KR20120098992A - 암의 검출을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
샘플을 적어도 2개의 상이한 적합한 항원과 접촉시켜서 샘플에 존재하는 항체와 적어도 2개의 상이한 복합체를 형성하는 단계; 상기 샘플에서 상기 항원-항체 복합체의 각각의 실제 수준을 결정하고, 상기 피험자에서 상이한 복합체의 수준들의 비율을 확립하는 단계; 및 이 비율을 동일한 적어도 2개 항원과 건강한 피험자의 샘플 사이에 형성된 항원-항체 복합체 수준들의 미리 결정된 비율과 비교하는 단계를 포함하는 피험자의 신체 샘플에서 암을 진단하는 방법 및 키트가 개시되며, 상기 단계에서 결정된 비율이 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 미리 정해진 컷오프 포인트보다 높거나 낮은 경우, 상기 피험자는 암으로 진단된다. 상기 방법 및 키트는 유방암, 난소암, 폐암, 전립선암 및 결장암을 포함하는 다양한 타입의 암을 진단하는데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 암의 진단 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 특이적 항원/항체 복합체에 기초한 암의 진단에 관한 것이다.
본 출원에서 언급된 모든 간행물은 거기에 인용된 모든 참고자료를 포함하여 본원에 참고자료로 완전히 포함된다.
피험자의 신체 샘플에서 암을 검출하기 위한 다양한 면역분석 방법이 개발되었다. 이들 방법의 일부는 암세포와 결합한다고 생각되는 자가항체의 존재의 검출에 기초한다.
암세포나 종양세포는 체내의 정상 세포로부터 출현하며(종양을 갖는다고 알려진 어떤 다른 동물이나 사람 모두), 변화를 겪어서 종양형성성으로 된다. 이러한 변화는 세포의 유전자 코드의 돌연변이로서 시작되며, 이들은 단백질 함량 및/또는 단백질 발현 수준의 변화를 번역하여 세포의 거동에 변화를 촉발한다.
종양세포는 "종양 항원"의 존재로 인해 정상 세포와 항원성에 있어서 상이하다. 이들은 종양세포에만 특유할 수 있거나, 또는 상이하게 발현되거나 과량으로 발현됨으로써 "종양-관련 항원"(TAA)으로서 인식된다. 종양세포는 단백질 1차 구조, 즉 아미노산 서열이 정사 세포와 상이할 뿐만 아니라(게놈 서열의 변화로부터 유래), 글리코실화, 포스포릴화의 변화와 같이 번역 후 변형의 변화로 인하여 2차 및 3차 구조도 정상 세포와 상이할 수 있으며, 이것은 계속해서 상기 단백질의 항원성을 변화시키고, 또한 그것을 종양-관련 항원으로서 특정한다. 한 전형적인 예는 유선에서 나오는 단백질 점액소인데, 이것 자체는 종양 세포에 존재하는 변화는 아니지만, 유방암 환자에서는 이것에 대한 자가항체가 발견된다(때로는 난소암에서도 그렇다). 그 이유는 아마도 정상 세포에서는 이 단백질이 고도로 글리코실화되고, 탄수화물 사슬의 치밀하고 두꺼운 코팅으로 인해서 전혀 노출되지 않기 때문인 것 같다. 종양세포에서 글리코실화가 불량하면, 항원성 결정소로서 작용하는 단백질 단편이 면역 시스템에 노출되게 된다.
면역 시스템에 나타나서 새로운 항원으로서 작용하는 정상 단백질의 다른 일반적인 예는 성체 세포에서 "신규" 발현되는 배아 단백질과 같은, 새로운 환경에서 나타나는 정상 단백질의 것이다.
어떤 정의와 결부되지는 않지만, TAA는 현재 특정 종양, 예를 들어 림프종, 암종, 육종 또는 흑색종과 결합될 수 있는 분자인 것으로 생각되며, 종양에 대해 세포성 및/또는 체액성 면역반응을 도출할 수 있고, 드물게는 종양에 대해 숙주를 방어하기도 한다. 이와 같은 TAA는 현재 3가지 부류로 분류되는데, 1명의 또는 단지 소수의 개체에만 존재하고 정상 세포에서는 발견되지 않는 특정 종양에 대해 고도도 특이적인 것, 예를 들어 종양-특이적 이식 항원(제 1 부류); 상이한 환자들의 다수의 관련된 종양에 존재하는 것(제 1 부류); 및 정상 세포와 악성 세포에 존재하며, 악성 세포에서 다량으로 발현되는 것(제 3 부류)이다. 제 2 부류의 TAA는 많은 종양에 존재하고 정상 피험자에서는 드물게 관찰되기 때문에 임상적으로 유용한 분석을 위한 잠재성이 가장 큰 것으로 생각된다.
일부 연구는 시험의 감도를 증가시키기 위해서 하나 이상의 자가항체를 확인한다(예를 들어, Zhang J.Y., et al., Cancer Epidemiology & Prevention 12:136-143 (2003)]. 다른 연구는 그 존재에 의해서 건강한 피험자와 암을 가진 피험자를 구별할 수 있다고 예상되는 항체 어레이를 설명하기 위한 "항체 프로파일링"과 관련된다(예를 들어, Chen, G., et al., Cancer Res. 67(7):3461-3467 (2007); Zhong et al., Journal of Thoracic Oncology 1(6) pp. 513-518 (2006)].
WO 2008/008708은 피험자의 샘플을 제공하는 단계; 및 폐암과 관련된 적어도 2개의 마커의 존재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 피험자에서 폐암의 존재를 검출하는 방법을 개시하며, 여기서 상기 마커의 적어도 절반이 샘플에 존재할 경우 상기 피험자에 폐암이 존재할 수 있거나, 또는 상기 샘플에서 상기 적어도 2개의 마커 각각의 존재와 상관되는 정규 값을 얻고, 상기 정규 값을 합해서 합계를 산출하고, 상기 합계를 상기 적어도 2개의 마커의 폐암에서의 최대 예측값인 기준값과 비교했을 때, 상기 합계가 상기 기준값의 적어도 30%이면 상기 피험자에 폐암이 존재할 수 있다.
본 발명의 용도 및 목적이 이후 설명으로부터 분명해질 것이다.
암 마커 또는 일군의 마커(자가항체 같은)의 존재를 검출하는 방법과 달리, 본 발명은 한편에서는 복수의 항원에 대한 특이적 항체-항원 복합체 수준의 상대적이고 정량적인 측정을 위해 신체 샘플을 분석하여, 진단된 피험자에서 암이 발생하는데 대한 항원의 생리학적 기여나 다른 기여가 계산되도록 정해진 기여 인자에 따라서 측정값을 조정하고, 다른 한편에서는 집단 전체에서 항체 발현 프로파일/수준의 차등성을 계산하는 진단 방법 및 응용 프로그램을 제공한다. 본 발명의 진단 방법 및 응용 프로그램은 진단된 피험자의 신체 샘플에서 자가항체 수준을 페어형으로 상대적 수준으로서 계산하며, 또한 분석 장치의 여러 한계들에 대한 기술적 해결책을 제공한다.
본 발명의 구체예는 암의 존재에 대해 평가될 피험자에게 진단을 배정하고, 및/또는 피험자가 병에 걸려 있을 가능성이 증가되었는지를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (i) 상기 피험자의 신체 샘플을 제공하는 단계; (ii) 상기 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플에 존재하는 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 자가항체와 복합체를 형성하는 단계, 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하고; (iii) 상기 피험자에서 상기 항원-항체 복합체의 각각의 수준을 측정하는 단계; (iv) 정해진 상대적 기여 인자에 따라 상기 항원-항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 암의 존재에 대한 상기 항원-항체 복합체 수준의 각각의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계; 및 (v) 시험 함수, (x)=f(상대적 기여 파라미터)의 결과를 결정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 (x)가 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치보다 높을 경우, 상기 피험자는 현재 암에 걸려 있을 가능성이 증가된 것이라는 진단에 배정된다.
본 발명의 방법의 모든 구체예에서, 항원의 세트는 적어도 2개 항원을 포함할 수 있으며, 상기 항원은 각각 상기 피험자에서 암의 존재에 대해 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하며, 정해진 상대적 기여 인자들은 상대적 기여 인자 행렬을 한정한다.
본 발명의 방법의 모든 구체예에서, 상대적 기여 인자 행렬은 상기 진단된 피험자에서 암의 발생을 특정하는 둘 이상의 항원-항체 복합체 수준의 비례적 관계를 포함한다.
본 발명의 방법의 모든 구체예에서, 신체 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플일 수 있으며, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법의 모든 구체예에서, 샘플은 알리쿼트로 나뉠 수 있으며, 예를 들어 제 1 알리쿼트는 예를 들어 1:5 내지 1:2000 범위에서 제 1 희석비로 적합한 완충 용액으로 희석되어 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공할 수 있고, 제 2 알리쿼트는 예를 들어 1:5 내지 1:2000 범위에서 제 1 희석비로 적합한 완충 용액으로 희석되어 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공할 수 있다. 제 2 희석비는 제 1 희석비와 상이할 수 있고, 제 1 희석비와 제 2 희석비는 자가항체가 이후 항원과 접촉하여 상이한 희석비에서 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공하는 수준까지 희석되고, 항원-항체 복합체는 2개의 상이한 항원을 가진다.
본 발명의 모든 구체예에서, 제 1 희석비와 제 2 희석비는 상기 2개의 상이한 항원의 상대적 희석비를 한정하거나, 또는 상기 2개의 상이한 항원 간의 비례적 관계를 한정한다. 상기 상대적 희석비는 적어도 2개의 상대적 희석비를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예들에서, 상기 방법은 유방암 또는 난소암, 자궁경부암, 결장암, 폐암 또는 전립선암을 검출하고, 이들의 진단을 배정하기 위해 설계되며, 이들에 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하는데 사용하기 위한 진단 모니터링 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 (i) 적어도 2개의 정해진 상대적 기여 인자를 포함하는 상대적 기여 인자 행렬을 유지하기 위한 레지스터; (ii) 상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-자가항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 수신하기 위한 입력 모듈, 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 상기 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하고; (iii) 상기 측정된 데이터와 상기 상대적 기여 인자 행렬을 프로세싱하기 위한 프로세서 모듈, 상기 프로세싱은 정해진 상대적 기여 인자에 따라 상기 항원-자가항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 상기 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계, 및 시험 함수 (x)=f(상대적 기여 파라미터)의 결과 (x)를 결정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 (x)가 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치보다 높을 경우, 진단된 피험자가 암에 걸린 것에 따른 상태에 진단된 피험자가 배정됨을 시스템 변수가 지시하고; 및 (iv) 진단된 피험자가 암에 걸린 것에 따른 상태에 진단된 피험자가 배정된다는 상기 시스템 변수에 저장된 지시를 출력하기 위한 출력 유닛을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하는데 사용하기 위한 컴퓨터 실행 진단 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) 적어도 2개의 정해진 상대적 기여 인자를 포함하는 상대적 기여 인자 행렬을 얻는 단계; (ii) 상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 수신하는 단계, 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 상기 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하고; (iii) 상기 측정된 데이터와 상기 상대적 기여 인자 행렬을 프로세싱하는 단계, 상기 프로세싱은 정해진 상대적 기여 인자에 따라 상기 항원-자가항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 상기 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계, 및 시험 함수 (x)=f(상대적 기여 파라미터)의 결과 (x)를 결정하는 단계를 포함하고; 상기 결과 (x)를 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치와 비교하는 단계, 이때 상기 (x)가 상기 역치보다 높을 경우, 상기 시스템 변수가 진단된 피험자가 암에 걸린 것에 따른 상태에 배정되고; (v) 진단된 피험자가 암에 걸린 것에 따른 상태에 진단된 피험자가 배정된다는 지시를 출력하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이며, 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 그 안에 저장된 컴퓨터 프로그램 코드를 가진 컴퓨터 기록가능한 매체를 포함하고, 이것은 프로세서에 의해 실행되었을 때, 상기 컴퓨터 실행 방법이 수행되도록 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 항원 인덱스를 인코딩하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) 신체 샘플에 존재하는 자가항체와 복합체를 형성하는데 사용될 항원의 세트를 포함하는 정보를 얻는 단계; (ii) 각 항원에 대해, 적합한 버퍼 용액을 사용하여 해당 희석비에서, 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 샘플에 존재하는 자가항체와 복합체를 형성하는 것을 포함하는 분석에서 측정가능한 항원-자가항체 복합체 수준을 제공할 수 있는 희석비를 지시하는 정보를 얻는 단계; 및 (iii) 항원 인덱스를 인코딩하는 단계를 포함하고, 이때 항원 인덱스는 희석비를 지시하는 정보를 관리하며, 항원 인덱스는 키 및 관련된 값을 포함하고, 각 키는 후보 항원의 실체를 유지하며, 각 값은 후보 항원에 대한 희석비를 지시하는 정보를 유지하고, 이로써 관심의 항원을 포함하는 쿼리에 대응하여, 지수가 관심의 항원에 맞는 희석비를 지시하는 정보를 검색한다. 어떤 구체예에서, 지수는 적어도 2개 항원의 희석비를 지시하는 정보를 유지한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 항원 인덱스를 인코딩하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이며, 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 그 안에 저장된 컴퓨터 프로그램 코드를 가진 컴퓨터 기록가능한 매체를 포함하고, 이것은 프로세서에 의해 실행되었을 때, 상기 컴퓨터 실행 진단 방법이 수행되도록 한다.
모든 구체예에서, 행렬은 적어도 2개의 상대적 기여 인자를 유지하는 값들의 어레이, 예를 들어, [b0, b1, ...bn],에 따른 것일 수 있으며, 이것은 이후 더 설명된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람 피험자에서 암을 진단하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 (a) 진단된 피험자의 신체 샘플을 선택적으로 희석하기 위한 버퍼 용액; (b) 암의 존재에 대한 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하는 적어도 2개의 항원, 상기 정해진 상대적 기여 인자는 레지스터에 유지되는 상대적 기여 인자 행렬을 한정하고; 및 (c) 피험자의 신체 샘플에서 상기 항원에 특이적인 항원-자가항체 복합체를 측정하기 위한 시약 및 수단; 및 (d) 사용 설명서를 포함한다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 컴퓨터 프로그램 제품 중 어느 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 상기 항원과 접촉시켜서 상기 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 프로세싱하기 위한 프로세서 모듈을 포함할 수 있으며, 상기 프로세싱은 정해진 상대적 기여 인자에 따라 상기 항원-항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 상기 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계, 및 시험 함수 (x)=f(상대적 기여 파라미터)의 결과를 결정하는 단계를 포함하고, 이때 상기 (x)의 값이 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치보다 높은 것은 진단된 피험자가 암에 걸린 것을 지시한다.
본 발명의 키트는 혈장 또는 혈청 샘플과 같은 신체 샘플을 시험하기 위해 설계될 수 있다.
본 발명의 키트에 포함된 항원은 SEQ ID NOs. 1 내지 26으로 표시된 항원들로부터 선택된 적어도 2개의 항원일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 분석에서 관심의 희석비에서 항체-항원 복합체에 대한 예측된 광학밀도(OD) 판독치를 결정하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 분석은 생물학적(또는 체) 샘플을 제공하고, 이 샘플을 항원 종과 접촉시켜서 항원 종과 특이적으로 결합할 수 있는 샘플에 존재하는 항체와 복합체를 형성함으로써 분석 장치에서 수행되며, 예측된 광학밀도(OD)는 (i) 적어도 3개의 상이한 희석비에서 항체-항원 복합체의 적어도 3개의 OD 측정값을 얻고, 이로써 적어도 3쌍의 희석비와 배정된 OD 측정값을 포함하는 데이터를 얻는 단계; (ii) 통계적 평활화 과정에 의해서 함수 [OD] = f(희석비)를 결정하는 단계; 및 (iii) f(관심의 희석비)에 대한 [OD] 값을 결정하는 단계에 의해서 결정되는 것을 특징으로 하며, 이로써 관심의 희석비에서 항체-항원 복합체의 예측된 광학밀도(OD)가 얻어진다.
적어도 3개의 상이한 희석비 중 하나가 입력되었을 때, 함수 [OD] = f(희석비)에서 함수 [OD]는 배정된 측정된 OD를 산출한다(또는 배정된 측정된 OD의 값 근처의 값을 산출한다).
이 방법은 상기 적어도 3개의 OD 측정값이 모두 분석 장치의 선형 범위에 들어있는지 검증하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예측된 광학밀도(OD) 판독치는 측정 장치의 선형 범위를 벗어날 수 있다.
모든 구체예에서, 신체 샘플은 포유류 또는 사람 피험자로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 구체예는 피험자에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 상기 피험자의 신체 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플을 적어도 2개의 상이한 적합한 항원과 접촉시켜서 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 상기 샘플에 존재하는 항체와 적어도 2개의 상이한 복합체를 형성하는 단계, 상기 항원은 각각 암을 가진 피험자의 샘플 중의 상기 적어도 2개 항원에 특이적인 항체 수준들 간의 비가 건강한 피험자에 대해 확립된 동일한 적어도 2개 항원에 대해 특이적인 항체 수준들 간의 비와 상이한 것을 특징으로 하고; (c) 상기 피험자에서 상기 항원-항체 복합체의 각각의 실제 수준을 결정하는 단계; (d) 상기 피험자에서 상기 적어도 2개의 상이한 복합체의 수준들 간의 비를 확립하는 단계; 및 (e) 상기 비를 동일한 적어도 2개 항원과 건강한 피험자의 샘플에서 형성된 항원-항체 복합체 수준들 간의 정해진 비와 비교하는 단계를 포함하고, 이때 단계 (d)에서 결정된 상기 비가 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 정해진 컷오프 포인트보다 높거나 낮은 경우, 상기 피험자는 암으로 진단된다.
이러한 방법에서, 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 정해진 컷오프 포인트는 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 상기 동일한 적어도 2개 항원에서 형성된 항원-항체 복합체 수준들 간의 비의 범위의 상한 또는 하한일 수 있다.
본 발명의 모든 구체예에서, 샘플 또는 그것의 알리쿼트는 항체의 적합한 검출가능한 수준, 예를 들어 1:5 내지 1:2000의 희석을 제공하는 희석까지 적합한 완충 용액으로 희석될 수 있으며, 상기 희석에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 모든 구체예에서, 상기 항원은 SEQ ID NOs. 1 내지 26으로 표시된 항원들 중 어느 하나일 수 있다.
모든 구체예에서, 본 발명의 방법은 검출될 암의 타입에 따라 적응될 수 있는 특정한 정해진 특이성 및/또는 감도에 맞게 설계될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 특정한 타입의 암을 검출하는데 효과적인 특정한 항원 쌍을 확립하는 방법이 제공된다. 이 방법은 기지의 암 샘플과 건강한 피험자의 샘플에 대한 수신자 판단 특성(ROC) 분석을 채용할 수 있다. 이러한 "유능한" 쌍을 확립하기 위한 특별한 알고리즘이 제공된다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 진단 방법에서 사용된 특정한 쌍의 항원에 대해 암의 진단을 위한 컷오프 비 또는 비의 범위를 결정하는 방법이 제공되며, 컷오프 비 또는 비의 범위는 암의 각 타입에 대한 감도 및 특이성의 특정 요건에 따라서 설계될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 진단 방법은 SEQ ID NO. 5(LDPeO7l), SEQ ID NO. 6(LDPe070), SEQ ID NO. 7(LDPeO69), SEQ ID NO. 9(LDPe002), SEQ ID NO. 10(LDPe008), SEQ ID NO. 11(LDPeO12), SEQ ID NO. 12(LDPeO16), SEQ ID NO. 13(LDPeO39), SEQ ID NO. 21(LDPeO4l), SEQ ID NO. 14(LDPeO66), SEQ ID NO. 15(LDPeO72), SEQ ID NO. 22(LDPeO76), SEQ ID NO. 23(LDPeO77), SEQ ID NO. 24(LDPeO78), SEQ ID NO. 25(LDPeO79), 및 SEQ ID NO. 26(LDPeO95)로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 항원을 포함하는 항원의 세트를 사용하여 수행되며, 유방암이 진단된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 진단 방법은 SEQ ID NO. 8(LDPeOOl), SEQ ID NO. 9(LDPe002) and SEQ ID NO. 16(LDPeO92)로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 항원을 포함하는 항원의 세트를 사용하여 수행되며, 난소암이 진단된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 진단 시스템은 SEQ ID NO. 5(LDPeO71), SEQ ID NO. 6(LDPe070), SEQ ID NO. 7(LDPeO69), SEQ ID NO. 9(LDPe002), SEQ ID NO. 10(LDPe008), SEQ ID NO. 11(LDPeO12), SEQ ID NO. 12(LDPeOl6), SEQ ID NO. 13(LDPeO39), SEQ ID NO. 21(LDPeO4l), SEQ ID NO. 14(LDPeO66), SEQ ID NO. 15(LDPeO72), SEQ ID NO. 22(LDPeO76), SEQ ID NO. 23(LDPeO77), SEQ ID NO. 24(LDPeO78), SEQ ID NO. 25(LDPeO79), 및 SEQ ID NO. 26(LDPeO95)으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 항원을 포함하는 항원의 세트를 이용하며, 유방암이 진단된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 진단 시스템은 SEQ ID NO. 8(LDPe001), SEQ ID NO. 9(LDPe002) 및 SEQ ID NO. 16(LDPeO92)로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 항원을 포함하는 항원의 세트를 이용하며, 난소암이 진단된다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 더 설명되며, 이들 도면은 단지 예시일 뿐이고, 첨부된 청구항에 의해서 한정되는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
도 1a는 동일한 희석에서 복합체를 직접 측정한 예이다(재료 및 방법 참조).
도 1b는 장치 한계로 인하여 수행될 수 없는 상이한 희석에서 복합체를 직접 측정한 예이다(재료 및 방법 참조).
도 1c는 상이한 희석에서 복합체를 직접 측정하고, 장치 한계를 수학적으로 극복한 예이다(재료 및 방법 참조).
도 2a는 항원 LDPe051, LDPeO64, LDPeO69 및 LDPeO7O에 대한 항체들에 대한 CT1 및 CT2의 3개 희석에 대해 그려진 그래프이다.
도 2b는 OC(난소암), CT(건강한 대조군) 및 CB(유방암)에서 LDPe051과 LDPe069 간의 비를 계산한 것이다(희석 No. 2).
도 2c는 유방암 51-69의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 7).
