JP6898617B2 - Ｐｒｄｍ１４発現を確認する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から確認する方法に関し、さらに詳細には、（１）該確認方法に使用するための末梢血循環腫瘍細胞バイオマーカー、がんの診断方法、がんの治療薬の有効性および予後を判断する方法、該バイオマーカー検出用試薬を含むキット、末梢血循環腫瘍細胞の同定方法、ならびに、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患の診断方法、該疾患の治療薬の有効性評価方法、該疾患に対する治療方針の決定方法および／または該疾患の治療後の予後の判定方法ならびにそれらの方法に使用し得るがん転移マーカーおよびキットに関する。

ＰＲＤＭ(PR domain-containing protein)１４は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、原始生殖細胞に一過性に発現する核内転写因子として同定され、ＳＥＴドメインとの相同性が高いＰＲドメインおよび６つのＺｎフィンガードメインから構成されている。ＰＲＤＭ１４分子は、乳がん、膵臓がん、非小細胞肺がんなどにおいて腫瘍部位限局的に発現が亢進されているものの、成人正常組織ではその発現が認められない（非特許文献１〜３）。これらのがんに対するバイオマーカーとしてのＰＲＤＭ１４遺伝子産物は、分泌タンパク質でも細胞膜タンパク質でもなく核内に存在することから、血中から容易に検出できる腫瘍マーカーとして取り扱うことは難しい。

Nishikawa N., et al., Cancer Res. (2007) 67(20) pp. 9649-9657 Taniguchi H., et al., Oncotarget (2017) 8(29) pp. 46856-46874 Moriya C., et al., Carcinogenesis (2017) 38(6) pp. 638-648

本発明は、乳がん、膵臓がんまたは非小細胞肺がんを対象から低侵襲的に検出するための方法やバイオマーカーならびにＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患と診断する方法、ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価する方法、前記疾患に対する治療方針を決定する方法および／または前記疾患治療後の予後を判定する方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を続ける中で、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現と相関するものとして、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の３種の分泌タンパク質の血中濃度またはリンパ液中濃度と、末梢血循環腫瘍細胞ＣＴＣ(circulating tumor cells)に着目した。ＣＴＣとは、原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から遊離し血中へ浸潤した腫瘍細胞として知られており、固形がん患者の末梢血中に微小量存在している。
近年、末梢血中のがん細胞の数を測定するＣＴＣ検査が注目されているが、本発明者らは、対象の血中から分離されたＣＴＣのうち、さらに特定の分子を染色することによってＰＲＤＭ１４陽性のＣＴＣを検出できることを見出したこと、さらには、これらの分泌タンパク質のサンプル中の濃度を測定し、本発明者らが初めて特定した基準範囲濃度と比較することで、例えば乳がんなどのＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患と診断するか、ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価するか、前記疾患に対する治療方針を決定するか、および／または、前記疾患治療後の予後を判定することができることを見出したことによって、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の事項に関する。
［１］ ＰＲＤＭ(PR domain-containing protein)１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から、
（１）ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現している末梢血循環腫瘍細胞（ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ）を検出するか、または
（２）レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定する
ことによって確認する方法。
［２］ ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを含む、［１］に記載の確認方法（１）に使用するためのバイオマーカー。
［３］ ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣが、がん幹細胞である、［２］に記載のバイオマーカー。

［４］ 乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんと診断するための、［２］または［３］に記載のバイオマーカー。
［５］ ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんの治療薬として有効であると判断するための、［４］に記載のバイオマーカー。
［６］ 抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断するためのバイオマーカーであって、該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、［４］に記載のバイオマーカー。
［７］ ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定するための、［５］または［６］に記載のバイオマーカー。
［８］ 予後が不良であると判断するための、［４］に記載のバイオマーカー。

［９］ ［２］または［３］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
該対象が、乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんに罹患しているか、または、該がんに罹患していたとの診断を補助する方法。
［１０］ ［４］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断する方法であって、
前記抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、前記方法。
［１１］ ［５］または［６］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定する方法。
［１２］ ［４］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
がん治療後の予後が不良であると判断する方法。

［１３］ ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの有無を判定するためのキットであって、［２］〜［８］のいずれかに記載のバイオマーカーを検出するための試薬を含む、前記キット。
［１４］ 試薬が、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を夫々染色するための試薬である、［１３］に記載のキット。
［１５］ 対象から採取された血液の中から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出するための方法であって、該方法が以下のステップ：
（ｉ）前記血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップ；
（ｉｉ）前記バンドから、抗ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップ；ならびに、
（ｉｉｉ）ＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップ
を含み、
ステップ（ｉｉｉ）において、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチンおよび細胞核は染色されるがＣＤ４５は染色されないＥｐＣＡＭ細胞を、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣであると同定する、前記方法。

