JP6755703B2 - がんの検出法 - Google Patents
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(背景)
本願は、タンパク質およびそれらタンパク質のペプチドフラグメントを包含し、これらは、上記タンパク質のタンパク質分解消化によって生成され、それらタンパク質およびペプチドフラグメントの両方が、がんを診断するか、または個体におけるがんの存在についてモニタリングするために有用である。
被験体ががんを有するかどうかを決定するための方法が、本明細書で提供される。方法は、上記被験体からサンプルを得る工程、および以下から選択されかつ表1に列挙されるとおりのマーカーのうちの少なくとも1種のレベルを検出する工程を包含する:Igλ鎖V−IV領域Hil(LV403)、Ig重鎖V−III BRO(HV305)、Ig重鎖V−III VH26(HV303)、β−2−ミクログロブリン(B2MG)、リポカリン−1(LCN1)、亜鉛−α−2−糖タンパク質(ZA2G)、シスタチンB(CYTB)、アンチロイコプロテイナーゼ(SLP1)、ガレクチン−3(LEG3)、ヒスチジントリアドヌクレオチド結合タンパク質1(D6RD60)、S100A9(S10A9)、S100A8(S10A8)、ガレクチン−3−結合タンパク質(LG3BP)、Igα−1鎖C領域のクラスター(IGHA1)、Igκ鎖V−III領域HAHのクラスター(KV312)、VEGF共調節ケモカイン1(VCC1)、L−乳酸デヒドロゲナーゼA鎖(LDHA)、アルド−ケトレダクターゼファミリー1メンバーC(AKR1C1)、ルートレチン(B1AKD8)、L−乳酸デヒドロゲナーゼB鎖(LDHB)、レチナールデヒドロゲナーゼ1(AL1A1)、性質不明タンパク質(B4E1Z4)、α−1−アンチキモトリプシン(AACT)、スーパーオキシドジスムターゼ[Cu−Zn](SODC)、SPARC様タンパク質1(SPRL1)、Ig重鎖V−III領域TIL(HV304)、ケラチン(K1C9)、シスタチン−SN(CYTN)、α−アクチニン−4(ACTN4)、Igλ−3鎖C領域(フラグメント)(IGLC3)、免疫グロブリンλ様ポリペプチド5(IGLL5)、アルコールデヒドロゲナーゼ1C(ADHIG)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア(MDHM)、カルモジュリン様タンパク質5(CALL5)、α−1−アンチトリプシン(A1AT)、α−1B−糖タンパク質(A1BG)、ロイシンリッチα−2−糖タンパク質(A2GL)、低分子ユビキチン様修飾因子3(A8MU27)、前勾配タンパク質(Anterior gradient protein)2ホモログ(AGR2)、プロフィリン−1(PROF1)、Igλ鎖V−III領域LOIのクラスター(LV302)、プロトロンビン(E9PIT3)、ヘモペキシン(HEMO)、Igγ−2鎖C領域(IGHG2)、ユビキチン−40Sリボソームタンパク質S27a(RPS27A)、アファミン(Afamin)(AFAM)、アポリポプロテインA−I(APOA1)、アポリポプロテインA−IV(APOA4)、フラビンレダクターゼ(NADPH)(BLVRB)、プロサポシン(PSAP)、ラクリチン(LACRT)、60S酸性リボソームタンパク質P1(RLA1)、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖H2(ITIH2)、ムチン様タンパク質1(MUCL1)、S100 A6(S100A6)、Na(+)/H(+)交換調節補因子NHE−RF1(NHRF1)、チオレドキシンドメイン含有タンパク質17(I3L0K2)、リンパ球特異的タンパク質(LSP1)、ハプトグロビンのクラスター(H3BS21)、ミオシン調節性軽鎖12A(J2QRS3)、リボヌクレアーゼインヒビター(RINI)、α−エノラーゼ(ENOA)、Igκ鎖V−I領域EUのクラスター(KV106)、アルコールデヒドロゲナーゼクラス4μ/σ鎖(ADH7)、プロテインAMBP(AMBP)、アンギオテンシノゲン(ANGT)、アンチトロンビン−III(ANT3)、アポリポプロテインA−II(APOA2)、カルパスタチン(B7Z574)、脳酸可溶性タンパク質1(BASP1)、α−2−HS−糖タンパク質(C9JV77)、カルレティキュリン(CALR)、カルパイン−1触媒サブユニット(CAN1)、細胞分裂制御タンパク質42ホモログ(CDC42)、補体C3(CO3)、コロニン−1A (COR1A)、プログラム細胞死6相互作用タンパク質(DCD)、ディフェンシン(Definsin)1(DEF1)、Fボックスオンリープロテイン(F−box only protein)50(FBX50)、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ(GGCT)、グルタチオンレダクターゼ、ミトコンドリア(GSHR)、ケラチン、タイプII細胞骨格1(K2C1)、UMP−CMPキナーゼ(KCY)、メソテリン(MSLN)、N−アセチルムラモイル−L−アラニンアミダーゼ(PGRP2)、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(PNCB)、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖H1(ITIH1)、リボヌクレアーゼT2(RNASET2)、スーパーオキシドジスムターゼ[Mn]、ミトコンドリア(SODM)、低分子プロリンリッチタンパク質3(SPRR3)、Src基質コルタクチン(SRC8)、チューブリンβ−4B鎖のクラスター(TBB4B)、トロポミオシンα−3鎖(TPM3)、セロトランスフェリン(TRFE)、グルタチオンS−トランスフェラーゼP(THIO)、ビトロネクチン(VTNC)、ビタミンD結合タンパク質(Q6LDC6)、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖H4(ITIH4)、メタロプロテアーゼインヒビター(TIMP1)、熱ショックタンパク質90(HSP90)、カテプシンB(CATB)、セルロプラスミン(CERU)、カルプロテクチン、14−3−3σ(1433S)、α−2−hs−糖タンパク質(FETUA)、α−2−マクログロブリン(A2MG)、トランスサイレチン(TTHY)。上記被験体は、これらマーカーのレベルががんのない被験体に由来するコントロールサンプルにおける上記マーカーのレベルと比較して変化する場合に、がんを有する可能性がある。上記サンプルは、最適には、眼のサンプル(例えば、単離された涙液サンプルもしくは眼の洗浄物)であるが、同様に、唾液もしくは他の体液に由来し得る。眼のサンプルは、涙腺およびリンパ系と接続する他の組織からの分泌物を含む涙液サンプルを示す。
