CN108918571B - 代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肾病综合征标志物筛选鉴定技术领域，为了解决现有技术不能确定肾病综合征病变进程的缺点，提供了一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用。所述代谢标志物为亮氨酸、2‑羟基丁酸、N‑乙酰‑谷氨酸和甲硫氨酸的组合。所述代谢标志物源于尿液。所述代谢标记物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。通过机体终端产物尿液中内源性生物标志物含量的动态变化过程，筛选可以反映肾病综合征病变进程的生物标志物，为解决现有肾病综合征病变进程尚无评价方法的缺点。最终依据确定的进展性标志物对肾病综合征模型早期病变及病程进行评价。本发明用于动态代谢物鉴定领域，从而针对性的评价肾病综合征的发病进程。

Description

代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的 应用

技术领域

本发明属于肾病综合征标志物筛选鉴定技术领域，具体涉及一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用。利用阿霉素肾病模型和NMR技术分析获得的与肾病综合征病变进程相关的进展性标志物及其在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。

背景技术

肾病综合征是由于各种病因导致的肾小球滤过膜通透性发生改变的一个症候群，大量蛋白尿是其主要特点和诱因，且肾病综合征为儿童多发难治性疾病，发病率髙达2~10/100000，为仅次于急性肾小球肾炎的第二大肾脏疾病，严重影响人类健康。

阿霉素诱导的大鼠肾病模型是公认的模拟人类肾脏疾病的动物模型，其临床表现接近肾病综合征的特征。实验中可依据24 h尿蛋白定量判断肾病综合征模型复制成功与否，而肾病的病理类型及病变程度主要依据肾组织病理学检查，不仅主观性强且耗时耗力，目前尚无肾病综合征病变进程动态评价方法，因而需要建立一种整体非入侵、快速、高灵敏度、专属性好的可用于早期肾病诊断以及动态反映疾病的病程的方法。

代谢组学以其不断增加的覆盖范围及其内在的高通量能力在许多领域中得到应用，如疾病诊断和治疗，药物毒性研究，生物标志物发现以及疾病机制探索等。尿液作为肾脏的终端产物，在反映肾脏状态方面具有很大优势，且可以无创伤的获得大量样本。

发明内容

本发明为了解决现有技术不能确定肾病综合征病变进程的缺点，提供了一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用。

本发明由如下技术方案实现的：一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，所述代谢标志物为亮氨酸、2-羟基丁酸、N-乙酰-谷氨酸和甲硫氨酸的组合。

所述代谢标志物源于尿液。所述代谢标记物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。

所述代谢标记物的筛选方法为：

（1）阿霉素肾病模型的复制与传统评价：将大鼠随机分为空白对照组与阿霉素肾病模型组，阿霉素肾病模型组采用尾静脉注射阿霉素进行诱导，建立阿霉素肾病模型；利用肾组织病理切片与尿蛋白定量水平进行阿霉素肾病模型评价；

（2）差异代谢物的寻找：在不同时间阶段收集各组大鼠的尿液样品，并分装成2份备用；对其中1份尿液进行核磁共振即Nuclear Magnetic Resonance，NMR分析，归属出代谢物；对另1份进行尿蛋白定量测定；核磁图谱转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找；

（3）计算各差异代谢物的变化率，并结合线性回归分析、主成分分析、累计方差贡献率分析、相关分析方法筛选、确定肾病综合征病变进程的进展性标志物；

（4）依据ROC曲线下面积，评估进展性标志物的诊断准确性，进展性标志物的曲线下面积大于0.9的标志物，作为反映肾病综合征病变进程的代谢标志物。

步骤（2）中核磁图谱经处理转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找的具体过程为：对所有图谱以TSP的化学位移δ 0.00定标，进行手动相位、基线调整，以δ 0.01对化学位移δ 0.83-8.48进行积分；其中残余水峰δ 4.68-5.20不积分，以消除残余水峰的影响；积分数据采用面积归一化处理；最终导出积分数据矩阵；

对各不同时期空白对照组与阿霉素肾病模型组尿液代谢轮廓数据进行主成分分析Principal component analysis, PCA、偏最小二乘法判别分析Partial least squarediscriminate analysis, PLS-DA和正交偏最小二乘法判别分析Orthogonal signalcorrection-partial least square discriminate analysis, OPLS-DA，依据S-plot分析中相关系数Coefficient>0.7、VIP>1以及两组间t-test（p<0.05）作为判别条件，寻找差异代谢物。

