JP6026422B2 - 肺がん試験 - Google Patents

Description

肺がん、より具体的には非小細胞肺がんの診断のための方法について説明する。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に関する診断又は予後的重要性を有するバイオマーカーの組み合わせは、非小細胞肺がんを有する患者を同定することが可能な多検体血清試験を成立させるために結び付けられる。この試験の実行は、肺がんの診断かそれともＣＴベースのスクリーニングプロトコルに関するコンパニオン様式として患者を分類することだろう。

肺がんは、依然として、米国で二番目に多く診断されるがんであり、２００８年においておよそ１６１０００人の死亡を伴うがん死亡率の最も一般的な原因である。全ての肺がんの８０％が非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣｓ）である。肺がん患者の全体的な予後は、５年生存率が１５％未満と悪い一方、早期疾患と診断された患者は、はるかに良好な予後を有する。病理学的病期Ｉ及びＩＩの疾患の患者は、それぞれ５７〜６７％及び３８〜５５％の５年生存率を持っている。

残念なことに、ＮＳＣＬＣの患者の半分以上は、早期段階において無症候性の性質のため、リンパ節や遠隔部への転移した後でのみ示す。肺がんの死亡率を減少させるための最善の見通しが早期発見でされた場合は、手術結果が最高の予後を持つ。早期段階での発見を可能にするスクリーニングツールが肺がん死亡率の減少を可能にする。

乳房、大腸、前立腺及び子宮頸がんに関する認められたスクリーニングプログラムは、全体的な疾患の死亡率のその後の減少につれて開発された一方、肺がんのスクリーニングプログラムは、研究領域のままである。現在のところ、死亡率を減少させることが証明されている肺がんに関するハイリスクがある個体をスクリーニングするための確立された方法はない。したがって、ＮＳＣＬＣに関するスクリーニングは、現在のところ、どの主要な医師会でも推奨されていない。国が定めるスクリーニングプロトコルがなければ、検出及び肺がんに関する治療の開始における広い変動の可能性がある。１９５０年代以来、胸部Ｘ線、喀痰細胞診、気管支鏡処置、低線量スパイラルコンピュータ断層撮影法及び核酸又はタンパク質バイオマーカーを通じた分子診断を含む非常に多くのスクリーニング方法は、このために評価されている。これらの様式は、単独及びいくつかの組み合わせの両方で評価された。肺がんに関するスクリーニング研究は死亡率を減少させる有効性が証明されていないにも関わらず、これらの戦略のいくつかは、肺がんの進行の理解を改善し、潜在的な将来のスクリーニング及び治療様式の開発を可能にさせている。これらの方法論の中で最も期待できる組み合わせの１つは、コンパニオン血清試験を伴う低線量スパイラルコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）から構成されている。

胸部放射線透過写真法は、幅広い利用可能性、比較的低コスト及び使い勝手の良さのために、予備のスクリーニングツールとして歴史的に見て広く用いられてきた。しかしながら、ＣＴのようなより現代的な画像技術と比較したとき、放射線透過写真は非常に低い特異性及び感度を有する。それゆえ、放射線透過写真法は、初期段階の疾患の診断の中で非常にわずかな成功を持っている。スクリーニング試験は、胸部放射線透過写真が、ＣＴによる同様の研究で発見された初期段階の肺がんの６０〜８０％を検出できないことを実証した。最近のスパイラルＣＴの進歩は、現在ＮＳＣＬＣに用いられる他の様式よりも、むしろ、切除可能な段階での腫瘍の検出に有効な方法にした。

歴史的対象を通じて見られる初期段階の疾患の増加を伴った最近のスパイラルＣＴの研究から得られた期待できる結果にもかかわらず、ＣＴスクリーニングは、ＮＳＣＬＣから死亡率を減少させることがごく最近になって示されている。全米肺検診試験（ＮＬＳＴ）からのデータは、”ハイリスク”の患者のＣＴスクリーニングでのＮＳＣＬＣから死亡率の２０％の減少を実証している。しかしながら、ＣＴスクリーニングプロトコルは、潜在的実施を大いに導くかもしれないいくつかの制限を有している。例えば、技術の相対的に高い感度を考えると、低い特異性と相俟って、多くの良性の病変は、疑わしい非石灰化結節に見える。これらの病変は、成長又はより明確な腫瘍性の形質を評価するための一連のスクリーニングを要求する。一連のＣＴスキャンを通じてどの病変に腫瘍性があるかを見分けるための時間間隔は、ＮＳＣＬＣの進行に重要な時期かもしれない。更に、コンピュータ断層撮影法自体は、非進行性のＮＳＣＬＣから早期進行性を差別化することができない。それゆえ、スパイラルＣＴは、より即時の診断及び患者の転帰の予知を達成するために、一般的に、ＰＥＴ画像のような第２の診断手段と組み合わせて使用される。しかしながら、組み合わされた画像様式のコストは、初期段階の疾患のためのいくつかの幅広いスクリーニングプログラムのために法外なものとなる場合があるかもしれない、最もハイリスクな層の中の唯一潜在的なサーバー個人、”潜在的に危険な状態にある”集団の大部分を含まない。それら疑問の余地がある結節を識別するために通常用いる他の方法は、指向性ＣＴ細針吸引物又は気管支鏡検査法を伴うスパイラルＣＴの組み合わせである。しかしながら、これらの侵襲的な技術に関連する不安や不快感は、それらを無症候性の患者のスクリーニングとって非現実的なものにしている。

このように、低線量スパイラルＣＴ技術の最近の進歩は、早期発見の向上に向けて大きな進歩を遂げてきた。しかしながら、ＮＳＣＬＣの死亡率を減少させるための低線量スパイラルＣＴの能力が未だ確立されていない。スパイラルＣＴのコストが比較的高く、偽陽性率の高さは、不必要な生体検査や手術につながり、また、非腫瘍性の疾患を確認するために一連の測定が必要であり、ＣＴスクリーニングプロトコルを称賛するための効率的な試験を加えることは、特異性及び費用対効果を向上させることができる。

ＮＳＣＬＣの存在及び段階並びに良性肺疾患との識別のために、安全性、信頼性があり、且つ単純な患者をスクリーニングする方法のための技術の明確な必要性がある。

開示の概要

一例では、核酸及び／又はそれらのポリペプチド生成物及び／又はそれらのポリペプチド生成物に対する自己抗体は、腫瘍内に過剰発現変異体を有する肺がんのバイオマーカーとして使用される。そのような核酸も、そのような核酸によってコードされたポリペプチド及びそれらのポリペプチドに対する自己抗体は、肺がん、より具体的には、哺乳類のＮＳＣＬＣを評価するために分析することができる。核酸、又はその核酸によってコードされたポリペプチドの分析は、哺乳類由来の生体サンプル（生体検査試料）中の核酸又はポリペプチドの１つ以上の上昇されたレベルに基づいて、肺がんが哺乳類中で評価されることを許し得る。複数の核酸又はポリペプチドのレベルは、核酸又はポリペプチドの配列を用いて同時に検出し得る。

低コスト且つ微小な侵襲的血清、痰又は組織試験は、スパイラルＣＴを補完するための手段又はＮＳＣＬＣ検出の全体のコストを最小化するための潜在的な事前スクリーニングとして機能する方法が選ばれる。この種のＦＤＡが承認した試験は現在のところ全く存在しない。

一態様において、肺がんを評価するための方法が提供される。その方法は、肺がんを有する哺乳類が、ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２Ｒα，ＣＡ１２５，ＭＣＰ−１，ＣＲＰ，ＭＭＰ−２及びｓＥ−セレクチンからなる群から選択された核酸又は前記核酸によってコードされたポリペプチド又は、ポリペプチドに対する自己抗体の１つ以上の発現の上昇されたレベルを含むか否かを測定することを含んでも良く、前記上昇されたレベルの存在又は欠如は、哺乳類が不良転帰の影響を受けやすいことを示す。その方法は、肺がんを有する哺乳類が、ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２Ｒα，ＣＡ１２５，ＭＣＰ−１，ＣＲＰ，ＭＭＰ−２及びｓＥ−セレクチン核酸、又は、前記ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２Ｒα，ＣＡ１２５，ＭＣＰ−１，ＣＲＰ，ＭＭＰ−２及びｓＥ−セレクチン核酸によってコードされたポリペプチド、又は、前記ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２Ｒα，ＣＡ１２５，ＭＣＰ−１，ＣＲＰ，ＭＭＰ−２及びｓＥ−セレクチン核酸によってコードされた前記ポリペプチドに対する自己抗体の上昇されたレベルを含むか否かを測定することを含まれ得る。前記哺乳類は人であり得る。前記レベルは、肺組織、痰又は血液で測定し得る。前記レベルは、ＰＣＲ法又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで測定し得る。前記レベルは、免疫組織化学を用いて測定し得る。前記不良転帰は、薬物又は放射線治療の５年以内の全身の経過を含み得る。

一実施形態では、この方法は、哺乳類がＮＳＣＬＣのような肺がんを有するか否かを判定することを含んでも良く、方法は、ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＭＭＰ−２，ＭＣＰ−１及びｓＥ−セレクチンからなる群から選択された核酸、ポリペプチド又は自己抗体の１つ以上の上昇されたレベルを検出することを含んでも良い。更に好ましい実施形態において、この方法は、ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＭＭＰ−２，ＭＣＰ−１及びｓＥ−セレクチンからなる群から選択された核酸、ポリペプチド又は自己抗体の１つ以上の上昇されたレベルを検出すること及びＮＳＣＬＣのような肺がんの治療を決定するのに上昇されたレベルの存在又は欠如を使用することを含んでも良い。

代わりの用途において、上述した血清、組織又は自己抗体の試験は、ＮＳＣＬＣのリスクを評価し、スパイラルＣＴを用いた更なるスクリーニングが要求されるより小さな集団を選択するための最初のスクリーニングとして使用しても良い。

別の態様においては、肺がんを評価するための方法が提供される。この方法は、（ａ）非ＮＳＣＬＣ肺がんに対してＮＳＣＬＣ肺がんを有するか否かを測定すること及び（ｂ）哺乳類がＮＳＣＬＣプロファイルを有している場合に、哺乳類を特異的治療の影響を受けやすいか否かに分類すること、及び、哺乳類がＮＳＣＬＣプロファイルを有していない場合に、哺乳類が特異的治療の影響を受けやすくないか否かを分類することを含んでも良い。

良性肺疾患に対してＮＳＣＬＣを識別するための方法は、哺乳類が、イノシン−５−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＩＭＰＤＨ），フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＦＨ），α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ），小胞体タンパク質２９（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ２９，Ｅｒｐ２９），アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），ヒドロステロイド１７−βデヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｓｔｅｒｏｉｄ １７−β ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ），メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＭＴＡＰ），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ），ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），ｃ−Ｍｙｃ，ＮＹ−ＥＳＯ，３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），ｐ５３ホスホグリセラートムターゼ（ｐ５３ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ）及び熱ショックタンパク質７０−９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−９Ｂ，ＨＳＰ７０−９Ｂ）からなる群から選択された核酸又は前記核酸によってコードされたポリペプチド又は、ポリペプチドに対する自己抗体の１つ以上の発現の上昇されたレベルを持つか否かを測定することを含んでも良い。前記哺乳類は人であり得る。前記ＮＳＣＬＣプロファイルは、肺生体検査組織、痰、尿又は血液によって測定し得る。前記ＮＳＣＬＣプロファイルは、ＰＣＲ法又は核酸の配列で測定し得る。前記ＮＳＣＬＣプロファイルは、免疫組織化学又はポリペプチドを検出するための配列を使用して測定し得る。治療計画及び転帰の決定は、サンプル集団に関するＮＳＣＬＣプロファイルに対した転帰（含むが、５年生存に限定されない）に対する特異的な治療規制を介して治療された患者のサンプル集団の統計分析に対する患者の新たに決定されたプロファイルの比較に基づいても良い。

別の実施形態において、この方法は、悪性でない疾患に対する肺がんを有する哺乳類が、ＩＭＰＤＨ，ホスホグリセラートムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ），ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及び熱ショックタンパク質７０−９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−９Ｂ，ＨＳＰ７０−９Ｂ）からなる群から選択された核酸、ポリペプチド又は自己抗体の１つ以上の上昇されたレベルの検出を含み得るか否かを測定することを含んでも良い。更に好ましい実施形態において、この方法は、ＩＭＰＤＨ，ホスホグリセラートムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ），ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及び熱ショックタンパク質７０−９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−９Ｂ，ＨＳＰ７０−９Ｂ）からなる群から選択された核酸、ポリペプチド又は自己抗体の１つ以上のレベルを測定すること及びＮＳＣＬＣのような肺がんの治療を決定するのに上昇されたレベルの存在又は欠如を使用することを含んでも良い。

交代に、血清、組織又は自己抗体試験は、ＣＴによって発見された疑問の余地がある結節のために非腫瘍性疾患と悪性腫瘍とを識別することに使用されても良く、これによって、一連のＣＴ又は侵襲的な生体検査の必要性を排除する。この代替的な使用において、上述した臨床的に有用な多検体の核酸、ポリペプチド又は自己抗体のパネルは、ＣＴによって発見された疑問の余地がある結節に関して、”非ＮＳＣＬＣ”集団からＮＳＣＬＣを識別することができ、これによって、一連のＣＴ又は侵襲的な生体検査の必要性を排除することができる。予後的なアプリケーションは、補助的な治療戦略の指針を助けるかもしれない。

図１Ａ〜図１Ｃは、添付の免疫ブロット法によるＨＣＣ８２７細胞溶解物の代表的な二次元タンパク質ゲルを示す。ＨＣＣ８２７細胞溶解物から分離されたタンパク質に関する二次元ゲルをクマシー染色した（Ａ）、免疫ブロット法と一致したコントロール（Ｂ）及び段階Ｉの腺がんコホート（Ｃ）である。

図２Ａ〜図２Ｆは、６個の選択されたバイオマーカー及び、以下の１−ＮＳＣＬＣ患者；２−ＣＯＰＤ／喘息患者；３−”がんのない”コントロールの患者；及び４−非腫瘍性結節を有する切除された患者として分離されたコホートを伴う循環自己抗体レベルの分布に関する個体の”箱髭”図を示す。略語：ＭＦＩ−スケール−適切な商用抗体の標準濃度にスケーリングされた平均蛍光強度値；ＰＧＡＭ−ホスホグリセラートムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ）；及びＩＭＰＤＨ−イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｉｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）。