도 2d는 실시예 1에 나타낸 결과에 대한 유방암의 ROC 곡선이다 - 항원 LDPeO5l 및 LDPeO69.
도 2e는 난소암 51-69의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 8).
도 2f는 난소암의 진단에서 항원 LDPeO5l 및 LDPeO69의 ROC 곡선이다.
도 2g는 OC(난소암), CT(건강한 대조군) 및 CB(유방암)에서 LDPe064와 LDPe070 간의 비를 계산한 것이다(희석 No. 2).
도 2h는 난소암 64-70의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 9).
도 2i는 난소암의 진단에서 항원 LDPeO64 및 LDPeO70의 ROC 곡선이다.
도 2j는 유방암 64-70의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 10).
도 2k는 유방암의 진단에서 항원 LDPeO64 및 LDPeO70의 ROC 곡선이다.
도 3은 다양한 쌍의 항원들을 사용한 결과를 분석한 예이다(A'- SEQ ID NOs. 18과 20; B: SEQ ID NOs. 19와 20; C: SEQ ID NOs. 1과 2; D: SEQ ID NOs. 1과 20; E: SEQ ID NOs. 2와 5; F: SEQ ID NOs. 4와 17; G: SEQ ID NOs. 5와 17; H: SEQ ID NOs. 3과 17; I: SEQ ID NOs. 5와 19).
도 4는 특정 항원들의 서열이다(표 11).
도 5a-5d:
도 5a는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 1139), 이 측정값은 동일한 일련의 희석비에서 얻어진다.
도 5b는 테스트 1139의 4개 항원에 대해 얻어진 평활화된 측정값을 도시한다.
도 5c는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 1139), 이 측정값은 각 항원에 대해 상이한 희석비에서 얻어진다: Ag1 - 1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512;
도 5d는 테스트 1139에서 Ag 1-4에 대해 얻어진 평활화된 결과를 도시하며, 각 항원에서 샘플의 시작 희석비는 다음과 같다: Ag1 -1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512.
도 6a-6d:
도 6a는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 120000), 이 측정값은 동일한 일련의 희석비에서 얻어진다.
도 6b는 테스트 1200의 4개 항원에 대해 얻어진 평활화된 측정값을 도시한다.
도 6c는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 1200), 이 측정값은 각 항원에 대해 상이한 희석비에서 얻어진다: Ag1 - 1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512;
도 6d는 테스트 1200에서 Ag 1-4에 대해 얻어진 평활화된 결과를 도시하며, 각 항원에서 샘플의 시작 희석비는 다음과 같다: Ag1 -1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512.
도 7a-7m:
도 7a는 병에 걸린/암 환자와 건강한 대조군의 통계적으로 분리할 수 있는, 14개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7b는 각 항원 및 각 샘플의 1차 희석비 또는 희석점에서의 In(OD) 결과를 상세히 나타낸다(표 17); 행 "O"는 건강한 샘플을 표시하고, 행 "1"은 암 샘플을 표시한다.
도 7c는 13개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7d는 12개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7e는 11개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7f는 10개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7g는 9개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7h는 8개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7i는 7개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7j는 6개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7k는 5개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7l은 4개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7m은 12개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7n은 7명의 난소암 환자와 17명의 건강한 피험자의 LDPe002 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 결과의 2-차원 그래프를 도시한다.
도 7o는 7명의 난소암 환자와 17명의 건강한 피험자의 LDPe002 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 도 7n에 도시된 결과에 대한 AUC 곡선이다.
도 7p는 14명의 난소암 환자와 14명의 건강한 피험자의 LDPe001 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 결과의 2-차원 그래프를 도시한다.
도 7q는 14명의 난소암 환자와 14명의 건강한 피험자의 LDPe001 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 도 7p에 도시된 결과에 대한 AUC 곡선이다.
도 8은 실시예 1-8에서 자가항체와 복합체를 형성하기 위해 항원으로서 사용된 펩티드/단백질의 서열목록이다(표 38).
도 9는 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하는데 사용하기 위한 컴퓨터 실행 진단 방법의 순서도이다.
도 10은 암의 진단을 위해 작동하는 진단 모니터링 시스템의 도식적 블록 다이어그램이다.
도 1b는 장치 한계로 인하여 수행될 수 없는 상이한 희석에서 복합체를 직접 측정한 예이다(재료 및 방법 참조).
도 1c는 상이한 희석에서 복합체를 직접 측정하고, 장치 한계를 수학적으로 극복한 예이다(재료 및 방법 참조).
도 2a는 항원 LDPe051, LDPeO64, LDPeO69 및 LDPeO7O에 대한 항체들에 대한 CT1 및 CT2의 3개 희석에 대해 그려진 그래프이다.
도 2b는 OC(난소암), CT(건강한 대조군) 및 CB(유방암)에서 LDPe051과 LDPe069 간의 비를 계산한 것이다(희석 No. 2).
도 2c는 유방암 51-69의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 7).
도 2d는 실시예 1에 나타낸 결과에 대한 유방암의 ROC 곡선이다 - 항원 LDPeO5l 및 LDPeO69.
도 2e는 난소암 51-69의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 8).
도 2f는 난소암의 진단에서 항원 LDPeO5l 및 LDPeO69의 ROC 곡선이다.
도 2g는 OC(난소암), CT(건강한 대조군) 및 CB(유방암)에서 LDPe064와 LDPe070 간의 비를 계산한 것이다(희석 No. 2).
도 2h는 난소암 64-70의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 9).
도 2i는 난소암의 진단에서 항원 LDPeO64 및 LDPeO70의 ROC 곡선이다.
도 2j는 유방암 64-70의 ROC 곡선을 위한 계산이다(실시예 1)(표 10).
도 2k는 유방암의 진단에서 항원 LDPeO64 및 LDPeO70의 ROC 곡선이다.
도 3은 다양한 쌍의 항원들을 사용한 결과를 분석한 예이다(A'- SEQ ID NOs. 18과 20; B: SEQ ID NOs. 19와 20; C: SEQ ID NOs. 1과 2; D: SEQ ID NOs. 1과 20; E: SEQ ID NOs. 2와 5; F: SEQ ID NOs. 4와 17; G: SEQ ID NOs. 5와 17; H: SEQ ID NOs. 3과 17; I: SEQ ID NOs. 5와 19).
도 4는 특정 항원들의 서열이다(표 11).
도 5a-5d:
도 5a는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 1139), 이 측정값은 동일한 일련의 희석비에서 얻어진다.
도 5b는 테스트 1139의 4개 항원에 대해 얻어진 평활화된 측정값을 도시한다.
도 5c는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 1139), 이 측정값은 각 항원에 대해 상이한 희석비에서 얻어진다: Ag1 - 1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512;
도 5d는 테스트 1139에서 Ag 1-4에 대해 얻어진 평활화된 결과를 도시하며, 각 항원에서 샘플의 시작 희석비는 다음과 같다: Ag1 -1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512.
도 6a-6d:
도 6a는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 120000), 이 측정값은 동일한 일련의 희석비에서 얻어진다.
도 6b는 테스트 1200의 4개 항원에 대해 얻어진 평활화된 측정값을 도시한다.
도 6c는 4개의 항원에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준 측정값을 도시하며(테스트 1200), 이 측정값은 각 항원에 대해 상이한 희석비에서 얻어진다: Ag1 - 1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512;
도 6d는 테스트 1200에서 Ag 1-4에 대해 얻어진 평활화된 결과를 도시하며, 각 항원에서 샘플의 시작 희석비는 다음과 같다: Ag1 -1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512.
도 7a-7m:
도 7a는 병에 걸린/암 환자와 건강한 대조군의 통계적으로 분리할 수 있는, 14개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7b는 각 항원 및 각 샘플의 1차 희석비 또는 희석점에서의 In(OD) 결과를 상세히 나타낸다(표 17); 행 "O"는 건강한 샘플을 표시하고, 행 "1"은 암 샘플을 표시한다.
도 7c는 13개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7d는 12개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7e는 11개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7f는 10개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7g는 9개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7h는 8개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7i는 7개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7j는 6개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7k는 5개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7l은 4개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7m은 12개의 항원을 포함하는 하위군에 대한 AUC를 결정하는 ROC 분석을 제공한다.
도 7n은 7명의 난소암 환자와 17명의 건강한 피험자의 LDPe002 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 결과의 2-차원 그래프를 도시한다.
도 7o는 7명의 난소암 환자와 17명의 건강한 피험자의 LDPe002 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 도 7n에 도시된 결과에 대한 AUC 곡선이다.
도 7p는 14명의 난소암 환자와 14명의 건강한 피험자의 LDPe001 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 결과의 2-차원 그래프를 도시한다.
도 7q는 14명의 난소암 환자와 14명의 건강한 피험자의 LDPe001 및 LDPeO92에 대한 1차 최소 희석(1:8)에서 얻어진 도 7p에 도시된 결과에 대한 AUC 곡선이다.
도 8은 실시예 1-8에서 자가항체와 복합체를 형성하기 위해 항원으로서 사용된 펩티드/단백질의 서열목록이다(표 38).
도 9는 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하는데 사용하기 위한 컴퓨터 실행 진단 방법의 순서도이다.
도 10은 암의 진단을 위해 작동하는 진단 모니터링 시스템의 도식적 블록 다이어그램이다.
도입 부분에서 언급된 대로, 암성 과정 동안 미래의 암성 세포는 DNA, 유전자 발현, 전사 후, 번역 및/또는 번역 후 수준에서 변화를 겪게 되고, 이런 변화는 이들의 표현형을 변화시킨다. 다시 말해서, 이들 세포는 이미 자신의 "정상" 레퍼토리의 일부분이 아닌 단백질을 발현하기 시작하며, 이것은 따라서 종양-관련 항원(TAA)이라고 확인된다. TAA는 정상 세포나 심지어 정상(건강한) 피험자의 세포에도 존재할 수 있다. 종양 항원은 바이러스에 의해 도입된 새로운 유전자 정보; 아마도 프로토-암유전자에 의한 발암인자에 의한 유전자 기능의 변경(이로써 정상적으로는 비활성인(배아 발생 동안은 아마도 제외하고) 유전자 재료가 암유전자로 활성화되어 해당 세포 표현형에서 발현되게 된다); 신생물성 세포가 막 구성체(예를 들어, 시알산)를 합성하지 못함에 따른 정상적으로 정상 세포 상에 존재하거나, 또는 세포막에 "매장된" 항원의 노출; 및 신생물성 세포의 사멸로 인한 정상적으로는 세포 또는 세포 소기관에서 격리되는 항원의 방출의 결과일 수 있다.
TAA 발현의 한 가지 중요한 결과는 이들이 신체 면역 시스템에 의한 면역 인식을 유발할 수 있다는 것이다. 면역 인식은 결국 자가항체라고도 불리는 TAA-인식 항체를 생성시키는데, 이것은 체내에 기본적 수준으로 유지됨으로써 면역 시스템이 "자가"인자 "비-자가"인지를 한정한다. 그렇지만, 지금까지 어떤 특정한 자가항체도, 특히 감도 및 특이성이 높은 수준이 아닌 상황에서, "컷오프" 기준을 사용하여 암 환자와 정상 집단을 구분할 수 있다고는 확인되지 않았다. 이것은 두 집단이 모두 이런 TAA에 대한 혈청 자가항체를 가진다는 사실 때문일 수 있다. 암이 출현할 때는 이들 자가항체의 생산이 변화된다. 엄밀히는 TAA라고 할 수 없는 다른 자가항체들도 건강한 집단과 비교하여 암 환자에서는 상이한 발현 수준을 가질 수 있다.
간단하고, 비용 효과적이며, 고도로 특이적이고, 민감한, 암을 진단하는 방법을 위한 조사에서, 피험자에서 특정한 자가항체의 혈중 존재는 진단되지 않는다는 것이 발견되었다. 오히려 특히 건강한 개체와 암 환자 모두의 혈액에서 발견된 어떤 둘 이상의 자가항체의 수준들 간의 비가 암 환자 진단에서 기초가 될 수 있는 중요한 특징이다. 일반적으로, 기존 기술은 의심되는 암 환자에서 TAA에 대한 자가항체 마커의 존재에 기초한다. 본 발명 발견의 관점에서는 특정 자가항체의 수준은 파라미터로서 결정되지 않는다. 따라서, 특정 컷오프 이상의 실제 자가항체 수준이 암의 진단을 지시하는 컷오프 비교와는 달리, 본 발명자들은 시험된 피험자에서 적어도 2개 항원, 예를 들어 TAA에 대한 자가항체의 실제 수준을 결정하고, 이들 2개 자가항체의 수준들 간의 비를 계산하고, 이 비를 정해진 정상 기준 집단에서 동일한 적어도 2개 항원에 대한 자가항체의 실제 수준의 비와 비교하는 새로운 방법을 결정했다. 시험된 피험자의 샘플에서의 비가 기준 비와 상이할 때는 언제나 이 차이는 피험자가 암을 가진다는 것을 지시한다. 이 차이는 더 높은 비나 더 낮은 비 중 어느 하나일 수 있음이 주지되어야 한다. 상기 방법은 각 피험자의 건강한 상태와 암성 상태에서 자가항체의 자체-생산을 비교 고려한다. 상기 비의 변화는 집단에서 이런 변화를 반영한다.
본 발명의 신규 방법을 평가하기 위해서, 본 발명자들은 실험 목적으로 특정 TAA를 사용했으며, 이것은 이후 상세히 설명될 것이다. 그러나, 본 발명의 방법에서 사용되는 항원이 반드시 전통적으로 TAA로 정의되는 항원일 필요는 없다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 본 발명의 방법에 알맞은 관심의 항원은 시험된 샘플과 건강한 대조군의 샘플에 모두 존재하는 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원이며, 이때 암 양성 환자에서 적어도 2개의 이러한 자가항체의 실제 수준들 간의 비는 건강한 집단에 대해 확립된 동일한 비와 상이하다. 하기 실시예에 나타낸 대로, 본 발명에 따르면, TAA인 것으로 알려진 항원에 의해 인식되는 자가항체의 존재만으로는 피험자가 암을 가진 것을 지시하지 못하며, 이러한 자가항체의 실제 수준도 그러하다. 따라서, 본 발명의 방법에서 유용한 항원은 반드시 전통적인 TAA일 필요는 없다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 항원, 특히 적어도 2개 항원의 쌍이 본원에 설명된 방법을 사용하여 당업자에 의해서 확인될 수 있다.
가장 중요한 점은 본원에 설명된 방법이 혈액 검사에 기초하며, 혈장 또는 혈청 샘플을 사용한다는 것이다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 공지된 진단 방법들과 비교하여 더 빠르고, 더 저렴하며, 전체적으로 유리한 방법이다.
하기 상세히 설명되는바, 시험된 샘플 및/또는 그것의 알리쿼트는 검출 방법/장치의 검출 한계를 적합하게 하기 위해서 항원과 접촉되기 전에 연속 희석될 수 있다. 희석은, 예를 들어 샘플 중의 자가항체의 수준이 높을 때 바람직하다. 희석도는 숙련된 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일반적으로, 각 샘플 또는 그것의 알리쿼트는 검출 방법(ELISA, FACS, 웨스턴 블롯 등)에 따른 모든 항원-자가항체 복합체의 적합한 검출에 필요한 수준까지 연속 희석되어야 한다. 모든 샘플이 동일한 희석으로 희석될 필요는 없고, 각 복합체가 동일한 희석에서 측정될 필요도 없으며, 이것은 하기 실시예에 나타낸다. 특정 희석에서 2개 복합체 간의 비를 확립함으로써 각 피험자에 대해 이 비를 결정하는데, 즉 자가항체의 수준이 높은 피험자의 경우에는 더 높은 희석이 이루어져야 하고, 자가항체 수준이 낮은 다른 피험자의 샘플은 더 작은 범위로 희석되어야 한다. 이 비는 "자체 비"이므로, 모든 피험자에서 모든 조건을 유사하게 유지할 필요는 없다. 동일한 시스템에서 2개 항체가 검출될 수 없는 경우에는 상이한 희석이 필요하기 때문에, 상이한 희석이 이용될 수 있고, 도 1(a, b, c) 및 하기 실시예에 나타낸 대로 상응하는 값들은 외삽에 의해서 결정될 수 있다. 희석은 적합한 수준까지, 구체적으로는 사용된 검출 시스템에 적합한 수준까지 이루어져야 한다. 따라서, 상이한 명세사항과 기술적 한계를 가진 상이한 검출 시스템의 경우, 기본적 검출 수준을 넘는 상이한 희석이 필요할 수 있다. 희석 범위와 같은 분석의 특정사항들의 설계는 당업자의 기술 범위 내이다. 모든 샘플에서 시험되는 각 항원 복합체에 대해서 희석된 샘플들 간의 정해진 상대적 희석비를 유지하는 것이 중요하다.
본 연구의 목적을 위해서, 제한은 아니지만, 본 발명자들은 표 11(및 도 8, 표 38)에 구체적으로 나타낸 다수의 항원(펩티드를 포함하는)을 선택했고, 이들을 혈장 샘플에 있는 상응하는 항체의 확인/검출에 사용했다. 본원에 사용된바, 용어 항원은 체내에 도입되었을 때 면역반응을 자극하여 항체의 생산을 유발할 수 있는 어떤 물질을 의미한다. 특정 구체예에서, 항원은 적어도 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 종양-관련 펩티드, 이러한 종양-관련 펩티드를 포함하는 펩티드 및 단백질 및 이들의 유도체이다. 그렇지만, 상기 설명된 대로, 항원이 반드시 전통적으로 TAA라고 알려진 것일 필요는 없다.
펩티드-기반 및 단백질-기반 항원에 더하여, 다른 항원도 사용될 수 있는데, 예를 들어 핵산-기반, 탄수화물-기반, 지질-기반, 천연 유기물질-기반, 합성 유도된 유기물질-기반, 무기물질-기반, 및 펩티드의태체-기반 물질들이다. 이러한 물질은, 예를 들어 펩티드의 조합 라이브러리, 고리형 펩티드의태체의 라이브러리 및 무작위 또는 전용 파지 디스플레이 라이브러리의 위치 스캐닝의 산물일 수 있다.
본 출원은 SEQ ID NOs. 1-26(도 8에 나타낸다 - 표 38)에서 한정된 특정 항원(TAA)을 이용한다. 필수적으로, TAA 및 TAA-인식 항체는 암의 진단을 위한 중요한 도구로서 본원에서 설명된다.
따라서, 본 발명의 항원은 피험자로부터 얻은 혈장 샘플에서 항체를 검출하기 위한 진단 조성물에 포함된 활성제로서 또는 그대로 사용되었다. 특정한 항원-인식 항체의 검출은 샘플을 적어도 2개의 특정 항원과 접촉시킴으로써 수행된다(즉, 본 발명의 항원, 예를 들어 SEQ ID NO. 1-26에 표시되고, 표 1, 5, 11 및 38(도 8)에 상세히 설명된 항원과). 바람직하게, 항원은 약 2.5-250μg/ml의 농도로 사용된다(항체 검출의 ELISA-기반 분석의 경우).
본원에 사용된 용어 "항체" 또는 "자가항체"는 또한 무손상 분자는 물론, 예를 들어 항원과 결합할 수 있는 항체의 scFv, Fv, Fab', Fab, 디아바디, 선형 항체, F(ab')2 항원 결합 단편과 같은 단편들도 포함하는 것을 의미한다(Wahl et al. (1983) J. Nucl. Med. 24, 316-325). 본원에 정의된 대로, "항체" 또는 "자가항체"는 IgG, IgM 및 IgA 중 어느 하나일 수 있다. 이론과 결부되지는 않지만, 암을 지시하는 자가항체는 주로 IgG일 것으로 예상된다. IgG를 측정하는 것이 더욱 특이적일 수 있다.
항체는 그것이 분자와 특이적으로 반응하여 상기 분자와 항체가 결합할 수 있다면 분자와 "결합할 수 있다" 또는 분자를 "인식한다"라고 말한다. 용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합될 수 있는 어떤 분자의 부분을 말하며, 이것은 또한 그 항체 또는 그 항체를 생산하는 세포에 의해서도 인식될 수 있다. 에피토프 또는 "항원 결정소"는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기들로 구성되며, 특정한 3-차원 구조 특징과 특정한 전하 특징을 가진다.
"항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분이다. 항원은 1개 또는 2개 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 상기 언급된 특정한 반응은 항원이 그것의 상응하는 항체와는 고도로 선택적이고 특이적인 방식으로 반응하지만, 다른 항원들에 의해 도출될 수 있는 많은 다른 항체들과는 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명에 의해서 검출될 수 있는 항체, 또는 그것의 단편은 임의의 방법에 의해서 피험자의 샘플에서 검출될 수 있다. 이것은 시각적으로 검출될 수 있는 신호를 제공하는 기술에 의해서 달성될 수 있으며, 이것은 형광(면역형광), 효소 반응의 발색 산물, 침전물의 생성, 화학발광 및 생물발광 중 어느 하나일 수 있다. 일반적으로, 항원이 적합한 지지체, 특히 고체 지지체 상에 고정된 다음, 자가항체를 함유하는 생물학적 샘플이 항원과 접촉되고, 효소, 태그, 색 등과 같은 검출 수단이 첨가되고, 자가항체의 수준이 측정된다. 더 상세한 설명은 하기 실험 섹션에서 찾을 수 있다. 자가항체를 검출하는데 사용될 수 있는 다른 기술은, 제한은 아니지만, 콜로이드상 금, 방사선활성 태그, GFP(녹색 형광 단백질) 등, 아비딘/스트렙토아비딘-바이오틴, 자기 비드, 및 물리적 시스템, 예를 들어 실제 결합에 감응하는 나노기술 시스템을 포함한다.
지지체는 "고체상 지지체", "고체 담체", "고체 지지체", "고체 담체", "지지체" 또는 "담체"일 수 있으며, 이들은 모두 항원과 결합할 수 있다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론 아밀라제, 천연 및 변성 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 어느 정도는 가용성일 수 있으며, 또는 본 발명의 목적을 위해서 불용성일 수도 있다. 지지체 재료는 결합된/고정된 항원 분자가 항체와 결합할 수 있기만 하면 실제로 어떤 가능한 구조적 입체형태라도 가질 수 있다. 따라서, 지지체 또는 담체 입체형태는 비드와 같은 구형, 시험관의 내면과 같은 원통형, 또는 막대의 외면일 수 있다. 동일한 시험관 안의 상이한 항원들에 대해 상이한 담체들이 사용될 수 있다. 대안으로서, 표면은 시트, 테스트 스트립 등과 같이 평평할 수도 있다. 바람직한 지지체 또는 담체는 폴리스티렌 비드를 포함한다. 당업자는 항원과 결합하는 많은 다른 적합한 담체를 알고 있거나, 또는 통상의 실험을 사용하여 그것을 확인할 수 있을 것이다.