1.被験体ががんを有するかどうかを決定する方法であって、該方法は、該被験体からサンプルを採取する工程;該サンプルにおいて、表1に提供されるマーカーのリストからのマーカーのうちの少なくとも1つのレベルを検出する工程を行う工程;および該マーカーのレベルががんのないコントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して変化する場合に、該被験体ががんを有するかもしくはがんを有する可能性があることを決定する工程を包含する方法。
2.前記がんは乳がんである、項目1に記載の方法。
3.前記サンプルは、眼のサンプルである、項目1〜2のいずれかに記載の方法。
4.前記被験体はヒトである、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
5.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超低下している、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
6.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
7.マーカーの組み合わせは、前記被験体におけるがんの可能性を決定するために使用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
8.前記マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
9.前記マーカーのレベルは、抗体ベースの検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
10.前記マーカーのレベルは、多重タンパク質検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
11.前記マーカーのレベルは、mRNA検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
12.前記被験体は、がんを有すると疑われる、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
13.前記被験体は、がんを発生するリスクが増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
14.前記被験体は、がん性であると疑われる触診可能なしこりを有する、項目2に記載の方法。
15.前記被験体の乳房密度は、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3もしくはカテゴリー4である、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
16.前記がんは、乳がんのステージとして検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
17.少なくとも10種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
18.少なくとも5種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
19.少なくとも3種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
20.収集チューブおよびプロテアーゼインヒビター、もしくは他のタンパク質安定化剤を含む、先行する項目のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
21.前記マーカーのうちの少なくとも1種に結合し得る抗体をさらに含む、項目20に記載のキット。
22.前記マーカーのうちの少なくとも1種を増幅し得るプライマー対をさらに含む、項目20または21に記載のキット。
A1.表1に提供されるマーカーのリストからのマーカーのうちの少なくとも1種のレベルを、被験体ががんを有するかどうかを決定するための指標とする方法であって、該方法は、該被験体から得られたサンプルにおいて、表1に提供されるマーカーのリストからのマーカーのうちの少なくとも1種の該サンプル中のレベルを検出する工程であって、ここでがんのないコントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較しての該マーカーのレベルの変化は、該被験体ががんを有するかもしくはがんを有する可能性があることを示す工程、を必要に応じて包含する方法。
A2.前記がんは乳がんである、項目A1に記載の方法。
A3.前記サンプルは、眼のサンプルである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
A4.前記被験体はヒトである、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A5.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超低下している、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A6.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A7.マーカーの組み合わせは、前記被験体におけるがんの可能性を決定するために使用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A8.前記マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A9.前記マーカーのレベルは、抗体ベースの検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A10.前記マーカーのレベルは、多重タンパク質検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A11. 前記マーカーのレベルは、mRNA検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A12. 前記被験体は、がんを有すると疑われる、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A13. 前記被験体は、がんを発生するリスクが増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A14.前記被験体は、がん性であると疑われる触診可能なしこりを有する、項目A2に記載の方法。
