CN111624264B - 一种用于早期检测移植肾急性排异的代谢组合物、筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于早期检测移植肾急性排异的代谢组合物，由氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖、棕榈酸、邻苯二酚10种代谢物组合中的一种或多种组成；本发明还公开了一种代谢组合物的筛选方法；本发明筛选的得到的代谢物组合物中，氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖水平升高，棕榈酸、邻苯二酚水平降低对急性排异的诊断有指导意义；该代谢物组合物中，代谢物单独指示率为0.609～0.762，结合指示率达到0.792；该代谢物组合物中，核心成分为蔗糖、半乳糖肌醇、乳糖、来苏糖、喹诺酮糖，共同参与半乳糖代谢途径。

Description

一种用于早期检测移植肾急性排异的代谢组合物、筛选方法 及应用

技术领域

本发明涉及一种用于早期检测移植肾急性排异的代谢组合物、筛选方法及应用。

背景技术

尿毒症是影响人类健康的重大疾病，肾移植是最有效的解决手段。自1954年成功开展第一例肾移植以来，60余年内全球已有近百万尿毒症患者接受肾移植手术，极大地改善了患者的生活质量。移植肾急性排斥反应(Acute Rejection，AR)是肾移植术后常见的并发症，可影响移植肾和患者的长期存活率。根据发病机制可分为细胞介导排斥反应(Cellular Mediated Rejection,CMR)和抗体介导排斥反应(Antibody MediatedRejection,AMR)两种类型。目前认为，急性排异发生的本质是细胞免疫应答，在异抗原刺激下T细胞发生活化，产生白介素IL-2并诱导致敏T细胞克隆增殖。急性排异多发生于移植后前3个月，移植后远期(5年以上)受者也会发生急性排异，但症状多不典型，若不能即时发现和处理可导致移植肾严重损害甚至失功[The impact of acute rejection in kidneytransplantation on long-term allograft and patient outcome.nephrourol,2015.7(1)]。

急性排异的发生多与免疫抑制剂用药调整有关。临床维持性免疫抑制方案通常包括钙调磷酸酶抑制剂(他克莫司或环孢素)、抗代谢药物(霉酚酸或硫唑嘌呤)和激素。免疫诱导方案采用抗胸腺球蛋白或者巴利昔单抗。钙调磷酸酶抑制剂不耐受患者药物调整为雷帕鸣素。目前不断有新型强效免疫抑制剂方案得到推广，在创新探索中急性排异的发生率显著下降，但是亚临床排异和临界改变的发生率未见明显降低，移植肾长期存活率未得到显著改善[Effect of histological damage on long-term kidney transplantoutcome.ransplantation,2001.71(4):p.515-23]。因此，急性排异的早期诊断是提高移植肾及患者长期存活率的关键措施，也是肾移植领域研究亟待解决的重要难题。

急性排异是多种生物学调控的复杂过程，很难利用单个生物标志物全面反映移植肾功能状态。需结合临床表现、肾功能检查、影像学检查及肾穿刺活检等进行诊断。典型的临床表现为移植肾肿胀、疼痛或伴发血尿，突发的不可解释的血压升高，发热，尿量减少和重量增加。血肌酐水平升高被认为是移植物功能障碍的常规标记。然而肌酐缺乏灵敏度和特异性，其升高水平与组织损伤程度并不一致，只有当急性排异严重到损耗肾功能时血肌酐才会升高，故而不能反映急性排异的早期阶段。从代谢与分布的生理学角度来看，血肌酐还受到其分布及分泌等综合作用的影响。尿量也是临床中检测肾功能的重要指标，但更易受到容量状态、药物等非肾脏因素影响。移植后早期尿量减少，可能为单纯性肾小管损伤，也有可能伴随急性排斥反应，处理措施截然不同。单纯性肾小管损伤，早期需要透析过度；若合并急性排斥反应，则需要调整抗排异治疗方案。目前诊断急性排异的金标准为移植肾穿刺活检，主要依据移植物内细胞的浸润情况作出判断。然而活检为有创性检查，可能出现肾包膜下血肿、血尿、动静脉瘘等并发症；穿刺点局部的病理情况往往不能反映肾脏的整体状态，难以动态监测移植肾的病理变化；取材的质量和病理诊断水平也影响临床应用价值。综上所述，我们亟需建立一种高特异性、无创性、早期诊断急性排异的方法。