통상적으로 또는 특정한 상황에서 필요하다면 세척, 교반, 진동, 여과 등과 같은 다른 단계가 분석에 추가될 수 있다.
본 발명은 한편에서는 암의 발생에 대해 각각 상이한 생리학적 기여 또는 다른 기여를 갖는 복수의 항원에 대한 특이적 항체-항원 복합체의 측정을 위해 신체 샘플을 분석하고, 다른 한편에서는 집단 전체에서 항체 발현 프로파일/수준의 차등성을 계산하는 진단 방법 및 응용 프로그램을 제공한다. 이와 관련하여, 피험자의 자가항체의 생산은 다른 피험자의 "약한" 자가항체 생산과 비교하여 특정 자가항체가 상대적으로 실질적인 수준으로 생산되는 "강한" 생산을 특징으로 할 수 있다.
하기 증명되는바, 본 발명은 유연한 진단적 접근법을 채용함으로써 특히 이러한 도전을 다루는 분석을 제공한다. 모든 항체-항원 복합체에 적용가능한 미리 규정된 단일 희석비로 희석된 신체 샘플(예를 들어, 혈장 또는 혈청)에 대해 진단 분석을 수행하는 대신, 본 발명은 복수의 희석비(2, 3 이상)에서 수행되는 진단 분석을 개시하며, 그로부터 모인 정보의 수집 및 통합을 교시한다. 하기 나타낸 대로, 동시 사용되는 모든 항체-항원 복합체에 대해 단일 범위의 희석이 항상 이용될 수 있지는 않다. 그것을 사용할 수 있다 하더라고, 분석이 단일 희석비에 제한되므로, 임상 환경에서는 검출 장치에 기술적 제약이 있게 된다.
따라서, 진단 항원 세트를 확인하거나 다수의 환자 샘플에 대해 진단 검사를 수행하는 과정에서 모든 항원에 동일한 희석비의 사용을 적용할 수 없는 상황이 생긴다. 단일 희석비는 부정확성의 이유뿐만 아니라, 분석 장치의 한계로 인해서 다양한 임상 환경에서 사용하는 데는 적용할 수 없을 수 있다. 부정확성은, 예를 들어 샘플에서 형성된 항체-항원 복합체 중 하나가 매우 높게(또는 매우 낮게) 산출되어, 특정한 검출 장치로 측정될 수 없을 때 생길 수 있다.
이 문제를 극복하기 위해서, 본 발명은 상이한 항체-항원 복합체에 대해 미리 규정된 상이한 희석비의 세트를 제공한다. 추가로, 여러 상이한 항원-자가항체 복합체에 대해 결정하는 경우, 상이한 희석비들 간의 상대적인 희석비가 한정되며, 이것은 모든 시험된 샘플에 대해서 항상 유지된다.
또한, 특정 샘플에서는 모든 항체-항원 복합체가 매우 높은 경우가 있을 수 있는데, 이 경우에도 다른 샘플과 마찬가지로 동일한 초기 희석비를 사용하는 것이 불가능하다. 본 발명은 또한 "고" 샘플을 정해진 대표 희석비로 희석하는 것을 교시하며, 이로부터 예를 들어 상이한 항원에 대한 항체-항원 복합체의 희석비들 간의 희석비를 유지함으로써 일부 또는 모든 희석비가 유도된다. 따라서, 정해진 대표 희석비에서 항체-항원 복합체 수준을 얻은 후에, 정해진 대표 희석비와 제 2 희석비 간의 희석비를 유지하는 제 2 희석비에서 다른 항체-항원 복합체 수준이 얻어질 수 있다. 연속 방식으로 유사하게 추가의 항체-항원 복합체 수준이 얻어질 수도 있다.
예를 들어, 샘플이 Ag1에 대해 1:5의 희석비로 희석되고, 다음에 Ag2에 대해 1:10의 희석비로 희석된 경우, Ag1와 Ag2 간의 희석비는 2(10/5)이다. 이 희석비가 동일한 항원(Ag1 및 Ag2)에 대해 측정되는 모든 샘플에서 유지되어야 한다. 자가항체의 수준이 높다면, 샘플은 1:100(Ag1의 경우) 및 1:200(Ag2의 경우)까지 희석될 수 있고, 희석비는 2로 유지된다(200/100). 이것은 항체가 항상 존재하는 "고" 샘플에 관해서 항체의 실제 존재가 진단을 결정하는데 충분하지 않은 이유 중 하나이다.
단지 판독의 신뢰성을 높이기 위한 목적에서 반복적으로 여러 번 OD를 측정하는 대신에(2번, 3번 등), 각 항체-항원 복합체에 대해 수행된 연속 희석 과정을 이용함으로써 각 항원에 대해 특정 희석비 범위에서 OD 측정값이 얻어졌다. 이 방식에서는 각 항체-항원 복합체에 대해 대표 희석비가 선택된다. 대표 희석비는 측정 장치의 선형 범위에서 OD 측정값을 생성하는 것이다. 예를 들어, 항원의 대표 희석비는 일련의 측정값에서 OD 판독치를 얻기 위해 사용되는 제 1 희석비일 수 있으며, 이것은 측정 장치의 선형 범위 내에서 결과를 생성한다. 이 방식에서, 복합체의 항체-항원 양의 정확한 측정값이 얻어진다(즉, 측정 장치의 선형 범위 내에서).
진단 분석이 일련의 희석비에서 과도하게 높은(측정 장치의 선형 범위를 초과하는) 신호를 생성했던 신체 샘플의 경우, 장치의 선형 범위가 더 넓다는 가정하에 여기서 정의된 외삽 과정을 사용하여 예측된 OD 신호가 계산될 수 있다(예를 들어, 도 1c 참조). 일반적으로, 본 발명의 외삽은 OD 판독치와 희석비를 연계하는 함수를 이용함으로써 수행되며, 이들 판독치를 생성할 수 있다. 앞서 언급된 대로, 진단 세트의 각 항원에 대해 일련의 OD 판독치가 특정 희석비의 함수로서 생성되고, 이로써 희석 곡선이 얻어진다. 이 데이터는 희석 함수, 즉 [OD] = f(희석비)로 전환된다(또는 평활화된다). 선택적으로, f는 선형, 지수, 다항 함수 등일 수 있다. 측정 장치가 특정 희석비에서 신호를 얻을 수 없거나, 또는 그것의 선형 범위를 벗어난 OD 신호가 얻어질 경우, 이 함수를 사용하여 다른 희석 범위에서, 바람직하게는 측정 장치의 선형 범위에서 수행된 OD 측정값으로부터 예측된 광학밀도(OD) 판독치를 외삽한다. 다음에, 더 나아가 이들 이론적 또는 예측된 값을 사용하여 진단 항원 세트, 및 각 항원을 특정하는 상대적 기여 인자를 결정한다(또는 확인한다)(실시예 5-7 참조).
신뢰성 있는 결과를 달성하기 위해서, 평활화 과정에 의해 데이터 세트로부터 아웃라이어(수학적 고려에서 극한값들)를 제거한 다음, 상기 설명된 대로 이론적 희석 함수를 계산한다. 평활화 과정은 선형 회귀에 의해서 함수를 얻는 형태를 취할 수 있다. 이 희석 함수를 사용하여 추가의 프로세싱을 수행해서 특유의 상대적 프로파일에 의해서 암성 집단과 건강한 집단을 가장 잘 구분할 항원들을 확인한다.
다음의 용어들이 본원에서 사용된다:
"진단의 배정"은 신신체 샘플이 얻어진 시점에서, 진단된 피험자가 암에 걸려 있거나, 또는 암에 걸려 있을 가능성이 높다는 것에 따른 지시를 제공하는 것을 의미한다.
"상대적 기여 인자"는 항원을 특정하는 또는 항원에 배정되는 변수를 의미한다. 이 변수는 진단된 피험자에서 암의 존재에 대한 항원의 기여도 측정을 나타내는 값을 유지한다. 특히, 상대적 기여 인자는 또한 상기 피험자에서 암의 발생이나 존재에 대한 진단된 피험자에서 측정된 항원-자가항체 복합체 수준(들)의 상대적 기여도를 특정한다. 특히, 상대적 기여 인자는 또한 정해진 희석 또는 정해진 희석률에서 측정된 항원-자가항체 복합체 수준(들)의 상대적 기여도를 특정할 수 있다. 이와 관련하여, 항원-자가항체 복합체 수준(들)은 실제 측정값, 또는 평활화된/예측된 측정값 중 어느 하나를 포함한다. 비제한적 예시로서, 한 쌍의 상대적 기여 인자(한 쌍의 항원을 특정하는) 간의 크기 관계가 암의 발생에 대한 상기 쌍의 각각의 상대적 기여도를 제공한다.
"희석", "희석률" 또는 "희석점"은 신신체 샘플(예를 들어, 혈청 또는 혈장)이 적합한 버퍼 용액으로 희석되는 분석과 관련된다. 희석률 또는 희석점은 신신체 샘플의 농도가 감소하는 것을 의미하며, 이러한 감소된 농도는 신신체 샘플의 체적 양 대 적합한 버퍼 용액의 체적 양으로서 한정된다. 비제한적 예로서, 신신체 샘플은 버퍼 용액 8 유닛당 신신체 샘플 1 유닛인 1:8의 희석률, 1:32의 희석률 등으로 희석될 수 있다.
"페어형 희석비" 또는 "상대적 페어형 희석비" 또는 "상대적 희석비"는 신신체 샘플이 한 쌍의 항원으로 이루어진 제 1 항원 및 제 2 항원과 접촉됨으로써 신신체 샘플에 존재하는 자가항체와 복합체를 형성하는 접촉 단계를 포함하는 분석과 관련된다. 샘플의 제 1 알리쿼트는 적합한 버퍼 용액으로 제 1 희석률(예를 들어, x1)로 희석되고, 샘플의 제 2 알리쿼트는 제 2 희석률(예를 들어, x2)로 희석되어, 측정가능한 항원-항체 복합체 수준이 제공된다. 진단될 집단에 대한 미리 설정된 기준이나 값에 의해 한 쌍의 항원에 대해 결정된 한 쌍의 희석률 사이의 비례적 관계를 추정한다. 각 희석률은 측정 장치의 선형 범위에서 생성된다. 비제한적 예로서, Ag1 및 Ag2의 한 쌍의 희석률을 x1 및 x2라고 하면, 이 한 쌍의 희석률은 측정 장치의 선형 범위 내에서 한 쌍의 OD 판독치를 생성한다. 따라서, 상대적 희석비는 x2/x1, ln(x1)/ln(x2) 등으로 정의될 수 있다. 다른 언급이 없다면, 상대적 희석비는 x1/x2를 의미한다. 비제한적 예로서, 제 1 알리쿼트가 1:8의 희석률(즉, x1=1:8, Ag1에 대해)에서 얻어지고, 제 2 알리쿼트가 1:32의 희석률(즉, x1=1:32, Ag2에 대해)에서 얻어지는 경우, 페어형 희석비는 x2/x1=0.25이다.
어떤 구체예에서, 한 쌍의 항원들에 대해 페어형 희석비를 결정하거나 미리 설정한 후에, 이 페어형 희석비는 하기 예시된 대로 본 발명의 시스템과 방법을 수행하는 동안 유지될 수 있다. 예를 들어, 페어형 희석비가 x2/x1=0.25이고, Ag1에 대해 얻어진 항원-자가항체 복합체 수준이 1:16일 때, 페어형 희석비를 유지한다는 것은 1:64의 희석률에서 Ag2에 대해 항원-자가항체 복합체 수준을 얻는 것을 의미한다. 하기 설명된 대로, 1:64에서 측정 장치가 그것의 선형 범위를 벗어난다면, 예측된 값이 확인된다.
"레지스터"는 기억 장치, 기억 유틸리티 또는 그것의 일부분에 유지된 기록을 의미한다. 레지스터는 컴퓨터 시스템이나 컴퓨터 메모리의 일부분이 수 있다. 본 발명과 관련하여, 레지스터는 상대적 기여 인자 행렬 또는 어레이를 유지하지만, 다른 정보도 포함할 수 있다.
"인덱스"는 그에 대한 쿼리-프로세싱을 허용하는 어떤 조합된 데이터 구조, 어레이, 컨테이너, 사전을 포함하는 정보의 저장 및 검색을 허용하는 데이터베이스 또는 어떤 다른 시스템 또는 유틸리티를 의미한다. 인덱스는 전형적으로 키의 수집과 값의 수집을 포함하며, 각 키는 하나 이상의 값과 연계된다. 키와 연계된 값을 찾는 작업을 통상 룩업이라고 하며, 이것은 여기 개시된 인덱스에 의해 지원되는 작업이다.
"항원 인덱스"는 키에 의해서 표시되는 항원의 수집을 포함하는 인덱스이며, 각 키(또는 연계된 항원)는 항원의 희석률 또는 제 2 항원과 관련해서는 페어형 희석비를 지시하는 정보를 표시하는 값과 연계된다.
"인코딩"은 하나의 표현이 상이한 등가의 표현으로 변환되는 것을 의미한다. 예를 들어, p53 항원은 인코딩 형태로서 문자열 "LDPr077"로 표시될 수 있다.
"쿼리"는 인덱스 또는 데이터베이스에서의 정보의 탐색을 의미한다. 정보는 특정 항원에 대한 정해진 희석률 또는 희석점을 지시하는 정보일 수 있다.
또한, 모든 수치 값(입력, 출력, 또는 본원에서 제공된 식에 따른 출력 또는 함수, OD 측정값 등)은 서술된 값으로부터 최대 ±10%까지, 때로는 최대 ±5%까지 변동되는 대략적인 값이다. 항상 명확히 언급되지 않는다 해도, 모든 수치 지정에는 그 앞에 "약"이라는 용어가 있다고 이해되어야 한다.
항원-자가항체 복합체 수준이 본 발명에 따라서 측정될 수 있는 방식 중 하나는 효소 면역분석(EIA)을 결합시키는 것이다. 이 분석에서 사용될 수 있는 효소는, 제한은 아니지만, 말레에이트 디히드로게나제, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 디히드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 디히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코오스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레아제, 카탈라제, 글루코오스-6-포스페이트 디히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제를 포함한다. 검출은 효소에 대한 발색 기질을 사용하는 열량분석 방법에 의해서 수행될 수 있다. 또한, 측정은 유사하게 제조된 표준물질과 기질의 효소 반응의 정도를 육안 비교함으로써 수행될 수 있다(이 과정은, 예를 들어 니트로셀룰로오스 또는 플라스틱 지지체 상에서, 가용성 착색 산물 및 불용성 착색 산물 모두에 적합하다).
항체와 항원의 반응을 검출하는 것은, 적합한 예로서, 상이한 에피토프와 특이적으로 반응하는, 또는 리간드나 반응된 항체와 비특이적으로 반응하는 2차 항체 또는 다른 리간드의 사용에 의해서 더 보조될 수 있다.
면역형광분석(IFA), 광도분석, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), ELISPOT 분석 및 면역블롯팅과 같은 효소 면역분석이 특정 항체의 검출을 달성하기 위해 쉽게 채용될 수 있다. 자가항체의 검출에 효과적인 ELISA 방법은, 예를 들어 다음 단계를 가질 수 있다: (1) 고체 지지체에 관심의 항원, 예를 들어 TAA를 결합시키는 단계; (2) 결합된 항원을 혈장 또는 혈청과 같은 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계; (3) 상기의 것을 검출가능한 부분(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 효소 또는 알칼리성 포스파타제 효소)에 결합된 2차 항체와 접촉시키는 단계 - 2차 항체는 단계 (2)의 상기 항체를 검출할 수 있다; (4) 상기의 것을 효소의 기질과 접촉시키는 단계; (5) 상기의 것을 적합한 시약과 접촉시키는 단계; (6) 색의 변화를 관찰하고 정량하는 단계.
항체의 존재를 면역효소 검출하는 다른 방법은 웨스턴 블롯 및 도트 블롯이다. 항원은 니트로셀룰로오스 막 또는 다른 적합한 지지체로 전달된다. 다음에, 시험될 샘플, 일반적으로 혈장이 막과 접촉되고, 형성된 면역 복합체의 존재가 이미 설명된 방법에 의해서 검출된다. 이 방법에 대한 변형에서는 정제된 항원이 막 위에 일렬로 또는 스폿으로 적용되고 결합이 이루어지게 된다. 계속해서, 막이 시험될 혈장 샘플과 접촉되고, 본원에 설명된 기술을 사용하여 형성된 면역 복합체가 검출된다.
또한, 샘플 중의 특정 항체의 측정은 응집에 의해 수행될 수 있다. 항원을 사용하여, 예를 들어 균일한 현탁액을 형성하는 라텍스 입자들을 코팅할 수 있다. 고정된 항원에 대한 특이적 자가항체를 함유하는 혈장과 혼합할 때, 라텍스 입자들이 응집하고, 커다란 응집체의 존재가 육안으로 검출될 수 있다.
또한, 자가항체는 다양한 면역분석 방법에 의해서 측정될 수 있다. 면역분석 기술에 의한 항체 측정에 적용할 수 있는 면역학적 과정과 면역분석 과정에 대한 리뷰는 Basic and Clinical Immunology(D. Stites et al. (eds.), (1994) Basic and Clinical Immunology, 8th Ed.)을 참조한다.
항체와 항원의 반응 측정은 본 분야에 공지된 방법에 의해 검출가능한 부분으로 표지된 항체 또는 리간드의 사용에 의해서 촉진될 수 있다. 이러한 검출가능한 부분은 침전물 또는 색 변화의 육안 검출, 현미경에 의한 육안 검출, 또는 분광광도기 또는 radiometric 측정 등에 의한 자동 검출을 허용한다. 검출가능한 부분의 예는 플루오레세인 및 로다민(형광현미경의 경우), 양고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제(광 현미경 또는 전자 현미경과 생화학적 검출의 경우, 그리고 색 변화에 의한 생화학적 검출의 경우), 및 바이오틴-스트렙토아비딘(광 현미경 또는 전자 현미경의 경우)를 포함한다. 사용된 검출 방법 및 부분은 이러한 선택에 적용되는 표준 기준에 따라서, 예를 들어 상기 리스트나, 또는 다른 적합한 예들로부터 선택될 수 있다(Harlow and Lane (1988) Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
측정은 여러 다른 면역분석들 중 어느 것을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 항원을 방사선활성 표지화함으로써 방사선면역분석(RIA)을 사용하여 항체를 검출할 수 있다. RIA에 관한 설명은 본원에 참고자료로서 포함되는 Work, T.S. 등의 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology(North Holland Publishing Company, NY (1978))에서 찾을 수 있으며, 특히 챕터 제목 "방사선면역분석 및 관련 기술의 소개"(Chard, T.)를 참조한다. 방사선활성 동위원소는 감마/베타 계수기 또는 섬광계수기를 사용하거나, 또는 autoradiography와 같은 수단에 의해서 검출될 수 있다.
언급된 대로, 샘플은 항원과 접촉되기 전에 연속 희석될 수 있다. 어떤 구체예에서, 예를 들어 skim milk로 비특이적 결합에 대해 항원을 차단하는 것이 권장될 수 있다.
흥미로운 것은 본원에 정의된 적어도 2개의 적합한 항원, 예를 들어 TAA에 대해 암 환자의 혈액에 존재하는 자가항체의 실제 수준들 사이의 비가 본원에서 기준비라고 하는 건강한 개체에 대해 결정된 동일한 적어도 2개 항원에 대한 자가항체 수준들 사이의 비와 상이하다는 점이다. 따라서, 샘플에서 항원-항체 복합체의 발견은 먼저 피험자에서 다른 항원-항체 복합체에 관하여 분석되어야 하고, 전체적인 결과가 질환이 없는 건강한, 또는 대조군 집단(정상 집단이라고도 한다)에서의 동일한 항원-항체 복합체에 대해 얻어진 패턴과 비교되어야 한다.
3개 이상의 자가항체를 측정할 때, 상대적 기여 인자가 각 항원에 대해 결정된다. 상대적 기여 인자는 각 항원을 특정하며, 이것은 진단된 피험자에서 암의 존재에 대한 항원의 기여 척도를 표시하는 값을 유지하고, 각 항원에 사용되는 상대적 희석률, 및 다른 항원에 대한 모든 다른 항체에 상대적인 각 항체의 상대적 양을 내포한다.
상기 설명된 구체예에서, 2개의 자가항체들 사이의 비가 결정될 수 있다. 그러나, 특정한 항원-인식 자가항체와 총 Ig를 포함하는 비특이적 항체들의 혼합물 사이의 비를 확립하는 것도 가능하다.
방법은 피험자의 샘플에서 자가항체를 측정하기 위한 것일 수 있지만, 그 자체로 암의 진단에도 사용되는 것이 고려된다. 샘플 중의 상이한 자가항체들 사이의 상기 "상이한" 비의 검출은 암의 존재를 지시한다(건강한 개체에서의 동일한 비와 상이한).
본 발명의 범위 내에서 샘플 중의 2개의 자가항체들 사이의 비가 숫자로 표시될 때, 이 숫자는 건강한 피험자, 또는 암 환자를 나타내는 범위의 한계이고, 이 범위는 범위의 상한일 수도 있고, 또는 범위의 하한일 수도 있다. 예를 들어, 건강한 환자에 대한 비가 상한이라면, 더 낮은 비를 가진 모든 환자는 건강하다. 이 비가 하한이라면, 더 높은 비를 가진 모든 환자는 건강하다. 암 환자의 비에 대해서도 동일하게 준용하여 적용된다. 하기 더 상세히 논의되는 대로, 범위의 하한이나 상한은 주치의의 특정 요건에 따라서 변동될 수 있으며, 한계의 설정은 본 발명의 범위 내이다.
