CN116529603A - 用于检测和治疗肺癌的方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于检测早期肺癌和确定患肺癌的风险的方法和相关试剂盒。

Description

用于检测和治疗肺癌的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年10月2日提交的美国临时专利申请号63/086,865和2020年10月27日提交的美国临时专利申请号63/106,187的权益，将这些申请的披露内容通过引用以其全文并入本文。

背景技术

肺结节是胸部计算机断层成像(CT)扫描的常见发现。一般群体中有相对高百分比的受试者(约1.9％)每年进行胸部CT检查，其中约24％-31％中发现了偶发结节，这与美国国家肺癌筛查研究(National Lung Screening Trial)中报告的结节发生率(24％)相似。结节是癌症的风险主要与其大小有关，大于20mm的结节通常需要进行检查。对于较小的结节，建议对其进行额外的成像，例如PET/CT，或短期随访重复CT扫描。这样的方法有遗漏早期肺癌的风险。

每年有超过150,000名患者因肺部不确定性结节就诊。这些结节被定义为肺部病变，小于3cm，边界清晰。其中大多数是非癌性或良性的。当结节含有钙化时，诊断良性病变更容易。非常小的结节(小于1cm)更可能是良性的；然而，用目前的活检和成像技术来证明这一点具有挑战性。

尽管大多数不确定性结节是良性的，但也有一些是恶性的，需要进行额外的干预。对于被认为恶性结节风险低的患者，目前的医疗实践要求至少两年进行扫描以监测肺癌。不确定性结节的鉴定与诊断之间的时间段是医学监视或“观察等待”的时间，可能会给患者带来压力，并由于反复的成像检查而导致重大风险和费用。如果对被发现具有良性结节的患者进行活检，则会不必要地增加成本和对患者造成伤害的可能性。为了切除标本以用于组织活检和诊断，需要进行大手术。所有这些程序都与患者的风险相关，该风险包括：疾病、损伤和死亡以及高昂的经济成本。

管理肺结节的关键未满足临床需求是非侵入性诊断测试，该非侵入性诊断测试区分具有不确定性肺结节(IPN)(尤其是大小在8mm至20mm之间)的患者中的恶性和良性过程。

发明内容

提供了用于分层肺结节的四种蛋白质生物标志物组(蛋白质前表面活性蛋白B(proSFTPB)、癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白-21片段(CYFRA 21-1))，和使用该组对通过CT扫描发现的肺结节(通过肺癌筛选或筛选之外发现的)的风险进行分层的方法。阳性4MP测试可以鉴定出具有患肺癌的高风险的肺结节，这些肺结节通过当前基于结节大小的风险计算被认为是低风险的。类似地，阴性4MP测试可以鉴定出其他风险的结节，这些结节可能不需要进行诊断检查，并且可以安全地通过放射照相方式检查。这些方法使用从受试者获得的生物样品内含有的生物标志物的多重测定。

还提供了用于改进的肺癌检测的2-微小RNA(miRNA)组(miR-320和miR-210)和它们与4MP测试组合使用的方法。2-miRNA组与4MP测试的组合能更好的鉴定具有患肺癌的高风险的肺结节。这些方法使用从受试者获得的生物样品内含有的生物标志物的多重测定。

还提供了用于改进的肺癌检测的3-微小RNA(miRNA)组(miR-320、miR-210和miR-21)和它们与4MP测试组合使用的方法。3-miRNA组与4MP测试的组合能更好的鉴定具有患肺癌的高风险的肺结节。这些方法使用从受试者获得的生物样品内含有的生物标志物的多重测定。

还提供了用于改进的肺癌检测的7-代谢物标志物组(二乙酰精胺、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸)和它们与4MP测试组合使用的方法。7-代谢物组与4MP测试的组合能更好的鉴定具有患肺癌的高风险的肺结节。这些方法使用从受试者获得的生物样品内含有的生物标志物的多重测定。

还提供了将2-miRNA组和7-代谢物组二者与4MP测试组合用于改进的肺癌检测的方法。还提供了将3-miRNA组和7-代谢物组二者与4MP测试组合用于改进的肺癌检测的方法。2-miRNA组或3-miRNA组和7-代谢物组与4MP测试的组合能更好的鉴定具有患肺癌的高风险的肺结节。这些方法使用从受试者获得的生物样品内含有的生物标志物的多重测定。

附图说明

图1描绘了4MP在匹兹堡结节(Pittsburgh nodule)队列中的性能。小图A：4MP显示了0.76的AUC(95％ CI 0.69-0.82)。三种标志物表现适中，其中对于接受者操作特征(ROC)的曲线下面积(AUC)，pro-SFTPB(小图B)的为0.69(95％ CI 0.62-0.77)，CEA(小图C)的为0.70(95％ CI 0.63-0.77)，并且CYFRA21-1(D)的为0.72(95％ CI 0.65-0.80)。CA125(小图E)未显示统计学显著性，AUC为0.57(95％ CI 0.49-0.65)。

图2通过结节大小描绘了4MP在匹兹堡队列中的性能。小图A)考虑年龄、性别、吸烟史和结节大小的Cox模型显示4MP和结节大小之间的显著相互作用，但没有其他变量。与单独的结节大小相比，4MP适度改进了性能，使AUC从0.86增加到0.90(比较的p值为0.033)。Pro-SFTPB(小图B)和CYFRA21-1(小图D)推动这种相互作用，在较大的结节中显示显著更高的性能。CEA和CA125(小图C和E)未显示与结节大小的显著相互作用。

图3描绘了4MP与基于结节大小的风险模型的组合的性能。4MP改进了基于结节大小的肺癌的风险模型的性能，使AUC从0.86增加到0.89。黑框表示这种性能改进在ROC的左侧很明显，表明高特异性下的灵敏度增加。

图4描绘了西南结节(Southwestern nodule)队列中综合4MP的性能。小图A)4MP显示AUC为0.87(95％ CI 0.79-0.96)，与其在匹兹堡结节队列中的性能一致。单个标志物性能的范围为AUC从CYFRA21-1的0.63(95％ CI 0.49-0.78)、CEA的0.72(95％ CI 0.59-0.86)至pro-SFTPB的0.76(95％ CI 0.63-0.88)和CEA的0.80(95％ CI 0.69-0.91)。小图B)在结节<6mm的亚组中，4MP明显改进了结节大小风险模型的性能。虽然结节大小单独预测癌症的AUC为0.57(95％ CI 0.35-0.79)，但4MP的加入使其增加至0.95(95％ CI 0.85-1.000)。

图5是用结节大小和每年吸烟包数的4MP的3D可视化。小图A)使用结节大小和癌症概率的4MP逻辑回归模型的三维投影。从上方和三个方向展示了相同的投影。小图B)类似的利用每年包数和结节大小以及癌症概率的模型的三维投影。每年包数轴上没有斜率表明它对癌症预测仅有很小的贡献。

图6通过吸烟情况描绘了4MP在匹兹堡队列中的性能。在匹兹堡队列中，4MP及其单个成分在以前吸烟者(小图A)和当前吸烟者(B)之间没有显示出显著差异。

图7通过每年吸烟包数描绘了匹兹堡队列中的4MP。在匹兹堡队列中，基于每年吸烟包数，4MP(小图A)或其单个成分(小图B-E)没有显示显著变化。基于Cox模型绘制曲线。

图8描绘了在UTSW队列中，与基于结节大小的肺癌风险模型组合的4MP。在UTSW队列中，相对于单独的结节大小，4MP与结节大小的组合改进了性能，显示AUC为0.86(95％ CI0.76-0.96)，而仅结节大小的ROC为0.54(95％ CI 0.37-0.70)。再次注意到高特异性下的灵敏度改进(黑色轮廓)。

图9描绘了与单独的4MP相比，miRNA miR-320和miR-210与4MP的组合改进了肺癌检测，显示95％特异性下的灵敏度改进了11％。

图10描绘了与单独的4MP相比，当使用一组7种癌症相关代谢物(二乙酰精胺、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸)时，在PLCO队列中(抽血1年内)区分肺癌病例与非癌症病例的能力改进。与单独的4MP相比，7-代谢物组与4MP的组合使AUC额外改进了7％。

图11描绘了3-miRNA组的性能。左小图显示了3-miRNA组单独用于诊断肺癌的性能的ROC图。右小图显示了3-miRNA组与4MP的组合用于诊断肺癌的性能的ROC图。蓝色条突出显示了在高特异性下的灵敏度增加。

具体实施方式

提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；以及

测量该生物样品中Pro-SFTPB的水平；

其中CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的量将该受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；以及

测量该生物样品中Pro-SFTPB的水平；

其中CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四报道分子接触；

测量与该表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四报道分子接触；

测量与该表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合pro-SFTPB的第三报道分子接触；

测量与该第一表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四表面缔合的该第三报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合pro-SFTPB的第三报道分子接触；

测量与该第一表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四表面缔合的该第三报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的装置的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的装置的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该第四表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该第一表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该第四表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该第一表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

通过使该生物样品与CEA抗体接触并观察CEA与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CEA的水平；

通过使该生物样品与CA125抗体接触并观察CA125与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CA125的水平；

通过使该生物样品与CYFRA21-1抗体接触并观察CYFRA21-1与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

通过使该生物样品与pro-SFTPB抗体接触并观察pro-SFTPB与该抗体之间的结合来测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

如通过测量CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平确定的，将该具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

通过使该生物样品与CEA抗体接触并观察CEA与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CEA的水平；

通过使该生物样品与CA125抗体接触并观察CA125与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CA125的水平；

通过使该生物样品与CYFRA21-1抗体接触并观察CYFRA21-1与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

通过使该生物样品与pro-SFTPB抗体接触并观察pro-SFTPB与该抗体之间的结合来测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

如通过测量CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平确定的，将这些不确定性肺结节指定为良性的或恶性的。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

确定相对于第一标准值的CEA水平，其中该比率预测肺癌的存在；

确定相对于第二标准值的CA125水平，其中该比率预测肺癌的存在；

确定相对于第三标准值的CYFRA21-1水平，其中该比率预测肺癌的存在；以及

确定相对于第四标准值的pro-SFTPB水平，其中该比率预测肺癌的存在；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的比率的统计学分析确定的，将具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