図２Ｇ〜図２Ｌは、ランダムフォレストアルゴリズムによって識別された６個のバイオマーカーに関する箱髭図である。６個の選択されたバイオマーカーに関するボックスプロットは、発見されたコホートのランダムフォレスト分析によって選択された。横軸のラベル：０＝外科的切除、非腫瘍性結節；１＝”正常な”コントロール；２＝段階ＩＡのＮＳＣＬＣ；３＝段階ＩＢのＮＳＣＬＣ；及び４＝段階ＩＩ及びＩＩＩ（リンパ節陽性）のＮＳＣＬＣ。注記：疾患の段階は、病理学的病理に基づいており、極端な値はプロットに示されていない。有意性（マンホイットニー順位和検定）は、ａ＝Ｐ＜０．００１、ｂ＝Ｐ＜０．０１及びｃ＝Ｐ＜０．０５を持ってボックスの上のバーで示されている。

図３Ａは、図２Ａ〜図２Ｆの６個の自己抗体パネルに関するアルゴリズムに基づいた分類及び回帰ツリー（ＣＡＲＴ）である。簡潔には、このアルゴリズムは、ツリーの別個の枝にデータを分割するために使用される一連のバイナリ’ｉｆ−ｔｈｅｎ’決定ルールを表す。ツリーの各節点は、考慮されている検体及び患者のグループを分割するために使用される閾濃度を表示する。追加分類は、その測定値が指示された閾カットオフ値と比較して小さい又は等しい又は超えているか否かを示されている分岐の各アームに沿って続く。この決定ツリーによる診断は、各最終アームの左側に指示された場合の”良性”としての予測及び各最終アームの右側に”ＮＳＣＬＣ”としての予測を伴って、各終端節点でリストに記載される。略語：ＭＦＩ−適切な商用抗体の標準濃度にスケーリングされた平均蛍光強度値；ＰＧＡＭ−ホスホグリセラートムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ）；ＨＳＰ７０−９Ｂ−熱ショックタンパク質７０ｋＤａタンパク質９Ｂ（モータリン−２（ｍｏｒｔａｌｉｎ−２））；及びＩＭＰＤＨ−イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｉｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）

図３Ｂは、図２Ｇ〜図２Ｌの６個の検体に関する他の分類及び回帰ツリーである。図３Ｂの分類及び回帰ツリーは、ＮＳＣＬＣに関して陽性である患者か否かを予測するためのものである。簡潔には、このアルゴリズムは、ツリーの別個の枝にデータを分割するために使用される一連のバイナリ’ｉｆ−ｔｈｅｎ’決定ルールを表す。ツリーの各節点は、考慮されている検体及び患者のグループを分割するために使用される閾濃度を表示する。追加分類は、その測定値が指示された閾カットオフ値と比較して小さい又は等しい又は超えているか否かを示されている分岐の各アームに沿って続く。分類（観測）の数は、各最終アームの標識（０＝ＮＳＣＬＣ陰性；１＝ＮＳＣＬＣ陽性）を伴って、各終端節点の下に即時にリストアップされる。略語：ｏｂｓ．＝観測（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ）；ＴＮＦ−ａ＝腫瘍壊死因子ａ（ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−ａ）；ＭＣＰ−１＝単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；ＭＭＰ−２＝マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）及びＩＬ−１ｒａ＝インターロイキン−１受容体拮抗薬。

図４は、図２Ｇ〜図２Ｌ及び図３Ｂの６個の検体を用いた６個の検体の血清試験に関するＲＯＣ曲線である。ＲＯＣ曲線は、患者の元の訓練コホートを用いた６個の検体のＣＡＲＴアルゴリズムが最適化されたものである。曲線の下の領域は、０．９７９であり、感度は９９％であり、特異性は９５％である。

図５は、血清バイオマーカーの発見のための一般的なアプローチを示している。この図は、弊社の全体的な候補バイオマーカーの発見戦略の一般的な手順を示している。提案されたアプローチは、６個の患者のグループ、及びスペースを考慮して、４つのグループの実験に制限したコントロール参照ペプチドグループを検査するだろう。（ＲＦＳ−無再発生存）

血清試験は、肺がんのリスクを評価し、スパイラルＣＴを用いた更なるスクリーニングが要求されるより小さな集団を選択するために、初期のスクリーニングとして使用しても良いことが開示されている。交代に、血清試験は、非腫瘍性がん疾患とＣＴによって発見された疑問の余地がある結節に関する肺がん悪性腫瘍とを識別するために使用され、これによって、一連のＣＴ又は侵襲的な生体検査の必要性を排除することができる。好ましい実施形態において、肺がんはＮＳＣＬＣである。更なる代替において、組織又は自己抗体試験は、肺がんのリスクに関して患者をスクリーニングする又は非腫瘍性疾患と悪性腫瘍とを識別するために用いることができる。その試験は、肺がんのリスクに関して患者をスクリーニングする又は非腫瘍性疾患と悪性腫瘍とを識別するために、１つ以上の特定のバイオマーカーをコードする核酸、これらのバイオマーカーの核酸によって転写されるポリペプチド、又は、これらのバイオマーカーの核酸によって転写されるポリペプチドに対する自己抗体をスクリーニングできる。その試験は、予知した転帰を提供する又は転移性の疾患の存在を検出することができる。

最初の例では、ＮＳＣＬＣに関係した４７の候補バイオマーカーの配列が選択され、早期ＮＳＣＬＣを有する患者と我々のコントロール集団とを区別するための重要な試験性能特性を有するバイオマーカーのパネルを評価するために、計１３５人の患者（ｎ＝９２ＮＳＣＬＣ、ｎ＝４３”健康な”コントロール）をスクリーニングした。選択されたバイオマーカーから、独立型の診断方法としてかそれとも現在のＣＴに基づくスクリーニングプロトコルに関するコンパニオン試験としてＮＳＣＬＣに関するスクリーニングができる多検体血液試験が確認された。

血清試料は、”ハイリスク”な集団が、このタイプの診断方法に対して提示する複雑性に近づくように、２つの異なるグループのコントロール（ｎ＝４３）だけでなく、９２人のＮＳＣＬＣ患者からも得られた。全てのＮＳＣＬＣ患者及びコントロールは、文書による公式同意を含む施設内治験審査委員会の全面順守において得られた。ＮＳＣＬＣコホートの診断結果は、リンパ節摘出を伴う腫瘍切除から得られた組織における外科病理報告書から得られた。ＮＳＣＬＣコホートに研究を含めるための基準は、広範であり（病理学的評価を伴う外科的切除を持つことからなる）、いくつかの人口学的又は臨床学的因子に限定されなかった。’正常な’コントロール試料（ｎ＝３１）は得られた。このコホートは、同様の人口学的特性に基づいて選択され、炎症性成分を有する診断された状況を有していた。このコホートにおける３１人の患者の内の７人にかなりの喫煙歴があった。試料発生時及び臨床経過観察日において、これらの患者は、いくつかの肺疾患又はいくつかのタイプのがん腫の証拠はなかった。’手術後の非腫瘍性疾患’のグループは、肉芽腫、肺臓炎又は肺炎を有する１２人の患者から構成されていた。これらの患者は、がん又は保存的治療の後の持続的症状に関する懸念に対する二次的な切除を受けた。

パネルの検証に使用される試料は、以下のコホートから構成される。２５の段階Ｉ、７の段階ＩＩ及び１の段階ＩＩＩのＮＳＣＬＣ患者から構成されるＮＳＣＬＣコホート（合計ｎ＝３３）。”疑問の余地がある”病変の外科的切除を有する１５人の非腫瘍性肺疾患の患者の第２のコントロールコホート及び” 慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）又は喘息を有する４０人の患者から構成される外科手術を伴わない非腫瘍性疾患”のグループも検証試験に用いられた。このＣＯＰＤ／喘息のグループの患者は、咳の進行又は呼吸器症状の変化の訴えに基づいて臨床的に見られ、血清は、気管支鏡検査法及びＣＴ撮影に先立って即座に集められ、ついで、肺結節の存在について評価するために用いられた。これらの場合から選択された全体のＣＯＰＤ／喘息コホートは、ＮＳＣＬＣコホート（年間４０パックの中央値）と同様に喫煙歴を有していた。末梢血は、ＮＳＣＬＣに対する治療の開始直前に各患者から採取した。血液の１０ｍＬは、標準のレッドトップＶａｃｕｔａｉｎｅｒｓ（登録商標）（抗凝固剤なし）に引き込まれ、３０〜４０分間、室温で凝固された。血清は、遠心分離で分離された。収率は、全血液１０ｍＬ当たり、血清４〜７ｍＬの範囲であった。血清は、その後即座に、一定分量に分けられ、−８０℃の超低温冷凍庫内で保管された。試料は、この研究に関する２つ以上の融解サイクルにさらされない。

末梢血は、上述と同様の方法で処理及び必要な処理を施された全てのサンプルを有し、標準的な瀉血技術を用いた治療の開始直前に各患者から得られた。試料は、この研究に関する２つ以上の融解サイクルにさらされない。コントロール血清は、同一の方法で採取し、上記のように処理した。

可能ならばいつでも、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ（登録商標）免疫測定法のプラットフォームは、試験された４７個のバイオマーカーの２つのみを包含するＥＬＩＳＡベースの免疫測定法を用いて、バイオマーカーの血中濃度を測定するために用いられた。全ての分析は、各製造業者の指示に従って実施し、以下のようなグループで行われた：Ｃ反応性タンパク質（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＰ）及び血清アミロイドＡ（ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ，ＳＡＡ）［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ］；インターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β，ＩＬ−１β），ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１０，腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α，ＴＮＦ−α）及び形質転換成長因子−α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α，ＴＧＦ−α）［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ］；ＩＬ−２，ＩＬ−１３，インターフェロン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ，ＩＦＮ−γ），インターフェロン誘導タンパク質１０（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １０，ＩＰ−１０）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＧＭ−ＣＳＦ）［Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ］；ＩＬ−１α，ＩＬ−２Ｒα，Ｍ−ＣＳＦ，幹細胞由来因子１α（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ １α，ＳＤＦ−１α）及び幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）［Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ］；ｓＥ−セレクチン（ｓＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ），ｓＰ−セレクチン（ｓＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）及び可溶性細胞内接着分子１（ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｓＩＣＡＭ１）［Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ］；マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２，ＭＭＰ−２），ＭＭＰ−３，ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１３［Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ］；死受容体５（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５，ＤＲ−５），組織壊死因子レセプターＩ（ｔｉｓｓｕｅ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ，ＴＮＦ−ＲＩ）及びＴＮＦ−ＲＩＩ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］；ＲＡＮＴＥＳ，マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−１α，ＭＩＰ−１α），ＭＩＰ−１β，単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１，ＭＣＰ−１）及びエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］；顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｇ−ＣＳＦ），上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ），血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］及びｓＥＧＦＲ（ｅｒｂ−ｂ１），Ｈｅｒ−２（ｅｒｂ−ｂ２），ＣＡ１２５，ＣＡ１５−３，ＣＡ１９−９，ＣＥＡ及びＣＹＦＲＡ２１．１は、ピッツバーグ大学がん研究所のＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで測定された。バイオマーカーの濃度は、ＢｉｏＰｌｅｘ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ４．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の一環として、５つのパラメトリック曲線適合によって計算された。ＴＩＭＰ−１及びオステオポンチンの濃度の測定は、市販のＥＬＩＳＡ分析を用いてキットの説明書（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に応じて実施された。データは、ＫＣジュニア（ｖ１．４０．３）ソフトウェアパッケージを用いてＢｉｏＴｅｋ ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳプレートリーダ上に集められた。４つのパラメトリック曲線適合は、吸光度の生の測定値から濃度を算出するのに使用された。この研究に関して実施された全ての分析は、盲検の方法で実施され、オペレータのバイアスを最小限に抑えるために異なる社員によって統計的に処理された。

検証研究は、以下のようなグループで、製造業者の指示に従って評価された１４の検体に関して同一の市販のキットを使用した。ＣＲＰ［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ］；ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＬ−１０及びＴＮＦ−α［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ］；インターフェロン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ，ＩＦＮ−γ）［Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ］；ＩＬ−２Ｒα［Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ］；ｓＥ−セレクチン（ｓＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）及びｓＰ−セレクチン（ｓＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）［Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ］；ＭＭＰ−２［Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ］；ＭＩＰ−１α，ＭＣＰ−１及びエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］；ＣＡ１２５及びＣＹＦＲＡ２１．１は、ピッツバーグ大学がん研究所のＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで測定された。データは、同じ方法で集められ、５つのパラメトリック曲線適合は、吸光度の生の測定値から濃度を算出するために使用された。

最初の選択は、４７のバイオマーカーの配列からなり、それらは、以下の機能の内の少なくとも１つに関する値を示す各バイオマーカーに関する公表されたリポートのいずれかに基づいて選択された：ＮＳＣＬＣ診断，病期若しくは予後又は疾患の進行に関与する生物学的プロセスへの関与。これらのマーカーのレベルは、９２人のＮＳＣＬＣ患者及び４３人の非がんコントロール由来の血清で評価した。表１〜表３は、患者の臨床的及び病理学的特性を示す。

ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−１５，ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＧＦ−α，ＤＲ５，ＭＭＰ−１３を含むいくつかのバイオマーカーは、測定範囲の閾を下回るそれらの測定のかなりの部分を有し、更なる分析に不適格と見なされる。これらのバイオマーカーは、必要とする再分析の生データに明らかな傾向を提示しなかった。

表３に定義しているように、２以上の患者のグループは、この研究の”発見”部分に登録された。最初のグループは、Ｒｕｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＲＵＭＣ），Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬにおいて、治癒目的で完全な解剖学的切除を受けた肺腺がん（Ｔ１−２Ｎ０Ｍ０）を有する１０人の患者から構成されていた。研究のためのコントロールとしての役目を果たした第２のグループは、ＮＳＣＬＣを持つことの疑いの下で、ＲＵＣＭにおいて切除された非腫瘍性肺疾患を有する患者（ｎ＝１０）から構成されていた。

ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２Ｒα及びＣＡ１２５の血清濃度は、ＮＳＣＬＣグループ中で著しく高くなることが判明した（０．００１と同等又はより低いマンホイットニー順位和（両面）ｐ値）のに対し、ＭＣＰ−１，ＣＲＰ，ＭＭＰ−２及びｓＥ−セレクチン（ｓＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）の濃度は、コントロールグループ中で著しく高くなることが判明した（０．００１と同等又はより低いｐ値）。０．０５未満のマンホイットニー順位和（両面）ｐ値の有意な閾値の使用又は’曲線下面積’（ＡＵＣ）が０．６５を超えるＲＯＣ曲線の分析、１４個のバイオマーカーの合計は、多変量解析を受けることが好適であることが見出された。それぞれの統計に基づくパラメータとともに、これらのバイオマーカーのリストは、表４〜表６に含まれる。有意差は、年齢、喫煙歴及び断食の状態と関連するバイオマーカーの検査で観察されなかった（全てのｐ値は＞０．１）。