近年来“组学”技术成为生命科学研究热点，包括基因组学、转录组学和蛋白质组学。基因组学描述生物活动的“蓝图”，转录组学探索可能发生的生物事件，蛋白组学反映“蓝图”指导下导致“事件发生”的方式。实际上许多生命活动是发生在代谢层面的，如细胞信号释放，能量传递，细胞间通信等。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白组学之后新发展起来的“组学”成员。1999年，Nicholson首次提出了代谢学的概念[metabonomicsunderstanding the metabolic responses of living systems to pathophysiologicalsyimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopicdata.xenobiotica,1999.29:p.1181-1189]。狭义“代谢组学”指生物细胞、组织和器官作为新陈代谢基础的小分子(<1kD)产物。广义代谢组学指用定性和定量的高通量检测方法，全面、动态分析生物系统中内源性或外源性的代谢物，反映生物个体在生理和病理状态下机体发生的复杂代谢反应变化情况。

过去已有一些研究从代谢物水平寻找供体损伤、移植后肾功能评估、肾功能障碍等相关的血清、尿液标记物。Ichimura T等利用表象差异分析法发现急性肾损伤诊断生物标记物KIM-1[Kidney injury molecule-1(KIM-1),a putative epithelial celladhesion molecule containing a novel immunoglobulin domain,is up-regulated inrenal cells after injury.J Biol Chem,1998.273(7):p.4135-42]。Muramatsu Y等通过扣除杂交的方法发现急性肾损伤早期诊断标记物Cyr61[Early detection of cysteinerich protein 61(CYR61,CCN1)in urine following renal ischemic reperfusioninjury.Kidney Int,2002.62(5):p.1601-10]。尽管如此，目前对肾移植术后以急性排异为典型的早期肾功能损害事件生物标记物的发现仍处于探索阶段，缺特异性和敏感性较高的有效手段。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种用于早期检测移植肾急性排异的代谢组合物、筛选方法及应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于早期检测移植肾急性排异的代谢组合物，由氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖、棕榈酸、邻苯二酚10种代谢物组合中的一种或多种组成。

一种代谢组合物的筛选方法，该方法用于筛选以上所述的代谢组合物，包括以下步骤：

(1)从急性排异组、移植稳定组、健康对照组中获得尿液样品，对尿液样品进行预处理；

(2)样品应用超高效液相色谱系统HILIC和RPLC进行分离；

(3)经步骤(2)分离后的样品用质谱仪进行质谱分析；

(4)将原始数据进行处理，每个样品生成包含核质比、保留时间、峰面积三维信息的CSV数据；

(5)从数据库中搜索，根据匹配因子推测识别代谢物，得到可识别的代谢物；

(6)选择每个样品中均测到的代谢物的CSV数据，进行多维统计分析；

(7)根据OPLS-DA负离子模型得到变量权重值VIP，以VIP>1为标准，筛选找到潜在代谢物；

(8)对步骤(7)中的潜在代谢物进行单变量统计分析，以单变量统计分析p值<0.1为筛选标准，进行筛选，得到代谢组合物。

进一步地，步骤(2)中，柱温25℃，流速300μL/min，进样量300μL，整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。

进一步地，步骤(3)中，质谱分析分别采用电喷雾电离正离子和负离子模式进行检测。

进一步地，步骤(5)中，设定匹配因子在80％之上的化合物为可识别。

进一步地，步骤(6)中多维统计分析包括无监督的PCA分析和有监督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析方法。

进一步地，本发明代谢组合物的筛选方法，还包括步骤(9)对代谢组合物先采用HMDB数据库检索比对，再结合KEGG对差异性代谢通路进行分析。

本发明还提供了一种代谢组合物在监测、诊断和评估肾移植术后不良事件中的应用。此处的代谢组合物为以上筛选得到的代谢组合物。

本发明的有益效果是：

(1)本发明选择氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖、棕榈酸、邻苯二酚10种代谢物中的一种或多种作为生物标志物，该代谢物组合在肾移植术后急性排异患者尿液中的水平显著不同于正常移植受体，该代谢物组合可用于早期检测移植肾是否发生急性排异。

(2)本发明筛选得到的代谢物组合物中，氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖水平升高，棕榈酸、邻苯二酚水平降低对急性排异的诊断有指导意义；该代谢物组合物中，代谢物单独指示率为0.609～0.762，结合指示率达到0.792；该代谢物组合物中，核心成分为蔗糖、半乳糖肌醇、乳糖、来苏糖、喹诺酮糖，共同参与半乳糖代谢途径；该代谢物组合物中，差异性代谢物越多，对急性排异指示率越高。