确定相对于第一标准值的CEA水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；

确定相对于第二标准值的CA125水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；

确定相对于第三标准值的CYFRA21-1水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；以及

确定相对于第四标准值的pro-SFTPB水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的比率的统计学分析确定的，将这些肺结节指定为良性的或恶性的。

还提供了一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，计算预测因子。

还提供了一种预测具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，计算预测因子。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，将该具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，将这些不确定性肺结节指定为良性的或恶性的。

还提供了一种用于使用从疑似患有肺癌的受试者获得的生物样品来确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

使用对CEA具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CEA的水平；以及

使用对CA125具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CA125的水平；以及

使用对CYFRA21-1具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CYFRA21-1的水平；以及

使用对pro-SFTPB具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的pro-SFTPB的水平；以及

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示该受试者患有肺癌。

还提供了一种用于使用从疑似患有肺癌的受试者获得的生物样品来区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

使用对CEA具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CEA的水平；以及

使用对CA125具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CA125的水平；以及

使用对CYFRA21-1具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CYFRA21-1的水平；以及

使用对pro-SFTPB具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的pro-SFTPB的水平；以及

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示这些不确定性肺结节是良性的或恶性的。

还提供了一种用于确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

其中这些抗体的结合指示该受试者的肺癌，并且该免疫测定可以检测早期肺癌。

还提供了一种用于区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

其中这些抗体的结合指示该受试者和该免疫测定中的恶性肺结节。

还提供了一种用于确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示该受试者患有肺癌。

还提供了一种用于区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示这些不确定性肺结节是良性的或恶性的。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从患者获得生物样品；

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)的量将该患有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从患者获得生物样品；

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)的量将这些不确定性肺结节分类为良性的或恶性的。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括源自血浆的生物标志物组和蛋白质标志物组：

其中该源自血浆的生物标志物组包含二乙酰精胺(DAS)；

其中该蛋白质生物标志物组包含CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB；

其中该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的水平；

其中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的量将该受试者分类为处于具有患肺癌的不确定性肺结节的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种从源自血浆的生物标志物组和蛋白质标志物组中区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法：

其中该源自血浆的生物标志物组包含二乙酰精胺(DAS)；

其中该蛋白质生物标志物组包含CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB；

其中该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的水平；

其中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的量将这些不确定性肺结节分类为良性的或恶性的。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括确定一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种代谢物标志物的水平，所述方法包括：

从该受试者获得生物样品；

使该样品与结合CEA抗原的第一报道分子接触；

使该样品与结合CA125抗原的第二报道分子接触；

使该样品与结合CYFRA21-1抗原的第三报道分子接触；以及

使该样品与结合pro-SFTPB抗原的第四报道分子接触；以及

确定该一种或多种生物标志物的水平，其中该一种或多种生物标志物选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子、该第四报道分子和该一种或多种生物标志物的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括确定一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种代谢物标志物的水平，所述方法包括：

从该受试者获得生物样品；

使该样品与结合CEA抗原的第一报道分子接触；

使该样品与结合CA125抗原的第二报道分子接触；

使该样品与结合CYFRA21-1抗原的第三报道分子接触；以及

使该样品与结合pro-SFTPB抗原的第四报道分子接触；以及

确定该一种或多种生物标志物的水平，其中该一种或多种生物标志物选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子、该第四报道分子和该一种或多种生物标志物的量将这些不确定性肺结节分类为良性的或恶性的。

还提供了一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB抗原的水平；以及

测量该生物样品中选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组的一种或多种代谢物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原、pro-SFTPB抗原和二乙酰精胺(DAS)的水平的统计学分析确定的，将该具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

还提供了一种用于区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB抗原的水平；以及

测量该生物样品中选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组的一种或多种代谢物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原、pro-SFTPB抗原和二乙酰精胺(DAS)的水平的统计学分析确定的，将这些结节的状况指定为良性的或恶性的。

在一些实施例中，该方法进一步包括：

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者区分为具有良性或恶性肺结节。在一些实施例中，该方法进一步包括测量生物样品中miR-320、miR-210和/或miR-21的水平；

其中miR-320、miR-210和/或miR-21的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者分类为具有良性或恶性肺结节。

在一些实施例中，该方法进一步包括测量生物样品中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者分类为具有良性或恶性肺结节。

在一些实施例中，该方法进一步包括测量生物样品中miR-320、miR-210和/或miR-21的水平；以及

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的水平；

其中miR-320、miR-210和/或miR-21的量以及二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者分类为具有良性肺结节或恶性肺结节。

在一些实施例中，基于生物标志物的测量浓度确定受试者患有肺癌。

在一些实施例中，该方法进一步包括：将该生物样品中每种生物标志物的测量浓度与统计学模型的预测进行比较。

在一些实施例中，该方法进一步包括对被指定为患有肺癌的受试者施用至少一种替代诊断测试。

在一些实施例中，至少一种替代诊断测试包含至少一种ctDNA的测定或测序。

在一些实施例中，在临界可切除阶段或之前诊断出肺癌。

在一些实施例中，在可切除阶段诊断出肺癌。

在一些实施例中，参考受试者或组是健康的。

在一些实施例中，标志物以下组成：CEA、CA125、CYFRA21-1、Pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)。

在一些实施例中，标志物由miRNA-320和miRNA-210组成。

在一些实施例中，标志物以下组成：二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸。

在一些实施例中，标志物以下组成：miRNA-320、miRNA-210、二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸。

在一些实施例中，该组选自由以下组成的组：

a.由CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB组成的组；或

b.由CEA、CA125、CYFRA21-1、Pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)组成的组。

在一些实施例中，该组选自由以下组成的组：

a.由CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB组成的组；或

b.由CEA、CA125、CYFRA21-1、Pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)组成的组。

c.由miRNA-320和miRNA-210组成的组；或

d.由二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸组成的组；或

e.a-d的任何组合。在一些实施例中，受试者中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB或与其结合的报道分子的量相对于健康受试者升高。

在一些实施例中，受试者中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平相对于健康受试者升高。

在一些实施例中，受试者中miR-320和miR-210的水平相对于健康受试者降低。

在一些实施例中，受试者中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的水平相对于健康受试者升高。

在一些实施例中，定量CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量。

在一些实施例中，定量miR-320和miR-210的量。

在一些实施例中，定量二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量。

在一些实施例中，测量CEA、CA125、CYFRA21-1、Pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)的浓度。

在一些实施例中，测量miR-320和miR-210的浓度。

在一些实施例中，测量二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的浓度。

在一些实施例中，表面中的至少一个进一步包含至少一种报道分子，该至少一种报道分子选择性结合选自CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的生物标志物或抗原。

在一些实施例中，第一报道分子选择性结合CEA。

在一些实施例中，第二报道分子选择性结合CA125。

在一些实施例中，第三报道分子选择性结合CYFRA21-1。

在一些实施例中，第四报道分子选择性结合Pro-SFTPB。

在一些实施例中，CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的确定基本上同时进行。

在一些实施例中，CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的确定以逐步的方式进行。

在一些实施例中，该方法进一步包括将受试者病史信息纳入患有肺癌或未患有肺癌的指定中。

在一些实施例中，表面中的至少一个进一步包含至少一种受体分子，该至少一种受体分子选择性结合选自CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的生物标志物。

在一些实施例中，与未患有肺癌的参考受试者或组中的CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平相比，CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的量升高。

在一些实施例中，与患有腺癌的参考受试者或组中的CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平相比，CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平升高。

在一些实施例中，与患有鳞状细胞癌的参考受试者或组中的CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平相比，CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平升高。

在一些实施例中，样品包含选自血液、血浆和血清的生物样品。在一些实施例中，生物样品是血清。

在一些实施例中，CEA、CA125、CYFRA21-1、pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)的量的检测包括使用固体颗粒。

在一些实施例中，表面中的至少一个是固体颗粒的表面。

在一些实施例中，该固体颗粒是珠子。

在一些实施例中，报道分子中的至少一种与酶连接。

在一些实施例中，报道分子中的至少一种提供可检测信号。

在一些实施例中，可检测信号可通过选自以下的方法检测：紫外可见光谱、质谱、核磁共振(NMR)光谱、质子NMR光谱、核磁共振(NMR)光谱、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、相关光谱(COSy)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY)、旋转坐标系核欧沃豪斯效应谱(ROESY)、LC-TOF-MS、LC-MS/MS和毛细管电泳-质谱。在一些实施例中，该光谱法是质谱。

在一些实施例中，该组包含已通过选自以下的方法鉴定的生物标志物：紫外可见光谱、质谱、核磁共振(NMR)光谱、质子NMR光谱、核磁共振(NMR)光谱、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、相关光谱(COSy)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY)、旋转坐标系核欧沃豪斯效应谱(ROESY)、LC-TOF-MS、LC-MS/MS和毛细管电泳-质谱。在一些实施例中，该组包含已通过紫外可见光谱或质子NMR光谱鉴定的生物标志物。

在一些实施例中，该方法进一步包括将CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量与包含至少0.83的AUC(95％ CI)的临界值进行比较。在一些实施例中，临界值包含至少0.80的AUC(95％ CI)。在一些实施例中，临界值包含至少0.81的AUC(95％ CI)。在一些实施例中，临界值包含至少0.88的AUC(95％ CI)。在一些实施例中，将受试者分类为患有肺癌在90％的特异性下具有73％的灵敏度、在95％的特异性下具有62％的灵敏度、和/或在99％的特异性下具有42％的灵敏度。在一些实施例中，将受试者分类为患有肺癌在90％的特异性下具有73％的灵敏度。在一些实施例中，将受试者分类为患有肺癌在95％的特异性下具有62％的灵敏度。在一些实施例中，将受试者分类为患有肺癌在99％的特异性下具有42％的灵敏度。在一些实施例中，与对照相比，将受试者分类为患有肺癌的在95％的特异性下的灵敏度增加了11％。在一些实施例中，与对照相比，将受试者分类为患有肺癌的AUC增加了7％。