A15.前記被験体の乳房密度は、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3もしくはカテゴリー4である、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A16.前記がんは、乳がんのステージとして検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A17.少なくとも10種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A18.少なくとも5種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A19. 少なくとも3種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の方法。
A20.収集チューブおよびプロテアーゼインヒビター、もしくは他のタンパク質安定化剤を含む、先行する項目のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
A21.前記マーカーのうちの少なくとも1種に結合し得る抗体をさらに含む、項目A20に記載のキット。
A22. 前記マーカーのうちの少なくとも1種を増幅し得るプライマー対をさらに含む、項目A20またはA21に記載のキット。
B1.被験体が表1に提供されるマーカーのリストからのマーカーのうちの少なくとも1種を含むがんを有するかどうかを決定するためのマーカーであって、ここでがんのないコントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較した場合に、該被験体に由来するサンプル中の該マーカーのレベルにおける変化は、該被験体ががんを有するかまたはがんを有する可能性があることを示す、マーカー。
B2.前記がんは乳がんである、項目B1に記載のマーカー。
B3.前記サンプルは、眼のサンプルである、先行する項目のいずれかに記載のマーカー。
B4.前記被験体はヒトである、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカー。
B5.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超低下している、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカー。
B6.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカー。
B7.前記マーカーは、前記被験体におけるがんの可能性を決定するために使用される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーの組み合わせ。
B8.前記マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B9.前記マーカーのレベルは、抗体ベースの検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B10.前記マーカーのレベルは、多重タンパク質検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B11.前記マーカーのレベルは、mRNA検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B12.前記被験体は、がんを有すると疑われる、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B13.前記被験体は、がんを発生するリスクが増加している、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B14.前記被験体は、がん性であると疑われる触診可能なしこりを有する、項目B2に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B15.前記被験体の乳房密度は、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3もしくはカテゴリー4である、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B16.前記がんは、乳がんのステージとして検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B17.少なくとも10種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B18.少なくとも5種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B19.少なくとも3種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせ。
B20.収集チューブおよびプロテアーゼインヒビター、もしくは他のタンパク質安定化剤を含む、先行する項目のいずれか1項に記載のマーカーもしくは組み合わせを使用して、被験体ががんを有するかどうかを決定するためのキット。
B21.前記マーカーのうちの少なくとも1種に結合し得る抗体をさらに含む、項目B20に記載のキット。
B22.前記マーカーのうちの少なくとも1種を増幅し得るプライマー対をさらに含む、項目B20またはB21に記載のキット。