附图说明

图1是质控(QC)样本泊松相关性分析结果。

图2急性排异组、移植稳定组和健康对照组的质谱总离子流(TIC)重叠色谱图(其中，箭头部分代表差异显著的峰)。

图3是急性排异组、移植稳定组和健康对照组尿液上清样本的PLS-DA分析结果及S载荷图。

图4是急性排异组、移植稳定组和健康对照组尿液上清样本的OPLS-DA分析结果及S载荷图。

图5是重要差异性通路半乳糖途径KEGG示例图。

图6是10种差异性代谢物在AR组和移植稳定组中的定量比较，以及对急性排斥反应的单独指示率。

图7是10种差异性代谢物对急性排斥反应的结合指示率。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。

甲酸(Fluka，06450)，乙腈(Merck，1499230-935)，乙酸铵(Sigma)，氟化铵(Sigma)均通过商业途径购得。

实施例1

肾移植术后具有少尿、发热、体重增加等临床表现，术后1年内血肌酐较基线值升高20％以上，移植肾穿刺活检明确存在急性排异的患者作为急性排异组即AR组，肾移植术后肾功能恢复稳定患者作为移植稳定组，健康人群作为健康对照组，从以上3组中获得尿液样品。

如果急性排异组为接受2次肾移植手术、多器官联合移植手术或死刑犯供肾手术，未明确活检，或发生急性排异时合并多瘤病毒感染、急性肾小管损伤，则将他们排除。如果移植稳定组肾移植术后肌酐未能稳定在基线值20％波动范围内，或术后早期出现尿漏、淋巴漏、延迟复功、肾周血肿等并发症，或移植后2年内失访，则将他们排除。所有移植肾活检病理诊断均由科室移植病理医生根据Banff2003[6]作出诊断。

样品收集

对于符合入选标准且已提供知情同意的患者，于穿刺当日早晨收集尿液样品，取尿时用50ml离心管，一小时内3000rpm 4℃低温离心10分钟去除沉渣，分别取上清1ml于2mleppendorf管，分装成2份保存于-80℃超低温冰箱。样品储存和运输置于干冰环境。

样品预处理

样品在4℃环境下缓慢解冻后，分别取每个样品100μL，加入400μL预冷甲醇/乙腈溶液(1：1，v/v)，涡旋混合，-20℃静置60min，14000g，4℃离心20min，取上清，真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1：1，v/v)复溶，涡旋，14000g，4℃离心15min，取上清液进行分析。

样品检测

(1)色谱条件：样品应用Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC和RPLC进行分离。柱温25℃，流速300μL/min，进样量300μL，整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。HILIC色谱柱的流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水；B：乙腈。乙腈的梯度洗脱程序如下：0～1min为85％B；1～12min B从85％线性变化到65％；12～12.1min B从65％线性变化到40％；12.1～15min B维持在40％；15～15.1min B从40％线性变化到85％；15.1～20min B维持在85％。

为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中随机插入质控(Quality Control,QC)样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可行性。QC样品的预处理流程与样品相同。

(2)Q-TOF质谱条件：分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后用Triple TOF 5600质谱仪进行质谱分析。HILIC色谱分离后的ESI源条件如下：Ion Source Gas1(Gas 1):60,Ion Source Gas2(Gas 2):60,Curtain gas(CUR):30,source temperature:600℃，IonSapary Voltage Floating(ISVF)±5500V(正负两种模式)；TOF MS scan m/z range:60-1000Da,product ion scan m/z range:25-1000Da,TOFMS scan accumulation time 0.20s/spectra,product ion scan accumulation time0.05s/spectra；二级质谱采用information dependent acquisition(IDA)获得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential(DP):±60V(正负两种模式)，CollisionEnergy:35±15eV，IDA设置如下：Exclude isotopes within 4 Da,Candidate ions tomonitor per cycle:6。

数据处理

将原始数据按质量数生成离子流提取数据，经Proteo Wizard转换成.mzML格式，采用XCMS进行峰匹配，去噪音，去卷积等操作，生成MHD数据；将MHD数据导入工具包，每个样品生成包含核质比、保留时间、峰面积三维信息的CSV数据。然后从实验室自建数据库中搜索，根据匹配因子推测识别代谢物，设定匹配因子在80％之上的化合物为可识别，这样可以排除非内源性代谢物(药物、试剂的代谢物)的影响，提高准确率。CSV数据经取对数，总体信号值做归一化处理。