还提供了一种方法，该方法包括：

a)从具有肺结节的受试者获得样品；

b)测量该样品中的标志物组，其中这些标志物包含：CEA、CA125、Cyfra 21-1和二乙酰精胺(DAS)；

c)确定每种标志物的生物标志物评分；

d)将每种标志物的生物标志物评分相加以获得每个受试者的综合评分，将该受试者存在肺癌的风险增加量化为风险评分，其中该综合评分与分层受试者群体分组的风险类别相匹配，其中与使用单个阈值相比，每个风险类别包含与综合评分的范围相关的、指示患有肺癌的可能性增加的乘数，其中该乘数由回顾性样品的阳性预测评分确定；以及

e)对具有存在肺癌的量化风险增加的受试者施用计算机断层成像(CT)扫描或其他显像模式。

还提供了一种方法，该方法包括：

a)从具有肺结节的受试者获得样品；

b)测量该样品中的标志物组，其中这些标志物包含：CEA、CA125、Cyfra 21-1和二乙酰精胺(DAS)；和/或miRNA-320和miRNA-210；和/或二乙酰精胺、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸；c)确定每种标志物的生物标志物评分；

d)将每种标志物的生物标志物评分相加以获得每个受试者的综合评分，将该受试者存在肺癌的风险增加量化为风险评分，其中该综合评分与分层受试者群体分组的风险类别相匹配，其中与使用单个阈值相比，每个风险类别包含与综合评分的范围相关的、指示患有肺癌的可能性增加的乘数，其中该乘数由回顾性样品的阳性预测评分确定；以及

e)对具有存在肺癌的量化风险增加的受试者施用计算机断层成像(CT)扫描或其他显像模式。

在一些实施例中，分层受试者群体的分组、指示患有该癌症的可能性增加的乘数以及综合评分的范围从群体的回顾性临床样品确定。

在一些实施例中，该风险类别进一步包含风险标识符。

在一些实施例中，该风险标识符选自低风险、中低风险、中风险、中高风险和最高风险。

在一些实施例中，针对每个风险类别计算指示患有该癌症的可能性增加的乘数包括基于回顾性生物标志物评分对受试者队列进行分层，并通过每个分层群体的阳性预测评分对队列中已知的癌症患病率进行加权。

在一些实施例中，分层受试者群体的分组包含至少三个风险类别，其中指示患有癌症的可能性增加的乘数为约2或更大。

在一些实施例中，分层受试者群体的分组包含至少两个风险类别，其中指示患有癌症的可能性增加的乘数为约5或更大。

在一些实施例中，受试者年龄为50岁或更大，并且具有吸烟史。

在一些实施例中，该方法进一步包括生成风险分类表，其中测量该标志物组，确定每种标志物的生物标志物评分，通过将这些生物标志物评分相加来获得综合评分；确定用于将这些综合评分划分到风险组的阈值，并为每个组指定一个乘数，以指示无症状受试者存在癌症的量化风险增加的可能性。

在一些实施例中，这些组的形式选自电子表格形式、软件应用、计算机程序和excel电子表格。

在一些实施例中，该标志物组包含结合测定法中测量的蛋白质、多肽或代谢物。

在一些实施例中，该标志物组包含使用流式细胞仪测量的蛋白质或多肽。

还提供了一种治疗疑似患有肺癌的具有不确定性肺结节的受试者的方法，该方法包括：

用本文所述的方法分析该具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险；以及

施用治疗有效量的癌症治疗。

还提供了一种治疗疑似患有肺癌的具有不确定性肺结节的受试者的方法，该方法包括：

用本文所述的方法分析该具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险；以及

如果该不确定性肺结节是恶性的，则施用治疗有效量的癌症治疗。

还提供了一种治疗或预防具有不确定性肺结节的受试者的肺癌进展的方法，其中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平将该具有不确定性肺结节的受试者分类为患有肺癌或处于患肺癌的风险中，该方法包括以下中的一项或多项：

i.向该患有肺癌的受试者施用化学治疗药物；

ii.向该患有肺癌的受试者施用治疗性辐射；以及

iii.部分或完全手术切除该患有肺癌的受试者中的癌组织的手术。

还提供了一种治疗或预防具有不确定性肺结节的受试者的肺癌进展的方法，其中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原、pro-SFTPB抗原、二乙酰精胺(DAS)的水平将该具有不确定性肺结节的受试者分类为患肺癌或处于患肺癌的风险中，该方法包括以下中的一项或多项：

i)向该患有肺癌的受试者施用化学治疗药物；

ii)向该患有肺癌的受试者施用治疗性辐射；以及

iii)部分或完全手术切除该患有肺癌的受试者中的癌组织的手术。

还提供了一种用于检测和治疗肺癌的方法，该方法包括：

经由免疫测定检测获得自具有不确定性肺结节的人的生物样品中的CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB；

定量所述收集样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量；

将CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量与临界值进行比较以确定所述人患有肺癌的风险是否增加；其中如果这些水平高于该临界值，则所述人患有肺癌；以及

向所述患有肺癌的人施用肺癌治疗。

还提供了一种用于检测和治疗肺癌的方法，该方法包括：

经由免疫测定检测获得自具有不确定性肺结节的人的生物样品中的CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB；和/或

经由免疫测定检测获得自具有不确定性肺结节的人的生物样品中的miRNA-320和miRNA-210；和/或

经由免疫测定检测获得自具有不确定性肺结节的人的生物样品中的二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸；和/或

定量所述收集样品中miRNA-320和miRNA-210的量；和/或

定量所述收集样品中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量；

定量所述收集样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量；

将CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量；和/或miRNA-320和miRNA-210的量；和/或二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量与临界值进行比较以确定所述人患有肺癌的风险是否增加；其中如果这些水平高于该临界值，则所述人患有肺癌；以及

向所述患有肺癌的人施用肺癌治疗。

还提供了一种治疗疑似患有肺癌的具有不确定性肺结节的受试者的方法，该方法包括：

用本文所述的方法分析该具有不确定性肺结节的受试者患肺癌或具有恶性肺结节的风险；以及

施用治疗有效量的癌症治疗。

还提供了一种用于本文所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

试剂溶液，该试剂溶液包含

用于检测CEA的第一溶质；

用于检测CA125的第二溶质；

用于检测CYFRA21-1的第三溶质；以及

用于检测pro-SFTPB的第四溶质。

还提供了一种用于本文所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

试剂溶液，该试剂溶液包含

用于检测CEA抗原的第一溶质；

用于检测CA125抗原的第二溶质；

用于检测CYFRA21-1抗原的第三溶质；

用于检测pro-SFTPB抗原的第四溶质；以及

用于检测二乙酰精胺(DAS)的第五溶质。

还提供了一种用于本文所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

第一试剂溶液，该第一试剂溶液包含用于检测CEA的第一溶质；

第二试剂溶液，该第二试剂溶液包含用于检测CA125的第二溶质；

第三试剂溶液，该第三试剂溶液包含用于检测CYFRA21-1的第三溶质；以及

第四试剂溶液，该第四试剂溶液包含用于检测pro-SFTPB的第四溶质。

还提供了一种用于本文所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

第一试剂溶液，该第一试剂溶液包含用于检测CEA抗原的第一溶质；

第二试剂溶液，该第二试剂溶液包含用于检测CA125抗原的第二溶质；

第三试剂溶液，该第三试剂溶液包含用于检测CYFRA21-1抗原的第三溶质；

第四试剂溶液，该第四试剂溶液包含用于检测pro-SFTPB的第四溶质；

第五试剂溶液，该第五试剂溶液包含用于检测二乙酰精胺(DAS)的第五溶质。

还提供了一种用于确定来自具有不确定性肺结节的受试者的样品中肺癌指示物的存在的试剂盒，该试剂盒包含：

(a)结合选自由CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB组成的组的每种蛋白质生物标志物的抗原结合试剂，或包含所述抗原结合试剂的阵列；以及

(b)用于执行用于确定个体中肺癌存在的方法的说明书。

在一些实施例中，该试剂盒进一步包含用于使试剂溶液与生物样品接触的设备。

在一些实施例中，该试剂盒进一步包含具有用于结合至少一种生物标志物或抗原的装置的至少一个表面。

在一些实施例中，该至少一种生物标志物选自由CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB组成的组。

在一些实施例中，至少一个表面包含用于结合ctDNA的装置。

在一些实施例中，该试剂盒进一步包含结合代谢物生物标志物二乙酰精胺(DAS)的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，该抗原结合试剂包含抗体或其抗原结合片段、RNA、DNA或RNA/DNA杂交体。

前述内容相当广泛地概述了本披露的特征和技术益处，以便更好地理解具体实施方式。本领域技术人员应该理解，所披露的特定实施例可以容易地用作修改或设计用于实现本披露的相同目的的其他结构或过程的基础。应当理解，本披露不限于所描述的特定实施例，因为可对特定实施例进行变化并且仍然落入所附权利要求书的范围内。

定义

如本文所用，术语“4MP”是指4种蛋白质标志物组，其包括表面活性蛋白B的前蛋白形式(pro-SFTPB)和在肺癌诊断中具有已知效用的三种其他标志物：癌症抗原125(CA125)、细胞角蛋白-19片段(CYFRA 21-1)和癌胚抗原(CEA)。关于4MP的其他细节如WO 2018/148600中所述，出于所有目的将其通过引用并入本文。

如本文所用，术语“2-miRNA组”是指2种miRNA的组，其包括miR-320和miR-210。在一些实施例中，该2-miRNA组可以与4MP组合以增强来自疑似患有肺癌或发展成肺癌的患者的生物样品中的肺癌检测。

如本文所用，术语“3-miRNA组”是指3种miRNA的组，其包括miR-320、miR-210和miR-21。在一些实施例中，该3-miRNA组可以与4MP组合以增强来自疑似患有肺癌或发展成肺癌的患者的生物样品中的肺癌检测。

如本文所用，术语“7-代谢物组”是指7种癌症相关代谢物的组，其包括二乙酰精胺、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸。在一些实施例中，该7-代谢物组可以与4MP组合以增强来自疑似患有肺癌或发展成肺癌的患者的生物样品中的肺癌检测。

在一些实施例中，2-miRNA组和7-代谢物组二者均可以与4MP组合以增强疑似患有肺癌的患者的生物样品中的肺癌检测。在一些实施例中，3-miRNA组和7-代谢物组二者均可以与4MP组合以增强疑似患有肺癌的患者的生物样品中的肺癌检测。在一些实施例中，当与单独的4MP相比时，2-miRNA组或7-代谢物组或者2-miRNA组和7-代谢物组二者与4MP的组合导致诊断测试的灵敏度和/或特异性增加或标志物或组的组合的预后值增加。在一些实施例中，当与单独的4MP相比时，3-miRNA组或7-代谢物组或者3-miRNA组和7-代谢物组二者与4MP的组合导致诊断测试的灵敏度和/或特异性增加或标志物或组的组合的预后值增加。