４つの患者集団（ｎ＝１９６）由来の血清試料は、Ｌｕｍｉｎｅｘ検証研究に含まれていた。これらグループの基本的な患者層については表３を参照せよ。ＮＳＣＬＣグループは、早期疾患（Ｔ１−３Ｎ０Ｍ０）を有する８１人の患者、局所進行性の疾患（Ｔ１−３Ｎ１−２Ｍ０）を有する３２人及び遠隔転移を有する４人から構成される。ＮＳＣＬＣコホートに研究を含めるための基準は、広範であり（ＮＳＣＬＣの外科的切除及び／又は病理学的確認を持つことからなる）、いくつかの人口学的又は臨床学的因子に限定されなかった。術前化学又は放射線療法を受けた患者は、研究から除外した。ＮＳＣＬＣコホート内の全ての患者は、系統的なリンパ節摘出を伴う原発腫瘍の明確な切除を受けた。解剖学的切除を受けている患者由来の全て血清試料は、手術の直前に集められたため、絶食中のものである。

３つに分割したグループから構成されたコントロールコホート：変形性関節症の研究（以下、”変形性関節症”コホートとして知られる）の一端として我々のリウマチ部門を受診し、血清採取時又は臨床経過観察の３年間において、肺疾患又はいくつかのタイプのがん腫の病歴を持たなかった３１人のボランティア；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）からの匿名化されたＣＯＰＤ及び喘息の患者（合計ｎ＝３２）及び病理学的診断の際に疑わしく思われたＮＳＣＬＣに関してＲＵＭＣでの解剖学的切除を受けた１６人の患者は、非腫瘍性結節（乾酪性肉芽腫、回復期肺炎など）と診断された。Ａｂｂｏｔｔコホートは、気管支鏡処置（症状の深刻化を調査するために実行される）の時点で集められ、血清発生時に断食となった。変形性関節症の研究に参加している患者は、通常の外来診療の一端としてその血清を集められ、このプロトコルの一端として設けられた絶食に関する要件はなかった。

６個のバイオマーカーのパネルは、材料及び方法のセクションで定義したように、ランダムフォレストアルゴリズムを使用した統計に基づく妥当性のために私たちの基準を満たす１４個のバイオマーカーから選択された。それぞれサブパネルごとに拡大されたランダムフォレストの１０００のツリーの範囲が提供しているＡＵＣと同様に平均ｏｕｔ−ｏｆ−ｂａｇ’誤判別エラー’は、表４〜表６に示される。

６個の検体のパネルに対する１４個の個々のバイオマーカーからのパネルの継続した”焦点”は、病理学的ＮＳＣＬＣの状態に関連して患者を正しく分類する能力を改善した。しかしながら、４回繰り返した後のＡＵＣ及び関連した検出感度は、バイオマーカーの数が減少するに伴って、ＮＳＣＬＣを診断するための好ましい組み合わせとしてのこのパネルが選択される結果に至った。個々の’箱髭’プロットは、図２Ｇ〜図２Ｌにおけるこれら６個のバイオマーカー（ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＭＭＰ−２，ＭＣＰ−１及びｓＥ−セレクチン（ｓＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ））に関して示されている。次に、分類ツリーは、良性のコントロールからＮＳＣＬＣを区別するために便利且つ有用なアルゴリズムを提供するためのＲＰＡＲＴソフトウェアパッケージ内のランダムフォレストアルゴリズムから選択された６個のマーカーのサブパネルに基づいて定義された。このプロセスから得られる分類ツリーは、図３Ｂに示されている。このツリーは、１３５のケースを１２９に正しく分類した（正しい分類率は９５％）。この分類ツリーに関するＲＯＣ曲線は、図４に示されている。このパネルに関する試験性能特性は、９９％の感度に変わる９７．９％のＡＵＣ及び９５％の特異性を持っている。いくつかの個々のバイオマーカー上の多検体パネルを使用する場合に、ＮＳＣＬＣに関するスクリーニングをする能力の相当な増加が確認された。

プロテオーム発見−細胞培養及び細胞溶解物の調製−ヒト肺腺がん細胞株ＨＣＣ８２７は、記載された研究のために特別に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から直接入手し、全ての研究は、最初の入手日から６ヶ月以内に実施された。細胞株の認証は、ＡＴＣＣによって行われた。細胞は、５％ＣＯ_２の湿気のある環境下、３７℃で１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ １６４０で培養された。全ての細胞は、記載された実験のために計５継代以内に維持された。８０％の密集度に到達する際に、全ての細胞は採取され、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で２回洗浄された。細胞溶解物は、コンプリートミニ−プロテアーゼ阻害剤の錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加したＴＢＳで希釈された１％のＮＰ−４０の５００μｌ中で１×１０^７の細胞を取ることにより調製された。細胞は、４℃で３０分間で溶解され、１４０００ｘｇで１０分間遠心分離され、タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって測定された。

２次元ウエスタンブロット分析による血清自己抗原プロファイリング−合計３つのゲルは、２次元分析のために同時に実行された。２つのゲルは、ＨＣＣ８２７細胞株由来の１００μｇの溶解物が装填され、肺腺がんとコントロール患者集団の間の免疫反応性の違いを識別するために、ウエスタンブロット分析を受けたのに対して、１つのゲルは、ゲル染色によってタンパク質パターンを可視化するために３００μｇのタンパク質が装填された。全細胞溶解物は、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）タンパク質沈殿キット（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ；Ｇｉｂｂｓｔｗｏｎ，ＮＪ）を用いてこの分析のために調製された。等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は、２２０００〜２４０００Ｖ−ｈｒｓの線形勾配プログラムを持ったＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＩＥＦセル（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施され、装置製造業者（Ｂｉｏｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって推奨された他の標準化されたプロトコルを用いて遂行された。２次元ゲルが遂行された後、それらは、２次元ウエスタンブロット分析によって分析されたか、Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で染色された。ウエスタンブロット分析のために、各ゲルからのタンパク質は、標準的な”ｔａｎｋ−ｔｒａｎｓｆｅｒ”プロトコルを用いて、１５Ｖでニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）薄膜上に移動される。ＰＢＳ中１％のＢＳＡで遮断した後、薄膜は、肺腺がんかコントロール患者グループ（グループ当たりｎ＝１０）由来のプール血清（グループ当たり１０試料）の１：５００希釈物中で１時間培養された。プローブされた薄膜は、ついで、ＰＢＳで洗浄され、１：１０００００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）で培養された。免疫ブロットは、強化化学発光システム（ＥＣＬ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で開発され、Ｘ線フィルムに記録された。全てのゲル及びＸ線フィルムは、ＶｅｒｓａＤｏｃ ４０００ゲル撮像システムを用いてスキャンされ、バージョン８．０のＰＤＱｕｅｓｔ２次元ゲル撮像ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて比較された。ゲル及び免疫ブロット法の反復実行は、免疫反応性の観測パターンの再現性を確保するために実行され、ターゲットは、タンパク質の同定のために抜いた。

質量分析のためのサンプル調製−ウエスタンブロットで観察された特異的な免疫反応性シグナルは、１０倍を超える免疫反応性の差を有することに基づくタンデム質量分析による同定のために、Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅで染色された２次元ゲルから抜き出された。ゲル内のトリプシン消化は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって指定された方法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｐｒｏｍｅｇａ.ｃｏｍ／ｔｂｓ／ｔｂ３０９／ｔｂ３０９.ｐｄｆ）を用いて達成された。消化後、得られたペプチドは、Ｃ_１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濃縮及び脱塩され、ＭＡＬＤＩ標的板上に直接スポットされた。５ｍｇ／ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む５０％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）に懸濁された再結晶α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ，ＣＨＣＡ）（Ｐｒｏｔｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ，ＷＶ）は、タンデム質量分析による分析の前に、各サンプル位置（サンプル当たり１μＬ）に添加された。

タンパク質の質量分析同定−質量分析によるタンパク質の同定は、７００〜４０００ｍ／ｚの範囲に最適化された正イオンモードで、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ）質量分析計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）で行われた。データは、各サンプルに渡って、２０００レーザショットで取得された。ペプチド質量指紋（ＰＭＦ）分析は、生の質量分析ファイルからＭａｓｃｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒによって抽出されたモノアイソトピックピークのリストを用いて行われた。ペプチドの照合及びタンパク質の検索は、質量許容誤差を１００ｐｐｍに設定し、修飾することない”１” ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅの状態でＭａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、ＮＣＢＩ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースと対照して達成された。更に、３〜５個の特有のペプチドは、ＭＳ／ＭＳ分析を実行するためのＭＳデータ中に見られたペプチドから選択された。タンパク質の同定は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンから各ペプチド配列タグ（ＰＫＬ）フォーマットファイル（各ＭＳ／ＭＳ実験によって生成される）をインポートすることによって達成され、ＮＣＢＩ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースを検索するために、±０．３ＤａのＭＳ／ＭＳ許容誤差が用いられた。

タンパク質の同一性の割り当てに関する基準は、以下のパラメータから構成されている：６７（ｐ＝０．０５）よりも大きいＭＡＳＣＯＴ ’ＭＯＷＳＥ’スコア，３０％よりも大きい配列カバー率，最低限の３つの特有のトリプシンペプチドのＭＳ／ＭＳデータ及び予測及び観測された質量／等電点（ｐｌ）のゲルの座標値の間の一般的な合意。更に、２次元ウエスタンブロットは、同定された自己抗原が免疫反応性が最初に観察されたゲルの座標に相互に関係があったことを確認するために、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗体を用いて行われた。抗体源は、以下のようであった：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からのＮＹ−ＥＳＯ，スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ），メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ），ｐ５３，ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）及びトリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）；Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのエノラーゼ１（ｅｎｏｌａｓｅ １）及びＧＡＰＤＨ；（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのアネキシンａ１（ａｎｎｅｘｉｎ ａ１）；Ａｖｉａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのカルポニン２（ｃａｌｐｏｎｉｎ ２）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ １７−β ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びホスホグリセラートデヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）並びに残りの抗体はＡｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）から得た。

血清試験開発−組み換えタンパク質：源及び生産−組み換えタンパク質は、ＮＹ−ＥＳＯ（１３〜１５），ｐ５３（１３，１６〜２１），ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）（２２，２３），トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＴＰＩ）（２３），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）（２４），３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（２３），スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５としても知られる）（２５），ｃ−Ｍｙｃ（１３，２６），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）（２７）及びユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ）（２８）を含む、我々の目的のための文書化された値を有する自己抗体の第２のグループと同様に、ＮＳＣＬＣ検出のための値（表７参照）を有するプロテオーム発見努力で特定された自己抗体候補のそれぞれについて得られた。商用抗体（標的確認のために上記で使用）は、分析動作の間に陽性コントロールとしての役目を果たすためのこれらの標的が得られた。組み換えタンパク質（自己抗原）の一部は、他のどこかで定義されているように（２９，３０）、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）における我々の共同研究者らによって特別に調製された。これらは、α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ），グリオキサラーゼドメインコンテイニング４（ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４），メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ），ホスホグリセラートムターゼＩ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ Ｉ），ＩＭＰ−デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＰ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＩＩ），トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ），ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ），ｅｒｐ−２９，アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），アネキシンＡ１（ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１）（イソ型 ＣＲＡ＿ｂ），ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１０イソ型１（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ−（１７−β）−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １０ ｉｓｏｆｏｒｍ １），フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ），熱ショック７０ｋＤａタンパク質９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ ９Ｂ）（モルタリン−２（ｍｏｒｔａｌｉｎ−２）），タンパク質ジスルフィドイソメラーゼアソシエイテッド３前駆体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ３ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１イソ型１（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ ｉｓｏｆｏｒｍ １），カルポニン−２（ｃａｌｐｏｎｉｎ−２），ｃ−Ｍｙｃ，アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ），３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びＧＲＰ−７８前駆体を含む。

Ｃｕｓｔｏｍ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ分析開発−ミクロスフィア抗原カップリング−”直接捕獲”ビーズに基づく免疫測定法は、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの提案したプロトコルによって提案されたプロトコルを使用して開発された。簡潔には、５〜１０μｇの組み換えタンパク質は、それぞれ特有のビーズ領域識別子を有する５×１０^６のＳｅｒｏＭＡＰ^ＴＭミクロスフィア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に結合された。これは、５ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）及び５ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＥＤＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むｐＨ６．２のリン酸ナトリウム水溶液中に懸濁されたミクロスフィアを活性化することによって達成された。暗所で２０分間インキュベートした後、ミクロスフィアは、洗浄され、ｐＨ５．０の５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｔｗｏ−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）中に再懸濁され、更に、組み換えタンパク質の適量が添加された。ビーズは、連続的に混合された状態で、暗所内で室温下において２時間の間インキュベートされた。インキュベーション後、ミクロスフィアは、０．１％のＢＳＡ，０．２％のトゥイーン−２０（ｔｗｅｅｎ−２０）を含むＰＢＳで２回洗浄され、４℃において同バッファー中に保管された。

マイクロスフィアの検証−商用抗体（上記で定義されたように）は、直接捕獲分析の間に陽性コントロールとしての役目を果たすための全ての自己抗原候補が得られた。全ての抗原結合ミクロスフィアは、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって推奨された方法ごとに個々の検証を受けた。簡潔には、各タンパク質特異的な抗体の連続希釈物（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中４μｇ／ｍＬから０．０６２５μｇ／ｍＬの範囲）は、１．２μｍＰＶＤＦフィルター９６ウェルマイクロタイタープレート中のウェル当たり５０００個の抗原結合ミクロスフィアとともに、２時間インキュベートされた。ＰＢＳ，１％ＢＳＡで洗浄した後、固定化された自己抗体複合体は、４〜６μｇ／ｍＬのビオチン結合抗ヒトポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使って、一定の撹拌状態で１時間インキュベートされた。最後に、２回洗浄（上記のように）した後、複合体は、４〜６μｇ／ｍＬのＲ−フィコエリトリン結合ストレプトアビジン（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って、一定の撹拌状態で４５分間インキュベートされた。得られた複合体は、ＩＳ２．３ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用する我々のＬｕｍｉｎｅｘ １００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに読まれる前に、再度洗浄され、ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中に再懸濁された。性能特性は、全てのＳＰＳＳ ｖ１５．０内で範囲、％ＣＶ、感度及び特異性を含めて各分析毎に確定された。

成功した個々の分析の検証に続いて、多重検証は、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの変更された’ｌｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ’プロトコルを用いて行われた。タンパク質結合ミクロスフィアは、交差反応を回避すべくグループ中に低タンパク質配列ホモロジーを持つことに基づいて選択された各パネル毎に、４〜６の自己抗体分析を含むセットに分類された。各ミクロスフィアセット（上記のように行われた）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、多重化されたタンパク質ミクロスフィアセットが互いに正の干渉を持っていなかったことを確認するためにパネル値と比較された。最後に、３つのストック血清試料の連続希釈物もまた、交差反応について個々のミクロスフィアを評価するために使用された。