步骤（3）中具体过程为：以不同时间点为横坐标，以各差异代谢物相对含量的变化率[(M-C)/C]为纵坐标，分别对各差异代谢物进行线性回归分析，选择实验进程中变化趋势一致的差异代谢物，且线性相关系数R²≥0.7作为潜在进展性标志物；以潜在进展性标志物为变量进行PCA，依据各潜在进展性标志物的累计方差贡献率>0.80，筛选出主要的主成分贡献变量，进一步筛选出潜在进展性标志物；以上述潜在进展性标志物和各时间点大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择合适的相关分析方法，计算二者的相关系数，确定进展性标志物。

以潜在进展性标志物为变量进行PCA，依据各潜在进展性标志物的累计方差贡献率>0.80，筛选出主要的主成分贡献变量，进一步筛选出潜在进展性标志物；具体过程为：

以在整个实验周期中变化趋势一致的潜在进展性标志物为变量进行PCA，依据各潜在进展性标志物在不同因子上的载荷，选择载荷值>0.80，得出亮氨酸、2-羟基丁酸、鸟氨酸、N-乙酰-谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和马尿酸为主要的主成分贡献变量，可作为潜在进展性标志物。

本发明采用阿霉素大鼠肾病模型模拟肾病综合征，结合¹H NMR尿液代谢组学技术与数理统计方法寻找与肾病综合征病变进程相关的潜在进展性标志物，并采用ROC曲线确证该标志物的诊断能力。最终确定了反映肾病综合征进展性病变的代谢标志物，即以亮氨酸、2-羟基丁酸、N-乙酰-谷氨酸和甲硫氨酸这四个进展性标志物的动态变化为依据，用于肾病综合征模型早期病变及病程进行评价。

与传统血清生化指标或肾脏组织病理分析相比，可量化，具有快速、灵敏度高、特异性强且无创伤的特点，能够反映肾病的病变进程。

附图说明

图1为空白组与阿霉素肾病模型组大鼠肾脏组织HE染色；图2为空白组与阿霉素肾病模型组大鼠尿液¹H NMR代谢物指纹谱；图3为空白组与阿霉素肾病模型组大鼠尿液PCA散点图；图4为空白组与阿霉素肾病模型组大鼠PLS-DA排列实验图；图5为空白组与阿霉素肾病模型组大鼠尿液OPLS-DA散点图；图6为空白组与阿霉素肾病模型组大鼠尿液S-plot。

具体实施方式

一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，所述代谢标志物为亮氨酸、2-羟基丁酸、N-乙酰-谷氨酸和甲硫氨酸的组合。所述代谢标志物源于尿液。所述代谢标记物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。

实验材料、仪器：Bruker 600-MHz AVANCE III NMR检测仪(德国布鲁克公司)；TGL-16高速台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司)；KYJ-3 氮吹仪专用空气源(北京斯珀特科技有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Sartorius BSA124S分析天平(德国Sartorius公司)。

实验试剂：三甲基硅烷丙酸钠盐(TSP, Cambridge Isotope Laboratories Inc，MA)；阿霉素(注射用盐酸多柔比星，深圳万乐药业股份有限公司，批号:1409E3)；NMR试剂重水(Norell, Landisville, USA)；分析级甲醇。

实验动物：SPF级雄性SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK (京) 2013-0014；动物饲养室保持温度（23±1.5)℃，相对湿度(45±15)%。

代谢标记物的筛选方法具体步骤如下：

（1）阿霉素肾病模型的复制与传统评价：

A、阿霉素肾病模型的复制：雄性SD大鼠共30只，适应环境一周，收集30只大鼠24 h的尿液，并记录尿液体积。以大鼠的尿蛋白定量和体重为依据进行初筛，去除尿蛋白或体重过高与过低的不合格大鼠，将合格大鼠随机分为空白对照组（C组）与阿霉素肾病模型组（M组），每组10只，实验过程中自由饮水进食；

B、病理组织切片分析：C、M组大鼠于第50天腹腔注射水合氯醛，进行解剖，取出右肾放到10%福尔马林中固定。

具体病理组织切片分析流程：第一步，制片：修取经10%中性福尔马林固定的肾组织，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。第二步，脱水及包埋：取肾组织经自来水冲洗固定液，酒精梯度脱水后(70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ)，对组织进行透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ），浸蜡（石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ）后包埋。第三步，切片：包埋后的组织3～5 µm切片，经60℃烤片后待染色。第四步，染色：HE染色（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡、过100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ、80%、70%的梯度酒精，苏木素染色、分化、反蓝、伊红染色、过70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精）。第五步，透明及封片：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后树胶封片，待镜检。第六步，光镜检查。