C1.被験体ががんを有するかどうかを検出するための検出剤であって、該検出剤は、該被験体のサンプルにおいて、表1に提供されるマーカーのリストのマーカーのうちの少なくとも1種のレベルを検出するための剤もしくは手段を含み;ここでがんのないコントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較した場合の該マーカーのレベルにおける変化は、該被験体ががんを有するかまたはがんを有する可能性があることを示す、検出剤。
C2.前記がんは乳がんである、項目C1に記載の検出剤。
C3.前記サンプルは、眼のサンプルである、先行する項目のいずれかに記載の検出剤。
C4.前記被験体はヒトである、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C5.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超低下している、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C6.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C7.マーカーの組み合わせは、前記被験体におけるがんの可能性を決定するために使用される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C8.前記マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C9.前記マーカーのレベルは、抗体ベースの検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C10.前記マーカーのレベルは、多重タンパク質検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C11.前記マーカーのレベルは、mRNA検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C12.前記被験体は、がんを有すると疑われる、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C13.前記被験体は、がんを発生するリスクが増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C14.前記被験体は、がん性であると疑われる触診可能なしこりを有する、項目C2に記載の検出剤。
C15.前記被験体の乳房密度は、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3もしくはカテゴリー4である、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C16.前記がんは、乳がんのステージとして検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C17.少なくとも10種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C18.少なくとも5種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C19.少なくとも3種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤。
C20.先行する項目のいずれか1項に記載の検出剤、収集チューブおよびプロテアーゼインヒビター、もしくは他のタンパク質安定化剤を含む、被験体ががんを有するかどうかを決定するためのキット。
C21.前記マーカーのうちの少なくとも1種に結合し得る抗体をさらに含む、項目C20に記載のキット。
C22. 前記マーカーのうちの少なくとも1種を増幅し得るプライマー対をさらに含む、項目C20またはC21に記載のキット。
D1.被験体ががんを有するかどうかを決定するための診断剤であって、該診断剤は、該被験体のサンプルにおいて、表1に提供されるマーカーのリストのマーカーのうちの少なくとも1種のレベルを検出するための剤もしくは手段を含み;ここでがんのないコントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較した場合の該マーカーのレベルにおける変化は、該被験体ががんを有するかまたはがんを有する可能性があることを示す、診断剤。
D2.前記がんは乳がんである、項目D1に記載の診断剤。
D3.前記サンプルは、眼のサンプルである、先行する項目のいずれかに記載の診断剤。
D4.前記被験体はヒトである、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D5.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超低下している、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D6.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D7.マーカーの組み合わせは、前記被験体におけるがんの可能性を決定するために使用される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D8.前記マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D9.前記マーカーのレベルは、抗体ベースの検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D10.前記マーカーのレベルは、多重タンパク質検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D11. 前記マーカーのレベルは、mRNA検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D12.前記被験体は、がんを有すると疑われる、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D13.前記被験体は、がんを発生するリスクが増加している、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D14.前記被験体は、がん性であると疑われる触診可能なしこりを有する、項目D2に記載の診断剤。