検証されたミクロスフィアセットを使用した血清分析−一旦多重化検証が完了すると、得られた自己抗原ミクロスフィアパネルの５つの異なる組み合わせは、自己抗体レベルについて患者の血清試料（ｎ＝１９６）を評価するために使用された。この評価のために、全ての血清は、例によって、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて１：２０に希釈され、分析は、別の方法で上記のように行った。血清中の与えられた自己抗体の濃度に関連する報告された平均蛍光強度値は、標準として利用できるモノクローナル又はポリクローナル抗体を使用して得られたＭＦＩ値と比較してスケーリングされた。スケーリングに使用される実際のＭＦＩ値は、患者コホート全体に関する中央のＭＦＩ値に最も近いものに基づいて選択された。これらは、残りの原稿の中で’ＭＦＩ^{ＳＣＡＬＥＤ}’値と呼ばれる。

単変量統計−我々が以前に定義したような、記述統計，受信者動作特性（ＲＯＣ）パラメータ（’曲線下面積’（ＡＵＣ），特異性及び感度）及び２つのコンパレータグループを有するマンホイットニーＵテストからのｐ値は、ＳＰＳ統計ソフトウェアバージョン１５．０（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて、個々の検体に関して得られた。

多変量解析−自己抗体バイオマーカーの最適化された多変量パネルは、前述のようなランダムフォレストパッケージを使用した患者コホートの評価によるデータから選択される。上述のランダムフォレスト変数選択プロセスによるバイオマーカーの最適なパネルは、患者のがんの状態（ＮＳＣＬＣ対非ＮＳＣＬＣ）を識別するための特定の分類システムをモデル化するために分類及び回帰ツリー（ＣＡＲＴ）アルゴリズムによって使用された。この解析は、Ｒ統計ソフトウェアスイートのＲＰＡＲＴパッケージを用いて行われた。最終的な分類ツリーから、我々は、標準試験性能特性値（すなわち、誤分類エラー及び受信者動作特性曲線パラメータ）を算出することができる。

結果

２次元ウエスタンブロット分析による血清自己抗原プロファイリング−我々の２つの患者グループで違って表示される腫瘍関連自己抗原候補を識別するために、我々は、我々のＨＣＣ８２７細胞溶解物を、コントロール及び腺がん患者グループ（グループ当たりｎ＝１０；患者特性について表３参照）からのプール血清で個別にプローブされた各免疫ブロットを用いて、２次元ウエスタンブロットを介して分離した。図１Ａは、図１Ｂ及び図１Ｃに示された患者の血清に対する免疫反応性の違いを有する肺腺がん細胞株ＨＣＣ８２７から抽出されたタンパク質の代表的なクマシーで染色された２次元ゲルを示す。計２１個のスポットは、１０倍を超える免疫反応性の差を有することに基づくタンデム質量分析による同定のために選択された。

タンデム質量分析によるタンパク質の同定−２次元ゲルから回収された自己抗原候補は、標準的なゲル内消化法によってタンパク質の同一性を証明するために、我々のＳｈｉｍａｄｚｕ ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）質量分析計で分析された。ＭＳ／ＭＳ実験と関係したペプチド指紋分析は、選択された自己抗原の同一性を決定するために使用され、表７に示されている。この分析によって同定された各標的は、最初に摘出された予測ゲル座標（ｐＩ及び見かけのＭＷの両方）と高い相互関係を示した。興味深いことに、スポット番号１２及び１８に関するＭＳ／ＭＳデータは、各スポットに関する２つのタンパク質を同定した、即ち、スポット１２について３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２型（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅ ２）及びヒドロステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１０イソ型１（ｈｙｄｒｏｓｔｅｒｏｉｄ−（１７−β）−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １０ ｉｓｏｆｏｒｍ １）並びにスポット１８についてＥＲ−６０プロテアーゼ（ＥＲ−６０ ｐｒｏｔｅａｓｅ）及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼアソシエイテッド３前駆体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ３ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）。ＮＣＢＩのウェブサイト上のｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴは、これらの対が１００％の配列ホモロジーを共有したことを明らかにした。また、α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）のイソ型は、この分析から５つの異なる位置（スポット１，１１，１７，１９及び２１）で同定されたのに対し、アネキシンＡ１（ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１）は、２つの異なる位置（スポット９及び１０）で同定されたという観測結果も興味深いものである。これらの結果は、各自己抗原候補に対する商業的に得られたポリクローナル及びモノクローナル抗体を使用した２次元ウエスタンブロットを介して確認された。更に、これらの研究は、各ゲル座標が図３Ａ及び図３Ｂ（結果は図示せず）に示したものに相当する免疫反応性タンパク質を含んでいたことを明らかにした。

第２患者コホートに対する自己抗原の検証−ＮＳＣＬＣ検出のための臨床的に使用可能な早期検出パネルに近づくために、我々の免疫プロテオーム（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）分析で同定された１６個のうちの１５個の異なる自己抗原は、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく免疫ビーズ（ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）血清分析に変換された。現在開発中であるが、グリオキサラーゼドメインコンテイニング４（ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４，ＧＬＯＤ４）は、分析開発のための容易に達成可能な組み換えタンパク質の欠如のためにＬｕｍｉｎｅｘ分析によって検証されなかった。また、文献で発見された１０個の期待できるマーカー（ＮＹ−ＥＳＯ，ｐ５３，ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ），トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ），３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ），ｃ−Ｍｙｃ，アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及びユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ））は、我々のグループによって免疫ビーズ分析に基づくＬｕｍｉｎｅｘに変換された。これにより、計２５個の改良免疫ビーズ（ｃｕｓｔｏｍ ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）分析は、ＮＳＣＬＣ状態に特異的な循環自己抗体に関して、我々の１１７のＮＳＣＬＣ患者の血清及び７９のコントロール患者の血清を評価するために使用された。これらコホートの人口学的及び臨床学的特性は、表７に定義されている。

評価された１５個の自己抗体（この報告によって同定された）のうちの７個は、コントロール集団と比較して、ＮＳＣＬＣ患者において著しく上昇したこと（ＡＵＣが０．６０よりも大きく、マンホイットニーＵ値が０．０５より小さい）が明らかにされた。これらは、イノシン−５−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＩＭＰＤＨ），フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＦＨ），α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ），小胞体タンパク質２９（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ２９，Ｅｒｐ２９），アネキシン１（ａｎｎｅｘｉｎ １），ヒドロステロイド１７−βデヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｓｔｅｒｏｉｄ １７−β ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＭＴＡＰ）を含んでいる。文献から評価されたもののうち、我々は、０．６８３のＡＵＣ及びｐ＜０．００１を有するアネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）がバイオマーカーとして最も期待できるものであることを発見した。ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），ｃ−Ｍｙｃ，ＮＹ−ＥＳＯ，３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びｐ５３は、ＡＵＣ及びマンホイットニー両面ｐ値の両方において有意であることを発見した。他の全ての検体は、統計的有意性を満たすことができなかった。表８は、自己抗原に対する試験についての個々の試験性能特性が記載されている。

第２の患者コホートに対するこの６検体パネルの性能特性の検証により、８５人の内７５人の患者が正常に分類された。個々のグループの試験は、ＮＳＣＬＣに関するスクリーニングをするためのパネルに関する期待を有する個々のバイオマーカーの関連の妥当性を確認するための手段として実施された。ＣＯＰＤ及び喘息患者からなるコホートを単に見ると、唯一一人の患者は、４０の試験において誤分類（偽陽性）された。ＮＳＣＬＣ子ノートにおいては、５人の患者は、３３人の患者において誤分類され、その結果、８５％の分類率が得られた。誤分類は、段階ＩＡの患者に限定されておらず、エラーは試験感度が原因でなかったことを示している。そして最後に、切除を有する１５人の患者のうちの８人は、非腫瘍性疾患が正しく分類された。このサブグループは、この方法論によって正確に分類することができる患者の範囲を改良するために、更なる開発を必要とするかもしれない。

ヒト肺腺がん細胞株ＨＣＣ８２７は、上記研究のために特別に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から直接入手され、全ての研究は、元の入手日から６ヶ月以内で実施された。細胞株の認証は、ＡＴＣＣによって行われた。細胞は、５％ＣＯ_２の湿気のある環境下、３７℃で１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ １６４０で培養された。全ての細胞は、記載された実験のために計５継代以内に維持された。８０％の密集度に到達する際に、全ての細胞は採取され、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で２回洗浄された。細胞溶解物は、コンプリートミニ−プロテアーゼ阻害剤の錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加したＴＢＳで希釈された１％のＮＰ−４０の５００μｌ中で１×１０^７の細胞を取ることにより調製された。細胞は、４℃で３０分間で溶解され、１４０００ｘｇで１０分間遠心分離され、タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって測定された。

合計３つのゲルは、２次元分析のために同時に実行された。２つのゲルは、ＨＣＣ８２７細胞株由来の１００μｇの溶解物が装填され、肺腺がんとコントロール患者集団の間の免疫反応性の違いを識別するために、ウエスタンブロット分析を受けたのに対して、１つのゲルは、ゲル染色によってタンパク質パターンを可視化するために３００μｇのタンパク質が装填された。全細胞溶解物は、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）タンパク質沈殿キット（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ；Ｇｉｂｂｓｔｗｏｎ，ＮＪ）を用いてこの分析のために調製された。等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は、２２０００〜２４０００Ｖ−ｈｒｓの線形勾配プログラムを持ったＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＩＥＦセル（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施され、装置製造業者（Ｂｉｏｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって推奨された他の標準化されたプロトコルを用いて遂行された。２次元ゲルが遂行された後、それらは、２次元ウエスタンブロット分析によって分析されたか、Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で染色された。ウエスタンブロット分析のために、各ゲルからのタンパク質は、標準的な”ｔａｎｋ−ｔｒａｎｓｆｅｒ”プロトコルを用いて、１５Ｖでニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）薄膜上に移動される。ＰＢＳ中１％のＢＳＡで遮断した後、薄膜は、肺腺がんかコントロール患者グループ（グループ当たりｎ＝１０）由来のプール血清（グループ当たり１０試料）の１：５００希釈物中で１時間培養された。プローブされた薄膜は、ついで、ＰＢＳで洗浄され、１：１０００００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）で培養された。免疫ブロットは、強化化学発光システム（ＥＣＬ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で開発され、Ｘ線フィルムに記録された。全てのゲル及びＸ線フィルムは、ＶｅｒｓａＤｏｃ ４０００ゲル撮像システムを用いてスキャンされ、バージョン８．０のＰＤＱｕｅｓｔ２次元ゲル撮像ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて比較された。ゲル及び免疫ブロット法の反復実行は、免疫反応性の観測パターンの再現性を確保するために実行され、ターゲットは、タンパク質の同定のために抜いた。

ウエスタンブロットで観察された特異的な免疫反応性シグナルは、１０倍を超える免疫反応性の差を有することに基づくタンデム質量分析による同定のために、Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅで染色された２次元ゲルから抜き出された。ゲル内のトリプシン消化は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって指定された方法を用いて達成された。消化後、得られたペプチドは、Ｃ_１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濃縮及び脱塩され、ＭＡＬＤＩ標的板上に直接スポットされた。５ｍｇ／ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む５０％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）に懸濁された再結晶α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ，ＣＨＣＡ）（Ｐｒｏｔｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ，ＷＶ）は、タンデム質量分析による分析の前に、各サンプル位置（サンプル当たり１μＬ）に添加された。

質量分析によるタンパク質の同定は、７００〜４０００ｍ／ｚの範囲に最適化された正イオンモードで、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ）質量分析計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）で行われた。データは、各サンプルに渡って、２０００レーザショットで取得された。ペプチド質量指紋（ＰＭＦ）分析は、生の質量分析ファイルからＭａｓｃｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒによって抽出されたモノアイソトピックピークのリストを用いて行われた。ペプチドの照合及びタンパク質の検索は、質量許容誤差を１００ｐｐｍに設定し、修飾することない”１” ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅの状態でＭａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、ＮＣＢＩ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースと対照して達成された。更に、３〜５個の特有のペプチドは、ＭＳ／ＭＳ分析を実行するためのＭＳデータ中に見られたペプチドから選択された。タンパク質の同定は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンから各ペプチド配列タグ（ＰＫＬ）フォーマットファイル（各ＭＳ／ＭＳ実験によって生成される）をインポートすることによって達成され、ＮＣＢＩ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースを検索するために、±０．３ＤａのＭＳ／ＭＳ許容誤差が用いられた。

タンパク質の同一性の割り当てに関する基準は、以下のパラメータから構成されている：６７（ｐ＝０．０５）よりも大きいＭＡＳＣＯＴ ’ＭＯＷＳＥ’スコア，３０％よりも大きい配列カバー率，最低限の３つの特有のトリプシンペプチドのＭＳ／ＭＳデータ及び予測及び観測された質量／等電点（ｐｌ）のゲルの座標値の間の一般的な合意。更に、２次元ウエスタンブロットは、同定された自己抗原が免疫反応性が最初に観察されたゲルの座標に相互に関係があったことを確認するために、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗体を用いて行われた。抗体源は、以下のようであった：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からのＮＹ−ＥＳＯ，スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ），メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ），ｐ５３，ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）及びトリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）；Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのエノラーゼ１（ｅｎｏｌａｓｅ １）及びＧＡＰＤＨ；（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのアネキシンａ１（ａｎｎｅｘｉｎ ａ１）；Ａｖｉａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのカルポニン２（ｃａｌｐｏｎｉｎ ２）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ １７−β ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びホスホグリセラートデヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）並びに残りの抗体はＡｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）から得た。

組み換えタンパク質は、ＮＹ−ＥＳＯ，ｐ５３，ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ），トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＴＰＩ），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ），３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５としても知られる），ｃ−Ｍｙｃ，アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及びユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ）を含む、我々の目的のための文書化された値を有する自己抗体の第２のグループと同様に、ＮＳＣＬＣ検出のための値（表７参照）を有するプロテオーム発見努力で特定された自己抗体候補のそれぞれについて得られた。商用抗体（標的確認のために上記で使用）は、分析動作の間に陽性コントロールとしての役目を果たすためのこれらの標的が得られた。組み換えタンパク質（自己抗原）の一部は、他のどこかで定義されているように、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）における我々の共同研究者らによって特別に調製された。組み換えタンパク質（自己抗原）の一部は、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）における我々の共同研究者らによって特別に調製された。これらは、α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ），グリオキサラーゼドメインコンテイニング４（ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４），メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ），ホスホグリセラートムターゼＩ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ Ｉ），ＩＭＰ−デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＰ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＩＩ），トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ），ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ），ｅｒｐ−２９，アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），アネキシンＡ１（ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１）（イソ型 ＣＲＡ＿ｂ），ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１０イソ型１（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ−（１７−β）−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １０ ｉｓｏｆｏｒｍ １），フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ），熱ショック７０ｋＤａタンパク質９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ ９Ｂ）（モルタリン−２（ｍｏｒｔａｌｉｎ−２）），タンパク質ジスルフィドイソメラーゼアソシエイテッド３前駆体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ３ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１イソ型１（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ ｉｓｏｆｏｒｍ １），カルポニン−２（ｃａｌｐｏｎｉｎ−２），ｃ−Ｍｙｃ，アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ），３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びＧＲＰ−７８前駆体を含む。