특정 구체예에서, (1) 샘플 중의 2개의 항체들 사이의 정량적 비가 (2) 기준비 또는 베이스라인 비로서 사용되는 건강한 또는 정상 개체로부터 얻어진 샘플에 존재하는 동일한 2개 항체들 사이의 동일한 비와 관련하여 결정될 수 있고, 이로써 상대적 값이 제공된다. 따라서, 상대적 값은 샘플의 비와 기준비를 서로 나눈 것의 결과일 수 있다(1 초과, 1과 동일, 또는 1 미만의 값을 제공하기 위해, 이때 1 이외의 다른 임의의 값은 시험된 샘플이 양성이라는 것을 지시한다; 본 출원의 범위 내에서 상대적 값은 실질적으로 1 이외의 다른 값이며, 즉 사용된 분석의 파라미터에 따라서 결정된다). 또한, 상대적 값은 기준비로부터 샘플의 비를 추론하거나, 또는 샘플의 비로부터 기준비를 추론함으로써 얻어질 수 있다(양성 또는 음성 값, 또는 0을 제공하기 위해, 이때 0 이외의 다른 임의의 값은 피험자가 암을 가진다는 것을 지시한다 - 이것은 이후 실시예에 나타낸다; 본 출원의 범위 내에서 상대적 값은 실질적으로 0 이외의 다른 값이며, 0과는 상이할 수 있고, 즉 사용된 분석의 파라미터에 따라서 결정된다). 본원에서 사용된 건강한 또는 정상 피험자는 암, 종양, 악성물 또는 증식성 질병이 없는 피험자를 의미하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 진단 방법은 한 샘플에서 여러 항원-자가항체 복합체를 측정하는 것과 관련하여 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 샘플은 적어도 2개의 알리쿼트로 나뉠 수 있으며, 여기 정의된 대로 항원-인식 항체에 대해 조사될 적합한 항원의 수와 알리쿼트의 수를 같게 한다. 따라서, 3개의 항원이 시험되어야 한다면, 샘플은 3개의 알리쿼트로 나뉘고, 4개의 항원이 시험되어야 한다면, 샘플은 4개의 알리쿼트로 나뉜다. 수행될 특정한 면역분석에서 이러한 분할이 필요할 경우에도 샘플이 알리쿼트로 나뉠 수 있다. 분할된 경우, 방법의 후속 단계들은 각 알리쿼트에 대해 병행하여 수행될 수 있고, 각 샘플에 대해 얻어진 항체-항원 복합체의 결과가 비교되고, 페어형 분석 또는 어떤 다른 적합한 통계적 분석에 의해서 분석된다.
다음에, 피험자의 샘플에 대해 얻어진 결과가 정상(건강한) 집단에 대해 이용가능한 또는 얻어진 결과와 비교될 수 있다. 시험된 샘플의 결과가 정상 집단에 대해 확립된 값과 상이할 경우, 상기 피험자는 암으로 양성 진단된다.
대안으로서, 본 발명의 진단 방법은, 예를 들어 Gannot et al(Gannot et al. (2005) Layered Peptide Array - High-Throughput antibody screening of clinical samples. J. Mol. Diagn. Vol.7:427-436)에 설명된 층상 펩티드 어레이를 사용하여 고 처리량 규모로 수행될 수 있으며, 이것은 한 샘플 중에 존재하는, 심지어 몇 개의 샘플 중에 존재하는 다수의 항원-인식 항체에 대한 동시 시험을 허용한다.
다른 선택사항은 다중 면역분석을 사용하는 것이다. 시험될 상이한 항원들이 다양한 상이한 표지, 예를 들어 상이한 색이나 상이한 형광 염료로 표지될 수 있고, 이것이 상이한 파장에서 검출된다. 샘플을 상이한 항원과 함께 인큐베이션하는 단계 후에, 상이한 복합체의 존재에 대해서 샘플이 분석된다. 복합체의 정량은 항원이 고체상, 플레이트에 결합된 채로 제시될 때는 ELISA에 의해, 또는 항원이 용액 중에 제시될 때는 FACS에 의해 이루어질 수 있다. ELISA 및 FACS의 표준 프로토콜이 여기 설명되며, 당업자에게 잘 알려져 있다.
종양 지시 자가항체의 검출에 필요한 항원은 항원으로서 작용할 수 있는 전체 세포(종양의); 그 산물이 항원으로서 사용될 수 있는 세포성 막; 분리된, 또는 재조합 생산된(이것은 일반적으로 세포, 박테리아, 효모, 파지를 형질전환할 수 있는 벡터에 삽입된 구성물로부터 제조된다), 또는 합성 생산된 종양-관련 단백질(또는 그것의 단편)을 포함하여 몇몇 형태를 취할 수 있다. 적합한 종양 항원의 특정한 예들이 본원의 표 1, 5, 11 및 도 8에 상세히 설명된 항원들이다.
본원에 인용된 대로, 용어 종양-특이적 단백질, 종양-특이적 항원, 종양 항원, 종양-관련 항원 및 이들의 변형들은 상호 교환하여 사용된다.
본 발명의 방법의 검출 시험 결과 분석의 밑바탕이 되는 기초적 컴퓨터 방법은 수신자 판단 특성(ROC)이다(http://www.medcalc.be/manual/roc.php). 이 방법에 의해서, 정상 사례로부터 질환 사례를 구별할 수 있는 시험의 진단 성능, 또는 시험의 정확도가 (ROC) 곡선 분석을 이용하여 평가된다(Metz C.E. (1978) Seminars in Nuclear Medicine, 8, 283-298; Zweig M.H. & Campbell G. (1993) Clin. Chem. 39, 561-577). 또한, ROC 곡선은 둘 이상의 연구실 또는 진단 시험의 진단 성능 비교에도 사용될 수 있다(Griner P.F., Mayewski R.J., Mushlin A.I., Greenland P. (1981) Annals of Internal Medicine, 94, 555-600). 질환을 가진 한 집단과 질환이 없는 다른 집단으로 이루어진 두 집단에서 특정 시험의 결과를 고려할 때, 두 그룹의 완전한 분리는 거의 관찰되지 않고, 실제로 시험 결과의 분포가 중첩된다. 두 집단을 구별하기 위해 선택되는 모든 가능한 컷오프 포인트 또는 기준값에 대해서, 일부 경우에는 질환이 양성으로 정확히 분류되지만(TP = 참 양성분), 일부 경우에는 질환이 음성으로 분류되기도 한다(FN = 거짓 음성분). 한편, 아래 표에 도식적으로 나타낸 대로, 질환이 없는 일부 경우는 음성으로 정확히 분류되지만(TN = 참 음성분), 질환이 없는 일부 경우가 양성으로 분류되기도 한다(FP = 거짓 양성분).
다음의 통계적 용어들이 정의될 수 있다:
- 감도: 질환이 존재할 때 시험 결과가 양성일 확률(참 양성률, 백분률로 표시된다) = a/(a+b)
- 특이성: 질환이 존재하지 않을 때 시험 결과가 음성일 확률(참 음성률, 백분률로 표시된다) = d/(c+d)
- 양성 확률비: 질환이 존재할 때의 양성 시험 결과의 확률과 질환이 부재할 때의 양성 시험 결과의 확률 사이의 비, 즉 = 참 양성률/거짓 양성률 = 감도/(1-특이성)
- 음성 확률비: 질환이 존재할 때의 음성 시험 결과의 확률과 질환이 부재할 때의 음성 시험 결과의 확률 사이의 비, 즉 = 거짓 음성률/참 음성률 = (1-감도)/특이성
- 양성 예측값: 시험이 양성일 때 질환이 존재할 확률(백분률로 표시된다) = a/(a+c)
- 음성 예측값: 시험이 음성일 때 질환이 존재하지 않을 확률(백분률로 표시된다) = d/(b+d)
더 높은 기준값이 선택되면, 특이성이 증가할수록 거짓 양성률이 감소하고, 다른 한편으로 참 양성률과 감도도 감소한다.
더 낮은 기준값이 선택되면, 참 양성률과 감도가 증가한다. 다른 한편으로, 거짓 양성률도 증가하고, 따라서 참 음성률과 특이성이 감소한다.
수신자 판단 특성(ROC) 곡선에서, 참 양성률(감도)은 상이한 컷오프 포인트에서 거짓 양성률(100-특이성)의 함수로 플롯팅된다. ROC 플롯 상의 각 포인트는 결정된 특정한 역치에 상응하는 감도/특이성 쌍을 표시한다. 완벽한 구별을 제공하는 시험(두 가지 분포가 겹치지 않는)은 ROC 플롯이 상부 왼쪽 코너를 통과하여 지나간다(100% 감도, 100% 특이성). 따라서, ROC 플롯이 상부 왼쪽 코너에 가까울수록 시험의 전체적인 정확성이 더 높다(Zweig & Campbell, 1993, ibid.).
실시예 3은 건강한(음성) 피험자와 병에 걸린(양성) 시험된 피험자를 구별할 수 있는 2벌 또는 3벌(또는 다른 항원 하위군)의 항원의 설계에 채용될 수 있는 일반적인 전략을 예시한다. 본 발명의 진단 방법과 키트는 주치의의 필요에 따라서 특이성과 감도를 다르게 하여 설계될 수 있다는 것이 기억되어야 하며, 이것은 질환의 성질, 시험될 환자, 역학적 및 통계적 정보 등등에 기초하여 결정된다. 예로서, 매우 치명적인 타입의 암인 난소 암종을 진단하기 위해서는 거짓 양성의 수가 많아지는 경향이 있다 하더라도 감도가 더 높은 것, 즉 거짓 음성의 수가 적은 것이 가장 중요하며, 주치의는 가장 민감한 시험을 요구한다. 다른 한편, 예를 들어 덜 치명적인 유방암의 경우, 특이성이 더 높은 것, 즉 거짓 양성의 수가 적은 것이 더욱 중요할 수 있다. 상기 언급된 대로, 특정한 선호도와 특이성 대 감도의 요구에 따라서 역치가 결정될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 분석통계 방법은 특정한 시험의 요구에 대답할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 구체예는 본 발명의 진단 방법을 위한 항원을 선택하기 위한 방법 및 수단을 제공하며, 이들은 적합한 분석 수단과 함께 특이적으로 설계된 정확하고 신뢰성 있는 진단 시험을 제공한다. 어떤 구체예에서, 특이적으로 설계된 정확하고 신뢰성 있는 진단 시험이 실시예 8에 제공된다.
본 발명을 설명하기 위해서 본원에서 사용된 "종양", "암", "악성 증식성 장애" 및 "악성물"은 모두 조직이나 장기의 과다증식과 동등하게 관련된다. 조직이 림프 시스템이나 면역 시스템의 일부인 경우, 악성 세포는 순환 세포의 비-고상 종양을 포함할 수 있다. 다른 조직이나 장기의 악성물은 고상 종양을 만들 수 있다. 일반적으로, 비-고상 및 고상 종양은, 예를 들어 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종이다.
암 및 종양은, 제한은 아니지만, 골수성 백혈병, 예를 들어 만성 골수성 백혈병, 화농을 동반한 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 호염기구가 증가하는 급성 비림프구성 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 호산구를 동반한 급성 골수단구성 백혈병, 악성 림프종, 예를 들어 버킷병, 비호지킨병, 림프구성 백혈병, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 고상 종양, 예를 들어 양성 수막염, 침샘의 혼성 종양, 입술과 구강, 인두, 후두, 부비동의 종양, 결장 선종, 선암종, 예를 들어 소세포 폐암, 신장, 자궁, 전립선, 방광, 난소, 결장, 육종, 지방육종, 점액종, 활액 육종, 횡문근육종(폐포), 골격외 점액종 연골육종, 유잉 육종을 포함하며, 다른 것들은 고환 및 난소 미분화세포종, 망막모세포종, 윌름씨 종양, 신경모세포종, 악성 흑색종, 중피종, 유방, 피부, 전립선 및 난소의 암, 눈꺼풀의 암종, 결막의 암종, 결막의 악성 흑색종, 포도막의 악성 흑색종, 망막모세포종, 누선의 암종, 안구, 뇌, 척추, 혈관계의 육종, 혈관육종 및 카포시 육종을 포함한다.
자가항체의 검출 및 암의 진단을 위해 본원에 설명된 방법은 암의 어떤 단계에서도 적합할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 유방암의 진단에 가장 유리한 것으로 판명되며, 위험한 수준의 방사선을 이용하고, 환자에게 상당한 불편을 야기하며, 비교적 높은 정도의 거짓 양성 결과(많은 환자에게 추가의 생검을 제출하도록 하여 불필요한 불안을 일으키는데, 이것은 거짓 양성 결과의 사례에서 아주 많다)를 나타내는 유방 뢴트겐 조영법에 비해서 유리하다. 본 발명에서 설명된 진단 방법은 간단한 혈액 검사에 기초하며, 거짓 양성뿐만 아니라 거짓 음성 결과가 발생할 확률이 훨씬 더 적고, 따라서 감도와 특이성이 높은 방법이다. 본 발명의 방법의 특이성과 감도를 평가하는 접근법이 실시예 3에 설명된다. 현재 마크로 수준의 진단 도구로서 유방 뢴트겐 사진, 디지털 직장 검사(DRE) 및 초음파(유방암, 전립선암 및 난소암의 경우)는 의심스러운 종양 덩어리가 육안으로 검출할 수 있는 크기까지 이미 발달한 후에야 암을 진단할 수 있으며, 결국 환자의 생존율이 저하되고, 삶의 질이 감소한다. 예를 들어, 유방암의 경우, 미국에서만 매년 약 3000만 건의 유방 뢴트겐 조영 과정이 수행되고, 의심되는 유방 병소를 가진 여성을 대상으로 100만 건이 넘는 외과적 유방 생검이 수행된다.
본원에서 정의된 "샘플"은 유기체로부터 얻어진 어떤 샘플을 말한다. 생물학적 샘플의 예는 체액 및 조직 견본을 포함한다. 샘플의 출처는 혈액, 혈청, 혈장, 침, 가래, 젖, 고름, 조직 부스러기, 세척액, 소변, 림프절 같은 조직 등의 생리학적 매체로부터 유래될 수 있다. 조직 견본은 비장, 림프절 및 어떤 림프구-함유 조직의 생검을 포함한다. 조직 샘플은 종양 자체의 생검을 포함한다. 바람직한 샘플은 혈장 샘플이다.
또한, 본 발명은 암 진단을 위한 키트를 제공한다. 필수적으로, 키트는 피험자의 샘플에서 적합한 항원-자가항체 복합체의 존재를 검출할 수 있는 시약을 제공하며, 상기 항체는 본원에 정의된 적합한 항원, 또는 그것의 면역반응성 단편과 특이적으로 반응한다. 키트는 고체 지지체에 결합될 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있는 적어도 2개 이상의 적합한 항원, 항원-인식 자가항체와 반응성인(또는 결합하는) 2차 항체 및 항원-인식 항체와 2차 항체의 반응/결합을 검출하기 위한 시약과 사용 설명서를 포함한다.
키트는 본질적으로 피험자에서 적어도 2개의 항원-자가항체 복합체를 검출할 수 있도록 설계되지만, 물론 3개 이상의 복합체, 예를 들어 3벌의 복합체의 검출을 위해 필요한 시약을 포함할 수도 있다. 피험자는 암 환자, 또는 건강한 개체일 수 있다.
한 구체예에서, 이러한 키트는 ELISA 키트와 같은 항체 포착 분석 키트이며, 이것은 고체 지지체, 항원, 적합한 경우 2차 항체, 및 상기 설명된 검출가능한 부분, 효소 기질 및 착색 시약과 같은 어떤 다른 필요한 시약을 포함한다. 대안으로서, 항체 포착 진단 키트는 상기 설명된 성분과 시약을 일반적으로 포함하는 면역블롯 키트이다. 본 발명의 진단 키트에 포함되는 특정 시약 및 다른 성분들은 키트에서 실행되는 특정한 진단 방법에 따라서 본 분야에서 이용할 수 있는 것들로부터 선택될 수 있다. 이러한 키트는 피험자로부터 얻어진 조직 또는 체액, 특히 혈장과 같은 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 항체를 검출하는데 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 키트는 혈액 샘플을 수집하기 위한 진공 밀봉 용기, 및 그로부터 혈장이나 혈청을 얻기 위한 수단을 더 포함할 수 있다.
사용 설명서는 연구원을 위한 것은 물론, 표준화 곡선, 본원에 설명된 기준비 또는 상대비, 적용되는 희석률 등을 확립하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 암의 존재에 대해 평가되는 진단된 피험자에게 진단을 배정하는데 사용되는 컴퓨터 실행 진단 방법(100)에 관한 것이다. 암은 유방암이나 난소암 중 하나일 수 있다. 다른 구체예에서, 암은 결장암, 폐암 또는 전립선암이다.
이제 본 발명의 구체예에 따른 컴퓨터 실행 진단 방법(100)을 도시한 도 9를 참조한다. 이 방법은 상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 수신하는 단계를 포함하며, 이때 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 상기 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 한다. 신체 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플일 수 있다.
또한, 진단 방법(100)은 상대적 기여 인자 행렬을 얻는 단계를 포함할 수 있으며, 상대적 기여 인자 행렬은 적어도 2개의 정해진 상대적 기여 인자(110)를 포함한다. 상대적 기여 인자의 각 쌍은 신체 샘플 중의 2개의 자가항체들 사이의 예측된 신호 강도 관계를 한정한다. 2개의 항체는 이들을 항원-항체 복합체를 형성하는데 적합한 항원과 접촉시킴으로써 측정되고, 항원은 상대적 기여 인자를 특징으로 한다. 두 자가항체 사이의 예측된 신호 강도 관계를 사용하여 진단된 피험자가 암에 걸린 것을 확인할 수 있다.
The values are the relative contribution factor matrix are fixed or constant for providing the diagnostic results.
측정된 데이터 및 상기 상대적 기여 인자 행렬의 프로세싱(130)은 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계를 포함한다. 이것은 정해진 상대적 기여 인자에 따라서 상기 항원-자가항체 복합체 수준, 즉 측정 데이터를 각각 조정함으로써 수행된다.
조정은 상대적 기여 인자(예를 들어, (bi), 항원(i)에 대해)와 연계하여 측정된 데이터(예를 들어, (oi))를 증가시키거나 또는 감소시킴으로써 수행될 수 있다. 증가 또는 감소는 상대적 기여 인자의 크기에 비례할 수 있다. 비제한적 예로서, 상대적 기여 인자의 값이 비교적 높은 경우, 측정된 데이터는 실질적으로 증가되며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 다른 비제한적 예로서, 각 상대적 기여 파라미터는 다음의 값 조정에 의해서 계산될 수 있다:
(여기서, PARAMi, 상대적 기여 파라미터(i)).
컴퓨터 실행 진단 방법(100)은 시험 함수 (x)=f(상대적 기여 파라미터)의 결과 (x)를 결정하는 단계를 포함한다(140). 상대적 기여 파라미터가 시험 함수 또는 판별 함수 (x)의 입력값이다. 어떤 구체예에서, 판별 또는 시험 함수는 다음과 같다: 
진단 방법(100)은 상기 함수 결과 (x)를 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치와 비교하는 단계(150)를 포함하며, 여기서 상기 (x)가 상기 역치보다 높으면, 상기 시스템 변수가 진단된 환자가 암에 걸린 것에 따른 상태에 배정된다. 다시 말해서, 진단된 피험자는 x > Z(미리 정해진 역치 컷오프 포인트)일 경우 "암에 걸려 있을 가능성이 높은" 것에 배정되거나 분류되고, 그렇지 않으면 "건강한" 것으로 배정된다.
방법(100)은 선택적으로 진단된 피험자가 암에 걸린 것에 따른 상태에 진단된 피험자가 배정되는 것을 지시하는 결과를 출력하는 단계를 포함한다.
또한, 암의 존재에 대해 평가되는 진단된 피험자에게 진단을 배정하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품이 제공된다. 이 프로그램은 그 안에 저장된 컴퓨터 프로그램 코드를 가진 컴퓨터 판독가능한 매체에 제공될 수 있으며, 프로그램 코드가 프로세서에 의해 실행될 때 방법(100)이 수행된다.
또한, 본 발명은 도 10에 도시된 대로 암의 진단을 위해 운영되는 진단 모니터링 시스템(200)을 제공한다. 암은 유방암이나 난소암 중 하나일 수 있다. 다른 구체예에서, 암은 결장암, 폐암 또는 전립선암이다.
모니터링 시스템은 암의 존재에 대해 평가되는 진단된 피험자에게 진단을 배정한다. 시스템(200)은 상대적 기여 인자 행렬을 보유하기 위한 레지스터(200)를 포함한다. 레지스터가 다양한 방식으로 실행될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 비제한적 예로서, 레지스터는 프로세서 기반 시스템 또는 컴퓨터 환경의 레지스터일 수 있다. 대안으로서, 레지스터는 RAM과 같은 컴퓨터 시스템인 할당 메모리에 의해서 얻어질 수 있으며, 여기에 상대적 기여 인자 행렬이 저장되거나, 다시 말하면 등록된다. 또한, 대안으로서, 레지스터는 EPROM과 같은 읽기전용 메모리(ROM)에 의해 사용할 수 있으며, 여기에 상대적 기여 인자 행렬이 영구적으로 저장되거나, 다시 말하면 등록된다.
The values are the relative contribution factor matrix are fixed or constant for providing the diagnostic applications.
상대적 기여 인자 행렬은 진단된 피험자에서 암의 발생에 대한 종양-관련 항원의 상대적 기여도를 결정하는데 사용되는 적어도 2개의 정해진 상대적 기여 인자를 포함한다.
상대적 기여 인자 행렬은 상기 진단된 피험자에서 암의 발생을 특정하는 2개 이상의 항원-항체 복합체 수준의 비례 관계를 포함한다.
결정은 피험자의 신체 샘플에서 자가항체 수준을 측정함으로써 수행되며, 이 측정은 항원-자가항체 복합체 수준의 측정이다. 신체 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플일 수 있다.
상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 신체 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-자가항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 수신하기 위해서 입력 모듈(210)이 사용된다. 이들 항원 또는 TAA는 진단된 피험자에서 암의 존재에 대한 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하며, 이것은 레지스터에 저장된다.
상대적 기여 인자 행렬과 함께 측정된 데이터를 프로세싱하기 위하여 프로세서 모듈(240)이 사용된다. 프로세싱은 측정된 항원-자가항체 복합체 수준에 대해 상대적 기여 파라미터를 결정함으로써 수행된다. 각 항원-자가항체 복합체 수준은 레지스터에 저장된 상대적 기여 인자에 따라서 조정된다(즉, 값 보정).