为尽量减少缺失值的误差，筛选每个样品中均测到的化合物做进一步分析。然后应用SIMCA-P 14.1(Umetrics,Umea,Sweden)软件和MetaboAnalyst网站(www.metaboanalyst.ca)进行多维统计分析，构建统计分析模型。多维统计分析通常包括无监督的PCA分析和有监督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析方法；根据不同模型(PLS-DA/OPLS-DA)中的S载荷图获得对分类有贡献的特征性变量及其贡献大小，并通过S载荷图和变量在投影中的重要性(Variable Importance in the Projection,VIP>1)找到潜在生物标记物(即生物代谢物)。之后对这些潜在的生物代谢物进行单变量统计分析，根据p值<0.1的原则筛选具有统计学意义的差异性代谢物。单变量统计分析方法包括t检验和变异倍数分析，以及综合以上两种方法的利用R软件绘制火山图。对经过多维统计分析和单变量统计分析筛选后的代谢物采用HMDB数据库(www.hmdb.ca)检索比对，并结合KEGG(www.genome.jp/kegg/)对差异性代谢通路进行分析。

统计学方法

临床资料分析：所有连续变量用均数±标准差(X±SD)表示，计数资料以频数及百分数表示。非匹配计量资料的比较，若符合正态分布，采用t检验；如不符合正态分布，进行对数变换并进行正态性检验。对数变换后如符合正态分布，采用t检验，如仍不符合正态分布，则采用Mann-Whitney分析。所有数据用SPSS 11.5统计软件分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

代谢特征分析：代谢物信号值与外标信号值相比去除系统误差，用t检验分析组间代谢物含量的统计学差异，利用VB 6.0自编程序对数据进行降维和特征提取，进行偏最小二乘法(PLS)统计分析；利用留一法(leave-one-out)建立预测模型，对鉴定出的差异性代谢物的预测敏感性和特异性进行验证。

结果

质控(QC)样本用于测定进样前仪器状态，平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。如图1所示，质控(QC)样本泊松相关性分析结果提示整个实验过程中仪器误差引起的变异较小，本次实验的仪器分析系统稳定性较好，实验数据稳定可靠。

质谱分析得到的急性排异组(即AR组)、移植稳定组和健康对照组的质谱总离子流(TIC)重叠色谱图如图2所示，箭头部分代表差异显著的峰；健康对照组、移植稳定组和急性排异组尿液的色谱图的比较可以发现一些谱峰在组间存在着明显的差异。

对急性排异组(即AR组)、移植稳定组和健康对照组的CSV数据进行偏最小二乘法(PLS-DA)分析；如图3所示，急性排异组、移植稳定组、健康对照组中两两组间的代谢物分布能够很好区分，各组之间代谢谱存在明显差异，S载荷图提示模型可靠性较高。

OPLS-DA法运用正交偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型。该方法在PLS-DA的基础上进行修正，滤除分类信息无关的噪音，提高了模型的解析能力和有效性。在载荷图中S曲线两端的数据代表了来自每个样品组可信度最高的特征离子。如图4所示，急性排异组、移植稳定组、健康对照组中两两组间的代谢物分布能够很好区分，各组之间代谢谱存在明显差异，S载荷图提示模型可靠性较高。

表1是PLS-DA和OPLS-DA两种模型解释率及预测率。R2Y代表模型解释率；Q2代表模型预测率，且越接近1代表该模型的预测能力越高。综合比较之后，选择OPLS-DA负离子模式下筛选出的代谢物作进一步研究；如图4所示，该模式对急性排异组(AR)和移植稳定组(GS)两组间差异代谢物的解释率R2Y为0.689，预测率Q2为0.328，对急性排异组(AR)和健康对照组(HC)两组间差异代谢物的解释率R2Y为0.938，预测率Q2为0.756，对移植稳定组(GS)和健康对照组(HC)两组间差异代谢物的解释率R2Y为0.929，预测率Q2为0.74。

表1 PLS-DA和OPLS-DA两种模式的比较

根据OPLS-DA负离子模型得到的变量权重值(Variable Importance for theProjection,VIP)来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物学意义的差异代谢物。