D15.前記被験体の乳房密度は、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3もしくはカテゴリー4である、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D16.前記がんは、乳がんのステージとして検出される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D17.少なくとも10種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D18.少なくとも5種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D19.少なくとも3種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤。
D20.先行する項目のいずれか1項に記載の診断剤、収集チューブおよびプロテアーゼインヒビター、もしくは他のタンパク質安定化剤を含む、被験体ががんを有するかどうかを決定するためのキット。
D21.前記マーカーのうちの少なくとも1種に結合し得る抗体をさらに含む、D20に記載のキット。
D22.前記マーカーのうちの少なくとも1種を増幅し得るプライマー対をさらに含む、項目D20またはD21に記載のキット。
E1.被験体ががんを有するかどうかを決定するためのシステムであって、該システムは、該被験体からサンプルを得るための剤もしくはであって、該サンプルにおいて、表1に提供されるマーカーのリストのマーカーのうちの少なくとも1種のレベルを検出する工程を行うための剤もしくは手段;および該マーカーのレベルががんのないコントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して変化する場合に、該被験体ががんを有するかまたはがんを有する可能性があることを決定するための剤もしくは手段を含む、システム。
E2.前記がんは乳がんである、項目E1に記載のシステム。
E3.前記サンプルは、眼のサンプルである、先行する項目のいずれかに記載のシステム。
E4.前記被験体はヒトである、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E5.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超低下している、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E6.前記マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E7.マーカーの組み合わせは、前記被験体におけるがんの可能性を決定するために使用される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E8.前記マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E9.前記マーカーのレベルは、抗体ベースの検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E10.前記マーカーのレベルは、多重タンパク質検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E11.前記マーカーのレベルは、mRNA検出法によって検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E12.前記被験体は、がんを有すると疑われる、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E13.前記被験体は、がんを発生するリスクが増加している、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E14.前記被験体は、がん性であると疑われる触診可能なしこりを有する、項目E2に記載のシステム。
E15.前記被験体の乳房密度は、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3もしくはカテゴリー4である、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E16.前記がんは、乳がんのステージとして検出される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E17.少なくとも10種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E18.少なくとも5種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E19.少なくとも3種のマーカーが併用される、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E20.収集チューブおよびプロテアーゼインヒビター、もしくは他のタンパク質安定化システムをさらに含む、先行する項目のいずれか1項に記載のシステム。
E21.前記マーカーのうちの少なくとも1種に結合し得る抗体をさらに含む、項目E20に記載のシステム。
E22.前記マーカーのうちの少なくとも1種を増幅し得るプライマー対をさらに含む、項目E20またはE21に記載のシステム。
がんのないコントロールサンプルと比較した場合に、一連の生体マーカーのうちの少なくとも1種のレベルを測定することによって、がん、および特に乳がんを、被験体において検出するための方法およびキット。上記生体マーカーの発現は、がんのない被験体における発現レベルと比較した場合に、がんを有する被験体に由来するサンプルにおいて増加するかもしくは低下するかのいずれかである。上記サンプルは、最適には、眼のサンプル(例えば、単離された涙液サンプルもしくは眼の洗浄物)であるが、同様に唾液もしくは他の体液に由来し得る。キットは、収集チューブおよびプロテアーゼインヒビターもしくはタンパク質安定化剤を含み得る。
(詳細な説明)