如本文所用，术语“肺组织”是指肺自身的组织以及邻近和/或位于肺下层和支撑结构(如胸膜、肋间肌、肋骨和呼吸系统的其他元件)内的组织。在上下文中，呼吸系统本身代表鼻腔、鼻窦、咽、喉、气管、支气管、肺、肺叶、肺泡、肺泡管、肺泡囊、肺泡毛细血管、细支气管、呼吸细支气管、脏胸膜、壁胸膜、胸膜腔、隔膜、会厌、腺样体、扁桃体、口和舌等。

如本文所用，术语“肺癌”是指以细胞异常增殖为特征的肺恶性赘生物，这些细胞的生长超过周围正常组织的生长并且与其不协调。美国肺癌学会(American Lung CancerSociety)提供以下肺癌分期定义。在T0期，没有原发肿瘤的证据。在Tis期，有原位癌。T1期指示3cm或更小的肿瘤。T1a期指示具有2cm或更小的肿瘤。T1b期指示尺寸大于2cm但小于3cm的肿瘤。T2期指示尺寸大于3cm但为7cm或更小的肿瘤。T2a期指示尺寸大于3cm但为5cm或更小的肿瘤。T2b期指示尺寸大于5cm但为7cm或更小的肿瘤。T3期指示大于7cm的肿瘤或侵袭胸壁、膈神经、隔膜、壁胸膜、壁心包或纵隔胸膜的那些肿瘤；或者小于2cm的主支气管内的肿瘤。T4期指示侵袭以下中的任一项的肿瘤：心脏、食道、纵隔、气管、喉返神经、隆突、椎体或不同同侧肺叶的独立肿瘤结节。

如本文所用，术语“肺癌阳性”是指将受试者分类为患有肺癌。

如本文所用，术语“肺癌阴性”是指将受试者分类为未患有肺癌。

如本文所用，术语“肺结节”(PN)是指可以通过放射照相技术可视化的肺病变。肺结节是直径小于或等于三厘米的任何结节。在一些实施例中，肺结节的直径为约0.8cm至2cm。

如本文所用，术语“肿块”或“肺肿块”是指最大直径大于三厘米的肺结节。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物，优选是人，需要将其分类为肺癌阳性或肺癌阴性，并且可以为其提供进一步的治疗。

如本文所用，“参考患者”、“参考受试者”或“参考组”是指一组患者或受试者，可以将来自疑似患有肺癌或处于患肺癌的风险中的患者或受试者的测试样品与之比较。在一些实施例中，这样的比较可用于确定测试受试者是否患有肺癌。参考患者或组可以作为用于测试或诊断目的的对照。如本文所述，参考患者或组可以是从单个患者获得的样品，或者可以表示样品组，如汇集的样品组。

如本文所用，“健康”是指其中没有发现肺癌证据的个体，即，该个体未患肺癌。这样的个体可以被分类为“肺癌阴性”，或被分类为具有健康的肺或正常的未受损肺功能。健康患者或受试者没有肺癌或其他肺疾病的症状。在一些实施例中，健康患者或受试者可用作参考患者，用于与患病或疑似患病样品进行比较，以确定患者或患者组中的肺癌。

如本文所用，术语“治疗”(“treatment”或“treating”)是指针对受试者进行的药物施用或医疗程序执行，用于预防(prophylaxis/prevention)或治愈，或在受试者或患者遭受折磨的情况下降低病弱或紊乱或病症或事件的发生或复发的程度或可能性。与本披露相关，该术语也可以指施用药理学物质或配制品，或执行非药理学方法，这些方法包括但不限于放射疗法和手术。如本文所用的药理学物质可以包括但不限于本领域中已投入使用的化疗药物，如埃罗替尼(TARCEVA等)、阿法替尼(GILOTRIF)、吉非替尼(IRESSA)、贝伐珠单抗(AVASTIN)、克唑替尼(XALKORI)、色瑞替尼(ZYKADIA)、顺铂(PLATINOL)、卡铂(PARAPLATIN)、多西他赛(TAXOTERE)、吉西他滨(GEMZAR)、紫杉醇(TAXOL等)、长春瑞滨(NAVELBINE等)或培美曲塞(ALIMTA)等。药理学物质可以包括用于免疫疗法的物质，如检查点抑制剂。治疗可包括多种药理学物质或多种治疗方法，这些方法包括但不限于手术和化学疗法。

如本文所用，术语“ELISA”是指酶联免疫吸附测定。该测定通常包括使荧光标记的蛋白质样品与对这些蛋白质具有特异性亲和力的抗体接触。对这些蛋白质的检测可以用多种方法完成，包括但不限于激光荧光测定法。

如本文所用，术语“回归”是指一种统计学方法，其可以基于样品的可观察性状(或可观察性状集)为所述样品的潜在特征分配预测值。在一些实施例中，该特性不是直接可观察到的。例如，本文使用的回归方法可以将特定受试者的特定生物标志物测试或生物标志物测试集的定性或定量结果与所述受试者为肺癌阳性的概率联系起来。

如本文所用，术语“逻辑回归”是指回归方法，其中对来自该模型的预测的分配可以具有几个允许的离散值中的一个。例如，本文使用的逻辑回归模型可以为某个受试者分配肺癌阳性或肺癌阴性的预测。

如本文所用，术语“生物标志物评分”是指通过将特定受试者的特定生物标志物水平输入到统计学方法而计算的所述受试者的数值评分。

如本文所用，术语“综合评分”是指在来自受试者的样品中测量的预定标志物的归一化值的总和。在一个实施例中，归一化值被报道为生物标志物评分，然后将这些生物标志物评分值相加，以提供每个测试受试者的综合评分。当在风险分类表的背景下使用并与基于风险分类表中的综合评分范围的分层分组相关联时，“综合评分”用于确定每个测试受试者的“风险评分”，其中指示分层分组的患有癌症的可能性增加的乘数变成“风险评分”。

如本文所用，术语“风险评分”是指与疾病队列中已知的癌症患病率相比，指示无症状人受试者患癌症的风险增加的单个数值。在某些实施例中，针对人受试者计算综合评分并将其与指示患癌症的风险增加的乘数相关联，其中基于风险分类表中每个分层分组的综合评分范围来关联综合评分。以这种方式，基于指示分组(与综合评分最佳匹配)患有癌症的可能性增加的乘数，将综合评分转换成风险评分。

如本文所用，术语“临界值”或“临界点”是指与特定统计学方法相关的数学值，该方法可用于基于受试者的生物标志物评分将肺癌阳性或肺癌阴性的分类指定给所述受试者。

如本文所用，当高于或低于临界值的数值“是肺癌所特有的”时，意味着受试者(其样品的分析产生该值)患有肺癌或处于患肺癌的风险中。

如本文所用，“处于患肺癌的风险中”的受试者是可能尚未证明肺癌的明显症状，但正在产生指示受试者患有肺癌或可能在近期发展为肺癌的生物标志物水平的受试者。可以对患有肺癌或疑似患有肺癌的受试者进行针对该癌症或被怀疑的癌症的治疗。

如本文所用，术语“分类”是指基于受试者获得的生物标志物评分的结果，将所述受试者指定为肺癌阳性或肺癌阴性。

如本文所用，术语“肺癌阳性”是指基于本披露方法成果的结果预测受试者处于患肺癌风险中的指示。

如本文所用，术语“肺癌阴性”是指基于本披露方法成果的结果预测受试者未处于患肺癌风险中的指示。

如本文所用，术语“Wilcoxon秩和检验”，也称为Mann-Whitney U检验、Mann-Whitney-Wilcoxon检验或Wilcoxon-Mann-Whitney检验，是指用于比较两个群体的特定统计学方法。例如，该测试可在本文中用于将可观察到的性状(特别是生物标志物水平)与特定群体的受试者中肺癌的不存在或存在联系起来。

如本文所用，术语“真阳性率”是指通过某种方法分类为阳性的给定受试者是真正阳性的概率。

如本文所用，术语“假阳性率”是指通过某种方法分类为阳性的给定受试者是真正阴性的概率。

如本文所用，术语“灵敏度”在各种生化测定的背景下是指测定正确鉴定有疾病者的能力(即，真阳性率)。通过比较，如本文所用，术语“特异性”在各种生化测定的背景下是指测定正确鉴定无疾病者的能力(即，真阴性率)。灵敏度和特异性是二元分类检验(即分类函数)性能的统计学度量。灵敏度量化了对假阴性的规避，而特异性对假阳性也有同样的作用。

如本文所用，“样品”是指待测试其中如本文所述的生物标志物的存在及其水平或浓度的测试物质。样品可以是根据本披露的任何合适的物质，包括但不限于血液、血清、血浆或其任何部分。

如本文所用，“抗原”是指可以结合抗体或抗原结合试剂或片段以检测如本文所述的生物标志物的蛋白质、代谢物或其他分子。在一些实施例中，生物标志物可以用作抗原。在其他实施例中，一部分生物标志物可以用作抗原。在一些实施例中，抗体可以用于检测如本文所述的抗原。在其他实施例中，核酸(如DNA、RNA、DNR/RNA杂交体)、抗体、抗体片段或能够结合抗原的任何其他化合物或分子可用于检测抗原，如本文所述的生物标志物。如本文所述的抗原可以用作用于检测与本文所述方法一起使用的蛋白质或代谢物标志物的水平、浓度或量的基础。

如本文所用，术语“CEA”是指癌胚抗原。

如本文所用，术语“CA125”是指癌症抗原125。

如本文所用，术语“CYFRA21-1”(也称为Cyfra 21-1)，是指细胞角蛋白片段19(也称为细胞角蛋白-19片段)。

如本文所用，术语“SFTPB”是指表面活性蛋白B。

如本文所用，术语“Pro-SFTPB”是指前表面活性蛋白B，其为SFTPB的前体形式。

如本文所用，术语“miR-320”、“miR-210”和“miR-21”是指本领域已知的特定微小RNA。在一些实施例中，这些miRNA可能可用于增强疑似患有肺癌的患者的生物样品中的肺癌检测。在一些实施例中，miR-320和miR-210可能可用于与4MP组合用于检测患者的肺癌。这样的组合增加了检测肺癌的灵敏度和特异性，这可以使用曲线下面积(AUC，参见下文)来描述。如本文所述的给定标志物、标志物组或标志物组(例如2-miRNA组或3-miRNA组)与4MP的组合的AUC增加指示该组或标志物或组的组合与对照样品相比具有增加的灵敏度和/或特异性。