C、尿蛋白定量分析：尿蛋白定量测定在模型复制过程中，分别于第0天、第14天、第28天、第42天、第49天早上9:00将C组和M组大鼠分别置于大鼠代谢笼中，于次日早上9:00收集尿液，并记录尿液体积，对收集的尿液样品于4℃，3500 rpm离心15 min后取上清液，分装成2份，每份1 mL，置于-80℃冰箱备用。

采用双辛丁酸（BCA）法进行尿蛋白定量测定，于562 nm测定大鼠24 h尿液吸光度，依据标准曲线计算尿蛋白浓度。通过将尿蛋白浓度（mg/mL）乘以24 h尿体积（mL）来计算24h尿蛋白排泄量（Upro）。

（2）差异代谢物的寻找：

尿液样品的数据采集：将收集的C组和M组尿液样本进行NMR分析。首先将尿液样品于4℃解冻，精密取尿液500 μL置于1.5 mL EP管中，再加入200 μL磷酸缓冲液（含0.01%TSP，0.2 M磷酸缓冲盐，pH =7.4），涡旋混匀10 s，于4℃，13000 r/min离心15 min，于测试前将600 μL上清液转移到5 mm核磁管。

样品于600 MHz ¹H NMR（25°C）仪上测定，采用cpmgprld脉冲序列，扫描次数为64，谱宽12 345.7 Hz，脉冲时间14 μs，采样时间2.654 s，延迟时间1.0 s，采样数据点65536，采样间隔40.5 μs, 内标为TSP。

核磁图谱采用MestReNova (version 8.0.1, Mestrelab Research, Santiagode Compostella, Spain) 软件处理。对其中1份尿液进行NMR分析测试，得到C组与M组代谢物指纹图谱（见图2），参照文献（牛倩云等，药学学报，2015，50(6)：708-713；张天舒等，中国药科大学学报，2016，47(2)：188-198）以及利用HMDB数据库对氨基酸类、有机酸类，胆碱类，胺类化合物以及嘧啶类化合物进行标准品比对，最终归属出43个代谢物。

对所有图谱以TSP的化学位移δ 0.00定标，进行手动相位、基线调整，以δ 0.01对化学位移δ 0.83-8.48进行积分；其中残余水峰（δ 4.68-5.20）不积分，以消除残余水峰的影响；积分数据采用面积归一化处理，最终导出积分数据矩阵。

尿液样品的数据处理：将积分数据矩阵导入SIMCA-P 13.0（Umetrics，Umea，Sweden）软件中。

（a）以C组和M组构建无监督的模式识别主成分分析（PCA），可以反映数据的原始状态，较直观显示不同样品之间的整体差异；

（b）以C组和M组构建偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），以排列实验（permutationtest）表征模型是否成功，并用于后续差异代谢物的鉴定；

(c)以C组和M组构建正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），以及相应的S-plot（coefficient>0.7）结合VIP（>1）寻找对二者分组贡献较大的差异代谢物，进一步通过t-test（p<0.05）确定具有显著性的差异代谢物。

（3）计算各差异代谢物的变化率，并结合线性回归分析、主成分分析、累计方差贡献率分析、相关分析方法筛选、确定肾病综合征病变进程的进展性标志物；

潜在进展性标志物的初筛（各差异代谢物变化率计算）：对C组与M组的差异代谢物，以不同时间点（第0天、14天、28天、42天、49天）为横坐标，以差异代谢物相对含量的变化率[(M-C)/C]为纵坐标，分别对各差异代谢物进行线性回归分析，选择实验周期进程中变化趋势一致的差异代谢物，且（线性相关系数R²≥0.7），作为潜在进展性标志物。

潜在进展性标志物的进一步筛选（主成分分析）：以上述潜在进展性标志物为变量进行主成分分析，依据各潜在进展性标志物的累计方差贡献率（>0.80），进一步筛选出潜在进展性标志物。

进展性标志物的确定（相关性分析）：以上述潜在进展性标志物和各时间点大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择合适的相关分析方法，计算二者的相关系数，确定进展性标志物。

（4）依据ROC曲线下面积，评估进展性标志物的诊断准确性，进展性标志物的曲线下面积大于0.9的标志物，作为反映肾病综合征病变进程的代谢标志物。

进展性标志物的诊断能力的评估（ROC分析）：依据ROC曲线下面积，评估进展性标志物的诊断准确性，通常认为AUC<0.5为无诊断能力，0.5<AUC<0.7为诊断准确性较低，0.7<AUC<0.9为诊断准确性较好，AUC>0.9为诊断准确性最好。以AUC>0.7的代谢物，最终被认为可作为反映肾病综合征进程的进展性标志物。