本明細書で提供されるのは、眼のサンプルに由来するタンパク質およびトリプシン消化によって得られるペプチドフラグメントである。上記生成されるポリペプチドは、以下から選択されかつ表1に列挙されるとおりである:Igλ鎖V−IV領域Hil(LV403)、Ig重鎖V−III BRO(HV305)、Ig重鎖V−III VH26(HV303)、β−2−ミクログロブリン(B2MG)、リポカリン−1(LCN1)、亜鉛−α−2−糖タンパク質(ZA2G)、シスタチンB(CYTB)、アンチロイコプロテイナーゼ(SLP1)、ガレクチン−3(LEG3)、ヒスチジントリアドヌクレオチド結合タンパク質1(D6RD60)、S100A9(S10A9)、S100A8(S10A8)、ガレクチン−3−結合タンパク質(LG3BP)、Igα−1鎖C領域のクラスター(IGHA1)、Igκ鎖V−III領域HAHのクラスター(KV312)、VEGF共調節性ケモカイン1(VCC1)、L−乳酸デヒドロゲナーゼA鎖(LDHA)、アルド−ケトレダクターゼファミリー1メンバーC(AKR1C1)、ルートレチン(B1AKD8)、L−乳酸デヒドロゲナーゼB鎖(LDHB)、レチナールデヒドロゲナーゼ1(AL1A1)、性質不明タンパク質(B4E1Z4)、α−1−アンチキモトリプシン(AACT)、スーパーオキシドジスムターゼ[Cu−Zn](SODC)、SPARC様タンパク質1(SPRL1)、Ig重鎖V−III領域TIL(HV304)、ケラチン(K1C9)、シスタチン−SN(CYTN)、α−アクチニン−4(ACTN4)、Igλ−3鎖C領域(フラグメント)(IGLC3)、免疫グロブリンλ様ポリペプチド5(IGLL5)、アルコールデヒドロゲナーゼ1C(ADHIG)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア(MDHM)、カルモジュリン様タンパク質5(CALL5)、α−1−アンチトリプシン(A1AT)、α−1B−糖タンパク質(A1BG)、ロイシンリッチα−2−糖タンパク質(A2GL)、低分子ユビキチン様修飾因子3(A8MU27)、前勾配タンパク質2ホモログ(AGR2)、プロフィリン−1(PROF1)、Igλ鎖V−III領域LOIのクラスター(LV302)、プロトロンビン(E9PIT3)、ヘモペキシン(HEMO)、Igγ−2鎖C領域(IGHG2)、ユビキチン−40Sリボソームタンパク質S27a(RPS27A)、アファミン(AFAM)、アポリポプロテインA−I(APOA1)、アポリポプロテインA−IV(APOA4)、フラビンレダクターゼ(NADPH)(BLVRB)、プロサポシン(PSAP)、ラクリチン(LACRT)、60S酸性リボソームタンパク質P1(RLA1)、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖H2(ITIH2)、ムチン様タンパク質1(MUCL1)、S100 A6(S100A6)、Na(+)/H(+)交換調節性補因子NHE−RF1(NHRF1)、チオレドキシンドメイン含有タンパク質17(I3L0K2)、リンパ球特異的タンパク質(LSP1)、ハプトグロビンのクラスター(H3BS21)、ミオシン調節性軽鎖12A(J2QRS3)、リボヌクレアーゼインヒビター(RINI)、α−エノラーゼ(ENOA)、Igκ鎖V−I領域EUのクラスター(KV106)、アルコールデヒドロゲナーゼクラス4μ/σ鎖(ADH7)、プロテインAMBP(AMBP)、アンギオテンシノゲン(ANGT)、アンチトロンビン−III(ANT3)、アポリポプロテインA−II(APOA2)、カルパスタチン(B7Z574)、脳酸可溶性タンパク質1(BASP1)、α−2−HS−糖タンパク質(C9JV77)、カルレティキュリン(CALR)、カルパイン−1触媒サブユニット(CAN1)、細胞分裂制御タンパク質42ホモログ(CDC42)、補体C3(CO3)、コロニン−1A(COR1A)、プログラム細胞死6−相互作用タンパク質(DCD)、ディフェンシン1(DEF1)、F−ボックスオンリープロテイン50(FBX50)、γグルタミルシクロトランスフェラーゼ(GGCT)、グルタチオンレダクターゼ、ミトコンドリア(GSHR)、ケラチン、タイプII細胞骨格1(K2C1)、UMP−CMPキナーゼ(KCY)、メソテリン(MSLN)、N−アセチルムラモイル−L−アラニンアミダーゼ(PGRP2)、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(PNCB)、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖H1(ITIH1)、リボヌクレアーゼT2(RNASET2)、スーパーオキシドジスムターゼ[Mn]、ミトコンドリア(SODM)、低分子プロリンリッチタンパク質3(SPRR3)、Src基質コルタクチン(SRC8)、チューブリンβ−4B鎖のクラスター(TBB4B)、トロポミオシンα−3鎖(TPM3)、セロトランスフェリン(TRFE)、グルタチオンS−トランスフェラーゼP(THIO)、ビトロネクチン(VTNC)、ビタミンD結合タンパク質(Q6LDC6)、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖H4(ITIH4)、メタロプロテアーゼインヒビター(TIMP1)、熱ショックタンパク質90(HSP90)、カテプシンB(CATB)、セルロプラスミン(CERU)、カルプロテクチン、14−3−3σ(1433S)、α−2−hs−糖タンパク質(FETUA)、α−2−マクログロブリン(A2MG)、トランスサイレチン(TTHY)。トリプシン配列およびがんサンプルにおいてダウンレギュレートされると同定されたタンパク質の全長アミノ酸配列は、Appendix Iに提供される。
研究参加者を、治験審査委員会の承認の下で、Breast Health and Surgery Centers AR, OK, TNおよびWAで診てもらっている患者から採用した。全ての患者から同意を得、サンプル収集の前にもしくは患者情報シートを仕上げる前に、インフォームド・コンセントのコピーを得た。サンプルをクリニックの職員(すなわち、看護師および専門技術者)および/もしくはAscendant Dxの職員が収集した。患者選択に使用した包含/排除基準は、以下のとおりであった:
包含基準:
年齢が18〜100歳の間の個体
慣例の健康診断を呈示、または
異常試験もしくは検査の評価を呈示、または
触診可能な塊の評価を呈示、または
塊の一部が残っている限りは、生検前もしくは生検後に塊を呈示、または
乳がんと最近診断されたが、いかなる種類の処置も未だ受けていない。
年齢が18歳未満および100歳超の個体
眼の感染もしくは外傷を併発している、または