在一些实施例中，miRNA或miRNA组可以用作标志物以检测或增强对疑似患有肺癌的患者的肺癌的检测。在一些实施例中，多于一种或多种miRNA标志物可以组合在一起用作如本文所述的诊断组。在一些实施例中，如本文所述的miRNA或miRNA组可以与一种或多种代谢物标志物或者代谢物组(如包括例如二乙酰精胺、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的组)组合。在一些实施例中，miRNA标志物或miRNA组可以与如本文所述的4MP组合用于增强对肺癌的检测。

miRNA组(如本文所述的2-miRNA组或3-miRNA组)与4MP的组合导致在95％的特异性下的检测灵敏度改进了5％、或6％、或7％、或8％、或9％、或10％、11％、或12％、或13％、或14％、或15％、或16％、或17％、或18％、或19％、或20％、或21％、或22％、或23％、或24％、或25％、30％、或40％、或45％、或50％等。在一些实施例中，这样的组合可以导致灵敏度增加11％。在一些实施例中，当与单独的4MP相比时，如本文所述的miRNA组与4MP的组合导致AUC增加或改进。例如，本文所述的2-miRNA组或3-miRNA组与4MP的组合可以导致AUC增加或改进例如1％、或2％、或3％、或4％、或5％、或6％、或7％、或8％、或9％、或10％、或15％、或20％、或25％、或30％、或35％、或40％、或45％、或50％等。在一些实施例中，这样的组合可以导致AUC增加或改进5％或更多、或者7％或更多、或者8％或更多等。

miRNA组(如本文所述的2-miRNA组或3-mRNA组)与4MP的组合产生例如至少0.70、或0.71、或0.72、或0.73、或0.74、或0.75、或0.76、或0.77、或0.78、或0.79、或0.80、或0.81、或0.82、或0.83、或0.84、或0.85、或0.86、或0.87、或0.88、或0.89、或0.90、或0.91、或0.92、或0.93、或0.94、或0.95、或0.96、或0.97、或0.98、或0.99等的AUC。在一些实施例中，与单独的4MP的AUC相比，这样的组合可以产生至少0.81的AUC。

如本文所用，“代谢物”是指当身体分解食物、药物或化学品或其自身组织(例如，脂肪或肌肉组织)时所制造或使用的物质。代谢物也有助于排出体内的有毒物质。如本文所用的代谢物可以为例如二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸。在一些实施例中，代谢物可以用作标志物以检测或增强对疑似患有肺癌的患者的肺癌的检测。在一些实施例中，多于一种或多种代谢物标志物可以组合在一起用作如本文所述的诊断组。在一些实施例中，如本文所述的代谢物或代谢物组可以与一种或多种miRNA或者miRNA组(如包括例如miR-320、miR-210和/或miR-21的组)组合。在一些实施例中，如本文所述的代谢物或代谢物组可以与包括例如miR-320和/或miR-210的miRNA组组合。在一些实施例中，代谢物或代谢物组可以与如本文所述的4MP组合，用于增强肺癌的检测。

代谢物组(如本文所述的7-代谢物组)与4MP的组合产生例如至少0.70、或0.71、或0.72、或0.73、或0.74、或0.75、或0.76、或0.77、或0.78、或0.79、或0.80、或0.81、或0.82、或0.83、或0.84、或0.85、或0.86、或0.87、或0.88、或0.89、或0.90、或0.91、或0.92、或0.93、或0.94、或0.95、或0.96、或0.97、或0.98、或0.99等的AUC。在一些实施例中，这样的组合可以产生至少0.88、或至少0.83、或至少0.81、或至少0.80的AUC。在一些实施例中，当与单独的4MP相比时，如本文所述的代谢物组与4MP的组合导致AUC增加或改进。例如，本文所述的7-代谢物组与4MP的组合可以导致AUC增加或改进例如1％、或2％、或3％、或4％、或5％、或6％、或7％、或8％、或9％、或10％、或15％、或20％、或25％、或30％、或35％、或40％、或45％、或50％等。在一些实施例中，这样的组合可以导致AUC增加或改进5％或更多、或者7％或更多、或者8％或更多等。

如本文所用，术语“ctDNA”是指无细胞或循环肿瘤DNA。ctDNA是被发现在癌症患者的血液中自由循环的肿瘤DNA。不受理论限制，ctDNA被认为来源于垂死的肿瘤细胞，并且可以存在于各种各样的癌症中，但以不同的水平和突变等位基因部分存在。通常，ctDNA携带在原始肿瘤细胞中形成的且在宿主的健康细胞中没有发现独特体细胞突变。因此，ctDNA体细胞突变可以作为癌症特异性生物标志物。

如本文所用，“代谢物”是指作为细胞代谢的中间体和/或产物的小分子。代谢物可以在细胞中执行多种功能，例如，对酶的结构性作用、信号传导作用、刺激作用和/或抑制作用。在一些实施例中，代谢物可以是非蛋白质的源自血浆的代谢物标志物，如包括但不限于乙酰亚精胺、二乙酰精胺、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、溶血磷脂酰胆碱(20:3)和吲哚衍生物。

如本文所用，术语“ROC”是指接受者操作特征，其为本文所用的用于衡量特定诊断方法在各个临界点的性能的图解图。ROC图可以由不同临界点处真阳性和假阳性的分数构建。

如本文所用，术语“AUC”是指ROC图曲线下的面积。AUC可用于估计某种诊断测试的预测能力。通常，较大的AUC对应于增加的预测能力，预测误差频率越低。AUC的可能值范围是从0.5到1.0，后一个值是无误差预测方法所特有的。

如本文所用，术语“p值”或“p”是指在Wilcoxon秩和检验的背景下肺癌阳性和肺癌阴性受试者的生物标志物评分分布相同的概率。通常，接近零的p值指示特定的统计学方法在对受试者进行分类时具有较高的预测能力。

如本文所用，术语“CI”指的是置信区间，即，可以取决于某个置信水平预测某个值的区间。如本文所用，术语“95％ CI”指的是可以取决于95％置信水平预测某个值的区间。

实例

包括以下实例来说明本披露的实施例。以下实例仅通过说明的方式呈现，并帮助普通技术人员使用本披露。这些实例不旨在以任何方式限制本披露的范围。本领域技术人员根据本披露内容应理解，可以对披露的特定实施例做出许多改变并且仍然获得相同或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。

实例1

研究群体的来源

Cooper肺结节和癌症蛋白质组学和基因组学研究注册获得了匹兹堡大学IRB的批准。该方案从肿瘤内科、胸外科和肺内科诊所招募了确诊为良性肺结节或确诊为肺癌的患者。该方案授权定期采集血液用于研究，包括诊断前和诊断时、手术后以及肺癌复发时。自2004年以来，该方案招募了666名患者，其中521名最终被诊断为肺癌，其余145名为具有肺部良性结节。

匹兹堡肺筛查研究(PLuSS)队列获得了匹兹堡大学IRB的批准。PLuSS是基于社区的研究队列，在2002-2016年期间招募了3,642名吸烟者(目前或以前)(2002-2006.6)。每位PLuSS参与者都完成了问卷调查，接受了肺功能测试(PFT)的呼吸量测定，接受了胸部低剂量CT检查，并提供了血液样品。所有3,642名参与者都接受了基线低剂量CT扫描，并且3,423名参与者在一年后接受了后续低剂量CT扫描。从2006年开始，我们重新招募了具有最高肺癌风险的PLuSS初始参与者(称为PLuSS X)。共有970人被招募进PLuSS X，他们在2006-2015年期间接受了两年一次的低剂量CT扫描、呼吸量测定和抽血。PluSS X和Cooper注册使用相同的方案进行血液样品采集、处理和储存。

德克萨斯大学西南分校(University of Texas at Southwestern)也通过类似的前瞻性方案获得了血液样品。总共196名因肺结节评估而就诊的患者被招募进本方案。样品符合最佳生物标志物采集的PRoBE要求。七名患者未通过筛选，初始招募的总数为186名。其中，33名是已知的肺癌患者，62名最终被诊断为肺癌，40名在肺癌检查中呈阴性，5名被诊断为另一种癌症，其余人最终未被诊断。由此，组建了年龄和性别匹配的32名肺癌患者和32名对照的队列。

UPMC和UTSW病例对照研究的设计

UPMC队列包括100名早期肺癌患者。初始诊断时，诊断性CT扫描上的中位最大结节大小为20mm(范围是7.5至38mm)。对于每个病例，我们选择了一名具有相似结节大小的对照受试者(最大结节大小：6.0至39.0mm)。所选的对照根据抽血时的吸烟状况和性别与指示病例相匹配。如果不能确认完全匹配，我们就放弃性别作为匹配标准。由于可得自Cooper注册的结节对照池较小，我们还从PLuSS X参与者中选择了结节对照。尽管进行了尝试，但病例队列与对照队列之间结节大小的完全匹配并未在整个队列中实现。对于本研究，我们选择了在显示6-39mm肺结节的CT扫描之前6个月内采集的血浆样品。所有200份样品均从生物储存库(biorepository)中取出并送至测试实验室。生物标本的病例对照状态对生物标志物测试小组是不知情的。对UTSW队列进行类似的方法，选择了年龄和性别匹配的32个病例和对照。由于队列的大小，在肺癌病例与对照之间的吸烟史和结节大小存在显著差异。

生物标志物验证遵循美国医学研究所(IOM)概述的指南和REMARK标准。简言之，在遵循临床实验室改进修正案(CLIA)指南的临床研究实验室中按照静脉穿刺的标准操作程序抽取样品并等分。4MP已经在肺癌筛选群体中得到验证，并且在具有不确定性肺结节的患者的新预期使用群体的双盲队列中使用相同的系数进行测试。基于对我们先前研究的先前分析验证，报告了该群体的灵敏度和特异性。