조정은 상대적 기여 인자(예를 들어, (bi), 항원(i)에 대해)와 연계하여 측정된 데이터(예를 들어, (oi))를 증가시키거나 또는 감소시킴으로써 수행될 수 있다. 증가 또는 감소는 상대적 기여 인자의 크기에 비례할 수 있다. 비제한적 예로서, 상대적 기여 인자의 값이 비교적 높은 경우, 측정된 데이터는 실질적으로 증가되며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 다른 비제한적 예로서, 각 상대적 기여 파라미터는 다음의 값 조정에 의해서 계산될 수 있다:
(여기서, PARAMi, 상대적 기여 파라미터(i)).
조정 과정 후, 시험 함수 (x)=f(상대적 기여 파라미터)의 결과 (x)가 결정된다. 컴퓨터 실행 진단 방법(100)은 시험 함수 (x)=f(상대적 기여 파라미터)의 결과를 결정하는 단계를 포함한다(140). 상대적 기여 파라미터가 시험 함수 또는 판별 함수 (x)의 입력값이다. 어떤 구체예에서, 판별 함수 또는 시험 함수는 다음과 같다: 
만일 (x)가 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치보다 높으면, 시스템 변수(250)가 진단된 피험자가 암에 걸린 것에 따른 값 또는 상태에 배정된다.
레지스터(220)는 2개 이상의 상대적 기여 인자를 저장할 수 있다. 상대적 기여 인자의 수는 의사나 다른 사람이 요구하는 진단되는 질환 또는 암 타입에 대한 감도 및 특이성에 따라서 미리 결정된다.
항원-자가항체 복합체 수준의 측정값을 얻거나 또는 수신하는 것은 신체 샘플의 제 1 알리쿼트가 적합한 버퍼 용액으로 제 1 희석률로 희석되어 얻어져서 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공할 수 있도록 수행될 수 있다. 제 1 희석률은 1:5 내지 1:2000의 범위일 수 있다. 예시적인 희석률은 1:5, 1:8, 1:1O, 1:16, 1:24 등이다. 항원-자가항체 복합체 수준의 측정값을 얻거나 또는 수신하는 것은 신체 샘플의 제 2 알리쿼트가 적합한 버퍼 용액으로 제 2 희석률로 희석되어 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공할 수 있도록 수행될 수 있다.
제 2 희석률은 제 1 희석률과 상이할 수 있다. 이와 같이, 2개의 측정가능한 항원-항체 복합체 수준이 상이한 희석률에서 2개의 상이한 항원으로부터 얻어진다.
제 1 희석률과 제 2 희석률은 상기 2개의 상이한 항원의 상대적 희석비 또는 상기 2개의 상이한 항원의 비례적 크기 관계를 한정한다.
이 기술은 컴퓨터 또는 프로세서 기반 환경과 같은 다양한 컴퓨팅 또는 프로세싱 환경에 적용될 수 있다. 이 기술은 하드웨어, 소프트웨어, 또는 이 둘의 조합에서 실시될 수 있다. 이 기술은 프로세서, 프로세서에 의해 판독가능한 저장 매체, 적어도 하나의 입력 장치 및 하나 이상의 출력 장치를 각각 포함하는 고정형 컴퓨터와 같은 프로그램가능한 기기, 또는 유사한 장치에서 실행되는 프로그램에서 구현될 수 있다. 프로그램 코드가 입력 장치를 사용하여 입력된 데이터에 적용되어 설명된 기능을 수행하고, 출력 정보를 생성한다. 출력 정보는 하나 이상의 출력 장치에 적용된다.
각 프로그램은 프로세싱 기반 시스템과 통신할 수 있는 하이 레벨 과정 또는 목적 지향 프로그래밍 언어에서 구현될 수 있다. 그러나, 프로그램은 원한다면 어셈블리 또는 기계 언어로 구현될 수도 있다.
다른 구체예에서, 방법 및 시스템은 네트워크 컴퓨팅 시스템 및/또는 환경에서 이용될 수 있다. 다수의 컴퓨터 시스템이 로컬 에어리어 네트워크(LAN), 또는 와이드 에어리어 네트워크(WAN)와 같은 네트워크를 통해 함께 연결될 수 있다. 따라서, 방법(100)은 전체적으로 또는 그것의 기능적 단계로서(110, 120, 130, 140, 150, 또는 이들의 어떤 조합), 원격 네트워크 컴퓨터 또는 몇 개의 조합에 의해서 실시될 수 있다. 시스템(200)의 어떤 기능적 부분도 컴퓨터 네트워크를 통해 제공되거나 또는 연결될 수 있다. 비제한적 예로서, 레지스터는 원격 레지스터일 수 있으며, 이것은 네트워크를 통해 그 안에 저장된 인자 행렬을 제공한다. 또한, 프로세서 모듈(240)도 네트워크를 통해 프로세서 서비스를 원격 제공할 수 있다.
이러한 프로그램은 각각 저장 매체 또는 장치, 예를 들어 컴팩트 디스크 읽기전형 메모리(CD-ROM), 하드 디스크, 자기 디스켓 또는 유사한 매체나 장치에 저장될 수 있으며, 이것은 일반적인 또는 특수 목적의 프로그램가능한 기계에 의해서 판독될 수 있고, 저장 매체 또는 장치가 컴퓨터에 의해서 판독되면 기계가 구성되고 운영되어서 본원에 설명된 과정이 수행될 수 있다. 또한, 이 시스템은 프로그램과 함께 구성된 기계-판독가능한 저장 매체로서 구현될 수 있으며, 이 경우 저장 매체는 기구가 특수하고 미리 규정된 방식으로 운영될 수 있도록 구성된다.
오래된 특허법 규정에 따라서 본 명세서와 첨부된 청구항에 사용된 단수형 "한" 및 "그"는 문맥상 분명히 다른 의미가 없다면 일반적으로 "적어도 하나", "하나 이상" 및 다른 복수의 언급을 의미한다. 따라서, 예를 들어 "한 항원"은 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다.
본 명세서와 이후 청구항 전체에서, 문맥상 다르지 않다면, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형들은 서술된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계들의 그룹의 포함을 내포하고, 어떤 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계들의 그룹의 배제는 내포하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이후의 실시예는 본 발명의 양태들을 수행하는데 있어서 본 발명자들에 의해서 사용된 기술을 대표한다. 이들 기술은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 구체예를 예시하는 것임이 인정되어야 하며, 본 명세서에 비추어 당업자는 본 발명의 사상 및 의도된 범위로부터 벗어나지 않고 다수의 변형이 이루어질 수 있음을 인정할 것이다.
실시예
실험 과정:
분자 생물학에서의 일반적인 방법
분자 생물학 분야의 많은 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으므로 여기에 상세히 설명하지 않는다. 이러한 방법은 PCR, cDNA의 발현, 사람 세포의 트랜스펙션 등을 포함한다. 이러한 방법을 설명하는 교과서로는, 예를 들어 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN: 0879693096; F.M. Ausubel (1988) Current Protocols in Molecular Biology, ISBN: 047150338X, John Wiley & Sons, Inc.가 있다. 또한, 예를 들어 웨스턴 블롯과 같은 많은 면역학적 기술도 당업자에게 잘 알려져 있으므로 각각의 경우마다 여기서 상세히 설명하지 않는다. 예를 들어, Harlow and Lane (1988) Antibodies' a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory를 참조한다.
ELISA
프로토콜
효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)은 항체의 특이성과 간단한 효소 분석의 감도를 조합하며, 용이하게 분석되는 효소에 결합된 항체나 항원을 이용한다. ELISA는 항원 또는 항체 농도의 유용한 측정값을 제공할 수 있다. ELISA는 5 단계 과정이다: 1) PBS 중에 희석된 항원으로 마이크로타이터 플레이트 웰을 코팅하고, 4℃에서 인큐베이션하고 세척한다; 2) PBS 중의 스킴 밀크 중에서 미결합 부위를 모두 차단하여 거짓 양성 결과를 방지하고, 1시간 인큐베이션하고 세척한다; 3) 웰에 항체를 첨가하고, 1시간 인큐베이션하고 세척한다; 효소에 콘쥬게이트된 항-사람 IgG를 첨가하고, 1시간 인큐베이션하고 세척한다; 5) 기질과 효소를 반응시켜 착색 산물이 생성되면, 이것은 양성 반응임을 지시한다.
연속 희석
샘플은 항원과 접촉되기 전에 연속 희석될 수 있다. 어떤 시험된 피험자의 경우, 주어진 분석 장치의 검출 한계를 극복하기 위해서 샘플의 연속 희석이 필요할 수 있다. 결정될 적어도 2개의 항원-항체 복합체가 동일한 희석률에서 측정될 수 있다면, 항원-항체 복합체 수준의 비는 도 1a에 도시된 대로 직접 측정에 의해서 계산될 수 있다.
복합체 중 하나가 다른 것보다 상당히 더 농축된 경우에는, 두 복합체에 동일한 희석을 사용하는 것이 불가능하다. 도 1b에 도시된 예는 복합체 수준의 비가 장치 한계로 인해서 결정될 수 없는 경우이다(3>OD>0). 이런 경우, 적어도 2개의 상이한 희석 또는 희석률(각 복합체에 각각 적합한)의 연속 희석에 의해서 이론선 [복합체 농도] = f(희석)을 계산할 수 있거나, ELISA 실험에서는 [OD] = f(희석)을 계산할 수 있다. 이 선을 사용하여 외삽에 의해서 임의의 희석에 대한 이론적 OD가 계산될 수 있다(도 1c). 외삽 후, 두 복합체의 비가 동일한 이론적 희석에서 결정될 수 있다.
펩티드 항원
표 1 및 2는 본 연구를 위해 선택된 일부 특정 항원들을 제시한다.
[표 1]
표 1은 LDPE051, LDPE069, LDPE064 및 LDPE070의 서열이고, 펩티드는 Biomer Technology에서 합성되었다.
실시예
1
잠재적 유방암 및 난소암 환자의 진단
본 발명은 면역 시스템을 통해서 피험자에서 종양을 검출하는 간단한 방법을 제공한다.
시험된
피험자
- 유방 뢴트겐 조영 결과가 음성인 여성은 건강한 대조군(CT)으로 간주되었다; n=12(LDPe051 및 LDPe069), n=6(LDPe064 및 LDPe070).
- 암성 유방 생검 또는 병리검사를 나타낸 여성은 유방암 환자(BC)로 간주되었다; n=10(LDPe051 및 LDPe069), n=7(LDPe064 및 LDPe070). 병리검사에서 검증된 난소암이 나타난 여성은 난소암 환자(OC)로 간주되었다; n=8(LDPe051 및 LDPe069), n=7(LDPe064 및 LDPe070).
건강한 대조군과 암 환자(유방암 및 난소암)의 혈액 샘플을 동의하에 채혈했다. 실온에서 3000x g로 10분간 원심분리한 후 헤파린 튜브를 사용하여 혈액 샘플로부터 혈장을 수집했다.
ELISA 플레이트를 4개의 상이한 항원(LDPe051 - SEQ ID NO. 3; LDPe069 - SEQ ID NO. 7; LDPe064 - SEQ ID NO. 4; LDPe070 - SEQ ID NO. 6)으로 코팅하고, 1% 스킴밀크로 차단했다.
혈장을 PBS 중의 5% 스킴밀크로 희석하고(1:30-1:4000), 4개의 상이한 ELISA 웰에 로딩했다. 각 웰은 상이한 항원(LDPe051, LDPe064, LDPe069, LDPe070)을 함유하며, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다.
플레이트를 0.1% PBST로 세척하고, 염소-항 사람 Ig HRP 콘쥬게이트(차단 버퍼에서 1:5000으로 희석)를 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다.
플레이트를 0.05% PBST로 세척하고, TMBE를 각 웰에 첨가했다.
30분 후에 0.5M H2SO4를 사용하여 색 전개를 중단시키고, 450nm에서 OD를 측정했다.
두 건강한 대조군(CT1, CT2)에서 얻어진 결과의 샘플을 표 2 및 도 2a에 제시한다.
[표 2]
표 2는 CT1 및 CT2에서 4개의 상이한 항원(LDPE051, LDPE064, LDPE069, LDPE070)에 대한 3가지 상이한 희석의 OD 결과 및 두 가지 쌍(LDPEp51_LDPE069 및 LDPE064_LDPE070)에 대한 계산된 비율을 나타낸다.
No. 2의 희석의 경우, 다음의 결과가 해당 샘플에 대해 얻어졌다(표 3):
[표 3]
OCx - 난소암 환자 No. x
CTx - 건강한 대조군 No. x
BCx - 유방암 환자 No. x
상기 결과를 그래프로 그렸다(도 2b).
도 2b에 도시된 대로, LDPe051와 LDPe069의 비율은 유방암 환자와 건강한 대조군에서 상이하다(비율이 <0.8이면 유방암 환자임을 지시하고, 비율이 >0.8이면 건강한 대조군임을 나타낸다). 난소암 환자와 건강한 대조군에서는 동일한 두 항원의 비율이 동일했다(도 2b).
유방암에 대한 ROC 계산 - 두 항원의 비율에 대한 결과를 오름차순으로 정렬했고, 각 비율 포인트에서, 다음의 값이 계산되었다. 데이터를 표 7에 제시하고, 도 2c에 도시한다.
역치 값은 0.849인 것으로 결정되었다 - 이 값 아래에서 모든 테스트는 참 음성(건강체)이었고, 이 값 위에서 모든 테스트는 참 양성(유방암)이었다.
도 2d에 도시된 대로 각 역치 포인트에 대해 ROC 곡선을 그렸다.
동일한 항원에 대한 유사한 계산을 난소 암종 환자(OC)와 대조군(CT)에 대해서 수행했다. 결과를 표 8에 제시한다(도 2e).
볼 수 있는 대로, LDPe051와 LDPe069의 항원 쌍을 사용했을 때, 건강한 피험자와 난소암 환자는 잘 분리되지 않았다(이 경우 PPV와 NPV가 높다). 이것은 도 2f에서도 볼 수 있다(난소암의 검출을 위한 LDPe051_LDPe069의 ROC 곡선).
LDPe064와 LDPe070의 항원 쌍을 사용한 경우에는 다음의 결과가 얻어졌다(표 4).
[표 4]
OCx - 난소암 환자 No. x
CTx - 건강한 대조군 No. x
BCx - 유방암 환자 No. x
상기 결과를 그래프로 그렸다(도 2g).
도 2g에 도시된 대로, LDPe064와 LDPe070의 비율은 난소암 환자와 건강한 대조군에서 상이하다(비율이 >0.85이면 난소암 환자임을 지시하고, 비율이 <0.8이면 건강한 대조군임을 나타낸다). 유방암 환자와 건강한 대조군에서는 동일한 두 항원의 비율이 동일했다(도 2g).
난소암에 대한 ROC 계산 - 두 항원의 비율에 대한 결과를 오름차순으로 정렬했고, 각 비율 포인트에서, 표 9에 제시된 값이 계산되었다(도 2h).
역치 값은 0.803인 것으로 결정되었다 - 이 값 아래에서 모든 테스트는 참 음성(건강체)이었고, 이 값 위에서 모든 테스트는 참 양성(유방암)이었다.
도 2i에 도시된 대로 각 역치 포인트에 대해 ROC 곡선을 그렸다.
동일한 항원에 대한 유사한 계산을 유방암 환자(BC)와 대조군(CT)에 대해서 수행했다. 결과를 표 10에 제시한다(도 2j).
볼 수 있는 대로, 이들 항원을 사용했을 때 분리는 잘 이루어지지 않았다(이 경우 PPV와 NPV가 높다).
표 10의 데이터에 대해 얻어진 ROC 곡선을 도 2k에 도시한다(유방암과 건강한 대조군의 분리를 위한 LDPE064_LDPe070).
AUC=1인 상기 예에서, 이 비율의 역치 포인트는 100% 감도 및 100% 특이성의 포인트로서 잘 한정되었다.
AUC<1인 다른 경우, 이 비율의 역치 포인트는 임상적 요구(고 감도 및 고 특이성)에 따라서 결정될 것이다.
실시예
2
본 발명의 방법에 따른 잠재적 유방암 환자의 진단 평가
생검 전에 유방임이 의심되는 시험 세트의 피험자로부터 혈액을 채혈하여 혈장을 얻었고, 통계적 고려사항을 참조하여 샘플 규모를 결정했다.
병리학적 생검 결과는 "Bpositive"(암성 샘플) 또는 "Bnegative"(건강한 샘플)로 기록했다.
실시예 1의 과정에 따라서 항원 LDPe051 및 LDPe069의 항원-항체 복합체의 양에 대해 각 샘플을 시험했고, 이들 복합체의 비율을 결정했다.
비율이 >0.8이면 샘플을 "Rnegative"로 지정했다. 비율이 <0.8이면 샘플을 "Rpositive"로 지정했다.
각각의 샘플에 대해서 생검 결과("Bpositive" 또는 "Bnegative")를 비율 결과("Rpositive" 및 "Rnegative")와 비교했다.
각 샘플을 다음과 같이 분류했다.
샘플이 "Bpositive" 및 "Rpositive"이면, 샘플은 참 양성이었다(TP).
샘플이 "Bpositive" 및 "Rnegative"이면, 샘플은 거짓 음성이었다(FN).
샘플이 "Bnegative" 및 "Rpositive"이면, 샘플은 거짓 양성이었다(FP).
샘플이 "Bnegative" 및 "Rnegative"이면, 샘플은 참 음성이었다(TN).
실시예 1에 예시된 대로, 이 시험의 특이성(TN 율) 및 감도(TP 율)를 결정해서 ROC(수신자 판단 특성) 곡선 상에 플롯팅했고, AUC(곡선밑 면적)를 계산했다.
AUC가 0.5보다 현저히 높다면, 이것은 항체 비율과 유방암(BC)의 존재 사이에 어떤 관계가 있음을 나타낸다. 그러나, AUC<0.7이면 임상적 사용에는 불충분한 것으로 간주되어야 한다. AUC가 0.7-0.85인 시험은 다른 과정과 조합하여 잠재적으로 유용하다고 간주되며, AUC>0.85인 시험은 단독으로 적용될 수 있다.
실시예
3
지시/진단 항원 쌍을 확인하는 일반적인 전략
이 실시예는 일반적으로 진단적으로 지시하는 항원의 쌍을 확인하는 전략을 예시하며, 여기서 이들의 항체와의 복합체의 비율이 시험된 피험자에서 암의 존재 유무를 지시할 수 있다.
이 전략은 표 5에 제시된 펩티드/단백질에 기초하여 예시될 것이다.
[표 5]
전체 서열은 표 11에 주어진다.
건강한 개체("참 음성")와, 예를 들어 생검에 의해서 유방암으로 명확히 진단된 개체("참 양성")로부터 혈액 샘플을 채혈하여 혈장을 얻었다. 통계적 평가를 위한 충분한 수의 양성 및 음성 샘플을 수집했다. 각 혈장 샘플에 대해서, 9번의 상이한 ELISA 실험을 수행했으며, 사용된 각 항원은 표 5에 제시된다. 각 샘플에서 9개 항원 각각에 대한 자가항체의 실제 수준을 ELISA 결과로부터 결정했다. 각 개체에 대해 두 복합체의 자가항체 수준의 비율의 모든 가능한 조합을 계산했고, 각 항원 쌍에 대한 각 개체로부터의 비율을 집계하여, 그 결과를 공지된 통계적 방법에 따라서 AUC에 대해 분석했다(실시예 1 참조). 모든 가능한 조합을 계산된 AUC에 따라 정렬했다. 높은 AUC 값을 나타낸 항원 쌍들이 더 진단적으로 합당하며, 50%에 가까운 AUC 값을 가진 쌍들은 훨씬 낮은 값을 가진다. 표 6에서 볼 수 있는 대로, "좋은" 조합과 "나쁜" 조합이 있다(AUC에 따라서). "좋은" 쌍(이러한 쌍에서 비율은 양성 조사대상과 음성 조사대상을 정해진 정도까지, 예를 들어 적어도 80% AUC까지 구별할 수 있다)의 선택은 매우 여러 번의 실험을 수반한다. 이러한 실험은 본원에 상세히 설명된 방법을 따르며(예를 들어, 상기 실시예 1 참조), 통상적인 실험이다. 가장 좋은 쌍이 지시/진단 항원 쌍으로 사용될 수 있다.
각 샘플의 ELISA에 9개의 항원을 모두 사용하면, (9x8)/2개의 상이한 비율 조합이 가능하며, 즉 아래 표 6에 나타낸 대로 36개 쌍의 상이한 항원이 비율 계산에 사용될 수 있다.
[표 6]
x_x1: ELISA에 사용된 제 1 항원
x_x2: ELISA에 사용된 제 2 항원
Ncase: 환자의 수
Ncont: 대조군의 수
AUC: 이 항원-항체 복합체 쌍에 대해 ROC 곡선으로부터 계산된 곡선밑 면적
Chi2e: 통계적 파라미터(χ2)
본 발명의 목적은 "병에 걸린"(암 환자) 피험자와 "건강한" 피험자의 구별을 가능하게 하는 진단 방법을 제공하는 것임이 이해되어야 한다. 특정 구체예에서(실시예 1 및 2에서 예시된 대로), 이 방법은 2벌 또는 3벌의 항원과 함께 형성된 복합체의 광학밀도(OD) 측정에 기초한다. 논리 회귀를 사용하여 잠재적으로 유효한 2벌 및 3벌의 항원을 찾을 수 있다. 테스트 품질은 수신자 판단 특성(ROC) 곡선의 곡선밑 면적(AUC)을 사용하여 평가된다. AUC(예를 들어, Bamber D.J. Math. Psychol. (1975) 12:387-415; Hanley, J.A. and McNeil B.J., Radiology (1982) 143(1):29-36; D'Agostino R.B. et al., Proc. Biometrical Section. Alexandria, VA, USA American Statistical Association, Biometric section: Alexandria VA. (1997) 253-258 참조]는 아직도 모델 성능을 평가하는 가장 유용한 기준이지만, 일부 새로운 제안도 있다[Cook, N.R. Circulation (2007) 115:928-935; Pepe M.S., et al., UW Biostatistics Working paper Series, #289, (2006). http://www. bepress.com/uwbiostat/paper289. accessed 9 March 2007; Pencina M.J., et al., Medicine (2008) 27:157-172]. AUC는 "1-특이성"의 함수로서 테스트의 감도를 제시한다. AUC는 2개의 무작위로 독립적으로 선택된 샘플(하나는 "병에 걸린" 샘플이고, 하나는 "건강한" 샘플)로부터 "병에 걸린" 환자가 더 높은 테스트 값을 가질 확률을 제공한다.