”直接捕獲”ビーズに基づく免疫測定法は、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの提案したプロトコルによって提案されたプロトコルを使用して開発された。５〜１０μｇの組み換えタンパク質は、それぞれ特有のビーズ領域識別子を有する５×１０^６のＳｅｒｏＭＡＰ^ＴＭミクロスフィア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に結合された。これは、５ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）及び５ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＥＤＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むｐＨ６．２のリン酸ナトリウム水溶液中に懸濁されたミクロスフィアを活性化することによって達成された。暗所で２０分間インキュベートした後、ミクロスフィアは、洗浄され、ｐＨ５．０の５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｔｗｏ−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）中に再懸濁され、更に、組み換えタンパク質の適量が添加された。ビーズは、連続的に混合された状態で、暗所内で室温下において２時間の間インキュベートされた。インキュベーション後、ミクロスフィアは、０．１％のＢＳＡ，０．２％のトゥイーン−２０（ｔｗｅｅｎ−２０）を含むＰＢＳで２回洗浄され、４℃において同バッファー中に保管された。

商用抗体は、直接捕獲分析の間に陽性コントロールとしての役目を果たすための全ての自己抗原候補が得られた。全ての抗原結合ミクロスフィアは、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって推奨された方法ごとに個々の検証を受けた。各タンパク質特異的な抗体の連続希釈物（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中４μｇ／ｍＬから０．０６２５μｇ／ｍＬの範囲）は、１．２μｍＰＶＤＦフィルター９６ウェルマイクロタイタープレート中のウェル当たり５０００個の抗原結合ミクロスフィアとともに、２時間インキュベートされた。ＰＢＳ，１％ＢＳＡで洗浄した後、固定化された自己抗体複合体は、４〜６μｇ／ｍＬのビオチン結合抗ヒトポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使って、一定の撹拌状態で１時間インキュベートされた。最後に、２回洗浄（上記のように）した後、複合体は、４〜６μｇ／ｍＬのＲ−フィコエリトリン結合ストレプトアビジン（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って、一定の撹拌状態で４５分間インキュベートされた。得られた複合体は、ＩＳ２．３ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用する我々のＬｕｍｉｎｅｘ １００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに読まれる前に、再度洗浄され、ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中に再懸濁された。性能特性は、全てのＳＰＳＳ ｖ１５．０中で範囲、％ＣＶ、感度及び特異性を含めて各分析毎に確定された。

成功した個々の分析の検証に続いて、多重検証は、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの変更された’ｌｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ’プロトコルを用いて行われた。タンパク質結合ミクロスフィアは、交差反応を回避すべくグループ中に低タンパク質配列ホモロジーを持つことに基づいて選択された各パネル毎に、４〜６の自己抗体分析を含むセットに分類された。各ミクロスフィアセット（上記のように行われた）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、多重化されたタンパク質ミクロスフィアセットが互いに正の干渉を持っていなかったことを確認するためにパネル値と比較された。最後に、３つのストック血清試料の連続希釈物もまた、交差反応について個々のミクロスフィアを評価するために使用された。

検証されたミクロスフィアセットを使用した血清分析−一旦多重化検証が完了すると、得られた自己抗原ミクロスフィアパネルの５つの異なる組み合わせは、自己抗体レベルについて患者の血清試料（ｎ＝１９６）を評価するために使用された。この評価のために、全ての血清は、例によって、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて１：２０に希釈され、分析は、別の方法で上記のように行った。血清中の与えられた自己抗体の濃度に関連する報告された平均蛍光強度値は、標準として利用できるモノクローナル又はポリクローナル抗体を使用して得られたＭＦＩ値と比較してスケーリングされた。スケーリングに使用される実際のＭＦＩ値は、患者コホート全体に関する中央のＭＦＩ値に最も近いものに基づいて選択された。これらは、残りの原稿の中で’ＭＦＩ^{ＳＣＡＬＥＤ}’値と呼ばれる。

２つの患者グループで違って表示される腫瘍関連自己抗原候補を識別するために、ＨＣＣ８２７細胞溶解物は、コントロール及び腺がん患者グループ（グループ当たりｎ＝１０）からのプール血清で個別にプローブされた各免疫ブロットを用いて、２次元ウエスタンブロットを介して分離された。図１Ａは、図１Ｂ及び図１Ｃに示された患者の血清に対する免疫反応性の違いを有する肺腺がん細胞株ＨＣＣ８２７から抽出されたタンパク質の代表的なクマシーで染色された２次元ゲルを示す。計２１個のスポットは、１０倍を超える免疫反応性の差を有することに基づくタンデム質量分析による同定のために選択された。

２次元ゲルから回収された自己抗原候補は、標準的なゲル内消化法によってタンパク質の同一性を証明するために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）質量分析計で分析された。ＭＳ／ＭＳ実験と関係したペプチド指紋分析は、選択された自己抗原の同一性を決定するために使用され、表５に示されている。この分析によって同定された各標的は、最初に摘出された予測ゲル座標（ｐＩ及び見かけのＭＷの両方）と高い相互関係を示した。スポット番号１２及び１８に関するＭＳ／ＭＳデータは、各スポットに関する２つのタンパク質を同定した、即ち、スポット１２について３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２型（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅ ２）及びヒドロステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１０イソ型１（ｈｙｄｒｏｓｔｅｒｏｉｄ−（１７−β）−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １０ ｉｓｏｆｏｒｍ １）並びにスポット１８についてＥＲ−６０プロテアーゼ（ＥＲ−６０ ｐｒｏｔｅａｓｅ）及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼアソシエイテッド前駆体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ３ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）。ＮＣＢＩのウェブサイト上のｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴは、これらの対が１００％の配列ホモロジーを共有したことを明らかにした。α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）のイソ型は、この分析から５つの異なる位置（スポット１，１１，１７，１９及び２１）で同定されたのに対し、アネキシンＡ１（ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１）は、２つの異なる位置（スポット９及び１０）で同定された。これらの結果は、各自己抗原候補に対する商業的に得られたポリクローナル及びモノクローナル抗体を使用した２次元ウエスタンブロットを介して確認された。更に、これらの研究は、各ゲル座標が図１Ａに示したものに相当する免疫反応性タンパク質を含んでいたことを明らかにした。

免疫プロテオーム（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）分析で同定された１６個のうちの１５個の異なる自己抗原は、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく免疫ビーズ（ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）血清分析に変換された。１０個の追加マーカー（ＮＹ−ＥＳＯ，ｐ５３，ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ），トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），リカバリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ），３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ），ｃ−Ｍｙｃ，アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及びユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ））は、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく免疫ビーズ（ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）血清分析に変換された。これにより、計２５個の改良免疫ビーズ（ｃｕｓｔｏｍ ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）分析は、ＮＳＣＬＣ状態に特異的な循環自己抗体に関して、１１７のＮＳＣＬＣ患者の血清及び７９のコントロール患者の血清を評価するために使用された。

評価された１５個の自己抗体のうちの７個は、コントロール集団と比較して、ＮＳＣＬＣ患者において著しく上昇したこと（ＡＵＣが０．６０よりも大きく、マンホイットニーＵ値が０．０５より小さい）が明らかにされた。これらは、イノシン−５−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＩＭＰＤＨ），フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＦＨ），α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ），小胞体タンパク質２９（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ２９，Ｅｒｐ２９），アネキシン１（ａｎｎｅｘｉｎ １），ヒドロステロイド１７−βデヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｓｔｅｒｏｉｄ １７−β ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＭＴＡＰ）を含んでいる。追加されたマーカーの、０．６８３のＡＵＣ及びｐ＜０．００１を有するアネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）は、最も優れたバイオマーカーであった。ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），ｃ−Ｍｙｃ，ＮＹ−ＥＳＯ，３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びｐ５３は、ＡＵＣ及びマンホイットニー両面ｐ値の両方において有意であることを発見した。他の全ての検体は、統計的有意性を満たすことができなかった。表３は、自己抗原に対する試験についての個々の試験性能特性が記載されている。

ランダムフォレスト多変量解析では、６個の検体（ＩＭＤＰＨ，ホスホグリセラートムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ，ＰＧＡＭ），ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及び熱ショックタンパク質７０−９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−９Ｂ，ＨＳＰ７０−９Ｂ））のパネルは、がんのないコホートからＮＳＣＬＣ患者を区別するための検体の最適な組み合わせであると決定された。これら６個の検体に関する箱髭図は、分割されたコホートとともに、図２Ａ〜２Ｆに示されている。年齢、性別又は喫煙状態との相関は、疾患状態に応じて観察されるそれらよりも強力であるこれら６個の検体でいずれにおいても観察されなかった。分類及び回帰ツリー（ＣＡＲＴ）分析は、これら検体から作られ、ＮＳＣＬＣ疾患状態に応じて患者を分類するための特定のアルゴリズムを定義するために使用される（図３Ａ参照）。このアルゴリズムは、０．９６４の’曲線下面積’，９４．８％の感度及び９１．１％の特異性を含む、全体的な研究のための”優れた”ＲＯＣパラメータを提供した。全体の誤分類率は、患者集団（ｎ＝１９６）全体に対して７％であった。２つの多変量アルゴリズム（例えば、ランダムフォレスト及びＣＡＲＴ）によって生じた結果の一般的な合意は、各方法によって選択された特定の６検体に関する確認としての役目を果たす。

患者コホートを評価すると、ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＭＭＰ−２，ＭＣＰ−１，ｓＥ−セレクチンからなる血清試験は同定された。サイトケラチンの１９のフラグメント、ＣＹＦＲＡ２１．１は、たぶん最も広く特徴づけられたＮＳＣＬＣに関する診断値を有するバイオマーカーである。多くの研究は、それらの潜在的な予後及び予測値と同様に、ＮＳＣＬＣの早期検出のためのそれらの潜在力を評価することに焦点を当ててきた。残りの検体のそれぞれは、ＮＳＣＬＣ又はがん腫のいずれかにおいて、診断値又は炎症における役割のいずれかを有する原因として個別に前もって示されている。より具体的には、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１ｒａは、急性期反応物質であると考えられているので、これらは、免疫応答の調整に関与しており、炎症状態において増加された発現を示す。がん細胞は免疫原性であり、それゆえ、関連した二次的なバイオマーカーと同様に、炎症性物質の増加された発現につながる。細胞回転の増加によるところが大きい慢性炎症及び腫瘍形成との間の関連がある場合に、血清マーカーを増加することができる。同様に、ｓＥ−セレクチン（ｓＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）は、細胞接着分子であり、炎症によって頻繁に調整される。ＭＭＰ−２は、上皮の再組織化のために組織を再構築する間の細胞外マトリックス中のタンパク質の分解に関与している。

検証コホート内のサブ集団に対する性能に関して、多変量パネルは、ＮＳＣＬＣを持つものとしてＮＳＣＬＣを有する患者のほとんどを正しく分類する（１５％の偽陰性率）ことができ、同様に、ＮＳＣＬＣを持たないものとしてアボットコホート内の患者を正しく分類する（２．５％の偽陽性率）ことができた。最も正しく分類することが困難だったサブ集団は、切除された非腫瘍性肺疾患を有する患者であった。誤分類されたこのグループからの患者（偽陽性率４７％）の全ては、ＮＳＣＬＣを持つものとして患者を分類するバイオマーカープロファイルを模倣するかもしれない炎症状態（例えば、肺炎、肺膿瘍、Ｃ型肝炎）を有していた。これは、更なる実施形態を提供し、分析は、炎症状態を検出し、更に、診断、予後及び治療選択のための高い関連性を有するこのプールから患者を選択するために、利用可能な技術と組み合わせて切除された非腫瘍性肺疾患を有する患者に使用される。

ここに示されたパネルの報告書に先んじて、ＣＥＡ，ＣＡ１２５，ＣＡ１９−９、ＣＹＦＲＡ２１−１及びＮＳＥの組み合わせは、感度９３．８％及び特異性７１．５％の報告された試験性能特性を備えた、ＮＳＣＬＣを診断するに関する最も効果的な血清試験である。このパネルは優れた感度を提供するにもかかわらず、それは特異性に乏しく、一連のＣＴに基づくスクリーニングプロトコルを補完するための手段としての役割を果たす能力がなく、”独立型の”診断方法としての役割を果たすには不十分である。

ここに示された結果を基に、６個の血清バイオマーカーに基づくＮＳＣＬＣ検出アルゴリズムは、ＮＳＣＬＣのリスクが高い患者のための低コスト且つ低侵襲なスクリーニング試験である。このパネルの感度及び特性を更に増加させるために、本パネルに対する自己抗体の添加が期待される。このタイプのバイオマーカーの添加は、ＮＳＣＬＣの症例からの切除を要求する炎症性結節を有する患者を識別するために必要な試験の特異性を提供する。

ＮＳＣＬＣと非ＮＳＣＬＣとの差別化のために、ＮＳＣＬＣに関する潜在的ながん自己抗体の多数は、試験され、実用性について検証された。これら３つの自己抗体（メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＭＴＡＰ），フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＦＨ）及び小胞体タンパク質２９（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ２９，Ｅｒｐ２９））は、コントロール集団からＮＳＣＬＣを区別するための新たな自己抗原標的を示す。以前に文献で見られた検体のうち、イノシン−５−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＩＭＰＤＨ），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ），ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），ｃ−Ｍｙｃ及びα−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）は、ＮＳＣＬＣの早期診断における応用に関して最も期待される（ＡＵＣ＞０．６３）。