基于Luminex珠的测定

使用基于Luminex珠的免疫测定定量人pro-SFTPB、CEA、CYFRA21-1和CA125蛋白质标志物，并用MAGPIX仪器(路明克斯公司(Luminex Corporation)，奥斯汀，德克萨斯州)测量测得的荧光强度。Pro-SFTPB Luminex测定是内部开发的夹心ELISA，使用针对pro-SFTPB的N末端的小鼠单克隆抗体。CEA和CA125使用来自默克密理博公司(EMD Millipore Corp.)的多重测定进行测定。CYFRA21-1使用来自研发系统公司(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)的单重试剂盒进行测定。将血浆样品在4℃解冻，并在4℃以1200g离心10分钟，随后铺板并测试。将pro-SFTPB样品稀释40倍，将CEA/CA125样品稀释6倍，并将CYFRA21-1样品稀释2倍。将样品铺板并分析(以盲法方式)。每个测定板含有7个校准标准和一个空白样品，一式两份。质量对照包括加标(spike-in)QC和低/高血浆对照。板间和板内变异系数分别为3％和3.6％(pro-SFTPB)、3.19％和10.4％(CEA)、1.33％和4.4％(CA125)、以及5.01％和13.9％(CYFRA21-1)。

统计学分析

ROC曲线估计值是基于经验的。AUC估计值的95％置信区间和标准差以及涉及给定特异性(灵敏度)下的灵敏度(特异性)的那些使用附录中介绍的bootstrap方案得出。为了导出目的协变量(如每年包数和结节大小)的各种固定值的ROC曲线和相应的AUC估计值，我们考虑了基于Cox的建模技术。这种名为HCNS的方法的详细信息可以在Bantis等人Lifetime Data Anal.[寿命数据分析]2012；18(3):364-396中找到。这估计了标志物的基线累积危险，然后通过Cox模型将其投射到需要的协变量水平。这是针对对照组和病例组分别进行的。使用这些累积危险估计值，我们推导出两组累积分布的相应估计值。反过来，这允许我们通过以下通式推导出协变量曲线Z的ROC：ROC_Z(t)＝1-F_病例|Z＝z(F^-1 _对照|Z＝z(1-t))。

我们说明了经验估计值以及通过HCNS方法给出的相应的基于样条的估计值二者。所有相应的p值和置信区间都是使用bootstrap得出的。基于逻辑回归模型，同时使用两个目的协变量(例如每年包数和结节大小)计算风险。这样的模型产生图5所示的风险表面，原始数据覆盖在该表面上，并从不同的角度提供图，以更好地可视化。这样的表面允许我们用图表说明随着包年或结核大小值的增加风险变化的陡峭程度。关于这些风险的数值结果在结果部分给出。整个过程中使用logit连接函数，并使用标准GLM理论来拟合这些逻辑回归模型。

结果

4MP在匹兹堡结节队列中的性能

研究设计由200名具有肺结节的受试者组成，这些受试者被转到匹兹堡大学医学中心的肺科门诊。该队列由100名随后被诊断为肺癌的受试者和100名具有良性结节的对照患者组成，如下所示，这些患者的性别、年龄和吸烟史相匹配。

病例和对照的年龄、性别、吸烟状况和每年吸烟包数的平均值和分布是相当的。病例的平均(±SD)最大结节大小(21±7.8mm)明显大于对照(11.6±5.8mm，p<0.001)。使用与诊断前研究中使用的相同标准操作程序和固定系数，以盲法进行4MP的血浆测定。4MP显示曲线下面积(AUC)为0.76，95％ CI为0.69-0.82(图1A)。四种独立标志物中的三种也显示出显著的区别(图1B-E)。

考虑年龄、性别、吸烟史和结节大小的Cox模型显示出4MP和结节大小之间的显著相互作用，但没有其他变量。在当前吸烟者和先前吸烟者之间，单个标志物或完整的4MP都没有显著差异(图6-7)。Pro-SFTPB和CYFRA21-1在较大的结节中表现出显著更高的性能(图2A-E)。与单独的结节大小相比，4MP使AUC从0.86增加到0.90(比较的p值为0.033)。此外，在结节大小上添加4MP显著增加了在高特异性下的灵敏度。在99％的特异性下，单独的结节大小的灵敏度为14％，而其与4MP的组合的灵敏度增加到42％。在95％的特异性下，灵敏度从31％增加到62％，并且在90％的特异性下，灵敏度从60％增加到73％(图3)。

独立队列中的额外验证

鉴于在第一个验证队列中的发现，我们试图在来自德克萨斯大学西南分校的60名结节患者的独立队列中进一步验证4MP。

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该队列由30名随后被诊断为肺癌的受试者和30名具有良性结节的受试者组成，这些受试者的年龄和性别匹配。该队列具有较低的每年包数史，并且包括具有较小结节的受试者。在60名受试者中，27名的结节≤6mm。

4MP在鉴定该队列中的肺癌病例方面表现良好(图4A)，AUC为0.87(95％ CI 0.79-0.96)。鉴于较小结节的数量较多，结节大小不能很好地预测癌症风险，ROC的AUC为0.54(95％ CI 0.37-0.70)。在4MP中增加结节大小并没有进一步改进4MP性能，AUC为0.86(95％CI 0.76-0.96)。同样，4MP显著提高了95％的特异性下的性能，灵敏度从4％提高到26％。(图8)。在27名结节大小≤6mm的受试者的子集中，整个小组的表现特别引人注目(图4B)。在这些患者中，有15名对照和12名病例，结节大小与4MP的组合显示AUC为0.95，95％ CI为0.85-1.00。

在这里，我们表明，先前报道的在基于低剂量CT的肺癌筛选中改进了风险预测的生物标志物组在区分良性与恶性肺结节方面也具有实用性。该组改进了单独的结节大小在重度吸烟者的大队列中预测癌症风险的性能。值得注意的是，该组将99％的特异性下的灵敏度从14％提高到42％。这表明在鉴定高风险结节中具有潜在的临床作用。然后可以更积极地跟踪或活检标记物阳性的结节，这对于疾病的早期鉴定和治疗具有很高的潜力。在第二个较小的队列中，4MP也表现良好。我们使用来自不同机构的具有不同结节大小的两个不同验证队列这一事实是我们研究的优势。有趣的是，该第二个队列含有结节大小≤6mm的12个病例和15个对照。在这个小的子集中，4MP表现得特别好，ROC的AUC为0.95。

实例2

2-miRNA组和代谢物对检测肺癌的贡献

评估了微小RNA(miRNA)和代谢物对于检测肺癌的贡献。对来自CARET II试验的诊断前血浆样品中数百种miRNA的基于定量PCR(qPCR)的验证导致鉴定出3种miMRA，即miR-320、miR-210和miR-21，这显示出显著性。与单独的4MP相比，两种miRNA(miR-320和miR-210)在与4MP组合时进一步改进，在95％的特异性下的灵敏度改进了11％(图9)。类似地，已确定，在用于区分PLCO队列中抽血1年内诊断的病例与非病例时，与单独的4MP相比，7种癌相关代谢物组(二乙酰精胺、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸)与4MP的组合使AUC额外改进7％(图10)。

可以使用其他分析物来改进4MP的性能。(A)由两种miRNA(miR-210和miR-320)的归一化血浆水平组成的组为CARET II试验中肺癌诊断1年内抽取的血浆中的4MP提供了额外的差别性能。使用加标对照(10fmol的cel-miR-39和cel-miR-54)对miRNA组进行归一化，以控制样品间的差异。通过qRT-PCR测量miRNA，并对miR-16-5p进行相对定量。

该组特别改进了高特异性下的灵敏度。(B)7种代谢物组改进了来自PLCO试验的肺癌诊断1年内抽取的血浆中的4MP。

实例3

3-miRNA组和代谢物对检测肺癌的贡献

图11显示了3-miRNA组在单独(左图)和与4MP组合时(右图)的性能。3-miRNA组与4MP的组合使总的曲线下面积从0.8提高到0.81。使用加标对照(10fmol的cel-miR-39和cel-miR-54)对miRNA组进行归一化，以控制样品间的差异。通过qRT-PCR测量miRNA，并对miR-16-5p进行相对定量。

这对于早期检测生物标志物来说是有用的特征，因为它表明阳性测试很可能代表真实的病例。使用加标对照(10fmol的cel-miR-39和cel-miR-54)对miRNA组进行归一化，以控制样品间的差异。通过qRT-PCR测量miRNA，并对miR-16-5p进行相对定量。

其他实施例

提供以上列出的详细说明以帮助本领域技术人员实践本披露。然而，本文描述和要求保护的披露不限于本文披露的特定实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本披露几个方面的说明。任何等效实施例都旨在处于本披露的范围内。事实上，除了本文示出并且描述的那些，本披露的各种修改从前述说明书对于本领域技术人员来说也将变得清楚，这不偏离本发明的精神或范围。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (112)

1.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；以及

测量该生物样品中Pro-SFTPB的水平；

其中CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的量将该受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

2.一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；以及

测量该生物样品中Pro-SFTPB的水平；

其中CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

3.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四报道分子接触；

测量与该表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

4.一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四报道分子接触；

测量与该表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该表面缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

5.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合pro-SFTPB的第三报道分子接触；

测量与该第一表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四表面缔合的该第三报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

6.一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合pro-SFTPB的第三报道分子接触；

测量与该第一表面缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二表面缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三表面缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四表面缔合的该第三报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

7.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的装置的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

8.一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的装置的表面；

孵育该表面与该生物样品；

使该表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

9.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该第四表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该第一表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

10.一种区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

提供具有用于结合CEA的装置的第一表面；

提供具有用于结合CA125的装置的第二表面；

提供具有用于结合CYFRA21-1的装置的第三表面；

提供具有用于结合Pro-SFTPB的装置的第四表面；

孵育该第一表面与该生物样品；

孵育该第二表面与该生物样品；

孵育该第三表面与该生物样品；

孵育该第四表面与该生物样品；

使该第一表面与结合CEA的第一中继分子接触；

使该第二表面与结合CA125的第二中继分子接触；

使该第三表面与结合CYFRA21-1的第三中继分子接触；

使该第四表面与结合Pro-SFTPB的第四中继分子接触；

使该第一表面与结合该第一中继分子的第一报道分子接触；

使该第二表面与结合该第二中继分子的第二报道分子接触；

使该第三表面与结合该第三中继分子的第三报道分子接触；

使该第四表面与结合该第四中继分子的第四报道分子接触；

测量与该第一中继分子和CEA缔合的该第一报道分子的量；

测量与该第二中继分子和CA125缔合的该第二报道分子的量；

测量与该第三中继分子和CYFRA21-1缔合的该第三报道分子的量；

测量与该第四中继分子和Pro-SFTPB缔合的该第四报道分子的量；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子和该第四报道分子的量区分良性肺结节与恶性肺结节。