이러한 분석에 기초하면, 제안된 테스트에서 항원으로 사용될 수 있는 무수한 후보들로부터 유효한 특징의 항원 쌍 또는 3벌의 항원이 선택될 수 있다.
도 3a 내지 3i는 적합한 항원을 선택하는 방법을 예시하며, 즉 이러한 항원은, 이들이 샘플에 존재하는 항체와 형성한 복합체들의 정량적인 비율에 기초하여 AUC 분석에 의해서 건강한 피험자와 암 환자를 효과적으로 구별할 수 있다.
도 3a, 3b, 3c, 3d 및 3e는 상기 가능한 조합(표 6)에서 5개의 가장 좋은 쌍을 도시하며, 이들은 집단(건강체 및 환자)을 분리할 수 있는 높은 AUC를 산출하고, 도 3f, 3g, 3h 및 3i는 집단을 분리할 수 없는 낮은 AUC(0.5)를 산출하는 쌍들을 도시한다.
실시예
4
진단 세트에서 항체-항원 복합체 각각에 대한 희석률 및 상대적
희석비의
한정
한편에서는 암의 발생에 대해 각각 상이한 생리학적 기여 또는 다른 기여를 가진 복수의 항원에 대해 특이적 항체-항원 복합체의 측정을 위해 신체 샘플을 분석하고, 다른 한편에서는 집단 전체에서 항체 발현 프로파일의 차등성을 계산하는 진단 방법 및 응용 프로그램이 본원에서 제공된다. 앞서 언급된 대로, 피험자에서 자가항체의 생산은 다른 피험자의 "약한" 자가항체 생산과 비교하여 특정 자가항체가 상대적으로 실질적인 수준일 때 "강한" 것으로 특정될 수 있다.
하기 증명된 대로, 진단적 접근법은 유연성을 가진다. 형성될 수 있는 모든 항체-항원 복합체에 적용할 수 있는 미리 규정된 단일 희석률(또는 일련의 희석 또는 희석률들)로 희석된 신체 샘플에 대해 진단 분석을 수행하는 대신, 진단 분석은 복수의 희석률에서 수행되었다. 그로부터 얻어진 정보의 수집과 통합이 도시된다. 하기 예시된 대로, 동시에 사용되는 모든 항체-항원 복합체에 대해 단일 범위의 희석을 항상 이용할 수 있지는 않았다. 단일 희석률에 따른 분석의 한계는 검출 장치의 기술적 제약을 드러냈다. 따라서, 단일 희석 범위나 희석률은 분석 장치 제한으로 인해서 적용될 수 없었다. 하기 나타낸 대로, 샘플에서 형성된 항체-항원 복합체 중 하나가 매우 높은 OD를 산출했을 경우에는 부정확성이 발생했으며, 사용된 특정한 검출 장지에서 측정될 수 없었다.
따라서, 다음의 실시예에서는 상이한 희석률을 사용하여 항원-자가항체 복합체를 생성했으며, 이들의 수준을 측정할 수 있었다. 본 실시예는 복수의 검출가능한 항원-자가항체 복합체를 가진 분석을 수행하기 위해서 상이한 희석률이 사용될 수 있음을 예시한다.
Ag1(LDPe002) - SEQ ID No. 9, Ag2(LDPeO12) - SEQ ID No. 11, Ag3(LDPrO4l) - SEQ ID No. 21, Ag4(LDPrO77) - SEQ ID No. 23로 표시되는 4개의 상이한 항원을 사용하여 2가지 상이한 방식의 테스트에 의해서 2개의 신체 샘플을 테스트했다.
제 1 방식에서, 샘플을 모든 항원에 대해 동일한 희석(동일한 연속 희석)으로 희석했다("희석 1"에서 시작, 이것은 1:8의 희석률을 표시한다). 이 결과는 표 12에 요약된다. 표 12는 1:8에서 1:256까지의 범위에서 희석을 다르게 하여 항원 Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4의 각각에 대해서 테스트1139 및 테스트1200에서의 OD 판독값을 제공한다. 연속 희석은 모든 항원에 동일했다. 볼드체의 값이 평활화에 적합하다.
제 2 방식에서, 신체 샘플을 몇 개의 알리쿼트로 나누고, 각 항원에 대해 상이하게 연속 희석했다. Ag1의 OD 측정은 1:8의 희석률에서 시작했고, Ag2의 경우 1:32의 희석률에서 시작했고, Ag3의 경우 1:64, Ag4의 경우 1:512의 희석률에서 시작했다. 결과는 표 13에 요약된다. 표 13은 Ag1 - 1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512의 상이한 제 1 희석을 사용한 경우, 항원 Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4에 대한 테스트1139 및 테스트1200에서의 OD 판독값을 제공한다. 볼드체의 값이 평활화 과정에 적합한 데이터이다.
OD 판독값을 평활화했다. 테스트1139의 경우에 볼 수 있는 대로, 제 1 방식에서 수행된 테스트는 평활화가 초기 희석률(1:8)에서 항원의 일부에 대해서는 선택사항이 아니었음을 나타내며, 로우 데이터는 표 12에 설명되었다.
분명히 표 12에 나타낸 복수의 OD 측정값은 신호의 포화를 지시하는 지나치게 높은 신호를 지시한다.
다시 제 1 방식으로 돌아가면, 도 5a는 테스트1139에서 Ag1-Ag4에 대해 얻어진 결과를 제공하는 그래프이며, 이 경우 신체 샘플은 모든 항원에 대해서 1:8에서 시작한 단일 희석률로 희석되었다. 도 5b는 테스트1139에서 Ag1-Ag4에 대해 얻어진 평활화된 결과를 제공한다.
도 6a는 테스트1200에서 Ag1-Ag4에 대해 얻어진 결과를 도시하는 그래프이며, 이 경우 신체 샘플은 모든 항원에 대해서 1:8에서 시작한 단일 희석률로 희석되었다. 도 6b는 테스트1200에서 Ag1-Ag4에 대해 얻어진 평활화된 결과를 도시한다. Ag2, Ag3 및 Ag4는 충분한 데이터 포인트의 부족으로 인해서 제거되었다.
도 5b에서, Ag2 및 Ag4는 충분한 데이터 포인트의 부족으로 인해서 제거되었다. 특히, 항원 Ag2 및 Ag4는 측정된 포인트가 3개 이하로서, OD<2.5이며, 이것은 높은 확실성의 선형 회귀를 얻기에는 불충분했다. 표 14는 테스트1139 및 테스트1200에서 Ag1-Ag4에 대한 평활화 결과를 제공한다. 테스트1139에 대해서 항원 Ag2 및 Ag4에 대해 데이터 포인트가 불충분함은 분명하다.
테스트1200에 대해서, 표 14는 Ag2, Ag3 및 Ag4에 대해 데이터 포인트가 불충분함을 증명한다. 테스트1200의 경우, 로우 데이터가 표 12와 도 6a 및 6b에 설명된다. Ag2, Ag3 및 Ag4는 3개 이하의 측정치를 가지며, OD<2.5로서(아웃라이어의 배제 후), 이것은 높은 확실성의 선형 회귀를 얻는데 불충분했다.
모든 항원에 대해 동일한 희석률을 사용하는 것의 단점을 극복하기 위해서, 신체 샘플을 4개의 상이한 초기 희석으로 희석했다. Ag1에 대한 초기 희석은 1:8이었고, Ag2의 경우 1:32, Ag3의 경우 1:64, Ag4의 경우 1:512였다. 테스트1139의 로우 데이터는 표 13과 도 5c에 요약되고, 테스트1200은 도 6c에 요약된다.
표 15는 AgI - 1:8, Ag2 - 1:32, Ag3 - 1:64, Ag4 - 1:512의 상이한 제 1 희석을 사용한 경우, 항원 Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4에 대한 테스트1139 및 테스트1200에서의 평활화 결과를 제공한다. 테스트1139 및 테스트1200의 평활화 결과가 도 5d 및 6d에 각각 예시된다.
도 5d 및 6d에서 볼 수 있는 대로, 제 2 방식으로 수행된 테스트에서는 완벽한 평활화가 달성되었고, 각 항원-항체 복합체에 대한 OD 판독값이 측정 장치의 선형 범위 내에 있었다. 따라서, 이들 결과는 진단 알고리즘 및 응용 프로그램에 더 통합될 수 있었다.
상기 실시예에 따라서, 항원 세트 Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4에서 모든 항원에 사용될 수 있었던 공통된 일련의 희석률은 없었다. 구체적으로, Ag1과 Ag4는 이러한 공통된(또는 공동의) 일련의 희석률을 나타내지 않았다. Ag1은 매우 낮은 신호를 나타냈고, Ag4는 매우 높은 신호를 나타냈다(포화된 신호 OD>2.5, 사용된 모든 희석률에 대해, 1-6).
제 2 방식에서, 각 항원에 일련의 상이한 희석이 사용되었고, 적합한 OD 범위, 예를 들어 0>OD≤3에서 측정가능한 신호가 발생했고, 추가의 프로세싱이 가능하거나, 또는 본 발명의 진단 방법, 진단 알고리즘 및 시스템이 가능했다.
어떤 구체예에서, 상이한 항원에 대해 희석비가 유지되는 한, 진단 과정, 시스템 및 소프트웨어는 상이한 제 1 희석에서 평활화 과정에 따른 예측된 값을 이용한다(실시예 5-7 참조).
[표 12]
[표 13]
[표 14]
[표 15]
실시예
5
분석 플랫폼의 분류 규칙(들)
일반적으로, 분류 규칙을 구축하기 위한 도구로서 논리 회귀를 사용한 증례-대조군 접근법(암-건강체)이 시험 세트에 대해 실시되었다. 플랫폼 규칙 및 알고리즘의 목표는 진단에 사용하기에 적합한 항원의 서브셋에 초점을 맞추는 것이다. 본 발명자들은 각 측정가능한 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 계산을 허용하는 알고리즘과 공식을 개발했으며, 이로써 "병에 걸린" 또는 "암 환자일 가능성이 높은" 중 어느 하나로서 환자에게 진단을 배정할 수 있다. 각 측정가능한 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 계산은 또한 상이한 희석률에서 복수의 항원을 분석하는 것을 포함하며, 이때 각 수준은 적합한 측정가능한 범위로 조정된다. 또한, 진단된 피험자에서 자가항체 수준의 개인적 변동성을 다루기 위한 내재된 해결책(들)이 제공된다. 따라서, 특히 플랫폼은 다중 마커의 존재를 고려하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 각 항원-자가항체 수준의 상대적 기여도에 기초하여 암 진단을 제공하고, 항체 프로파일 수준의 개인적 변동성을 고려할 수 있다.
먼저, 잠재적으로 유용한 항원의 리스트가 추가 프로세싱을 위해 선택된다. 분류 규칙을 만들기 위해 "암" 및 "건강한" 피험자의 시험 샘플이 얻어진다.
각 항원에 대해 복수의 연속 희석을 사용하여 각 피험체에서 항원-자가항체 수준의 측정을 수행했고, 이로써 희석률의 함수로서 항원-자가항체 수준의 측정값의 세트 또는 패턴을 얻었다. 주어진 희석에서 주어진 항원에 대한 광학 밀도(OD)의 측정을 한번 만 수행했다(어떤 구체예에서는 반복될 수도 있다). 따라서, 전형적으로 항원과 관련하여 주어진 희석률을 복제하는 것은 필수 요건은 아니다.
어떤 구체예에서, 품질제어 기준은 수행된 측정에서 신뢰도의 증가로서 취해진다. 미리 규정된 역치를 초과하는 OD를 가진 측정값은(예를 들어, 특정 측정 장치에 대해 2.5 이상) 이용할 수 없는 것으로 간주될 수 있고(검출 장치의 선형 범위를 벗어난다), 따라서 제외된다. 각 항원에 대해 미리 규정된 OD 역치 이하, 또는 측정 장치의 선형 범위 이내의 OD를 생성하는 희석률이 확립되거나 결정된다. 둘 이상의 희석률이 미리 규정된 OD 역치 이하의 OD를 생성하는 경우, 최소 희석률이 사용될 수 있다.
선택적으로, 각 항원에 대해서 OD 판독값의 세트가 프로세싱되어 평활화된/예측된(또는 프로세싱된) OD 판독값이 생성된다. 어떤 구체예에서, 선형 회귀 과정을 사용하여 평활화된/예측된 데이터를 얻는다. 선형 회귀 과정은 플랫폼에 의해서 신뢰할 만한 것으로 간주되는 OD 판독값 세트에 대해 적용된다. 비제한적 예로서, 데이터 세트의 평활화에 사용되는 OD 판독값의 신뢰할 수 있는 세트는 최소 제곱 회귀를 사용할 때 희석률 증가에 비례하여 신호의 선형 감소를 나타내는 측정값들이다. 또한, 선택적으로 가중치 최소 제곱 회귀를 수행할 수도 있다.
또한, 선형 회귀의 제곱 상관관계가 주어진 역치(예를 들어, 0.9) 이하였다면 <환자, 항원> 쌍의 데이터가 제외된다. ln(OD)의 관찰된 값이 평활화된/예측된 값으로 치환된다. 이러한 평활화된 값이 분류에 사용되었다.
적어도 한 쌍의 항원에 대해서, 상대적 페어형 희석비가 결정된다. 상대적 희석비는 희석률의 비를 고려한다. 다시 말해서, 어떤 기준 또는 값이 진단된 집단에 대해 미리 설정되고, 이것에 의해서 한 쌍의 항원에 대해 결정된 한 쌍의 희석률 사이의 비례적 관계를 추정한다. 각 희석률은 측정 장치의 선형 범위 내에서 생성된다. 비제한적 예로서, x1 및 x2가 각각 Ag1 및 Ag2의 한 쌍의 희석률이라고 하면, 한 쌍의 희석률은 측정 장치의 선형 범위 내에서 한 쌍의 OD 판독값을 생성한다. 따라서, 상대적 희석비는 x1/x2로서 정의될 수 있다.
이후, 상대적 희석률이 암 피험자 또는 건강한 피험자의 분석에 사용된다(시험 세트에서). 한 쌍의 항원에 대한 항원-자가항체 수준의 측정값(피험자로부터 얻어진)은 측정 쌍에서 그리고 피험자 집단 전체에서 희석비가 유지된다고 가정되며, 그렇게 되도록 운영될 수 있다.
비제한적 예로서, 상대적 희석률은 다음과 같이 사용될 수 있다. 특정 희석률 x1에서 항원-자가항체 복합체 수준(예를 들어, Ag1의)의 측정값을 얻은 후, 희석비(예를 들어, x1/x2)를 사용하여 Ag2의 항원-자가항체 복합체 수준을 얻을 수 있는 희석율을 예측하거나 또는 이론적으로 추정한다. 예측된 희석률에서 항원-자가항체 복합체 수준이 이용가능하지 않다면(예를 들어, 예측된/이론적 희석률에서 기술적 한계/신호의 포화로 인해서), 평활화된 데이터를 사용하여 예측된/이론적인 희석률에서 항원-자가항체 복합체 수준을 예측할 수 있다. 이러한 예측은 외삽 과정의 형태를 취할 수 있다(상대적 희석비의 이러한 사용은 하기 논의된 진단 방법 및 응용 프로그램에서도 유사하게 사용된다).
OD 판독값을 얻는 이 과정은 모든 평활화된 항원-자가항체 복합체 수준이 "암" 그룹 및 "건강체" 그룹 모두에서 그리고 잠재적으로 유용한 항원 각각에 대해서 각 피험자와 관련하여 확인될 때까지 반복된다.
"암" 그룹 및 "건강체" 그룹에서 피험자의 모든 <항원, 평활화된 OD 판독값> 쌍의 세트는 논리 회귀 과정에 의해 프로세싱된다. 논리 회귀 과정을 사용하여 각 자가항체-항원 복합체의 평활화된 OD 판독값의 상대적 기여도를 측정할 수 있다. 따라서, 이 결과는 복수의 가능한 항원 서브셋 및 암의 발생에 대한 이들의 상대적 기여도를 포함했다. 이들은 미리 설정된 상대적 희석비의 제약하에 얻어졌다.
이 결과는 수신자 판독 곡선의 곡선밑 면적(AUC)에 의해서 정렬된다. 특정한 조합이 허용가능한 감도 또는 특이성에 대해 어떤 제한이나 불만족을 나타냈다면, 부분적 AUC(pAUC)를 사용하여 결과를 정렬하는데, 즉 감도 또는 특이성에 미리 정해진 제한을 부여한다. 다음에, 추가의 비공식 전문가 분석을 위해 최상의 조합들에서 어떤 항원 서브셋이 제시된다.
논리 회귀 과정은 다음을 포함할 수 있다:
a) "최상의 n 서브셋" Ag1, Ag2, 및 Ag3... Agn;
b) 
형태의 선형 시험 함수
여기서, o1, o2, o3 및 on은 주어진 희석에서(상이한 항원에 대해 상이할 수 있다)n 항원 Ag1, Ag2, Ag3... Agn의 광학 밀도의 평활화된 로그함수이고, bo, b1, b2, b3 및 bn은 사용된 적합한 논리 회귀 모델의 계수 또는 인수이다;
c) 전체 역치 Z0, 이때 z > Z0이면, 여성/피험자는 "암"으로 분류되고, z≤Z0이면, 여성/피험자는 "건강체"로 분류된다.
어떤 구체예에서, 함수 z = f(상대적 기여 파라미터)가 논리 회귀 모델에서 사용된다. 어떤 특정 구체예에서, 이 함수는 
형태의 다항 함수이다. 다른 특정 구체예에서, 이 함수는 
; 
; 등이다.
바람직한 또는 최상의 선택된 항원 서브셋에 기초한 선형 분류장치를 "암" 피험자 및 "건강한" 피험자의 독립적인 (시험) 샘플에 대해 검증하여, 미지의 집단의 건강 상태를 예측할 수 있는 능력에 있어서 이 서브셋의 안정성을 검증했다. 계수 b0, b1, b2, b3 및 bn의 셋트는 서브셋의 안정성을 유지하는 것으로 검증되며, 미지의 집단의 건강 상태를 예측할 수 있는 능력은 임상 환경에서 추가의 진단 방법 및 응용 프로그램을 위한 상대적 기여 인자로서 사용될 수 있다. b0는 전형적으로 자유 계수이다. 이 값들 또는 계수들은 진단 응용 프로그램을 제공하기 위한 고정된 값 또는 상수로서 상대적 기여 인자 행렬에 보존될 수 있다.
상기 분류 규칙 및 과정을 하기 실시예 6 및 7에 사용했다.
실시예
6
진단 응용 프로그램을 위한 항원
서브셋
결정
유방암 생검에서 양성을 나타낸 40명의 암 환자로부터 동의하에 혈장 샘플을 얻었다. 유방암에 대해 음성인 42명의 건강한 피험자로부터 동의하에 혈장 샘플을 얻었다.
비제한적 예로서, 표 16은 본원에서 사용된 항원들의 리스트를 제공한다.
더 나아가, 앞서 설명된 대로 1:10에서 출발하여 적어도 5개 샘플의 연속 희석에 의해서 상기 항원들에 대해 상대적 페어형 희석비를 결정했다.
본 실시예에서는, 샘플의 희석에 대응하는 일련의 적어도 6개 OD 판독값에서 제 1/최소 희석률로서 각 항원에 대한 대표적 희석률을 결정했으며, 즉 적어도 6개 연속 OD 판독값은 포화되지 않았고, 측정된 신호와 사용된 희석률 사이에 실질적으로 로그함수의 의존성을 나타냈다.
상이한 희석률을 사용하여 얻어진 일련의 평활화된 OD 판독값으로부터 항원 또는 항원 쌍 사이의 상대적 희석비를 얻었다.
항원 쌍에서 각 항원의 상응하는 일련의 OD에서 제 1 희석률로부터 상대적 희석비를 얻었다. 상대적 희석비는 암 그룹 또는 건강체 그룹에서 각 피험자의 OD 판독값의 프로세싱에 대한 제약으로서 유지된다.
본 발명은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 연속 OD 판독값으로부터 대표적 희석률에 의해서 유사하게 사용될 수 있음이 주지되어야 한다. 이 시리즈에서 대표적 희석률은 추가의 프로세싱을 위해 선택된다.
표 16은 각 항원에 대한 혈장 샘플의 대표적 희석률을 제공한다(일련의 OD에서 제 1 희석률로서 선택됨).
암 피험자 및 건강한 피험자의 각 샘플을 표 16에 상세히 나타낸 제 1 희석률 또는 희석 포인트로 희석하고, ELISA를 수행했다. ln(OD)를 계산했고, 각 항원에 대한 제 1 희석 OD를 사용했다. 일반적으로, 임의의 한 항원 그룹 {LDPe002, LDPeO12, LDPeOlβ, LDPeO39, LDPeO66, LDPeO69, LDPe070 및 LDPeO7l} 대 임의의 한 항원 그룹 {LDPrO41, LDPrO76, LDPrO77, LDPrO78, LDPrO79, LDPrO95} 사이에 결정된 페어형 희석비는 0.5였다. 특히, LDPe071 대 LDPrO41의 페어형 희석비는 0.5이다. 페어형 희석비는 측정된 OD 데이터를 얻는 동안 유지되었다.
[표 16]
표 17(도 7b)은 각 항원 및 각 샘플의 제 1 희석률에 대한 ln(OD) 결과를 상세히 나타낸다. 열 ntype "O"은 건강한 샘플을 나타내고, 열 ntype "1"은 암 샘플을 나타낸다. 상기 항원 조합의 논리 회귀를 상기 설명된 대로 수행했고, ROC 분석에 의해 도 7a에 도시된 대로 상기 샘플 세트의 AUC를 결정했다.
동일한 과정을 사용하여 추가의 항원 서브셋을 확인했으며, 이것은 병에 걸린/암 피험자와 건강한 대조군 사이의 통계적 분리를 가능하게 한다.
특히, 13개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.9091였고(표 18, 도 7c); 12개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.8794였고(표 19, 도 7d); 11개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.8576였고(표 20, 도 7e); 10개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.9545였고(표 21, 도 7f); 9개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.9545였고(표 22,도 7g); 8개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.9545였고(표 23, 도 7h); 7개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.9577였고(표 24, 도 7i); 6개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.9053였고(표 25, 도 7j); 5개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.8892였고(표 26, 도 7k); 4개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.8989였고(표 27, 도 7l); 3개의 항원을 포함하는 서브셋을 사용한 결과는 ROC 곡선밑 면적이 0.8792였고(표 28, 도 7m)였다.