［１６］ 対象において、
（Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を補助するか、
（Ｂ）ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価するか、
（Ｃ）前記疾患に対する治療方針の決定を補助するか、および／または、
（Ｄ）前記疾患治療後の予後の判定を補助する
方法であって、該方法が、以下のステップ：
（ｉ）［１］に記載の確認方法（２）を実施するステップ；ならびに、
（ｉｉ）得られた濃度のうち少なくとも１つが基準濃度範囲を満たす場合、
（Ａ）において、対象が前記疾患を有するとの診断を補助し、
（Ｂ）において、前記疾患を有する対象にとって前記治療薬が有効であると評価し、
（Ｃ）において、対象へ前記治療薬を投与するという治療方針の決定を補助し、
（Ｄ）において、前記疾患治療後の予後が良好ではないとの判定を補助する
ステップ
を含む、前記方法。
［１７］ 疾患が、乳がんまたは膵臓がんである、［１６］に記載の方法。

［１８］ 治療薬が、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤を含有する、［１６］または［１７］に記載の方法。
［１９］ 治療薬が、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を含有し、
該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、［１６］または［１７］に記載の方法。
［２０］ サンプルが血液であるとき、
ＬＥＰＲの基準濃度範囲が、４．３ｎｇ／ｍｌ以上であるか、
ＭＤＣの基準濃度範囲が、１１．２ｐｇ／ｍｌ以下であるか、または、
ＩＦＮγの基準濃度範囲が、３．２ｐｇ／ｍｌ以下である、
［１６］〜［１９］のいずれかに記載の方法。

［２１］ 治療薬が、がん分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用される、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２２］ ［２０］に記載の方法に使用するための、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、がん転移マーカー。
［２３］ ［１６］〜［２０］のいずれかに記載の方法に使用するためのキットであって、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む、前記キット。

本発明に係る確認方法（１）に使用するためのバイオマーカーが検出されると、乳がんや膵臓がんなどのがんが存在していることまたは存在していたことが、対象にとって低侵襲かつ簡便に特定され得る。
また、本発明に係る確認方法（２）によると、対象の病変組織を直接採取することなく、血液などの低侵襲性のサンプルから、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を簡便かつ容易に行うことができ、さらにＰＲＤＭ１４を標的とする疾患の治療薬の有効性を評価することで、対象に不要な治療薬を適用することなく、疾患を処置することができる。ＰＲＤＭ１４標的治療薬を投与するという当該疾患に対する治療方針を決定すること、および、当該疾患治療後の予後を判定することができる。その上、それらの方法に使用し得るがん転移マーカーおよびキットもまた提供することができる。

本発明者らは、乳がん患者３６例からＣＴＣの検出を試みたところ、２９例（８０％）からＣＴＣが検出され、このうち約６５％の１９例でＰＲＤＭ１４が陽性であったという知見を得ていることから（実施例１）、本発明に係るバイオマーカーを使用すると、ＰＲＤＭ１４標的治療薬が有効であるか否かについても、かかる治療薬を投与することが治療方針として妥当か否かについても、治療後の予後が不良であるか否かついても、判断することができる。それによって、例えば乳がん患者のうち、ＰＲＤＭ１４陽性または陰性の乳がん患者が区別されるため、夫々の患者に対しより的確な治療を施すことができる。

図１は、本発明に係るＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ同定方法の一態様を模式的に示した図である。 図２は、乳がん患者から採取した血漿中に含まれる腫瘍マーカーＣＡ１５−３の量とＣＴＣ数とを患者ごとに比較したグラフを示す。 図３は、乳がん患者から採取した血漿中に含まれるＣＡ１５−３の量とＣＴＣのＰＲＤＭ１４陽性率とを患者ごとに比較したグラフを示す。 図４は、乳がん患者から採取した血漿中に含まれるＣＡ１５−３の量に対し、ＣＴＣ数およびＣＴＣのＰＲＤＭ１４陽性率を夫々プロットした図である。

図５−１は、膵がん患者の血液中から単離されたＣＴＣの顕微鏡写真を示す。 図５−２は、乳がん患者、膵がん患者の血液中から単離されたＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの顕微鏡写真を示す。 図６は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関する血清バイオマーカーの同定に係る一連のスクリーニング方法を概説した模式図を示す。 図７は、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、例としてＬＥＰＲ遺伝子発現量と相関を検証した実験の結果を示す。 図８は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関する血清バイオマーカーとして同定されたＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγの、ＰＲＤＭ１４高発現および低発現の群の統計学的な有意差を示した箱ひげ図である。箱の上限および下限ならびに箱内側の水平線は夫々、第７５および第２５パーセンタイル値ならびに中央値を示す。上下の水平バーは夫々、第９０および第１０パーセンタイル値を意味する。 図９は、ＰＲＤＭ１４標的治療薬の有効性の指標および当該有効性の評価方法を概説した図である。

以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学に関して用いられる用語およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。本明細書中に参照される全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

また、別記のない限り、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的なおよびより専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992および2000の補遺); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology-4thEd., Wiley & Sons (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990);およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)などが挙げられる。