11.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

通过使该生物样品与CEA抗体接触并观察CEA与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CEA的水平；

通过使该生物样品与CA125抗体接触并观察CA125与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CA125的水平；

通过使该生物样品与CYFRA21-1抗体接触并观察CYFRA21-1与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

通过使该生物样品与pro-SFTPB抗体接触并观察pro-SFTPB与该抗体之间的结合来测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

如通过测量CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平确定的，将该具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

12.一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

通过使该生物样品与CEA抗体接触并观察CEA与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CEA的水平；

通过使该生物样品与CA125抗体接触并观察CA125与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CA125的水平；

通过使该生物样品与CYFRA21-1抗体接触并观察CYFRA21-1与该抗体之间的结合来测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

通过使该生物样品与pro-SFTPB抗体接触并观察pro-SFTPB与该抗体之间的结合来测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

如通过测量CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平确定的，将这些不确定性肺结节指定为良性的或恶性的。

13.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

确定相对于第一标准值的CEA水平，其中该比率预测肺癌的存在；

确定相对于第二标准值的CA125水平，其中该比率预测肺癌的存在；

确定相对于第三标准值的CYFRA21-1水平，其中该比率预测肺癌的存在；以及

确定相对于第四标准值的pro-SFTPB水平，其中该比率预测肺癌的存在；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的比率的统计学分析确定的，将具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

14.一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA的水平；

测量该生物样品中CA125的水平；

测量该生物样品中CYFRA21-1的水平；

测量该生物样品中pro-SFTPB的水平；

确定相对于第一标准值的CEA水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；

确定相对于第二标准值的CA125水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；

确定相对于第三标准值的CYFRA21-1水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；以及

确定相对于第四标准值的pro-SFTPB水平，其中该比率预测恶性肺结节的存在；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的比率的统计学分析确定的，将这些肺结节指定为良性的或恶性的。

15.一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，计算预测因子。

16.一种预测具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；以及

如通过CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，计算预测因子。

17.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，将该具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

18.一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB生物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的统计学分析确定的，将这些不确定性肺结节指定为良性的或恶性的。

19.一种用于使用从疑似患有肺癌的受试者获得的生物样品来确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

使用对CEA具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CEA的水平；以及

使用对CA125具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CA125的水平；以及

使用对CYFRA21-1具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CYFRA21-1的水平；以及

使用对pro-SFTPB具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的pro-SFTPB的水平；以及

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示该受试者患有肺癌。

20.一种用于使用从疑似患有肺癌的受试者获得的生物样品来区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

使用对CEA具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CEA的水平；以及

使用对CA125具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CA125的水平；以及

使用对CYFRA21-1具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的CYFRA21-1的水平；以及

使用对pro-SFTPB具有特异性的至少一种抗体或抗体部分测定该生物样品中存在的pro-SFTPB的水平；以及

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示这些不确定性肺结节是良性的或恶性的。

21.一种用于确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

其中这些抗体的结合指示该受试者的肺癌，并且该免疫测定可以检测早期肺癌。

22.一种用于区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段对该样品进行免疫测定；

其中这些抗体的结合指示该受试者和该免疫测定中的恶性肺结节。

23.一种用于确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示该受试者患有肺癌。

24.一种用于区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品样品；

用抗CEA抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CA125抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗CYFRA21-1抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

用抗pro-SFTPB抗体或其抗原结合片段进行免疫测定；

确定CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平是否指示这些不确定性肺结节是良性的或恶性的。

25.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从患者获得生物样品；

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)的量将该患有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

26.一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从患者获得生物样品；

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)的量将这些不确定性肺结节分类为良性的或恶性的。

27.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括源自血浆的生物标志物组和蛋白质标志物组：

其中该源自血浆的生物标志物组包含二乙酰精胺(DAS)；

其中该蛋白质生物标志物组包含CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB；

其中该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的水平；

其中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的量将该受试者分类为处于具有患肺癌的不确定性肺结节的风险中或不处于患肺癌的风险中。

28.一种从源自血浆的生物标志物组和蛋白质标志物组区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法：

其中该源自血浆的生物标志物组包含二乙酰精胺(DAS)；

其中该蛋白质生物标志物组包含CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB；

其中该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的水平；

其中这些源自血浆的生物标志物和这些蛋白质生物标志物的量将这些不确定性肺结节分类为良性的或恶性的。

29.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括确定一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种代谢物标志物的水平，所述方法包括：

从该受试者获得生物样品；

使该样品与结合CEA抗原的第一报道分子接触；

使该样品与结合CA125抗原的第二报道分子接触；

使该样品与结合CYFRA21-1抗原的第三报道分子接触；以及

使该样品与结合pro-SFTPB抗原的第四报道分子接触；以及

确定该一种或多种生物标志物的水平，其中该一种或多种生物标志物选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子、该第四报道分子和该一种或多种生物标志物的量将具有不确定性肺结节的受试者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

30.一种区分具有不确定性肺结节的受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括确定一种或多种蛋白质生物标志物和一种或多种代谢物标志物的水平，所述方法包括：

从该受试者获得生物样品；

使该样品与结合CEA抗原的第一报道分子接触；

使该样品与结合CA125抗原的第二报道分子接触；

使该样品与结合CYFRA21-1抗原的第三报道分子接触；以及

使该样品与结合pro-SFTPB抗原的第四报道分子接触；以及

确定该一种或多种生物标志物的水平，其中该一种或多种生物标志物选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组；

其中该第一报道分子、该第二报道分子、该第三报道分子、该第四报道分子和该一种或多种生物标志物的量将这些不确定性肺结节分类为良性的或恶性的。

31.一种确定具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB抗原的水平；以及

测量该生物样品中选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组的一种或多种代谢物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原、pro-SFTPB抗原和二乙酰精胺(DAS)的水平的统计学分析确定的，将该具有不确定性肺结节的受试者的状况指定为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中。

32.一种用于区分受试者的良性与恶性肺结节的方法，该方法包括：

从该受试者获得生物样品；

测量该生物样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB抗原的水平；以及

测量该生物样品中选自由二乙酰精胺(DAS)组成的组的一种或多种代谢物标志物的水平；

如通过该生物样品中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原、pro-SFTPB抗原和二乙酰精胺(DAS)的水平的统计学分析确定的，将这些结节的状况指定为良性的或恶性的。

33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者区分为具有良性或恶性肺结节。

34.如权利要求1至32中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

测量该生物样品中miR-320、miR-210和/或miR-21的水平；

其中miR-320、miR-210和/或miR-21的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者分类为具有良性或恶性肺结节。

35.如权利要求1至32中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的水平；

其中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者分类为具有良性或恶性肺结节。

36.如权利要求1至32中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

测量该生物样品中miR-320、miR-210和/或miR-21的水平；以及

测量该生物样品中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的水平；

其中miR-320、miR-210和/或miR-21的量以及二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量将该患者分类为处于患肺癌的风险中或不处于患肺癌的风险中，或者将该患者分类为具有良性肺结节或恶性肺结节。

37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中基于这些生物标志物的测量浓度确定该受试者患有肺癌。

38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，该方法进一步包括将该生物样品中每种生物标志物的测量浓度与统计学模型的预测进行比较。

39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，该方法进一步包括对被指定为患有肺癌的受试者施用至少一种替代诊断测试。

40.如权利要求39所述的方法，其中该至少一种替代诊断测试包含至少一种ctDNA的测定或测序。

41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中该肺癌在临界可切除阶段或之前被诊断出来。

42.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中该肺癌在可切除阶段被诊断出来。

43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中参考受试者或组是健康的。

44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中这些标志物由以下组成：CEA、CA125、CYFRA21-1、Pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)。

45.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中这些标志物由miRNA-320和miRNA-210组成。

46.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中这些标志物由以下组成：二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸。

47.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中这些标志物由以下组成：miRNA-320、miRNA-210、二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸。

48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中该组选自由以下组成的组：

a.由CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB组成的组；或

b.由CEA、CA125、CYFRA21-1、Pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)组成的组；或

c.由miRNA-320和miRNA-210组成的组；或

d.由二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸组成的组；或

e.a-d的任何组合。

49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中该受试者中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB或与其结合的这些报道分子的量相对于健康受试者升高。

50.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中该受试者中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的水平相对于健康受试者升高。

51.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中该受试者中miR-320、miR-210和/或miR-21的水平相对于健康受试者降低。

52.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中该受试者中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的水平相对于健康受试者升高。

53.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量被量化。

54.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中miR-320、miR-210和/或miR-21的量被量化。

55.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量被量化。

56.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中测量了CEA、CA125、CYFRA21-1、Pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)的浓度。

57.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中测量了miR-320、miR-210和/或miR-21的浓度。

58.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中测量了二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的浓度。

59.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中这些表面中的至少一个进一步包含至少一种报道分子，该至少一种报道分子选择性结合选自CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的生物标志物或抗原。

60.如权利要求1至59中任一项所述的方法，其中第一报道分子选择性结合CEA。

61.如权利要求1至60中任一项所述的方法，其中该第二报道分子选择性结合CA125。

62.如权利要求1至61中任一项所述的方法，其中该第三报道分子选择性结合CYFRA21-1。

63.如权利要求1至62中任一项所述的方法，其中该第四报道分子选择性结合Pro-SFTPB。

64.如权利要求1至63中任一项所述的方法，其中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的确定基本上同时进行。

65.如权利要求1至63中任一项所述的方法，其中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB水平的确定以逐步的方式进行。

66.如权利要求1至65中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括将受试者病史信息纳入患有肺癌或未患有肺癌的指定中。

67.如权利要求1至66中任一项所述的方法，其中这些表面中的至少一个进一步包含至少一种报道分子，该至少一种报道分子选择性结合选自CEA、CA125、CYFRA21-1和Pro-SFTPB的生物标志物。

68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中与未患有肺癌的参考受试者或组中的CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平相比，CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的量升高。

69.如权利要求1至68中任一项所述的方法，其中与患有腺癌的参考受试者或组中的CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平相比，CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平升高。

