蛋白、乳铁蛋白含量和粪便外观初判结果的关联性

根据麝场兽医诊断林麝肠道疾病的方法和林麝粪样的性状赋值结果，将粪便连续三天异常的个体判定为患肠道炎症性疾病个体，共筛选出18头粪便异常个体。将初判的换肠道炎症性疾病个体作为类别1，其余初判未肠道炎症性疾病个体作为类别2。将个体粪便的外观进行赋值后，根据公式计算粪便外观得分。结果显示判定为患肠道炎症性疾病个体的得分均高于判定非患肠道炎症性疾病个体，且患病个体中粪便异常程度越大的得分越高。

将麝粪便的外观赋值以及乳铁蛋白和钙卫蛋白的含量这三项指标进行相关性分析，结果表明：钙卫蛋白和乳铁蛋白作为肠道急性炎症的标志物，两者之间存在着明显的相关性，对林麝肠道炎症性疾病诊断有显著的指示性作用(P<0.01)。粪便钙卫蛋白和林麝粪样的性状赋值结果进行相关性分析，两者的相关性(Pearson Correlation)为-0.191，即两项指标呈现负相关性或两者之间不存在直接的相关性。粪便乳铁蛋白和林麝粪样的性状赋值结果进行相关性分析，两者的相关性(Pearson Correlation)为-0.131，即两项指标呈现负相关性或两者之间不存在直接的相关性。见表3。

表3圈养林麝粪便三项指标间的相关矩阵

注：**.相关性在0.01水平(2-tailed)显著。Cal是钙卫蛋白英文缩写，Lac是乳铁蛋白英文缩写。

粪便钙卫蛋白对粪便外观初判结果的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.394(0.228～0.470)<0.5，表示完全无价值的诊断(图2中a)。相同的，传统的粪便外初判结果对跟变钙卫蛋白的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.375(0.057～0.693)<0.5，表示完全无价值的诊断(图2中b)

粪便乳铁蛋白对粪便外观初判结果的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.433(0.294～0.573)<0.5，表示完全无价值的诊断(图3中a)。相同的，传统的粪便外初判结果对跟变乳铁蛋白的诊断价值的ROC曲线下曲线面积(AUC)为0.559(0.431～0.687)>0.5，但<0.7，表示诊断价值较低(图3中b)。

将粪便一般性状项指标处在异常范围最大的5个体筛选出来，对粪便的外观赋值以及乳铁蛋白和钙卫蛋白的含量三项指标的相关性进行分析，结果表明三项指标间存在着明显的相关性(P>0.01)(表4)。

表4圈养林麝粪便外观异常个体间的三项指标相关矩阵

注：**.相关性在0.01水平(2-tailed)显著。Cal是钙卫蛋白英文缩写，Lac是乳铁蛋白英文缩写。

对林麝新鲜粪便进行钙卫蛋白和乳铁蛋白含量的检测，若两者的指标中至少有一个指标的含量高于正常生理值范围，则判定该个体肠道内发生了炎症反应，初步诊断该个体患有肠道炎症性疾病。

传统方法对林麝消化道健康的评估准确性不高，其诊断价值较低。消化道炎症性疾病指示物乳铁蛋白和钙卫蛋白对林麝消化道炎症反应有着明显的指示性作用，具有较高诊断价值的指标。因此，在圈养林麝的实际养殖过程中，只靠传统方法诊断林麝消化道健康与否是片面不准确的，还需要结合其他生理指标，如Cal和Lac的检测。

实施例2、利用粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测评价林麝肠道炎症性疾病的方法的实际应用

依照实施例1建立的评价体系流程对77头实验个体进行肠道健康状况的评估诊断，粪便外观赋值结果进行初筛，结果显示共有18头个体粪便外观赋值异常(表5)，将粪便赋值和炎症指标(钙卫蛋白和乳铁蛋白)的含量检测，检测结果显示疑似患有肠道炎症性疾病的个体共11头，其中粪便外观赋值异常个体7头，耳号分别为4496、9485、10015、12035、B5、A6和A9；粪便外观正常的个体4头，耳号分别为C10、C7、D4和008(表6)。

表5连续三天粪便性状异常林麝个体及赋值

表6 77头林麝粪便外观和炎症反应两方面初步评估结果(只列举疑似患病个体)

耳号	粪便异常与否	Cal结果	Lac结果	诊断
					4496	异常	高	高	炎症性肠病(IBD)
9485	异常	正常	高	炎症性肠病(IBD)
					10015	异常	正常	高	炎症性肠病(IBD)
12035	异常	正常	高	炎症性肠病(IBD)
					B5	异常	正常	高	炎症性肠病(IBD)
A6	异常	正常	高	炎症性肠病(IBD)
					A9	异常	正常	高	炎症性肠病(IBD)
C10	正常	高	高	炎症性肠病(IBD)
					C7	正常	高	高	炎症性肠病(IBD)
D4	正常	高	正常	炎症性肠病(IBD)
					OO8	正常	高	正常	炎症性肠病(IBD)

注：“高”其含义是相应指标的含量高于正常值范围；“正常”代表处于正常范围。

对粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白这两个指标未处于生理常值的林麝个体尽快进行相应的用药治疗和在养殖过程中要加强这些个体的照顾。做到早发现、早治疗，在病情初期就能合理诊治，降低炎症性肠道疾病的加重几率，提高康复率，进而提高圈养林麝种群的增长。

Claims (1)

1.用于检测林麝粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量的物质在制备用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品中的应用；

所述应用为用于检测林麝粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量的物质和记载有如下（A1）和（A2）所示的可读性载体在制备用于评估林麝肠道炎症性疾病的产品中的应用：

（A1）所述粪便中钙卫蛋白含量的生理常值为8223-10478μg/g；所述粪便中乳铁蛋白含量的生理常值为5000-7511μg/g；各含量均为在每g干粪便中的含量；

（A2）若待测林麝的粪便中钙卫蛋白含量和粪便中乳铁蛋白含量两项指标中至少一项高于生理常值，则所述待测林麝患有肠道炎症性疾病；反之，则所述待测林麝不患有肠道炎症性疾病；

钙卫蛋白和乳铁蛋白作为肠道急性炎症的标志物，两者之间存在着明显的相关性，对林麝肠道炎症性疾病诊断有显著的指示性作用；粪便钙卫蛋白和林麝粪样的性状赋值结果呈现负相关性或两者之间不存在直接的相关性；粪便乳铁蛋白和林麝粪样的性状赋值结果呈现负相关性或两者之间不存在直接的相关性。

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