本研究による６個の検体の血液試験（ＩＭＤＰＨ，ホスホグリセラートムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ），ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及びＨＳＰ７０−９Ｂから構成される）は、全体で誤分類されたのが１３人の患者のみである状態で、４の臨床的に異なるグループから構成される１９６の患者コホートに対して試験された際に、優れた試験性能特性を有する。我々が遭遇した分類エラーの範囲内で、我々は、Ａｂｂｏｔｔコホートからの２人の患者（グループの６％；１−喘息，１−ＣＯＰＤ），”変形性関節症”コホートからの１人の患者（グループの３％）及び”非腫瘍性”結節を切除されたコホートからの４人の患者（グループの２５％；２−肺炎，１−肺臓炎及び１−肉芽腫）を含む非ＮＳＣＬＣコホートにおいて４％の偽陽性率を観測した。臨床的特徴は、これらグループのいずれかの内の誤判別率の高さの説明に有効ではない。これらの知見、現時点で、アルゴリズムは、更なる診断評価が実施されるべき症状のある患者を示すのに役立つために適合するという考えを支持する。切除された非腫瘍性グループ内の誤判別率の高さは、間質性肺疾患、ＣＯＰＤ及び喘息などのような特定の炎症状態がＮＳＣＬＣを有する患者において見られる自己抗体に共通するかもしれない自己抗体の産出を誘導することが報告されているという事実から部分的に構成されるかもしれない。しかしながら、これらの自己抗体が発がんの前又は間に産出されるかどうかは、現時点では知られておらず、それは、これら標的のサブセットが早期疾患検出の手段を提供するかもしれないことに従うことができる。このテーマは今後の研究で更に追及される。この切除された非腫瘍性患者コホートにおける患者の数が相対的に小さく（計１６）、この一般的な知見の重要性を推定することを困難にすることにも留意すべきである。また、与えられたこのコホート全体は、疑わしいＮＳＣＬＣに関して間違って切除され、このグループは、現在の診断方法のいずれかによって識別することが最も難しいかもしれない。たとえそうでも、我々は、臨床学的及び放射線学的診断基準を正常に補完するこのアプローチの価値があることを実証しているこれらの患者の内の７５％をうまく分類した。おそらく、多くの懸念は、ＮＳＣＬＣコホートにおいて観測された５％（全体で３．１％）の偽陰性率（１１７の内の６）である。これらの誤分類が、単一のサブグループ又は臨床学的パラメータの周りに集められなかったにもかかわらず、このカテゴリ内の未分化腫瘍を有する患者の高い発生率（計４）があった。この観察における関連性は、未だ調査中である。また、興味深いことは、これらの誤分類が、段階ＩＡの患者（２−Ｔ_１Ｎ_０Ｍ_０，４−Ｔ_２Ｎ_０Ｍ_０）に制限されていなかったことであり、おそらく、指示エラーは、試験の感度に起因しなかった。これらの線に沿って、我々の試験がもともと腺がん試料のみに対して向けられたという事実にもかかわらず、これらの誤分類の組織構造が扁平上皮がん（ＳＣＣ）及び腺がんとの間で公平に分配されたという発見があった。これは、同定された標的がＮＳＣＬＣに関する自己抗体の産出に一般的だったことを示す。興味深いことに、全てのＳＣＣ患者は、病理学的検査の際に低分化度を有する腫瘍を持っていた。これは、非腺がん組織構造を有する患者の数がＮＳＣＬＣ患者の一般的な集団内において相当な（〜４０％）ものであるので、特に重要である。

多検体の自己抗体パネルは、ＮＳＣＬＣにおける使用のために前もって報告されたが、ここに記載されたパネルは、いくつかの報告されたどの血清試験よりも優れたＮＳＣＬＣの検出のための試験性能特性を持っている。加えて、提案された多検体パネルのうちのいくつかは、ここに報告されたものと比較して非常に小さな患者集団を持っている。

標的とされた自己抗体に関する診断に適した核酸又はポリペプチドは、様々な公知の分析形式のいずれにおいても提示することができる。例えば、自己抗体分析において、検体又はエピトープは、例えば、公知の化学的性質を使用して、固相に固定することができる。代替的に、検体又はエピトープは、典型的には合成結合分子を形成するためのエピトープよりも大きい他の分子に結合させる、又は、当技術分野で公知の組み換え法を使用して複合分子として作成することができる。多くのポリペプチドは、マルチウェルプレートのような組織培養器具において見出すことができるポリエチレン表面のようなプラスチック表面にありのままに結合する。そのようなプラスチック表面は、生物学的に適合する分子の結合を強化するための当技術分野で知られている技術のように処理することができる。ポリペプチドは、捕獲要素を形成し、検体又はエピトープと明確に結合する自己抗体を担持することが疑われる液体が捕獲要素に曝され、抗体は捕獲要素に取り付けられ固定化された後に洗浄されて、結合した抗体は、適切に検出可能にラベル化されたレポーター分子、例えば、コロイド金属、蛍光色素又は他の適切な当技術分野で知られているとして報告されたものでラベル化された抗ヒト抗体を使用して検出される。

あるいはまた、特定のファージの発現として、ＮＳＣＬＣを有する患者で発見された自己抗体によって明確に結合されたエピトープ、すなわち、分析の捕獲要素は、それぞれ固相上の捕獲サイトで、細胞溶解物から得られたような個々のファージとなり得る。発現された担体が取り付けられるタンパク質（例えば、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ），キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）など）のような反応的に不活性な担体又は合成担体（例えば、合成高分子など）、又は、免疫測定のための固相上の関心のある検体又はエピトープを提示するためのいくつかの他の方法は使用され得る。

許容される分析形式は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｒｉｎ）の非抗原結合部位が結合する固相に取り付けられた捕獲要素（タンパク質Ａ，タンパク質Ｇなど）の場所で配置を取るかもしれない。患者の痰、組織又は血漿は、捕獲試薬に曝され、その後、ＮＳＣＬＣ特異的な自己抗体の存在は、例えば、当該技術分野において知られている直接的又は競争的な形式でラベル化されたマーカーを使用して検出される。捕獲要素は、上述したように、特異的な捕獲試薬を生産するための他の方法を提供するためのエピトープを提示するファージに結合する抗体となり得る。

免疫測定技術分野において知られているように、捕獲要素は、抗体が結合する決定因子である。ここに教示されるように、決定因子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、多糖類などの生体分子又はその一部、及び、ここに記載されたバイオマーカーから選択された糖タンパク質又はリポタンパク質などのそれらの組み合わせであり、自己抗体の存在と相関する存在は、ＮＳＣＬＣの患者において見つかった。決定因子は、天然素材となりえ、組み換え又は合成製造及び精製することもできる。

免疫測定法の固相は、公知のものの及び当技術分野で知られている形態のいずれかとすることができる。したがって、固相は、ポリスチレン又はポリプロピレンなどのプラスチック、ガラス、シリコンチップのようなシリカ系構造体、ナイロンのような薄膜、紙などであり得る。固相は、紙形式、ビーズ、一般的に膜、マイクロタイタープレート、スライド、チップなどを使用するディップスティック又はラテラルフロー装置の一部などのような既知の異なる多数の形式を提示することができる。固相は、スライドガラスやチップに見られるような固い平面として現れ得る。いくつかの自動化された検出装置、例えば、分光光度計、液体シンチレーションカウンター、色度計、蛍光光度計及び光子ベースのシグナルの検出及び読み込みのためのようなものは、検出可能なシグナルを読み込むための方法に使われる消耗品に費やされている。

結合した抗体を検出するための他の免疫試薬は、当技術分野で知られている。例えば、抗ヒトＩｇ抗体は、捕獲決定因子、自己抗体及び抗ヒトＩｇ抗体を含むサンドイッチ状のものを形成するのに適しているだろう。抗ヒトＩｇ抗体、検出要素は、酵素、コロイド金属、放射性核種、染料などのレポーター分子で直接的にラベル化することができ、又は、それ自体は、レポーター機能の役目を果たす第２の分子によって結合することができる。結合した抗体を検出するためのいくつかの方法は、ここに記載された典型的な分析で使用することができ、このようないくつかの方法は、オペレータによって識別可能な信号を生成するためのレポート機能のためのいくつかの方法を含むことができる。レポーターを形成するための分子のラベル化は、当技術分野で知られている。

多数のサンプルの同時分析を可能にする装置との関連で分析性能、試薬性能、特異性及び感度をコントロールするために、多数のコントロール要素、すなわち、陽性及び陰性の両方のコントロールは、分析装置に含めることができる。多くの場合、前述のように、関心のある装置を作る全てのステップとはいかないまでも、分析ステップの多くは、機械化又は自動化された方法によって行われ得る。これら装置からのデータは、スキャン手段によってデジタル化することができ、デジタル情報は、データ記憶手段に伝達され、そのデータはデータ処理手段に伝達され、当技術分野で知られているような統計に基づく分析のようなデータ処理手段では、測定結果又は結果を生成するためのデータを使用することができ、それから、診断結果を提供するためのスクリーン又は情報の読み出しのようなデータ提示手段によって提示するために内部で比較される又は参照基準と比較され得る。

より小さいサンプル数を分析する、又は、十分な量の集団のデータがある装置については、適切なエラー測定を伴って、陽性結果及び陰性結果を何が構成するかに関する派生した測定法を提供することができる。このような場合、単一の陽性コントロール及び単一の陰性コントロールは、当技術分野で知られているように、内部検証のために必要とされる全てであってもよい。分析装置は、ＮＳＣＬＣクラスターが含まれるか否かというより定性的な結果をもたらすように構成することができる。

他の高スループット及び／又は自動化された免疫測定形式は、当技術分野で知られ、利用可能なものを使用することができる。したがって、色度、蛍光又は発光シグナル上に接地された、例えば、ビーズ−ビーズ分析、例えば、ここに記載されたＬｕｍｉｎｅｘ、すなわち、染料が充填されたマイクロスフィア及びＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍに頼る技術は使用することができる。いずれの場合も、関心のあるエピトープはビーズに固定されている。

ここに記載されたバイオマーカーパネルを検出するための分析の別の例においては、開示は、当技術分野で知られている技術を用いて、患者からの組織内の遺伝子発現を検査することによって、ＮＳＣＬＣのような肺がんに関連する遺伝子発現内の広範囲の変化を同定する。ここに記載されたバイオマーカーの遺伝子発現プロファイルは、肺がん疾患状態、疾患の進行及び薬物の有効性をモニターするために使用することができる診断マーカーとしての役目を果たすことができる。開示された実施形態は、表６からの２以上の遺伝子の組織サンプル中の発現レベルを検出するステップを包含する、患者における肺がんの有無を診断する方法を含み、表６中の遺伝子の差次的発現がＮＳＣＬＣのような肺がんの指標となる。いくつかの実施形態においては、１以上の遺伝子は、表６にリスト化された遺伝子からなる群から選択することができる。

また、開示された実施形態は、肺がんの進行を検出する及び／又は慢性炎症からがん性疾患を区別する方法を含む。例えば、開示された方法は、表６からの１以上の遺伝子の組織サンプル中の発現レベルを検出するステップを包含する、患者における肺がんの進行を検出することを含み、表６中の遺伝子の差次的発現が肺がんの進行の指標となる。

いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣのような肺がんを有する患者の治療をモニタリングする方法が開示されており、患者に医薬組成物を投与すること、患者からの細胞又は組織サンプルからの遺伝子発現プロファイルを用意すること及び正常血漿、痰又は正常肺細胞を包含する細胞集団からの遺伝子発現プロファイル、又は肺がんを有する患者からの血清、痰又は組織を包含する細胞集団からの遺伝子発現プロファイルと患者の遺伝子発現プロファイルとを比較することを含んでいる。いくつかの実施形態においては、遺伝子プロファイルは、表６中の１以上の遺伝子の発現レベルが含まれるだろう。他の実施形態においては、１以上の遺伝子は、表６にリスト化された遺伝子からなる群から選択することができる。

別の態様では、ＮＳＣＬＣのような肺がんを有する患者を治療する方法が開示されており、組成物が表６中の少なくとも１の遺伝子の発現を変化させるような医薬組成物を患者に投与すること、がん細胞を含む患者からの細胞又は組織サンプルからの遺伝子発現プロファイルを比較すること及び肺がん組織、尿、血清又は痰を含む未処理の細胞集団からの遺伝子発現プロファイルと患者の発現プロファイルとを比較することを含んでいる。

別の態様では、疾患の再発に関する患者の前兆のついての試験は、ここに開示された方法を用いて開示されている。病期は、ＮＳＣＬＣ患者に関する重要な予後的情報を提供し、治療決定を導く。ＮＳＣＬＣ患者の約２０〜３０％は、限局性疾患を示し、治癒への可能な限り最良の手段としての系統的なリンパ節の詳細な分析を伴う完全な解剖学的切除に対する資格がある。標準的な治療としては、局所領域の転移を伴う患者は、転帰を改善するための手段としての全身性の補助の化学療法を受けるだろう。明白な転移病変を有していない患者は、他方では、前のグループよりも良好な予後を持っており、それらの腫瘍が４ｃｍ未満であった場合、最終的な切除の後にのみ疾患の監視を受ける。これらの良好な見込みにもかかわらず、段階Ｉの疾患を有する患者は、再発に関するリスクが高く、これらの患者のおよそ３０〜４０％は、腫瘍の切除から５年以内に再発性疾患で死亡する。再発性疾患は、主として、標準的な臨床学的及び病理学的病期プロトコルによって検出されない、手術時における肉眼で発見できない”微小転移”病変の存在に起因する。化学療法が与えられた選択されていない段階Ｉの患者の集団は、臨床学的実験において転帰が劣る傾向を示したが、肉眼で発見できない転移を有する初期段階の患者のグループは、効果的な方法が最終的な治療の選択のために利用可能である場合に、重要な転帰の利益（より高い段階のグループと似ている）を受けることができる。

現在、段階Ｉの患者の高リスクサブセットを同定することができる検証方法が全くない。増えている証拠は、上皮性がんにおける転移の進行が、調節経路に広範囲に影響を与え、積極的な腫瘍細胞の挙動（例えば、高い移動性、足場非依存性及び侵襲性）をもたらす表現型のシフトによって引き起こされ得ることを示唆する。我々の研究の仮説は、細胞表現型における転移特有の変化は、血清中で発見されたｔｕｍｏｒ−ｓｈｅｄタンパク質バイオマーカーの違いをもたらすことを強く主張する。これらのバイオマーカーは、肉眼で発見できない転移性疾患を検出し、患者の転帰を予測するための大きな価値を持つかもしれない。このアイデアを評価するための我々のアプローチは、切除可能な早期ＮＳＣＬＣにおける患者の転帰を評価する臨床学的実験に関与した約５００人の患者からの照合発現配列データを有する血清プロテオームにおける転移関連の違いの比較研究に基づく転移性ＮＳＣＬＣに関する血清”セクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）”のモデルを構築することだろう。腫瘍転移によって最も高度に調整された生物学的経路の範囲の代表的なバイオマーカーの計画的なサンプルは、全身補助研究に関する対象者であるリスクが高い段階Ｉの患者を選択するための血清試験を開発するために使用される。