[표 18]
[표 19]
[표 20]
[표 21]
[표 22]
[표 23]
[표 24]
[표 25]
[표 26]
[표 27]
[표 28]
실시예
7
난소암 진단 응용 프로그램을 위한 항원 세트의 결정
병리검사로 검증된 20명의 상피난소암 환자로부터 혈장 샘플을 얻었다. 또한, 20명의 건강한 피험자로부터 혈장 샘플을 얻었다. 모든 피험자로부터 서면 동의서를 받았다.
표 29는 본원에서 사용된 항원들의 리스트를 제공한다. 앞서 설명된 대로 1:5에서 출발하여 적어도 5개 샘플의 연속 희석에 의해서 항원들에 대해 상대적 희석비를 결정했다.
[표 29]
본 실시예에서는, 앞서 설명된 대로 샘플의 희석에 대응하는 일련의 적어도 6개 OD 판독값에서 제 1/최소 희석률로서 각 항원에 대한 대표적 희석률을 결정했다.
표 29는 각 항원에 대한 혈장 샘플의 제 1 희석률을 제공한다. ln(OD)를 계산했고, 각 항원에 대한 제 1 희석 OD를 사용했다. 표 30은 각 항원 및 각 샘플의 제 1 희석률에 대한 ln(OD) 결과를 상세히 나타낸다. ntype "O"은 건강한 샘플을 나타내고, ntype "1"은 암 샘플을 나타낸다. 총 7명의 환자와 17명의 건강한 피험자를 시험했다.
상기 항원 조합 LDPe002(SEQ ID no. 9)와 LDPeO92(SEQ ID no. 16)의 논리 회귀를 상기 설명된 대로 수행했고, ROC 분석에 의해서 도 7n에 도시된 대로 상기 샘플 세트의 AUC를 결정했다.
[표 30]
도 7n은 7명의 환자와 17명의 건강한 피험자에서 LDPe002와 LDPeO92에 대한 제 1 최소 희석에서 얻어진 결과를 도시하고, 도 7o는 .90%로서 상기 데이터에 대해 계산된 AUC를 도시한다.
동일한 과정을 사용하여 추가의 항원 서브셋을 확인했으며, 이것은 병에 걸린/암 피험자와 건강한 대조군 사이의 통계적 분리를 가능하게 한다.
상기 항원 조합 LDPe001(SEQ ID no. 8)와 LDPeO92(SEQ ID no. 16)의 논리 회귀를 상기 설명된 대로 수행했고, ROC 분석에 의해서 도 7p에 도시된 대로 상기 샘플 세트의 AUC를 결정했다.
[표 31]
도 7p는 14명의 환자와 14명의 건강한 피험자에서 LDPe001과 LDPeO92에 대한 제 1/최소 희석에서 얻어진 결과를 도시한다. 도 7q는 .85%로서 상기 데이터에 대해 계산된 AUC를 도시한다.
실시예
8
진단 방법 및 응용 프로그램
암의 존재에 대해 평가될 피험자에게 진단을 배정하기 위한 방법 및 응용 프로그램은 미리 결정된 입력 파라미터를 이용한다. 상기 방법 및 응용 프로그램은 이와 같이 확립된 항원 세트에 대한 지식, 즉 항원 쌍의 세트의 상대적 희석비 및/또는 대표적 항원 희석률 및 상기 각 항원의 상대적 기여 인자를 이용한다.
상기 방법 및 응용 프로그램은 진단된 피험자가 암에 걸려 있다는 진단에 배정되어야 하는지, 또는 피험자가 암에 걸려 있을 가능성이 높다는 진단에 배정되어야 하는지를 결정할 수 있게 한다.
먼저, 진달된 피험자로부터 신체 샘플이 얻어진다. 일반적으로, 이 샘플은 진단 과정에 적합하다고 이미 결정된 항원 서브셋과 접촉된다.
항원 서브셋, 예를 들어 Ag1, Ag2 및 Ag3가 피험자의 신체 샘플과 접촉되고, 이후 항원마다 3개 이상의 희석률에서 적어도 3개의 OD 판독값(선택적으로 6개)에 대해 분석된다.
분석은 상기 신체 샘플을 대표적 희석률에서 복수의 샘플 알리쿼트 내의 자가항체와 접촉시켜 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 전형적으로, 최소 희석에서 출발하는 연속 희석이 수행된다. 앞서 설명된 대로, 희석률(최소 희석률을 포함하는)은 상이한 항원에 대해 상이할 수 있다. 상이한 희석률의 복수의 샘플 알리쿼트가 얻어진다.
품질제어 과정이 각 항원-항체 복합체 수준에 대해 측정된 데이터에 개별적으로 적용된다. 미리 규정된 역치(예를 들어, 특정 측정 장치에 대해 2.5 이상)를 초과하는 OD를 가진 측정값은 이용할 수 없는 것으로 간주될 수 있으며(검출 장치의 선형 범위를 벗어난다), 따라서 제외된다. 품질제어 단계를 통과하지 못한 데이터의 경우, 테스트는 "기술적으로 실패"로 간주된다. 진단의 결론을 내리기 위해서 품질 보장 과정에 따라서 계속해서 측정이 반복 수행되어야 한다.
품질제어 과정이 이어지고, 그와 관련하여 각 항원에 대한 측정값이 검증되는 경우, 상기 설명된 대로 데이터가 평활화되고, 이로써 평활화된/예측된 OD 판독값이 얻어진다. 선택적으로, 진단 결정은 평활화된 또는 예측된 OD 판독값에 기초하여 결정된다. 어떤 구체예에서, 상대적 희석비는 항원들에서 유지된다. 항원-자가항체 복합체 수준을 나타내는 OD 판독값/평활화된 OD 판독값/예측된 OD 판독값의 세트가 이와 같이 얻어지며, 예를 들어 n 항원 Ag1, Ag2, Ag3... Agn에 대한 광학 밀도 o1, o2, o3 등이다.
암의 존재에 대한 상기 항원-항체 복합체 수준의 각각의 상대적 기여 파라미터의 값이 앞서 결정된 또는 고정된 미리 결정된 상대적 기여 인자에 따라서 상기 항원-항체 복합체 수준의 각각을 조정함으로써 계산된다. 어떤 구체예에서, 조정은 다항식 PARAMi = oibi,l≥i≥n의 형태를 취하며, 여기서 oi는 Agi의 항원-항체 복합체 수준이고, bi는 항원 Agi을 특정하는 상대적 기여 인자이다. 다른 구체예에서, PARAMi = ln(oibi),l≥i≥n이다.
다음에, 구별/시험 함수 (x)가 계산되고, 이것의 입력값이 상대적 기여 파라미터이다. 값 (x)는 미리 결정된 컷오프 포인트 Z과 비교된다. 어떤 구체예에서, 판별/시험 함수는 
이다.
진단된 피험자는 x>Z이면 "암에 걸려 있을 가능성이 높은"에, 아니면 "건강체"에 배정되거나 분류될 것이다.
이후 실시예에서, 유방 수술의는 높은 감도 및 중간 정도의 특이성을 허용하는 항원의 진단 세트를 필요로 한다. 이 방식에서, 수술의는 현재 행해지는 불필요한 생검을 대부분 없앨 수 있다.
유방 생검 또는 수술이 예정된 의심되는 여성 집단으로부터 서면 동의하에 혈장 샘플을 얻었다. 또한, 각 여성은 생검 결과에 접근할 수 있었다. 혈장 샘플을 무작위로 2개 샘플 세트, 즉 시험 세트와 검증 세트로 나누었다.
총 106개의 샘플을 시험 세트로 사용했다. 항원 세트를 제안하고, 최상의 서브셋을 상기 설명된 방법에 따라서 수술의의 요구사항 하에 선택했다(환자를 잃지 않기 위한 높은 감도, 및 생검이 필요 없는 모니터링을 위해 건강한 집단의 적어도 50%를 보내기 위한 중간 정도의 특이성).
8개의 항원을 함유하는 서브셋은 표 32에 제공된 상대적 기여 인자를 가져왔다.
[표 32]
이 항원 세트를 사용하여 특정 대표적 희석과 상대적 기여 인자에서 분석을 수행했다. 표 33에 나타낸 대로, 테스트의 총 감도는 97%였고(59/57 정확히 진단됨), 테스트의 총 특이성은 49%였다(23/47 정확히 진단됨).
[표 33]
동일한 항원 세트를 15명의 암 환자와 21명의 건강한 대조군(생검에 의해 검증된)을 함유하는 검증 세트에 사용했다. 컷오프에 따라서 각 샘플에 건강한 상태를 배정했으며, Z>-1.16일 때는 암에 배정되었고, Z≤-1.16일 때 건강한 상태에 배정되었다.
[표 34]
이와 같이, 특정한 상대적 기여 인자와 구별/시험 함수를 사용하여 유방 수술의의 임상 요건에 엄격히 순응하여 표 34에 나타낸 대로 높은 감도(93%)와 중간 특이성(53%)의 결과를 얻었다.
다른 응용 프로그램에서, 유방 수술의는 선별된 집단의 거짓 음성 결과(이것은 약 10%이다)의 대부분을 검출하기 위해서 고도로 특이적이고, 중간 정도의 감도를 가진 테스트를 원할 수 있다.
동일한 과정을 115개 샘플 세트(64건 암, 51건 건강체)에 대해 수행했다. 7개 항원을 함유하는 서브셋은 표 35에 제공된 상대적 기여 인자를 가져왔다.
[표 35]
특정한 상대적 기여 인자와 구별 함수를 사용하여 유방 수술의의 임상 요건에 엄격히 순응하여 표 36에 나타낸 대로 중간 감도(50%)와 높은 특이성(92%)의 결과를 얻었다.
[표 36]
동일한 항원 세트를 18명의 암 환자와 22명의 건강한 대조군(생검에 의해 검증된)을 함유하는 검증 세트에 사용했다. 컷오프에 따라서 각 샘플에 건강한 상태를 배정했으며, Z>1.1일 때는 암에 배정되었고, Z<1.1일 때 건강한 상태에 배정되었다.
[표 37]
특정한 상대적 기여 인자와 구별 함수를 사용하여 유방 수술의의 임상 요건에 엄격히 순응하여 표 37에 나타낸 대로 중간 감도(44%)와 높은 특이성(91%)의 결과를 얻었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Lab Discoveries Ltd.
<120> A METHOD AND SYSTEM FOR THE DETECTION OF CANCER
<130> 202123-4YS
<140> US 61/219,539
<141> 2009-06-23
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Tyr
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Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
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Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
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Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
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Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala
1 5 10 15
Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly
20 25 30
Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly
35 40 45
Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser
50 55 60
Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala
65 70 75 80
Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys
85 90 95
Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile
100 105 110
Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile
115 120 125
Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu
130 135 140
Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr
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Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe
165 170 175
Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly
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Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
195 200 205
Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp
210 215 220
Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly
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Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu
245 250 255
Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys
260 265 270
Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu
275 280 285
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Ala Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu
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Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg
325 330 335
Ser Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys
340 345 350
Lys Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile
355 360 365
Pro Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro
370 375 380
Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val
385 390 395 400
Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu
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Leu Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val
420 425 430
Met Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser
435 440 445
Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys
450 455 460
Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly
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Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln
485 490 495
Ile Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr
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Ala Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp
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Thr Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile
565 570 575
Gly Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu
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50 55 60
Thr Pro Arg Asn Gly Ser Thr Glu Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ser Pro
65 70 75 80
Glu Pro Pro Ser Glu Leu Leu Glu Asp Gly Gln Asp Thr Pro Thr Ser
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Pro Gln Glu Asn Gly Thr Thr Leu Trp Pro Ser Arg Gly Ile Pro Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ala His Thr Thr Glu Ala Gly Thr Leu Pro Ala Pro Thr
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Pro Ser Pro Pro Ser Leu Gly Arg Pro Trp Ala Pro Leu Thr Gly Pro
195 200 205
Ser Val Pro Pro Pro Ser Ser Gly Arg Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu
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Gly Gly Ala Pro Pro Trp Gly Ser Leu Gln Asp Pro Asp Ser Gln Gly
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Leu Ser Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ser Gln Gln Leu Gln Arg Pro Asp
245 250 255
Val Arg Leu Arg Thr Pro Leu Leu His Pro Leu Val Met Gly Ser Leu
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Gly Lys His Ala Ala Pro Ser Ala Phe Ser Ser Gly Leu Pro Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gln Val Ala Val Thr Thr Leu Thr Arg Asp Ser Gly Ala Trp
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Val Ser His Val Ala Asn Ser Val Gly Pro Gly Leu Ala Asn Asn Ser
305 310 315 320
Ala Leu Leu Gly Ala Asp Pro Glu Ala Pro Ala Gly Arg Cys Leu Pro
325 330 335
Leu Pro Pro Ser Leu Pro Val Cys Gly His Leu Gly Ile Ser Arg Phe
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Trp Leu Pro Asn His Leu His His Glu Ser Gly Glu Gln Val Arg Ala
355 360 365
Gly Ala Arg Ala Trp Gly Gly Leu Leu Gln Thr His Cys His Pro Phe
370 375 380
Leu Ala Trp Phe Phe Cys Leu Leu Leu Val Pro Pro Cys Gly Ser Val
385 390 395 400
Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Cys Cys Gln Phe Cys Glu Ala Leu Gln
405 410 415
Asp Ala Cys Trp Ser Arg Leu Gly Gly Gly Arg Leu Pro Val Ala Cys
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Ala Ala Glu Arg Ile Ser Glu Glu Val Gly Leu Leu Gln Leu Leu Gly
450 455 460
Asp Pro Pro Pro Gln Gln Val Thr Gln Thr Asp Asp Pro Asp Val Gly
465 470 475 480
Leu Ala Tyr Val Phe Gly Pro Asp Ala Asn Ser Gly Gln Val Ala Arg
485 490 495
Tyr His Phe Pro Ser Leu Phe Phe Arg Asp Phe Ser Leu Leu Phe His
500 505 510
Ile Arg Pro Ala Thr Glu Gly Pro Gly Val Leu Phe Ala Ile Thr Asp
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Ser Ala Gln Ala Met Val Leu Leu Gly Val Lys Leu Ser Gly Val Gln
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Asp Gly His Gln Asp Ile Ser Leu Leu Tyr Thr Glu Pro Gly Ala Gly
545 550 555 560
Gln Thr His Thr Ala Ala Ser Phe Arg Leu Pro Ala Phe Val Gly Gln
565 570 575
Trp Thr His Leu Ala Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Ala Leu Tyr
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Val Asp Cys Glu Glu Phe Gln Arg Met Pro Leu Ala Arg Ser Ser Arg
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625 630 635 640
Arg Arg Asp Pro Gln Val Ser Pro Met His Cys Leu Asp Glu Glu Gly
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Asp Asp Ser Asp Gly Ala Ser Gly Asp Ser Gly Ser Gly Leu Gly Asp
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Ser Thr Glu Asp Ser Arg Ser Glu Glu Val Glu Glu Gln Thr Thr Val
705 710 715 720
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Trp Asp Gly Ser Val Arg Thr Pro Gly Gly Arg Val Lys Glu Gly Gly
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Leu Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Arg
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Gly Arg Asp Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Glu Asp Gly Lys Pro Gly
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850 855 860
Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Phe Arg His Asp Lys
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Leu Thr Phe Ile Asp Met Glu Gly Ser Gly Phe Gly Gly Asp Leu Glu
885 890 895
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Val Pro Gly Leu Pro Gly Glu Pro Gly Arg Phe Gly Val Asn Ser Ser
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Gly Ala Pro Gly His Lys Gly Ser Lys Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
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Ala Arg Gly Glu Ser Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro
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Gly Leu Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Ala Lys
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Gly Glu Val Gly Ala Asp Gly Val Pro Gly Phe Pro Gly Leu Pro
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Gly Arg Glu Gly Ile Ala Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Arg
1085 1090 1095
Gly Ser Arg Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Lys Asp Gly Val Gly
1100 1105 1110
Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Val
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Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ile Phe Ser Pro Asp Gly
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Glu Ile Gly Phe Pro Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly Met Asn Gly
1220 1225 1230
Leu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Ser Leu Gly Phe
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Gly Met Arg Gly Met Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
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Ser Ser Arg Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Asn Gln Gly Pro
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Pro Gly Gln Phe Pro Phe Asp Phe Leu Gln Leu Glu Ala Glu Met
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Lys Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Gln Lys Gly Glu
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Arg Gly Glu Pro Gly Gly Gly Gly Phe Phe Gly Ser Ser Leu Pro
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Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Met Gly Ala Ser Ser
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Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
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Glu Ala Arg Thr Pro Leu Pro Arg Gly Thr Asp Asn Glu Val Ala
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Tyr Pro Gly Ala Pro His His Ser Ser Tyr Val His Leu Arg Pro
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<213> Homo sapiens
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Met Arg Ala Leu Ala Val Leu Ser Val Thr Leu Val Met Ala Cys Thr
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Leu Val Asp Thr Ala Met Tyr Ala Thr Met Gln Arg Asn Leu Lys Lys
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210 215 220
Arg Tyr Ser Asp Leu Leu Met Ala Trp Gly Gln Tyr Ile Asp His Asp
225 230 235 240
Ile Ala Phe Thr Pro Gln Ser Thr Ser Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Ala Asp Cys Gln Met Thr Cys Glu Asn Gln Asn Pro Cys Phe Pro Ile
260 265 270
Gln Leu Pro Glu Glu Ala Arg Pro Ala Ala Gly Thr Ala Cys Leu Pro
275 280 285
Phe Tyr Arg Ser Ser Ala Ala Cys Gly Thr Gly Asp Gln Gly Ala Leu
290 295 300
Phe Gly Asn Leu Ser Thr Ala Asn Pro Arg Gln Gln Met Asn Gly Leu
305 310 315 320
Thr Ser Phe Leu Asp Ala Ser Thr Val Tyr Gly Ser Ser Pro Ala Leu
325 330 335
Glu Arg Gln Leu Arg Asn Trp Thr Ser Ala Glu Gly Leu Leu Arg Val
340 345 350
His Ala Arg Leu Arg Asp Ser Gly Arg Ala Tyr Leu Pro Phe Val Pro
355 360 365
Pro Arg Ala Pro Ala Ala Cys Ala Pro Glu Pro Gly Ile Pro Gly Glu
370 375 380
Thr Arg Gly Pro Cys Phe Leu Ala Gly Asp Gly Arg Ala Ser Glu Val
385 390 395 400
Pro Ser Leu Thr Ala Leu His Thr Leu Trp Leu Arg Glu His Asn Arg
405 410 415
Leu Ala Ala Ala Leu Lys Ala Leu Asn Ala His Trp Ser Ala Asp Ala
420 425 430
Val Tyr Gln Glu Ala Arg Lys Val Val Gly Ala Leu His Gln Ile Ile
435 440 445
Thr Leu Arg Asp Tyr Ile Pro Arg Ile Leu Gly Pro Glu Ala Phe Gln
450 455 460
Gln Tyr Val Gly Pro Tyr Glu Gly Tyr Asp Ser Thr Ala Asn Pro Thr
465 470 475 480
Val Ser Asn Val Phe Ser Thr Ala Ala Phe Arg Phe Gly His Ala Thr
485 490 495
Ile His Pro Leu Val Arg Arg Leu Asp Ala Ser Phe Gln Glu His Pro
500 505 510
Asp Leu Pro Gly Leu Trp Leu His Gln Ala Phe Phe Ser Pro Trp Thr
515 520 525
Leu Leu Arg Gly Gly Gly Leu Asp Pro Leu Ile Arg Gly Leu Leu Ala
530 535 540
Arg Pro Ala Lys Leu Gln Val Gln Asp Gln Leu Met Asn Glu Glu Leu
545 550 555 560
Thr Glu Arg Leu Phe Val Leu Ser Asn Ser Ser Thr Leu Asp Leu Ala
565 570 575
Ser Ile Asn Leu Gln Arg Gly Arg Asp His Gly Leu Pro Gly Tyr Asn
580 585 590
Glu Trp Arg Glu Phe Cys Gly Leu Pro Arg Leu Glu Thr Pro Ala Asp
595 600 605
Leu Ser Thr Ala Ile Ala Ser Arg Ser Val Ala Asp Lys Ile Leu Asp
610 615 620
Leu Tyr Lys His Pro Asp Asn Ile Asp Val Trp Leu Gly Gly Leu Ala
625 630 635 640
Glu Asn Phe Leu Pro Arg Ala Arg Thr Gly Pro Leu Phe Ala Cys Leu
645 650 655
Ile Gly Lys Gln Met Lys Ala Leu Arg Asp Gly Asp Trp Phe Trp Trp
660 665 670
Glu Asn Ser His Val Phe Thr Asp Ala Gln Arg Arg Glu Leu Glu Lys
675 680 685
His Ser Leu Ser Arg Val Ile Cys Asp Asn Thr Gly Leu Thr Arg Val
690 695 700
Pro Met Asp Ala Phe Gln Val Gly Lys Phe Pro Glu Asp Phe Glu Ser
705 710 715 720
Cys Asp Ser Ile Thr Gly Met Asn Leu Glu Ala Trp Arg Glu Thr Phe
725 730 735
Pro Gln Asp Asp Lys Cys Gly Phe Pro Glu Ser Val Glu Asn Gly Asp
740 745 750
Phe Val His Cys Glu Glu Ser Gly Arg Arg Val Leu Val Tyr Ser Cys
755 760 765
Arg His Gly Tyr Glu Leu Gln Gly Arg Glu Gln Leu Thr Cys Thr Gln
770 775 780
Glu Gly Trp Asp Phe Gln Pro Pro Leu Cys Lys Asp Val Asn Glu Cys
785 790 795 800
Ala Asp Gly Ala His Pro Pro Cys His Ala Ser Ala Arg Cys Arg Asn
805 810 815
Thr Lys Gly Gly Phe Gln Cys Leu Cys Ala Asp Pro Tyr Glu Leu Gly
820 825 830
Asp Asp Gly Arg Thr Cys Val Asp Ser Gly Arg Leu Pro Arg Val Thr
835 840 845
Trp Ile Ser Met Ser Leu Ala Ala Leu Leu Ile Gly Gly Phe Ala Gly
850 855 860
Leu Thr Ser Thr Val Ile Cys Arg Trp Thr Arg Thr Gly Thr Lys Ser
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Asp Ser Glu Gln Glu Ser Ala Gly Met Glu Gly Arg Asp Thr His Arg
915 920 925
Leu Pro Arg Ala Leu
930
<210> 20
<211> 1255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
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50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
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Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
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195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