現在急性結膜炎に罹患している、または
乳がんと診断されて処置を受けている。
治験審査委員会の承認を、シルマーストリップ(GuldenOpthalmics Elkins Park, PA)を使用する涙液収集に関して得た。収集のために、シルマーストリップの丸くなった先端を、注ぎ口(lip)を形成する0mmラインで折った。折った部分を、参加者の下まぶたに配置し、彼らに眼を閉じて、その眼を閉じた状態で5分間にわたって保持するように要請した。5分後、上記ストリップを外し、滅菌した1.5mLの予めラベル貼付したスナップトップチューブの中に入れ、利用性に応じて−20℃もしくは−80℃に置いた。収集基準には、5分間の時間より前に35mmマークに達した場合には、上記ストリップが外され得ることが規定されていた。参加しているクリニックで収集したサンプルは1週間に1回の基本としてAscendant Dx職員が回収し、ドライアイスに入れてAscendant Dxの研究施設に運んだ。
タンパク質溶離を、滅菌したピンセットと鋏とを使って最初に上記ストリップをさいの目に切って、きれいな滅菌1.5mLスナップトップチューブの中に入れることによって行った。200μLの1×リン酸緩衝食塩水(PBS)を上記さいの目に切ったストリップに添加し、上記サンプルを、穏やかに振盪しながら4℃で3時間インキュベートした。溶離後に、上記サンプルを、卓上型遠心分離機で短時間遠心分離して、上記ストリップ断片を上記チューブの底に集め、その上清を、新しいきれいな1.5mLスナップトップチューブに移した。総タンパク質含有量を、標準的なビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用して決定し、上記サンプルを、さらに使用するときまで−80℃で貯蔵した。
実験1: 溶液中でトリプシン消化、続いてLC MS/MSを、University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS)のProteomic Coreが25の乳がんサンプル、25の良性サンプル、および25のコントロールサンプルに対して行った。溶液消化を、10mM トリス[2−カルボキシエチル]ホスフィン(Pierce)中での還元および50mM ヨードアセトアミド(Sigma−Aldrich)中でのアルキル化の後に、100ng ブタトリプシン(Promega)の添加および37℃で12〜16時間のインキュベーションによって、100mM 炭酸水素アンモニウム(Sigma−Aldrich)中で全ての75サンプルに対して行った。次いで、ペプチド生成物を、0.1% ギ酸(Fluka)中で酸性にした。トリプシン消化ペプチド(Tryptic peptide)を、逆相Jupiter Proteo樹脂(Phenomenex)によって、100×0.075mmカラム上でnanoAcquity UPLCシステム(Waters)を使用して分離した。ペプチドを、緩衝液A:B比97:3から35:65への80分間の勾配を使用して溶離した[緩衝液A=0.1% ギ酸、0.05% アセトニトリル;緩衝液B=0.1% ギ酸、75% アセトニトリル]。溶離したペプチドをエレクトロスプレー(1.8kV)によってイオン化し、続いて、LTQ Orbitrap Velos質量分析計(Thermo)での衝突誘起解離を使用してMS/MS分析を行った。MSデータを、375〜1500m/zの範囲にわたって、分解能60,000においてプロフィールモードでFTMS分析器を使用して獲得した。MS/MSデータを、上記イオントラップ分析器を質量中心モード(centroid mode)および正規化衝突エネルギー35.0での通常の質量範囲で使用して、各MSスキャンから上位15ピークについて獲得した。タンパク質を、Mascotサーチエンジン(Matrix Science)もしくはMaxQuant定量的プロテオミクスソフトウェア(Max Planck Institute)をデータベース検索することによって、MS/MSスペクトルから同定した。Mascotサーチ結果を、Scaffold(Proteome Software)を使用して編集した。
実験1: データを、マイクロソフトエクセル(登録商標)スプレッドシートソフトウェアと、全75サンプルに関して以前に同定されたタンパク質のうちの各々のスペクトル強度とを使用することによって、整理した。サンプル状態(がん、良性、コントロール)、がんタイプ、腫瘍サイズグループ分け(1=0.1mm〜1cm、2=1.1〜2.9cm、3=3cmもしくはそれ超)および腫瘍悪性度状態もまた、スプレッドシートに含めた。このスプレッドシードを、分析のためにJMPpro11ソフトウェアパッケージにアップロードした。
コントロールサンプルに対してがんサンプルにおいて発現レベルが増加している一連のタンパク質を、質量分析法によって観察し、いくつかの候補を、ELISAを使用してさらに検証するために選択した。S100A9を、コントロールと比較して乳がん患者の涙液中で増加した発現の代表例として選択した。LG3BPは、コントロールサンプルと比較して乳がんサンプル中で発現レベルが低下したタンパク質の代表として示される。標準的なELISAプロトコルを使用して、涙液中の発現レベルを評価した。S100A9およびLG3BPのデータを、R&D Systems(Minneapolis, MN)からDuoSetsとして購入したキットを使用して得た。ELISA手順を、R&D systemsによって提供された指示に従って行った。簡潔には、1×PBS中に推奨される作業濃度(GAL3BP 1.0μg/ml;S100A9 0.5μg/ml)に希釈した100μL/ウェルの捕捉抗体を、高結合96ウェルプレートに添加し、室温で一晩(約16時間)インキュベートした。上記プレートを、0.05% Tweenを含む1×PBSで4回すすぎ、きれいな吸収紙に対してブロットして、各すすぎ後のいかなる微量の液体も除去した。すすぎサイクルを、上記アッセイの各工程後に行った。ブロッキング緩衝液(1% BSAを含む1×PBS)を、全てのウェルに添加し(約200μL/ウェル)、上記プレートを、室温で2時間インキュベートした。涙液サンプルを、1%BSAを含む1×PBSを使用してS100A9については1:10および1:50、ならびにガレクチン3結合タンパク質については1:100および1:500の希釈度で希釈した。各アッセイについての標準曲線の線形領域内に入ることが既知の希釈物を、以前の最適化アッセイの結果に基づいて選択した。サンプルおよび標準物質を、100μL/ウェルを使用して二連で試験し、室温で2時間インキュベートした。検出抗体を、その推奨される作業濃度(GAL3BP 2μg/mlおよびS100A9 1μg/ml)に希釈し、100μLを各ウェルに添加し、上記プレートを室温で2時間インキュベートした。ストレプトアビジン−HRP溶液を各ウェルに添加し(100μL/ウェル)、室温で15分間インキュベートした。視覚化を、TMB基質溶液に添加によって達成した。15分後に、50μLの1M H2SO4を各ウェルに添加し、450nmの吸光度を決定した。ELISAデータを、GraphPadから入手可能なPrismバージョン6.0を使用して分析した。