模型传统评价结果：由尿蛋白定量分析结果（见表1）可知，与C组比较，M组大鼠造模后尿蛋白定量随时间呈现稳定上升趋势，且于第14天具有显著性差异（p<0.05），表明造模成功。

表1 空白组与阿霉素肾病模型组大鼠尿蛋白定量动态分析

“*”代表与空白对照组相比，*p<0.0

由组织病理切片图分析结果（图1）可知，与C组比较，M组肾小管上皮细胞中至重度水样变性，小管嗜碱性变及蛋白管型多见，成纤维细胞中至重度成纤维细胞增生，间质炎细胞中至重度炎细胞浸润，部分小管上皮细胞萎缩，管腔变大，表明模型复制成功。

差异代谢物的寻找结果：

空白和模型组大鼠血清¹H NMR指纹谱代谢物归属：参照文献以及比对标准品，共归属指认出化合物43个（见表2与图2），包括氨基酸（亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、鸟氨酸等）、有机酸（丁酸类化合物、马尿酸），胆碱类代谢物，胺类化合物以及嘧啶类化合物。

表2 大鼠血清中主要化合物的¹H NMR数据归属

δ代表化学位移

对各不同时期C组与M组尿液代谢轮廓数据进行PCA（见图3）、PLS-DA排列实验（见图4）和OPLS-DA（见图5），可以看出，图3中C组与M组二者明显分开，其中PC1=0.336，PC2=0.111，说明模型复制成功。图4中R²=0.603代表能够解释原始变量的60.3%，Q²=0.829代表模型预测能力良好，即R²和Q²所有排列值均小于原始值，且R²和Q²均接近1，说明所建分类模型稳定可靠，可用于后面差异代谢物的寻找。图5因消除与分组变量无关的因素，而获得最大的分离趋势，其模型验证CV-ANOVA参数p=8.71749E-008<0.05，表示模型稳健。相应的S-plot（图6）结合VIP（>1），并经过t-test筛选，找到对分组贡献较大的代谢物。结果显示，与空白对照组相比，阿霉素肾病大鼠尿液中的代谢物亮氨酸、2-羟基异丁酸、丙氨酸、鸟氨酸、N-乙酰谷氨酸、醋酸、N-乙酰糖蛋白、甲硫氨酸、谷氨酰胺以及二甲基甘氨酸含量升高，而丁酸、酮戊二酸、柠檬酸、肉毒碱、氧化三甲胺、尿囊素、苯丙氨酸以及马尿酸含量降低，以这18种代谢物作为差异代谢物。

进展性标志物的筛选结果

潜在进展性标志物的筛选：对C组与M组的差异代谢物，以不同时间点为横坐标，以差异代谢物相对含量的变化率[(M-C)/C]为纵坐标，分别对各差异代谢物进行线性回归分析（见表3），最终得出亮氨酸、2-羟基丁酸、丙氨酸、鸟氨酸、N-乙酰-谷氨酸、N-乙酰糖蛋白、甲硫氨酸、苯丙氨酸和马尿酸9个差异代谢物变异趋势随时间动态变化一致，可作为阿霉素肾病病变进程的潜在进展性标志物。

表3 各差异代谢物随时间动态变化趋势分析

“*”表示与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

潜在进展性标志物的进一步筛选：

主成分分析：以上述9个潜在进展性标志物做主成分分析，由表4研究结果发现前3个因子的累计方差贡献率为88.593%，大于85%，故提取前3个主成分进行评价。表5得出第一主成分贡献度最显著，其中亮氨酸、2-羟基丁酸、鸟氨酸、N-乙酰-谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和马尿酸这7个代谢物的载荷较高，可作为潜在进展性标志物。

表4 方差贡献表

表5 因子载荷矩阵^a

相关性分析：以上述7个潜在进展性标志物和各时间点大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，计算二者的相关系数（见表6），研究结果发现阿霉素肾病模型自第0天尾静脉注射起，大鼠内源性代谢随时间发生不同程度变异，第49天、42天、28天尿蛋白定量与亮氨酸、2-羟基丁酸、N-乙酰-谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸变异均呈正相关，与苯丙氨酸和马尿酸均呈负相关，相关系数均大于0.7（除苯丙氨酸和马尿酸）；且第28天尿蛋白定量几乎与所有代谢物相关性系数最大，且具有统计学差异；从第14天开始，尿蛋白定量与个别代谢物具有相关性可作为成模转折点，称作病变初期；而第0天尿蛋白定量与所有代谢物均无显著相关性（r<0.3，p>0.05）；经上述分析得出亮氨酸、2-羟基丁酸、N-乙酰-谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和马尿酸变异趋势随时间变化一致，且与尿液动态尿蛋白定量关系密切，确定为进展性标志物。