本实验以VIP>1且单变量统计分析(包括t检验和变异系数分析)p值<0.1为筛选标准。最终筛选出氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖、棕榈酸、邻苯二酚10种代谢物组合中的一种或多种组成；其中，AR组与移植稳定组相比，氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖在AR组较移植稳定组水平升高，棕榈酸、邻苯二酚在AR组较移植稳定组水平降低对急性排异的诊断有指导意义。

经HMDB数据库(www.hmdb.ca)检索比对，并结合KEGG(www.genome.jp/kegg/)进行差异通路分析筛选。

如表2所示，氨基蝶呤、蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖水平升高，棕榈酸、邻苯二酚水平降低对急性排异的诊断有指导意义。核心成分为蔗糖、半乳糖肌醇、乳糖、来苏糖、喹诺酮糖，共同参与半乳糖代谢途径。

重要差异性通路半乳糖途径KEGG示例图如图5所示，从该图种可以发现10种差异性代谢物的核心成分为蔗糖、半乳糖肌醇、乳糖、来苏糖、喹诺酮糖5种，共同参与半乳糖代谢途径。

表2筛选后具有代表性的反应急性排异的差异性代谢物。

10种差异性代谢物在AR组和移植稳定组中的定量比较，及10种差异性代谢物对急性排斥反应的单独指示率如图6所示，该组合中代谢物对急性排斥反应的单独指示率为0.609～0.762；10种差异性代谢物对急性排斥反应的结合指示率如图7所示，该组合中代谢物对急性排斥反应的结合指示率达到0.792，组合中差异性代谢物越多，对急性排异指示率越高。

结论

移植后急性排异患者与移植稳定患者尿液中蔗糖、雌酚酮、半乳糖肌醇、可的松、异鼠李糖、乳糖、来苏糖、棕榈酸、邻苯二酚代谢水平存在显著差异，对急性排斥反应的结合指示率为0.792；其中半乳糖代谢通路为重要差异途径。

Claims (7)

1.一种代谢组合物在制备用于早期检测移植肾急性排异试剂中的应用，其特征是，所述代谢组合物由蔗糖、半乳糖肌醇、喹诺酮糖、乳糖、来苏糖5种代谢物组成。

2.一种代谢组合物的筛选方法，其特征在于，该方法用于筛选权利要求1所述的代谢组合物，包括以下步骤：

（1）从急性排异组、移植稳定组、健康对照组中获得尿液样品，对尿液样品进行预处理；

（2）样品应用超高效液相色谱系统HILIC和RPLC进行分离；

（3）经步骤（2）分离后的样品用质谱仪进行质谱分析；

（4）将原始数据进行处理，每个样品生成包含核质比、保留时间、峰面积三维信息的CSV数据；

（5）从数据库中搜索，根据匹配因子推测识别代谢物，得到可识别的代谢物；

（6）选择每个样品中均测到的代谢物的CSV数据，进行多维统计分析；

（7）根据OPLS-DA负离子模型得到变量权重值VIP，以VIP>1为标准，筛选找到潜在代谢物；

（8）对步骤（7）中的潜在代谢物进行单变量统计分析，以单变量统计分析p值<0.1为筛选标准，进行筛选，得到代谢组合物；

超高效液相色谱系统中，采用HILIC色谱柱，HILIC色谱柱的流动相组成 A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水；B：乙腈；乙腈的梯度洗脱程序如下：0~1min为85%B；1~12min B从85%线性变化到65%；12~12.1min B从65%线性变化到40%；12.1~15 min B维持在40%；15~15.1min B从40%线性变化到85%；15.1~20min B维持在85%。

3.根据权利要求2所述的一种代谢组合物的筛选方法，其特征在于， 步骤（2）中，柱温25℃，流速300μL/min，进样量300μL，整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。

4.根据权利要求2所述的一种代谢组合物的筛选方法，其特征在于， 步骤（3）中，质谱分析分别采用电喷雾电离正离子和负离子模式进行检测。

5.根据权利要求2所述的一种代谢组合物的筛选方法，其特征在于， 步骤（5）中，设定匹配因子在80%之上的化合物为可识别。

6.根据权利要求2所述的一种代谢组合物的筛选方法，其特征在于， 步骤（6）中多维统计分析包括无监督的PCA分析和有监督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析方法。

7.根据权利要求2所述的一种代谢组合物的筛选方法，其特征在于，还包括步骤（9）对代谢组合物先采用HMDB数据库检索比对，再结合KEGG对差异性代谢通路进行分析。

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