ＣＴスクリーニングが肺がんの死亡率を減少させるという最近の見解は、おそらく段階Ｉの肺がんと診断される個人の数の増加をもたらすだろう。疾患の再発の高いリスクを持ち、全身補助療法を試験する試験の対象である段階Ｉの患者を識別する信頼性のある診断方法は、肺がんの死亡率の更なる減少をもたらす。この研究の目的は、転帰によってＮＳＣＬＣ患者を階層化することができる検証された血清試験を開発することによって、この臨床学的必要性を満たし、全身補助療法のために患者を選択するための方法としての役目を果たす。

提示された病期は、これらの患者のための最も重要な診断情報を提供し、治療戦略の選択の指針を助ける。通常、ＮＳＣＬＣ患者の２０〜３０％は、限局性疾患を示し、治癒への可能な限り最良の手段としての系統的なリンパ節の詳細な分析を伴う完全な解剖学的切除（Ｒ_０切除）に対する資格がある。無作為化比較実験及びＬｕｎｇ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＬＡＣＥ）メタ分析に基づく、術後全身化学療法は、原発腫瘍が４ｃｍを超えるとき、転帰を改善するためにリンパ節転移を有する患者に推奨される。明白な転移病変を有していない患者は、他方では、前のグループよりも良好な予後を持っており、それらの腫瘍が４ｃｍ未満であった場合、最終的な切除の後にのみ疾患の監視を受ける。これらの良好な見込みにもかかわらず、段階Ｉの疾患を有する患者は、再発に関するリスクが高く、これらの患者のおよそ３０〜４０％は、腫瘍の切除から５年以内に再発性疾患で死亡する。再発性疾患は、主として、標準的な臨床学的及び病理学的病期プロトコルによって検出されない、手術時において肉眼で発見できない”微小転移”病変の存在に起因する。化学療法が与えられた選択されていない段階Ｉの患者の集団は、臨床学的実験において転帰が劣る傾向を示したが、肉眼で発見できない転移を有する初期段階の患者のグループは、効果的な方法が最終的な治療の選択のために利用可能である場合に、重要な転帰の利益（より高い段階のグループと似ている）を受けることができる。

増えている証拠は、上皮性がんにおける転移の進行が、間充織幹細胞の特徴を有する１つに向かう表現型の変化によって引き起こされ得ることも示唆する。この上皮−間充織変化（ＥＭＴ）に関連付けられた分子の特性は、調節経路に広範囲に影響を与え、積極的な腫瘍細胞の挙動（例えば、高い移動性、足場非依存性及び侵襲性）をもたらす。理論に束縛されるものではないが、これは、細胞表現型における転移特有の変化は、血清中で発見されたｔｕｍｏｒ−ｓｈｅｄタンパク質バイオマーカーの違いをもたらすことを強く主張されている。これらのバイオマーカーは、肉眼で発見できない転移性疾患を検出し、患者の転帰を予測するための大きな価値を持つかもしれない。このアイデアを評価するためのアプローチは、切除可能な早期ＮＳＣＬＣにおける患者の転帰を評価する臨床学的実験に関与した約５００人の患者からの照合発現配列データを有する血清プロテオームにおける転移関連の違いの比較研究に基づく転移性ＮＳＣＬＣに関する血清”セクレトーム”のモデルを構築することである。腫瘍転移によって最も高度に調整された生物学的経路の範囲の代表的なバイオマーカーの計画的なサンプルは、全身補助研究に関する対象者であるリスクが高い段階Ｉの患者を選択するための血清試験を開発するために使用されるだろう。我々は、これらの目標を達成するために３つの特定の目的を提案する。

目的１：疾患の再発に関するリスクに基づいて、段階ＩのＮＳＣＬＣの患者を分類するための値を持つバイオマーカーを同定する。この目的は、切除可能なＮＳＣＬＣを有する患者に関する生存率予測を評価する研究から取得した発現マイクロアレイプロファイルが保管されたおよそ５００人からのデータを有する血清プロテオーム（ｎ＝１００）からの交差データによって達成されるだろう。

目的２：２５個もの候補バイオマーカーの測定（絶対量測定）循環レベルを同定し、再発性疾患に関するリスクに基づいて、段階Ｉの患者を階層化するためのこれらの能力についてこれら候補バイオマーカーを評価する。最も期待されるバイオマーカーは、再発性疾患を予測診断するための分類アルゴリズムを開発するために使用されるだろう。

目的３：血清試料に対するバイオマーカーの最適な組み合わせの独自の検証では、我々は、がん及び白血病グループＢ（Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｇｒｏｕｐ Ｂ，ＣＡＬＧＢ）との協力を通して得られた。この検証研究、ＣＡＬＧＢ１５０８０９は、ＣＡＬＧＢ１４０２０２への完全なＩＲＢ承認コンパニオン研究であり、試料（ｎ＝２３０）の多組織コホートで、この提案の目的として開発されたバイオマーカーパネルを試験するだろう。

様々な分子アプローチは、臨床学的転帰（無病再発）に基づいて段階ＩのＮＳＣＬＣ患者を階層化するための方法として研究されている。この分野において重要な研究は、全身補助化学療法のためのＮＳＣＬＣ患者を選択するための前兆となる多重遺伝子シグネチャーを同定するという究極の目的をもって、主として、原発腫瘍からの発現マイクロアレイデータと、局所領域のリンパ節の状態又は転帰との関連に焦点を当てている。

全ての血清／血漿試料は、完全なＩＲＢの承認及び文書による（個々の）患者の同意を伴う腫瘍切除の直前に採取された。他の収集プロトコル及び保存条件は、他のどこかで定義されている。以下に概説される選択基準を満たしている血清試料についてのグループ分けは、表９に与えられている。

全ての試料は、≧２年の利用可能な臨床経過観察データを有するＲＵＭＣで予め集められた。全ての患者は、標準的な門及び縦隔リンパ節の詳細な分析を伴って病理学的に段階分けされるだろう。ヘマトキシリン及びエオシン染色は、転移性疾患の存在を同定するために行われた。解剖学的切除における転移の進行の病理学的証拠がなく、切除から２年以内の疾患の再発がない患者は、”再発なし”と見なされるだろう。全ての試料は、目的を達成するために利用可能な十分の血清を持つだろう。全ての患者は、化学又は放射線両方のいずれかに対してナイーブになるだろう。

血清バイオマーカーの発見のために提案されている一般的なアプローチは、口腔扁平細胞がんに関する循環バイオマーカーの同定のためにＢｉｊｉａｎらによって使用されたものに酷似しているだろう。簡潔には、彼らは、プールされたｉＴＲＡＱラベル化血清試料グループ（コントロール対担がん；侵襲性対非侵襲性腫瘍）の２次元ＨＰＬＣに次いで、彼らの研究グループ間での特異的な発現された候補バイオマーカー（ｐ＜０．０５）の範囲（〜１１００）を同定及び定量化するためにオンラインのイオントラップ質量分析を使用した。

多量のタンパク質の枯渇−血清プロテオームは、一般的に、血清／血漿試料中に通常存在するタンパク質濃度（１０〜１２桁）の広い範囲が与えられた技術的に困難な作業であると考えられている。この広ダイナミックレンジは、未分画試料において、少及び超少量のタンパク質の検出を困難にする。この問題を未然に防ぐために、我々は、現在、バイオマーカーの発見のための少量タンパク質へのアクセスを改良するために血清試料中の１４の最も多量なタンパク質の９０〜９５％を除去するためにＡｇｉｌｅｎｔ ＭＡＲＳ Ｈｕ−１４カラムを使用している。［注記：我々は、これらタンパク質の枯渇は、実際には、特有でない共通の枯渇に起因して、同定されたタンパク質の数を少し減少させるかもしれないことを認識している。この結果のために、我々の枯渇プロトコルは、ＨＵ−１４カラムからの溶出液は、将来の分析のために保存されることを保証する。］

多量のタンパク質は、製造業者のプロトコルに従って、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＡＲＳ ＨＵ−１４カラム（４．６×１００ｍｍ）を用いて、上で概説された６個のグループ（グループ当たりｎ＝１０；ｎ＝５の場合は３及び４のグループを除く）に相当する１００個の術前血清試料（それぞれ４０μＬ）から個々に枯渇され得る。試料は、この研究のために我々の統計学者（Ｄｒ．Ｂａｓｕ）によって、各グループのための我々の完全なリポジトリホールディングス（表１に概説されたような）から無作為に選択され、共通層のカテゴリ（例えば、年齢、性別など）に関するこれら組織学的グループ間でできる限りマッチさせられるだろう。全ての実験は、盲目にされ、サンプリングバイアスを制限するための非冗長な反復下で行われた。試料の枯渇は、技術的な反復及び我々のＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムの採用によって達成されるだろう。結果として生じる少量のタンパク質の画分（推定：計２４０〜３４０μｇｓ）は、枯渇バッファーからのタンパク質混合物を濃縮する及び脱塩するために沈殿されたアセトンであろう。

トリプシン処理及びｉＴＲＡＱラベル化：多量のタンパク質の枯渇された全ての個々の血清試料は、最小限の修正を伴って、ｉＴＲＡＱ分析のためのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって推奨されたプロトコルを用いたＭＳ分析のために準備された。シーケンシンググレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使った完全な試料消化は、製造業者の定義されたプロトコルを用いて達成される。各トリプシン消化物は、患者コホートセクションで定義された６個のグループに応じて、特有のｉＴＲＡＱ試薬を用いてラベル化されるだろう。すなわち、１１３〜１１９Ｄａ。ペプチド参照基準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の追加のグループもまた、インターランＱＣ／ＱＡを制御するためのコントロールとしての役目を果たし、バッチ間の再現性を確保するためにラベル化（１２１Ｄａ）されるだろう。

多次元タンパク質同定（ＭｕｄＰＩＴ）実験：上で調製された試料は、オンライン（直接注入される）多次元ＨＰＬＣ戦略（”ＭｕｄＰＩＴ”として知られる）を用いて質量スペクトル研究のために分画されるだろう。各ｉＴＲＡＱラベル化ペプチド混合物のおよそ２０〜５０μｇｓは、各クロマトグラフの実行で処理されるだろう。最初のクロマトグラフの分画は、１０ステップの揮発性塩勾配を用いた強陽イオン交換によって達成されるだろう。全ての溶出したペプチドは、逆相ペプチドカートリッジを用いた第２のクロマトグラフの次元における分解のためにトラップされる。バルブを切り替える際に、第２のトラッピングカートリッジは、次のＳＣＸ勾配の画分が詰め込まれる一方、トラップされたＳＣＸ画分は、逆相カラム上に分解され、分析するために、ナノＥＳＩ−を介して我々のＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ ＸＬ線形イオントラップ質量分析計に注入されるだろう。分解されたｉＴＲＡＱラベル化ペプチドは、各ＭＳスキャンからの４〜１０個の最も豊富に存在するペプチド（５００カウントのイオン閾値）に関するＭＳ／ＭＳスキャンを使ってデータ依存モードにおいて分析されるだろう。ｉＴＲＡＱラベルシグネチャー集団（即ち、１１３〜１１９及び１２１Ｄａ）は、同一のｉＴＲＡＱラベル化ペプチドの適切な定量化結果を得るためにパルス誘起解離（ＰＱＤ）を用いて監視されるだろう。全ての実行は、生成された全てのデータの再現性を保証するために技術的な反復の下で行われ、装置は５回毎に分析の直前に調整した。ｉＴＲＡＱ実験で同定された特定のペプチドは、ペプチドの量及びタンパク質の同一性の確認研究のために多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を受けるだろう。親ペプチド集団及び娘断片化パターンは、ＭＡＳＣＯＴ結果ファイルから得られるだろう。このデータベースは、この一連の実験のためのＭＲＭ値を生成するために使用されるだろう。ｉＴＲＡＱラベルシグネチャー集団は、同一のｉＴＲＡＱラベル化ペプチドの適切な定量化結果を得るために、ＰＱＤを用いて監視されるだろう。更に、発見段階で観察されたのを除いて、同定されたタンパク質に相当する追加ペプチドは、最初の研究結果に対する追加の信頼を提供するために特に監視されるだろう。追加の分解がこの分析のために必要とされる場合には、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ ＦＴ−ＩＣＲがＵＩＣ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて利用可能である。広範囲に及ぶ配慮は、実験的バイアスの潜在源を最小限にし、試験されたグループ間の真の定量的変化を検出するための我々の能力を促進するために、Ｏｂｅｒｇ及びＶｉｔｅｋの提案を使用したこの研究に関する実験計画に入れられた。

バイオインフォマティクス（タンパク質同定）：データ分析（タンパク質同定及び関係のあるペプチドの定量化）は、以前に我々が報告した方法と同様に、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）及びＢｉｏｗｏｒｋｓ３．３．１（Ｔｈｅｒｍｏ）プラットフォームを用いて実施されるだろう。生データは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェアパッケージ内のデータ抽出モジュールを使用してＭＳデータファイルから抽出され、その後、タンパク質の同定のために、Ｍａｓｃｏｔ及びＳｅｑｕｅｓｔアルゴリズムによってタンパク質ライブラリ検索を受けるだろう。タンパク質データベース検索は、ヒトデータベース内のトリプシンペプチドに制限されており、同定されたタンパク質のＭＳデータ（拒否された全ての偽陽性タンパク質を有する）は、デコイデータベース検索を受ける。ＬＴＱ−ＦＴから得られたデータの前駆体質量誤差は、ＬＴＱ−ＸＬに関して１０ｐｐｍ及び０．５Ｄａであるだろう。同定されたタンパク質の完全なリストは、その後、タンパク質における結果並びに比率及び標準偏差の計算のグループ分けするためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ａｃｃｅｓｓ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）データベースに転送されるだろう。タンパク質の同定の信頼性は、９５％の信頼性及び最低３０％の配列カバー率及びタンパク質当たりの同定が２つのタンパク質を下回らないことに応じて選択されるだろう。代替的に、ＣｈｉｃａｇｏにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＩｌｌｉｎｏｉｓのＭａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙは、日常的に、プロジェクト毎に有料のＳｃａｆｆｏｌｄ ｖ３．０を使用したこの分析を実行する。

遺伝子発現マイクロアレイデータの分析−この副次的目的のために使用されるデータは、研究の調査員から直接入手された。全ての発現データのセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙプラットフォームを使用してプロファイリングされた。ここで検査された一次データのセット（．ＣＥＬファイル）は、Ｒａｐｏｎｉら（Ｔ_１−４Ｎ_０Ｍ_０ｎ＝８３；Ｔ_１−４Ｎ_１−２Ｍ_０ｎ＝４７）及びＳｈｅｄｄｅｎら（Ｔ_１−４Ｎ_０Ｍ_０ｎ＝２０１；Ｔ_１−４Ｎ_１−２Ｍ_０ｎ＝９０）からのものであり、無再発生存に基づいて比較されるだろう。組織学的診断は、もっぱらＳｈｅｄｄｅｎに関する腺がんであった一方、Ｒａｐｏｎｉデータのセットは、扁平細胞がんであった。