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580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
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610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
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645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
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Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
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Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
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Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
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770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
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Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
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820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
1040 1045 1050
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Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
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Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
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Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
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Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
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1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
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Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
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<210> 21
<211> 270
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Trp Asn Ser Gly Phe Glu Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Gly Tyr Thr Gln Ser Pro Gly Gly Phe Gly Ser Pro Ala Pro
20 25 30
Ser Gln Ala Glu Lys Lys Ser Arg Ala Arg Ala Gln His Ile Val Pro
35 40 45
Cys Thr Ile Ser Gln Leu Leu Ser Ala Thr Leu Val Asp Glu Val Phe
50 55 60
Arg Ile Gly Asn Val Glu Ile Ser Gln Val Thr Ile Val Gly Ile Ile
65 70 75 80
Arg His Ala Glu Lys Ala Pro Thr Asn Ile Val Tyr Lys Ile Asp Asp
85 90 95
Met Thr Ala Ala Pro Met Asp Val Arg Gln Trp Val Asp Thr Asp Asp
100 105 110
Thr Ser Ser Glu Asn Thr Val Val Pro Pro Glu Thr Tyr Val Lys Val
115 120 125
Ala Gly His Leu Arg Ser Phe Gln Asn Lys Lys Ser Leu Val Ala Phe
130 135 140
Lys Ile Met Pro Leu Glu Asp Met Asn Glu Phe Thr Thr His Ile Leu
145 150 155 160
Glu Val Ile Asn Ala His Met Val Leu Ser Lys Ala Asn Ser Gln Pro
165 170 175
Ser Ala Gly Arg Ala Pro Ile Ser Asn Pro Gly Met Ser Glu Ala Gly
180 185 190
Asn Phe Gly Gly Asn Ser Phe Met Pro Ala Asn Gly Leu Thr Val Ala
195 200 205
Gln Asn Gln Val Leu Asn Leu Ile Lys Ala Cys Pro Arg Pro Glu Gly
210 215 220
Leu Asn Phe Gln Asp Leu Lys Asn Gln Leu Lys His Met Ser Val Ser
225 230 235 240
Ser Ile Lys Gln Ala Val Asp Phe Leu Ser Asn Glu Gly His Ile Tyr
245 250 255
Ser Thr Val Asp Asp Asp His Phe Lys Ser Thr Asp Ala Glu
260 265 270
<210> 22
<211> 1377
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
ggtccttttt ggtgtaaatc tggactctaa ttctgtaata tatcaaggaa tctcgtaaaa 60
ccgacactaa aacgtccctg cctacaaatc atccggccaa attatgagtt cattgtatta 120
tgcgaatact ttattttcta aatatccagc ctcaagttcg gttttcgcta ccggagcctt 180
cccagaacaa acttcttgtg cgtttgcttc caacccccag cgcccgggct atggagcggg 240
ttcgggcgct tccttcgccg cctcgatgca gggcttgtac cccggcgggg ggggcatggc 300
gggccagagc gcggccggcg tctacgcggc cggctatggg ctcgagccga gttccttcaa 360
catgcactgc gcgccctttg agcagaacct ctccggggtg tgtcccggcg actccgccaa 420
ggcggcgggc gccaaggagc agagggactc ggacttggcg gccgagagta acttccggat 480
ctacccctgg atgcgaagct caggaactga ccgcaaacga ggccgccaga cctacacccg 540
ctaccagacc ctggagctgg agaaagaatt tcactacaat cgctacctga cgcggcggcg 600
gcgcatcgag atcgcgcaca cgctctgcct cacggaaaga cagatcaaga tttggtttca 660
gaaccggcgc atgaagtgga aaaaggagaa caagaccgcg ggcccgggga ccaccggcca 720
agacagggct gaagcagagg aggaagagga agagtgaggg atggagaaag ggcagaggaa 780
gagacatgag aaagggagag gaagagaagc ccagctctgg gaactgaatc aggaaactca 840
aatcgaatag ggaagtaaaa aaacaaaaca aaaaacaaaa aaaacaaaaa aaaaacccta 900
tttaaatgaa aggagtttaa aaacattttt taaggaggga gaaaggagaa attttggttt 960
ttcaacactg aaaaaatact acctatagga aagtctgtca ggtttggttt ttttgtacaa 1020
tatgaaaagg atattatcta cctgttctgt agctttctgg aatttacctc cccttttcta 1080
tgttgctatt gtaaggtctt tgtaaaatct tgcagttttg taagccctct ttaatgctgt 1140
ctttgtggac tgtgggtctg gactaaccct gtggttgcct gccctcctga gcctccgcct 1200
tcccagcagc ggcaccaagg ggccttaggg agccccaaaa cctaccactc gcgtgttccc 1260
caagcgcctg gctgctgctt cttgcttccc gtcccccagc cccatgctcc cttttacatt 1320
ctgtgtgtat ctaaaggatg gaaaaataaa acgcaattaa aaataaaaaa aaaaaaa 1377
<210> 23
<211> 1235
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
aggagccaga accactcggc gccgcctggt gcatgggagg ggagccgggc caggaacaat 60
atgttagccg tgcactttga caagccggga ggaccggaaa acctctacgt gaaggaggtg 120
gccaagccga gcccggggga gggtgaagtc ctcctgaagg tggcggccag cgccctgaac 180
cgggcggact taatgcagag acaaggccag tatgacccac ctccaggagc cagcaacatt 240
ttgggacttg aggcatctgg acatgtggca gagctggggc ctggctgcca gggacactgg 300
aagatcgggg acacagccat ggctctgctc cccggtgggg gccaggctca gtacgtcact 360
gtccccgaag ggctcctcat gcctatccca gagggattga ccctgaccca ggctgcagcc 420
atcccagagg cctggctcac cgccttccag ctgttacatc ttgtgggaaa tgttcaggct 480
ggagactatg tgctaatcca tgcaggactg agtggtgtgg gcacagctgc tatccaactc 540
acccggatgg ctggagctat tcctctggtc acagctggct cccagaagaa gcttcaaatg 600
gcagaaaagc ttggagcagc tgctggattc aattacaaaa aagaggattt ctctgaagca 660
acgctgaaat tcaccaaagg tgctggagtt aatcttattc tagactgcat aggcggatcc 720
tactgggaga agaacgtcaa ctgcctggct cttgatggtc gatgggttct ctatggtctg 780
atgggaggag gtgacatcaa tgggcccctg ttttcaaagc tactttttaa gcgaggaagt 840
ctgatcacca gtttgctgag gtctagggac aataagtaca agcaaatgct ggtgaatgct 900
ttcacggagc aaattctgcc tcacttctcc acggagggcc cccaacgtct gctgccggtt 960
ctggacagaa tctacccagt gaccgaaatc caggaggccc ataagtacat ggaggccaac 1020
aagaacatag gcaagatcgt cctggaactg ccccagtgaa ggaggatggg gcaggacagg 1080
acgcggccac cccaggcctt tccagagcaa acctggagaa gattcacaat agacaggcca 1140
agaaacccgg tgcttcctcc agagccgttt aaagctgata tgaggaaata aagagtgaac 1200
tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1235
<210> 24
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Thr Pro Pro Arg Leu Phe Trp Val Trp Leu Leu Val Ala Gly Thr
1 5 10 15
Gln Gly Val Asn Asp Gly Asp Met Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ala Thr
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Asn Gln Gly Arg Val Glu Ile Phe Tyr Arg Gly Gln Trp Gly Thr Val
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Cys Asp Asn Leu Trp Asp Leu Thr Asp Ala Ser Val Val Cys Arg Ala
50 55 60
Leu Gly Phe Glu Asn Ala Thr Gln Ala Leu Gly Arg Ala Ala Phe Gly
65 70 75 80
Gln Gly Ser Gly Pro Ile Met Leu Asp Glu Val Gln Cys Thr Gly Thr
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Glu Ala Ser Leu Ala Asp Cys Lys Ser Leu Gly Trp Leu Lys Ser Asn
100 105 110
Cys Arg His Glu Arg Asp Ala Gly Val Val Cys Thr Asn Glu Thr Arg
115 120 125
Ser Thr His Thr Leu Asp Leu Ser Arg Glu Leu Ser Glu Ala Leu Gly
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Gln Ile Phe Asp Ser Gln Arg Gly Cys Asp Leu Ser Ile Ser Val Asn
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Val Gln Gly Glu Asp Ala Leu Gly Phe Cys Gly His Thr Val Ile Leu
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Thr Ala Asn Leu Glu Ala Gln Ala Leu Trp Lys Glu Pro Gly Ser Asn
180 185 190
Val Thr Met Ser Val Asp Ala Glu Cys Val Pro Met Val Arg Asp Leu
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Leu Arg Tyr Phe Tyr Ser Arg Arg Ile Asp Ile Thr Leu Ser Ser Val
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Lys Cys Phe His Lys Leu Ala Ser Ala Tyr Gly Ala Arg Gln Leu Gln
225 230 235 240
Gly Tyr Cys Ala Ser Leu Phe Ala Ile Leu Leu Pro Gln Asp Pro Ser
245 250 255
Phe Gln Met Pro Leu Asp Leu Tyr Ala Tyr Ala Val Ala Thr Gly Asp
260 265 270
Ala Leu Leu Glu Lys Leu Cys Leu Gln Phe Leu Ala Trp Asn Phe Glu
275 280 285
Ala Leu Thr Gln Ala Glu Ala Trp Pro Ser Val Pro Thr Asp Leu Leu
290 295 300
Gln Leu Leu Leu Pro Arg Ser Asp Leu Ala Val Pro Ser Glu Leu Ala
305 310 315 320
Leu Leu Lys Ala Val Asp Thr Trp Ser Trp Gly Glu Arg Ala Ser His
325 330 335
Glu Glu Val Glu Gly Leu Val Glu Lys Ile Arg Phe Pro Met Met Leu
340 345 350
Pro Glu Glu Leu Phe Glu Leu Gln Phe Asn Leu Ser Leu Tyr Trp Ser
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Glu Asp Thr Tyr Lys Pro Arg Ile Tyr Thr Ser Pro Thr Trp Ser Ala
405 410 415
Phe Val Thr Asp Ser Ser Trp Ser Ala Arg Lys Ser Gln Leu Val Tyr
420 425 430
Gln Ser Arg Arg Gly Pro Leu Val Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Phe Gln
435 440 445
Ala Pro Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Pro Tyr Gln Ser Phe Gln Thr Pro
450 455 460
Gln His Pro Ser Phe Leu Phe Gln Asp Lys Arg Val Ser Trp Ser Leu
465 470 475 480
Val Tyr Leu Pro Thr Ile Gln Ser Cys Trp Asn Tyr Gly Phe Ser Cys
485 490 495
Ser Ser Asp Glu Leu Pro Val Leu Gly Leu Thr Lys Ser Gly Gly Ser
500 505 510
Asp Arg Thr Ile Ala Tyr Glu Asn Lys Ala Leu Met Leu Cys Glu Gly
515 520 525
Leu Phe Val Ala Asp Val Thr Asp Phe Glu Gly Trp Lys Ala Ala Ile
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585
<210> 25
<211> 702
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
100 105 110
Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
180 185 190
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Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
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Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln
515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
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580 585 590
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Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
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<213> Homo sapiens
<400> 26
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1 5 10 15
Pro Ala Ser Ala Leu Val Arg Ile Pro Leu His Lys Phe Thr Ser Ile
20 25 30
Arg Arg Thr Met Ser Glu Val Gly Gly Ser Val Glu Asp Leu Ile Ala
35 40 45
Lys Gly Pro Val Ser Lys Tyr Ser Gln Ala Val Pro Ala Val Thr Glu
50 55 60
Gly Pro Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn Tyr Met Asp Ala Gln Tyr Tyr
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355 360 365
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385 390 395 400
Asn Asn Arg Val Gly Phe Ala Glu Ala Ala Arg Leu
405 410
Claims (25)
- 암의 존재에 대해 평가될 피험자에게 진단을 배정하고, 및/또는 피험자가 병에 걸려 있을 증가된 가능성을 갖는지 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 상기 피험자의 신체 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 상기 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플에 존재하는 자가항체와 복합체를 형성하는 단계로, 상기 자가항체는 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하는 단계;
(iii) 상기 피험자에서 상기 항원-항체 복합체의 각각의 수준을 측정하는 단계;
(iv) 정해진 상대적 기여 인자에 따라서 상기 항원-항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 암의 존재에 대한 상기 항원-항체 복합체 수준의 각각의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계;
(v) 시험 함수 (x) = f(상대적 기여 파라미터)의 값을 결정하는 단계
를 포함하며, 이때 상기 (x)가 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치보다 높으면, 상기 피험자를 피험자가 암에 걸려 있을 증가된 가능성을 갖는다는 진단에 배정하는 방법. - 제 1 항에 있어서, 항원 세트는 적어도 2개의 항원을 포함하고, 상기 항원의 각각은 상기 피험자에서 암의 존재에 대한 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하며, 정해진 상대적 기여 인자가 상대적 기여 인자 행렬을 한정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상대적 기여 인자 행렬은 상기 진단된 피험자에서 암의 발생을 특정하는 둘 이상의 항원-항체 복합체 수준의 비례적 관계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 신체 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 샘플의 제 1 알리쿼트를 포함하고, 상기 샘플의 상기 제 1 알리쿼트는 적합한 버퍼 용액으로 제 1 희석률로 희석되어 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 제 1 희석률은 1:5 내지 1:2000의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 샘플의 제 2 알리쿼트를 포함하며, 상기 샘플의 상기 제 2 알리쿼트는 적합한 버퍼 용액으로 제 2 희석률로 희석되어 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공하고, 제 2 희석률은 상기 제 1 희석률과는 상이하며, 제 1 희석률과 제 2 희석률은 상이한 희석률에서 두 측정가능한 항원-항체 복합체 수준을 제공하고, 상기 두 측정가능한 항원-항체 복합체 수준은 두 상이한 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 제 1 희석률과 제 2 희석률은 상기 두 상이한 항원의 상대적 희석비 또는 상기 두 상이한 항원의 비례 관계를 한정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 상대적 희석비는 적어도 2개의 상대적 희석비를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 난소암인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 결장암, 폐암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
- 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하는데 사용하기 위한 진단 모니터링 시스템으로서, 상기 시스템은
(i) 적어도 2개의 정해진 상대적 기여 인자를 포함하는 상대적 기여 인자 행렬을 보유하기 위한 레지스터;
(ii) 상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-자가항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 수신하기 위한 입력 모듈로, 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 상기 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하는 입력 모듈;
(iii) 상기 측정된 데이터와 상기 상대적 기여 인자 행렬을 프로세싱하기 위한 프로세서 모듈로, 상기 프로세싱은 정해진 상대적 기여 인자에 따라서 상기 항원-자가항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 상기 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계, 및 시험 함수 (x) = f(상대적 기여 파라미터)의 값 (x)를 결정하는 단계를 포함하고, 이때 상기 (x)가 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치보다 높으면, 시스템 변수가 진단된 피험자가 암에 걸려 있는 것에 따른 상태에 진단된 피험자를 배정함을 지시하는 프로세서 모듈; 및
(iv) 진단된 피험자가 암에 걸려 있는 것에 따른 상태에 진단된 피험자를 배정한다는 상기 시스템 변수에 저장된 지시를 출력하기 위한 출력 유닛
을 포함하는 진단 모니터링 시스템. - 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하는데 사용하기 위한 컴퓨터 실행 진단 방법으로서, 상기 방법은
(i) 적어도 2개의 정해진 상대적 기여 인자를 포함하는 상대적 기여 인자 행렬을 얻는 단계;
(ii) 상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 수신하는 단계로, 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 상기 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하는 단계;
(iii) 정해진 상대적 기여 인자에 따라서 상기 항원-자가항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 상기 항원-자가항체 복합체 수준의 상대적 기여 파라미터를 결정하고, 시험 함수 (x) = f(상대적 기여 파라미터)의 값 (x)를 결정하는 것을 포함하는 상기 측정된 데이터와 상기 상대적 기여 인자 행렬을 프로세싱하는 단계;
(iv) 상기 값 (x)를 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치와 비교하는 단계로, 상기 (x)가 상기 역치보다 높으면, 시스템 변수가 진단된 피험자가 암에 걸려 있는 것에 따른 상태에 배정되는 단계; 및
(v) 진단된 피험자가 암에 걸려 있는 것에 따른 상태에 진단된 피험자를 배정한다는 지시를 출력하는 단계
를 포함하는 방법. - 프로세서에 의해 실행되었을 때 제 13 항에 따른 방법이 수행되도록 하는 컴퓨터 프로그램 코드가 저장된 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하는, 암의 존재에 대해 평가될 진단된 피험자에게 진단을 배정하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품.
- 항원 인덱스를 인코딩하는 방법으로서,
(i) 신체 샘플에 존재하는 자가항체와 복합체를 형성하는데 사용될 항원 세트를 포함하는 정보를 얻는 단계;
(ii) 상기 항원의 각각에 대해, 희석률을 지시하는 정보를 얻는 단계로, 적합한 버퍼 용액을 사용하면 상기 희석률에서, 상기 샘플을 정해진 항원 세트와 접촉시켜서 상기 샘플에 존재하는 자가항체와 복합체를 형성하는 것을 포함하는 분석에서 측정가능한 항원-자가항체 복합체 수준이 제공되며, 상기 자가항체는 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 단계;
(iii) 항원 인덱스를 인코딩하는 단계로, 항원 인덱스는 희석률을 지시하는 정보를 관리하며, 항원 인덱스는 키 및 관련된 값을 포함하고, 상기 키는 각각 후보 항원의 존재를 보유하며, 상기 관련된 값은 각각 후보 항원에 대한 희석률을 지시하는 정보를 보유하고, 관심의 항원을 포함하는 쿼리에 대응하여, 상기 인덱스가 관심의 항원에 대한 희석률을 지시하는 정보를 검색하는 단계
를 포함하는 방법. - 프로세서에 의해 실행되었을 때 제 15 항에 따른 방법이 수행되도록 하는 컴퓨터 프로그램 코드가 저장된 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하는, 항원 인덱스를 인코딩하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품.
- 사람 피험자에서 암을 진단하기 위한 키트로서, 상기 키트는
(a) 진단된 피험자의 신체 샘플을 선택적으로 희석하기 위한 버퍼 용액;
(b) 적어도 2개의 항원, 상기 항원은 각각 암의 존재에 대한 정해진 상대적 기여 인자를 특징으로 하며, 상기 정해진 상대적 기여 인자는 레지스터에 보유되는 상대적 기여 인자 행렬을 한정하고; 및
(c) 피험자의 신체 샘플에서 상기 항원에 특이적인 항원-자가항체 복합체를 측정하기 위한 시약 및 수단; 및
(d) 사용 설명서
를 포함하는 키트. - 제 16 항에 있어서, 제 13 항의 컴퓨터 프로그램 제품을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 16 항에 있어서, 제 15 항의 컴퓨터 프로그램 제품을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 16 항에 있어서, 상기 진단된 피험자의 신체 샘플을 상기 항원과 접촉시켜서 상기 샘플의 자가항체와 복합체를 형성함으로써 얻어지는 항원-항체 복합체 수준을 포함하는 측정된 데이터를 프로세싱하기 위한 프로세서 모듈을 포함하며, 상기 프로세싱은 정해진 상대적 기여 인자에 따라서 상기 항원-항체 복합체 수준을 각각 조정함으로써 상기 항원-항체 복합체 수준의 상대적 기여 파라미터를 결정하는 단계, 및 시험 함수 (x) = f(상대적 기여 파라미터)의 값을 결정하는 단계를 포함하고, 이때 건강한 피험자에 대해 미리 확립된 역치보다 높은 상기 (x)의 값은 진단된 피험자가 암에 걸려 있는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 16 항에 있어서, 상기 신체 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 SEQ ID NO. 1 내지 26으로 표시된 항원인 것을 특징으로 하는 키트.
- 분석에서 관심의 희석률에서 항체-항원 복합체의 예측된 광학밀도(OD) 판독값을 결정하기 위한 방법으로서, 상기 분석은 생물학적 샘플을 제공하고, 상기 샘플을 항원 종과 접촉시켜서 상기 샘플에 존재하는 항체와 복합체를 형성하는 것에 따라 분석 장치를 사용하여 수행되고, 상기 항체는 상기 항원 종과 특이적으로 결합할 수 있는 방법에 있어서, 예측된 광학밀도(OD)가
(a) 3개의 상이한 희석률에서 상기 항체-항원 복합체의 적어도 3개의 OD 측정값을 얻음으로써, 적어도 희석률과 배정된 OD 측정값의 적어도 3개 쌍을 포함하는 데이터를 얻는 단계;
(b) 통계적 평활화 과정에 의해서 함수 [OD] = f(희석률)을 결정하는 단계;
(c) f(상기 관심의 희석률)에 대해 [OD]를 결정함으로써, 관심의 희석률에서 항체-항원 복합체의 상기 예측된 광학밀도(OD) 판독값을 얻는 단계
에 의해서 결정되며, 함수 [OD] = f(희석률)에서 적어도 3개의 상이한 희석률 중 하나가 입력된다면, 함수 [OD]는 배정된 측정된 OD 또는 배정된 측정된 OD의 값 근처의 값을 출력하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 23 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 OD 측정값이 모두 분석 장치의 선형 범위 안에 있는지 검증하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 예측된 광학밀도(OD)는 측정 장치의 선형 범위를 벗어날 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190006476A (ko) * | 2016-03-07 | 2019-01-18 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항-p53 항체의 검출 |
| KR20190008786A (ko) * | 2017-07-17 | 2019-01-25 | 김준 | 암 진단기 및 이를 이용한 암 진단시스템 |
| US10526052B2 (en) | 2015-10-27 | 2020-01-07 | Hyundai Heavy Industries Co., Ltd. | Liquefied gas carrier |
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Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| US11544582B2 (en) * | 2016-02-02 | 2023-01-03 | Ambertag, Inc. | Predictive modelling to score customer leads using data analytics using an end-to-end automated, sampled approach with iterative local and global optimization |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10526052B2 (en) | 2015-10-27 | 2020-01-07 | Hyundai Heavy Industries Co., Ltd. | Liquefied gas carrier |
| KR20190006476A (ko) * | 2016-03-07 | 2019-01-18 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항-p53 항체의 검출 |
| KR20190008786A (ko) * | 2017-07-17 | 2019-01-25 | 김준 | 암 진단기 및 이를 이용한 암 진단시스템 |
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