Claims (22)
- 被験体から得られた涙腺サンプルにおける表1に提供されるマーカーのうちの少なくとも2つのレベルを、該被験体ががんを有するかまたはがんを有する可能性があるかどうかの指標とする方法であって、該方法は、該サンプルにおいて、表1に提供されるマーカーのうちの少なくとも2つのレベルを検出する工程を包含し、がんのないコントロールサンプルにおけるレベルと比較した、該サンプルにおける該少なくとも2つのレベルの変化が、該被験体ががんを有するかまたはがんを有する可能性があることを示し、ここで、該少なくとも2つのマーカーが、S100A9およびLG3BPを含み、S100A9のレベルが増加し、LG3BPのレベルが低下しており、該がんが乳がんである、方法。
- 前記被験体は、ヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記LG3BPマーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも、1.5倍、2倍、4倍またはそれ超低下している、請求項1または2に記載の方法。
- 前記S100A9マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、請求項1または2に記載の方法。
- 前記方法が、表1に提供されるマーカーのリストからの第3のマーカーのレベルを検出することを包含し、がんのないコントロールサンプルにおけるレベルと比較した、前記サンプルにおける該第3のマーカーのレベルの変化が、前記被験体が乳がんを有するかまたは乳がんを有する可能性があることを示し、ここで、該第3のマーカーがS100A8を含み、S100A8のレベルが増加する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記S100A8マーカーは、前記コントロールサンプルにおける該マーカーのレベルと比較して、少なくとも1.5倍、2倍、4倍またはそれ超増加している、請求項5に記載の方法。
- 前記マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって検出される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカーのレベルは、抗体ベースの検出法によって検出される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカーのレベルは、多重タンパク質検出法によって検出される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカーのレベルは、mRNA検出法によって検出される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験体は、がんを有すると疑われる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験体は、がんを発生するリスクが増加している、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験体は、がん性であると疑われる触診可能なしこりを有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験体の乳房密度は、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3もしくはカテゴリー4である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんは、乳がんのステージとして検出される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 収集チューブおよびプロテアーゼインヒビター、もしくは他のタンパク質安定化剤を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
- 前記マーカーに結合し得る抗体をさらに含む、請求項16に記載のキット。
- 前記マーカーを増幅し得るプライマー対をさらに含む、請求項16に記載のキット。
- イムノアッセイシステムであって、該システムが、
(a)ヒト被験体由来の涙腺分泌物サンプルであって、該被験体が、乳がんを有すると疑われているか、またはがん性であると疑われる触診可能なしこりを有し、該涙腺分泌物サンプルが、S100A9およびLG3BPを含む少なくとも2つのタンパク質マーカーを含む、サンプルと、
(b)結合剤、および(a)における該少なくとも2つのタンパク質マーカーに特異的な結合相互作用を提供して検出可能なシグナルの生成に基づいて定量され得る反応を生じさせる試薬と
を含み、がんのないコントロールサンプルと比較して、S100A9のレベルが増加し、LG3BPのレベルが低下している、イムノアッセイシステム。 - 前記涙腺分泌サンプルが、S100A8を含む第3のタンパク質マーカーを含み、前記結合剤が、該S100A8タンパク質マーカーに特異的に結合する抗体を含み、がんのないコントロールサンプルと比較して、S100A8のレベルが増加している、請求項19に記載のイムノアッセイシステム。
- 前記涙腺分泌物サンプルが眼の洗浄物サンプルである、請求項19または20に記載のイムノアッセイシステム。
- 前記被験体の乳房密度が、カテゴリー1、カテゴリー2、カテゴリー3またはカテゴリー4である、請求項19〜21のいずれか一項に記載のイムノアッセイシステム。
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