70.如权利要求1至68中任一项所述的方法，其中与患有鳞状细胞癌的参考受试者或组中的CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平相比，CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平升高。

71.如权利要求1至70中任一项所述的方法，其中该样品包含选自血液、血浆和血清的生物样品。

72.如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中该生物样品是血清。

73.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中CEA、CA125、CYFRA21-1、pro-SFTPB和二乙酰精胺(DAS)的量的检测包括使用固体颗粒。

74.如权利要求1至73中任一项所述的方法，其中这些表面中的至少一个是固体颗粒的表面。

75.如权利要求73或74所述的方法，其中该固体颗粒是珠子。

76.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中这些报道分子中的至少一种与酶连接。

77.如权利要求1至76中任一项所述的方法，其中这些报道分子中的至少一种提供可检测信号。

78.如权利要求77所述的方法，其中该可检测信号可通过选自以下的方法检测：紫外可见光谱、质谱、核磁共振(NMR)光谱、质子NMR光谱、核磁共振(NMR)光谱、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、相关光谱(COSy)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY)、旋转坐标系核欧沃豪斯效应谱(ROESY)、LC-TOF-MS、LC-MS/MS和毛细管电泳-质谱。

79.如权利要求1至78中任一项所述的方法，其中该组包含已通过选自以下的方法鉴定的生物标志物：紫外可见光谱、质谱、核磁共振(NMR)光谱、质子NMR光谱、核磁共振(NMR)光谱、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、相关光谱(COSy)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY)、旋转坐标系核欧沃豪斯效应谱(ROESY)、LC-TOF-MS、LC-MS/MS和毛细管电泳-质谱。

80.如权利要求79所述的方法，其中该组包含已通过紫外可见光谱或质子NMR光谱鉴定的生物标志物。

81.如权利要求1至80中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括将CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量与包含至少0.83的AUC(95％CI)的临界值进行比较。

82.如权利要求1至81中任一项所述的方法，其中该临界值包含至少0.80的AUC(95％CI)。

83.如权利要求1至81中任一项所述的方法，其中该临界值包含至少0.81的AUC(95％CI)。

84.如权利要求1至81中任一项所述的方法，其中该临界值包含至少0.88的AUC(95％CI)。

85.如权利要求1至80中任一项所述的方法，其中将该受试者分类为患有肺癌在90％的特异性下具有73％的灵敏度、在95％的特异性下具有62％的灵敏度、和/或在99％的特异性下具有42％的灵敏度。

86.如权利要求1至80中任一项所述的方法，其中与对照相比，将该受试者分类为患有肺癌的在95％的特异性下的灵敏度增加了11％。

87.如权利要求1至80中任一项所述的方法，其中与对照相比，将该受试者分类为患有肺癌的AUC增加了7％。

88.一种方法，该方法包括：

a)从具有肺结节的受试者获得样品；

b)测量该样品中的标志物组，其中这些标志物包含：

CEA、CA125、Cyfra 21-1和二乙酰精胺(DAS)；和/或

miRNA-320和miRNA-210；和/或

二乙酰精胺、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸；

c)确定每种标志物的生物标志物评分；

d)将每种标志物的生物标志物评分相加以获得每个受试者的综合评分，将该受试者存在肺癌的风险增加量化为风险评分，其中该综合评分与分层受试者群体分组的风险类别相匹配，其中与使用单个阈值相比，每个风险类别包含与综合评分的范围相关的、指示患有肺癌的可能性增加的乘数，其中该乘数由回顾性样品的阳性预测评分确定；以及

e)对具有存在肺癌的量化风险增加的受试者施用计算机断层成像(CT)扫描或其他显像模式。

89.如权利要求88所述的方法，其中分层受试者群体的分组、指示患有该癌症的可能性增加的乘数以及综合评分的范围从群体的回顾性临床样品确定。

90.如权利要求88或89所述的方法，其中该风险类别进一步包含风险标识符。

91.如权利要求90所述的方法，其中该风险标识符选自低风险、中低风险、中风险、中高风险和最高风险。

92.如权利要求88至91中任一项所述的方法，其中该分层受试者群体的分组包含至少三个风险类别，其中指示患有癌症的可能性增加的乘数为约2或更大。

93.如权利要求88至91中任一项所述的方法，其中该分层受试者群体的分组包含至少两个风险类别，其中指示患有癌症的可能性增加的乘数为约5或更大。

94.如权利要求88至93中任一项所述的方法，其中该受试者年龄为50岁或更大，并且具有吸烟史。

95.如权利要求88至94中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括生成风险分类表，其中测量该标志物组，确定每种标志物的生物标志物评分，通过将这些生物标志物评分相加来获得综合评分；确定用于将这些综合评分划分到风险组的阈值，并为每个组指定一个乘数，以指示无症状受试者存在癌症的量化风险增加的可能性。

96.一种治疗疑似患有肺癌的具有不确定性肺结节的受试者的方法，该方法包括：

用本文所述的方法分析该具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险；以及

施用治疗有效量的癌症治疗。

97.一种治疗疑似患有肺癌的具有不确定性肺结节的受试者的方法，该方法包括：

用本文所述的方法分析该具有不确定性肺结节的受试者患肺癌的风险；以及

如果该不确定性肺结节是恶性的，则施用治疗有效量的癌症治疗。

98.一种治疗或预防具有不确定性肺结节的受试者的肺癌进展的方法，其中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原和pro-SFTPB抗原的水平将该具有不确定性肺结节的受试者分类为患有肺癌或处于患肺癌的风险中，该方法包括以下中的一项或多项：

iv.向该患有肺癌的受试者施用化学治疗药物；

v.向该患有肺癌的受试者施用治疗性辐射；以及

vi.部分或完全手术切除该患有肺癌的受试者中的癌组织的手术。

99.一种治疗或预防具有不确定性肺结节的受试者的肺癌进展的方法，其中CEA抗原、CA125抗原、CYFRA21-1抗原、pro-SFTPB抗原、二乙酰精胺(DAS)的水平将该具有不确定性肺结节的受试者分类为患肺癌或处于患肺癌的风险中，该方法包括以下中的一项或多项：

iv)向该患有肺癌的受试者施用化学治疗药物；

v)向该患有肺癌的受试者施用治疗性辐射；以及

vi)部分或完全手术切除该患有肺癌的受试者中的癌组织的手术。

100.一种用于检测和治疗肺癌的方法，该方法包括：

经由免疫测定检测获得自具有不确定性肺结节的人的生物样品中的CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB；和/或

经由免疫测定检测获得自具有不确定性肺结节的人的生物样品中的miRNA-320和miRNA-210；和/或

经由免疫测定检测获得自具有不确定性肺结节的人的生物样品中的二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸；和/或

定量所述收集样品中CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量；和/或

定量所述收集样品中miRNA-320和miRNA-210的量；和/或

定量所述收集样品中二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量；

将CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB的量；和/或miRNA-320和miRNA-210的量；和/或二乙酰精胺(DAS)、二乙酰亚精胺、乙酰亚精胺、1-甲基腺苷、n-乙酰乳糖胺、精氨酸和二甲基精氨酸的量与临界值进行比较以确定所述人患有肺癌的风险是否增加；其中如果这些水平高于该临界值，则所述人患有肺癌；以及

向所述患有肺癌的人施用肺癌治疗。

101.一种治疗疑似患有肺癌的具有不确定性肺结节的受试者的方法，该方法包括：

用如权利要求1至95中任一项所述的方法分析该具有不确定性肺结节的受试者患肺癌或具有恶性肺结节的风险；以及

施用治疗有效量的癌症治疗。

102.一种用于本文所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

试剂溶液，该试剂溶液包含：

用于检测CEA的第一溶质；

用于检测CA125的第二溶质；

用于检测CYFRA21-1的第三溶质；以及

用于检测pro-SFTPB的第四溶质。

103.一种用于权利要求1至95所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

试剂溶液，该试剂溶液包含：

用于检测CEA抗原的第一溶质；

用于检测CA125抗原的第二溶质；

用于检测CYFRA21-1抗原的第三溶质；

用于检测pro-SFTPB抗原的第四溶质；以及

用于检测二乙酰精胺(DAS)的第五溶质。

104.一种用于权利要求1至95所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

第一试剂溶液，该第一试剂溶液包含用于检测CEA的第一溶质；

第二试剂溶液，该第二试剂溶液包含用于检测CA125的第二溶质；

第三试剂溶液，该第三试剂溶液包含用于检测CYFRA21-1的第三溶质；以及

第四试剂溶液，该第四试剂溶液包含用于检测pro-SFTPB的第四溶质。

105.一种用于权利要求1至95所述的任何方法的试剂盒，该试剂盒包含：

第一试剂溶液，该第一试剂溶液包含用于检测CEA抗原的第一溶质；

第二试剂溶液，该第二试剂溶液包含用于检测CA125抗原的第二溶质；

第三试剂溶液，该第三试剂溶液包含用于检测CYFRA21-1抗原的第三溶质；

第四试剂溶液，该第四试剂溶液包含用于检测pro-SFTPB的第四溶质；

第五试剂溶液，该第五试剂溶液包含用于检测二乙酰精胺(DAS)的第五溶质。

106.一种用于确定来自具有不确定性肺结节的受试者的样品中肺癌指示物的存在的试剂盒，该试剂盒包含：

(a)结合选自由CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB组成的组的每种蛋白质生物标志物的抗原结合试剂，或包含所述抗原结合试剂的阵列；以及

(b)用于执行用于确定个体中肺癌存在的方法的说明书。

107.如权利要求102至106中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含用于使这些试剂溶液与生物样品接触的设备。

108.如权利要求102至107中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含具有用于结合至少一种生物标志物或抗原的装置的至少一个表面。

109.如权利要求108所述的试剂盒，其中该至少一种生物标志物选自由CEA、CA125、CYFRA21-1和pro-SFTPB组成的组。

110.如权利要求108所述的试剂盒，其中至少一个表面包含用于结合ctDNA的装置。

111.如权利要求102至107中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含结合代谢物生物标志物二乙酰精胺(DAS)的抗体或其抗原结合片段。

112.如权利要求111所述的试剂盒，其中该抗原结合试剂包含抗体或其抗原结合片段、RNA、DNA或RNA/DNA杂交体。