．ＣＥＬファイルのプローブレベルの正規化は、ＲＭＡ方法によって実施されるだろう。異なる研究室からのバッチ効果は、主成分分析を用いて評価されるだろう。バッチ効果がデータセット間で存在した場合には、Ｍｅａｎ−Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄは、我々が以前に遂行したような、バッチ効果を除去するために使用されるだろう。簡潔には、各バッチ内の全てのサンプルに渡る各特徴の平均がゼロに設定される。このアプローチは、また、ゼロ平均又は分散調整の一元分析と呼ばれる。これはｐａｍｒ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ.ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ.ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｐａｍｒ）により実行されるだろう。正規化及びバッチ効果の除去後、全てのデータセットは、転移関連遺伝子を同定するために集められるだろう。対をなさないスチューデントｔ検定は、非転移性と転移性サンプル間の差別化された遺伝子を同定するために使用されるだろう。２倍を伴うカットオフｐ値≦０．０５は、著しく異なった形で発現する遺伝子を発見するためのカットオフとして変化する。バイオマーカーの選択方法−候補バイオマーカーの選択は、上で定義された方法を用いて実施された。簡潔には、切除（無再発に関連して）から２年以内の疾患の再発を有する患者において１．５よりも多く調整された我々のプロテオームセクションで同定されたタンパク質は、濾過され、分析された発現アレイデータを使って分析された。我々は、およそ２００〜５００のタンパク質（又は標的）がこのカテゴリーになり、腫瘍セクレトームが存在するだろうことを期待する。これら標的は、その後、Ｄｅｔａｂｅｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）及びＧｏｆｅｔｃｈｅｒツールを使用して定義されているＧｅｎｅ Ｏｎｔｒｏｌｏｇｙ（ＧＯ）に従って機能的なカテゴリーに分類されるだろう。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙの機能的な項の０．０５未満の濃縮ｐ値は、有意と見なされる。この労力と並行して、また、我々は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎａｌｙｓｉｓツールを使用して、この経路分析を実行するだろう。ＧＯ分析と同様に、０．０５未満の濃縮ｐ値を有する経路は、有意な調節経路（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）であると見なされた。我々は、その後、ラッパースタイルでＳＶＭを使用することによって、最適な標的（候補バイオマーカー）を除外する一次的方法としてｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ（ＳＶＭ−ＲＦＥ）を使用するだろう。アルゴリズムは、特定の学習課題に関する特徴のサブセットを選択する。基本的なアルゴリズムは、以下である：１）全ての特徴が含まれるようにデータセットを初期化し、２）データセットにＳＶＭを訓練し、３）ｃｉ＝（ｗｉ）に応じて特徴をランク付け、４）特徴の低ランクの５０％を排除し、５）ステップ２に戻る。各ＲＦＥステップ４において、遺伝子の数は、ＳＶＭ分類モデルの活性変数から捨てられる。１０のＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）定義の最小値は、表され、内部検証に関する有意性に基づいてランク付けされるだろう。潜在的な隠れた危険と代替戦略−現在、我々の全体的なオペレーションは、血清試料の分析に合わせて調整されたので、これは我々の自然な選択だった。一般的に、血清ベースのプロテオームに疲れた調査員は、血栓形成の間にタンパク質分解に対するバイオマーカーの潜在的な損失に関心を持っている。この問題を回避するために、我々は、血清が血清学的方法からのばらつきを最小限にし、再現性を維持するために処理される方法に関係する厳密なプロトコルを持っている。しかしながら、完全なまま又は部分的に分解したかどうかの血清タンパク質における関連性のある違いは、我々の一般的な戦略によって検出され、我々の目標を達成させるだろう。

定量化Ｌｕｍｉｎｅｘ分析開発及び特性評価−Ｌｕｍｉｎｅｘ分析開発：可能な限り、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォーム上に構築された市販の免疫ビーズ分析は、記載された研究のために使用されるだろう。選択された候補バイオマーカーのための有効な分析の商業的供給源が利用できない場合にのみ、改良分析が開発されるだろう。各候補バイオマーカーに関する改良サンドイッチ状免疫ビーズの開発は、商用抗体の販売業者（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を介して購入された抗体対（モノクローナルキャプチャ／ポリクローナルキャプチャ）を採用するだろう。我々は、この研究に関するいくつかの免疫試薬の開発を進展する又は縮小することを提案しておらず、我々の候補バイオマーカーの選択アルゴリズムの因子としての免疫試薬の利用可能性を検討するだろう

改良分析開発に関する方法は、我々が事前に定義し、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって推奨されたものと一致するだろう。成功した個々の分析の開発及び性能特性判定（下記参照）の後に、パネル当たり５〜１０の検体の分析を含む多重分析が構築されるだろう。分析のグループ分けは、交差反応を有する潜在的な問題を回避するために、グループに渡り低いタンパク質配列相同性を有することに基づくだろう。交差反応に関するこれら多重分析の検証は、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの修正された’ｌｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ’プロトコルを用いて実行されるだろう。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値における１０％の差は、各個々の標的に関する相互分析干渉のための我々の閾値となるだろう。性能特性は、多重グループ内の全ての個々の分析のために再確立されるだろう。

分析性能を確保する（品質保証）ためのガイドライン：全ての分析の技術的及び臨床的な検証は、以下のパラメータの決定を必要とするだろう：分析間精度，ＱＣモニタリング，分析の再現性，分析の線形性，組み換え抗原バッチの再現性及び分析標準（ポリクローナル抗体）バッチの再現性。内部検証及びバイオマーカーパネルの開発−個々の患者試料を有する候補バイオマーカーの評価は、我々がすでに報告した方法と一致して進むだろう。３つの患者集団（混合された組織構造／性別）からの血清試料を評価可能な合計３０９のＮＳＣＬＣは、この研究に含まれ、表１に定義されている。このグループは、無再発の初期段階（Ｔ_１−３Ｎ_０Ｍ_０）のＮＳＣＬＣを有する９９人の患者と、初期段階（Ｔ_１−３Ｎ_０Ｍ_０）のＮＳＣＬＣを有する２８人の患者とから構成され、最初の切除から２年以内の病理学的に確認された疾患を持っている。我々はまた、陽性リンパ節（Ｔ_１−３Ｎ_１−２Ｍ_０）疾患（ｎ＝８０）を有する我々のパネルの患者を試験するだろう。この研究のために使用される試料は、目的１の発見努力から非冗長になるだろう。患者の選択基準及び収集プロトコルに関する詳細は、我々のグループによって以前に報告されている。このコホートは、平均３．４年の経過観察を持っている。全ての試験されたバイオマーカーの単変量分析は、以前に定義されたように、多変量パネル選択アルゴリズム（ランダムフォレスト及びＲＣＡＲＴ）がするように実施されるだろう。この目的からの研究結果は、検証されるだろう。バイオマーカーパネルの多組織コホート検証−検証研究のための検出力予測−この目的の第１の目的は、２年の無再発生存に従って初期段階のＮＳＣＬＣ患者を正確に階層化するために我々の多変量バイオマーカーパネルの精度を評価することである。

Ｌｕｍｉｎｅｘ分析の性能に関する検証方法は、単一、多重パネル（個別の代わり）のようなパネルを実行するための潜在的な例外とともに、目的２に使用されるということに近づけるだろう。このパネルの開発及び検証は、目的２のための方法で記載された同一の’ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ’検証プロトコルを使用されるだろう。我々は、１００μＬのうちのおよそ２０μＬのアリコートが、多重パネル／分類アルゴリズムを試験する可能性を提供している検証目的のためにＣＡＬＧＢから得られるということを予測している。この比較研究を達成するための容認は、物の集まりからなっている。

他の非肺がん病変からＮＳＣＬＣを区別する方法は、表６からの１以上の遺伝子の組織サンプル中の発現レベルを検出するステップを含み、表６における遺伝子の差次的発現が、他の病変というよりもむしろＮＳＣＬＣのような肺がんの指標となる。

ＮＳＣＬＣのような肺がんの発病又は進行を調節することができる物質をスクリーニングする方法は、物質へ細胞を暴露するステップを含み、表６からの２以上の遺伝子の発現レベルを検出する。

上述した開示された方法のうちのいくつかは、表らからの少なくとも２つの遺伝子の検出を含むかもしれない。特定の実施形態において、方法は、全て又はほぼ全ての表中の遺伝子を検出するかもしれない。いくつかの実施形態では、１以上の遺伝子は、表６中にリスト化された遺伝子からなる群から選択されるかもしれない。

組成物は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドが表３中の遺伝子に特異的にハイブリッドする配列を含み、同様に、固体は少なくとも２つのプローブを支持し、各プローブは、表６中の遺伝子に特異的にハイブリッドする配列を含むことが開示されている。

コンピュータシステムは、また、表６中の少なくとも２つの遺伝子を含む遺伝子セットの肺組織、血清又は痰中の発現レベルを同定する情報を含むデータベースを含むこと及び情報を表示するためのユーザインターフェースが開示されている。データベースは、更に、遺伝子に関する配列情報、正常な肺組織及び悪性組織（転移性及び非転移性）中の遺伝子セットに関する発現レベルを同定する情報を含むかもしれず、ＧｅｎＢａｎｋなどのような外部データベースへのリンクを含むかもしれない；データベースは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）又はＮＣＢＩ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）によって維持した。使用するかもしれない他の外部データベースは、ケミカル・アブストラクツ・サービス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）（ｓｔｎｗｅｂ．ｃａｓ．ｏｒｇ／）及びＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）によって提供されるものが含まれる。

開示された方法の１つ以上の実施のために有用なキットもまた開示される。いくつかの実施形態において、キットは１以上のオリゴヌクレオチドを結合した１以上の固体支持物を含むかもしれない。固体支持物は、高密度のオリゴヌクレオチドアレイであっても良い。キットは、更に、アレイとともに使用するための１以上の試薬、１以上のシグナル検出及び／又はアレイ処理装置、１以上の遺伝子発現データベース及び１以上の分析及びデータベース管理ソフトウェアパッケージを含むかもしれない。

データベースを使用する方法は、データベース中の遺伝子の発現レベルと組織又は細胞における表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルとを比較するステップを含む表６中の少なくとも１つの遺伝子の組織又は細胞中の発現レベルを同定する情報を提示するための開示されたコンピュータシステムを使用する方法など開示されている。

開示された組成物及び遺伝子の発現レベルを検出するための方法は、細胞の状態、すなわち、正常に対するがん性に依存して差次的に発現されるかもしれない。ここで使用するとき、”レベルの発現を検出する”という語句は、目的の遺伝子の全てが発現されたかどうかを決定する方法と同様に、定量的に発現レベルを決定するという当技術分野で知られている方法を含む。したがって、必ずしも発現量の定量化を提供しなくとも、ｙｅｓ又はｎｏの結果を提供する分析は、ここで使用される語句のような”発現レベルを検出すること”を必要とする分析である。

この開示では、ＮＳＣＬＣ対非悪性疾患の検出及び肺がんを有する患者のための治療の選択のために使用される好ましい及び代替の実施形態を説明したが、これは、開示された実施形態が、他のがん、より具体的には他の肺がんの検出に用いることができると考えられる。したがって、即時の開示は、ＮＳＣＬＣに対する開示された実施形態の使用に制限すると解釈すべきではない。更に、ここに記載された分析の個々の要素の構成及びタイプは、好ましい実施形態を表し、代替の構成及びタイプの使用を制限すると解釈すべきではない。当業者は、記述から、設計者によって意図され得る代替の実施形態を識別することができる。

Claims (9)

1. 哺乳類の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を評価するための方法であって、
   哺乳類から採取された生体サンプルを分析することと、
   イノシン−５−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＩＭＰＤＨ），フマル酸ヒドラターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＦＨ），α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ），小胞体タンパク質２９（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ２９，Ｅｒｐ２９），アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），ヒドロステロイド１７−βデヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｓｔｅｒｏｉｄ １７−β ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ），メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＭＴＡＰ），アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ），ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ），ｃ−Ｍｙｃ，ＮＹ−ＥＳＯ，３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），ｐ５３ホスホグリセラートムターゼ（ｐ５３ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ）及び熱ショックタンパク質７０−９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−９Ｂ，ＨＳＰ７０−９Ｂ）からなる群から選択された少なくとも１つの自己抗原に対する自己抗体のレベルを測定することとを含み、
   前記自己抗体の存在が、哺乳類がＮＳＣＬＣを持っていることを示すことを特徴とする方法。
2. 哺乳類が、ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２Ｒα，ＣＡ１２５，ＭＣＰ−１，ＣＲＰ，ＭＭＰ−２及びｓＥ−セレクチン（ｓＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）からなる群から選択された少なくとも１つのポリペプチドの上昇された発現を有するか否かを測定することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 前記生体サンプルは、肺組織、痰及び血液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
4. 生体サンプル中の１つ以上の少なくとも１つのポリペプチドの上昇されたレベルを検出することと、
   前記少なくとも１つのポリペプチドは、ＴＮＦ−α，ＣＹＦＲＡ２１．１，ＩＬ−１ｒａ，ＭＣＰ−１，ＭＭＰ−２及びｓＥ−セレクチン（ｓＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）からなる群から選択されることとを更に含む測定をすることを特徴とする請求項１乃至３記載のいずれかの方法。
5. 同時にポリペプチドアレイを使用して、複数のポリペプチドの上昇されたレベルを検出することを更に含むことを特徴とする請求項１乃至４記載のいずれかの方法。
6. ＮＳＣＬＣのリスクを評価するために、前記自己抗体の存在を使用することと、
   哺乳類が更なるコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を使ったスクリーニングを必要とするか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項１乃至５記載のいずれかの方法。
7. レベルは、免疫組織化学を用いて決定することができることを特徴とする請求項１乃至６記載のいずれかの方法。
8. 前記自己抗原は、ＩＭＰＤＨ、ホスホグリセラートムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ）、ユビキリン（ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ）、アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ）、アネキシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）及び熱ショックタンパク質７０−９Ｂ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−９Ｂ，ＨＳＰ７０−９Ｂ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至７記載のいずれかの方法。
9. 哺乳類が、ＩＭＰＤＨ，ＦＨ，α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ），小胞体タンパク質２９（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ２９，Ｅｒｐ２９），アネキシンＩ（ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ），ヒドロステロイド１７−βデヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｓｔｅｒｏｉｄ １７−β ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びＭＴＡＰからなる群から選択された自己抗原に対する自己抗体パネルの発現を有するか否かを測定することを含むことを特徴とする請求項１乃至７記載のいずれかの方法。
   

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