表6 潜在进展性标志物与24 h动态尿蛋白定量（24 h Upro）关系

“*”表示与空白对照组相比，*p<0.05,**p<0.01.***p<0.001

进展性标志物的诊断评估结果：采用ROC曲线对进展性标志物的诊断能力进行评估（见表7），最终得出亮氨酸、2-羟基丁酸、N-乙酰-谷氨酸和甲硫氨酸的曲线下面积均大于0.9，可作为进展性标志物，用于肾病综合征模型早期病变及病程的评价。

表7 AUC曲线评估分析

Claims (6)

1.一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，其特征在于：所述代谢标志物为亮氨酸、2-羟基丁酸、N-乙酰-谷氨酸和甲硫氨酸的组合。

2.根据权利要求1所述的一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，其特征在于：所述代谢标志物源于尿液。

3.根据权利要求1所述的一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，其特征在于：所述代谢标记物的筛选方法为：

（1）阿霉素肾病模型的复制与传统评价：将大鼠随机分为空白对照组与阿霉素肾病模型组，阿霉素肾病模型组采用尾静脉注射阿霉素进行诱导，建立阿霉素肾病模型；利用肾组织病理切片与尿蛋白定量水平进行阿霉素肾病模型评价；

（2）差异代谢物的寻找：在不同时间阶段收集各组大鼠的尿液样品，并分装成2份备用；对其中1份尿液进行核磁共振即Nuclear Magnetic Resonance，NMR分析，归属出代谢物；对另1份进行尿蛋白定量测定；核磁图谱转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找；

（3）计算各差异代谢物的变化率，并结合线性回归分析、主成分分析、累计方差贡献率分析、相关分析方法筛选、确定肾病综合征病变进程的进展性标志物；

（4）依据ROC曲线下面积，评估进展性标志物的诊断准确性，进展性标志物的曲线下面积大于0.9的标志物，作为反映肾病综合征病变进程的代谢标志物。

4.根据权利要求3所述的一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，其特征在于：步骤（2）中核磁图谱经处理转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找的具体过程为：对所有图谱以TSP的化学位移δ 0.00定标，进行手动相位、基线调整，以δ 0.01对化学位移δ 0.83-8.48进行积分；其中残余水峰δ 4.68-5.20不积分，以消除残余水峰的影响；积分数据采用面积归一化处理；最终导出积分数据矩阵；

对各不同时期空白对照组与阿霉素肾病模型组尿液代谢轮廓数据进行主成分分析Principal component analysis, PCA、偏最小二乘法判别分析Partial least squarediscriminate analysis, PLS-DA和正交偏最小二乘法判别分析Orthogonal signalcorrection-partial least square discriminate analysis, OPLS-DA，依据S-plot分析中相关系数Coefficient>0.7、VIP>1以及两组间t-test（p<0.05）作为判别条件，寻找差异代谢物。

5.根据权利要求3所述的一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，其特征在于：步骤（3）中具体过程为：以不同时间点为横坐标，以各差异代谢物相对含量的变化率[(M-C)/C]为纵坐标，分别对各差异代谢物进行线性回归分析，选择实验进程中变化趋势一致的差异代谢物，且线性相关系数R²≥0.7作为潜在进展性标志物；以潜在进展性标志物为变量进行PCA，依据各潜在进展性标志物的累计方差贡献率>0.80，筛选出主要的主成分贡献变量，进一步筛选出潜在进展性标志物；以上述潜在进展性标志物和各时间点大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择合适的相关分析方法，计算二者的相关系数，确定进展性标志物。

6.根据权利要求5所述的一种代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用，其特征在于：以潜在进展性标志物为变量进行PCA，依据各潜在进展性标志物的累计方差贡献率>0.80，筛选出主要的主成分贡献变量，进一步筛选出潜在进展性标志物；具体过程为：

以在整个实验周期中变化趋势一致的潜在进展性标志物为变量进行PCA，依据各潜在进展性标志物在不同因子上的载荷，选择载荷值>0.80，得出亮氨酸、2-羟基丁酸、鸟氨酸、N-乙酰-谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和马尿酸为主要的主成分贡献变量，可作为潜在进展性标志物。

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