本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびに、その実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達ならびに対象の処置に用いるものとする。
本明細書においては、別記のない限り、タンパク質の名称はアルファベット大文字またはカタカナで表記し、そのタンパク質をコードする遺伝子は、前記のアルファベット大文字またはカタカナで表記したものに「遺伝子」と付記するか、または前記のアルファベット大文字またはカタカナで表記したものに下線を付して表記するものとする。したがって、別記のない限り、例えば、単に「ＰＲＤＭ１４」と表記した場合には、ＰＲＤＭ１４(PR domain-containing protein 14)そのもの自体であるタンパク質を意味し、「ＰＲＤＭ１４遺伝子」と表記した場合には、ＰＲＤＭ１４をコードする遺伝子を意味し、また、「ＰＲＤＭ１４」と表記した場合もＰＲＤＭ１４をコードする遺伝子を意味する。

本発明において用いられるＰＲＤＭ１４は、上述のとおり、PR domain-containing protein 14（別名ＰＦＭ１１またはＭＧＣ５９７３０）と呼ばれる、ＰＲドメインおよびジンクフィンガードメインを有するタンパク質であり、例として、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列等を例示することができる。

また、本発明において用いられるＰＲＤＭ１４遺伝子には、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または、配列番号２で表される塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ前記の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同等の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが含まれる。ここで、配列番号２で表される塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号２で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等を用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、通常、４２℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。

また、本明細書において、「がん」という用語を「癌腫」に限らない「悪性腫瘍」という意味でも使用する。
なお、異種動物間はもちろんのこと、同種動物間でも、多型、アイソフォーム等によってＰＲＤＭ１４遺伝子の塩基配列に相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＰＲＤＭ１４をコードする限り、ＰＲＤＭ１４遺伝子に含まれる。

本発明において「遺伝子の発現」とは、該遺伝子の転写を起点とし、翻訳まで包含する一連の生体反応をいう。ＰＲＤＭ１４をコードするｍＲＮＡの発現量の定量にあたっては、公知の技術、例えばハイブリダイゼーション技術（ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｃＤＮＡマイクロアレイ等）、遺伝子増幅技術（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等を含む））などを利用することができる。ハイブリダイゼーション技術を用いる場合には、ＰＲＤＭ１４をコードするポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を用いる場合には、当該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。「ＰＲＤＭ１４をコードするポリヌクレオチドまたはその一部」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者が含まれ、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。したがって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれであってもよい。本発明におけるＰＲＤＭ１４をコードするｍＲＮＡの発現量の定量にあたっては、用いられるオリゴヌクレオチドの塩基長は、特に限定されないが、通常１５〜１００塩基、好ましくは１７〜３５塩基であり、また、用いられるポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１０００塩基、好ましくは１５０〜５００塩基である。

ＰＲＤＭ１４の発現量の定量にあたっては、公知の技術、公知のタンパク質解析技術、例えば抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を用いた抗原抗体反応に基づくウェスタンブロッティング法、ドットブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色法（ＩＨＣ）等を利用することができる。「遺伝子の発現が有意に高い」とは、ｍＲＮＡの発現レベル（発現量）および／またはタンパク質を包含するポリペプチドの発現レベル（発現量）が、対照と比較して、統計学的に有意に高い（多い）か、あるいは、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは少なくとも３倍、最も好ましくは少なくとも５倍高い（多い）ことをいう。ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量は、組織や個体間で発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えばβ−アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）を内部標準遺伝子として、この内部標準遺伝子の発現量に基づいて補正することが好ましい。

また、「ＬＥＰＲ」、「ＭＤＣ」および「ＩＦＮγ」と表記した場合には、レプチン受容体(leptin receptor)、マクロファージ由来ケモカイン(macrophage-derived chemokine)およびインターフェロンγ(interferon-gamma)そのもの自体であるタンパク質を夫々意味し、「ＬＥＰＲ遺伝子」、「ＭＤＣ遺伝子」および「ＩＦＮγ遺伝子」と表記した場合には、ＬＥＰＲをコードする遺伝子、ＭＤＣをコードする遺伝子およびＩＦＮγをコードする遺伝子を夫々意味する。さらに、「ＬＥＰＲ」、「ＭＤＣ」および「ＩＦＮγ」と表記した場合も夫々、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγをコードする遺伝子を意味する。

本発明において用いられるＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγは夫々、例として、配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。ここで、配列番号１、２および３の夫々で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号１、２および３の夫々で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列等を例示することができる。

本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から、（１）ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現している末梢血循環腫瘍細胞（ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ）を検出するか、または（２）レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定することによって確認する方法（単に確認方法ともいう）を提供するものである。本発明者らは、ＰＲＤＭファミリーの１４以外のメンバーや癌マーカー、幹細胞マーカーについても、本発明においてこれらがＰＲＤＭ１４に代わってがんの診断等に使用し得るか探索しているが、ＰＲＤＭ１４より有用性を示すものは未だ見出されていない。

＜バイオマーカー＞
本発明はまた、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを含む、確認方法（１）に使用するためのバイオマーカーを提供するものである。
ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣは、がん幹細胞であってもよい。「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞をいい、「幹細胞」とは細胞分裂を経ても分化能を維持している細胞のことをいう。がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素（Hoechst33342）で染色し、フローサイトメトリーを利用してＵＶレーザー（波長約３５０ｎｍ）を励起光に用いて検出すると、サイドポピュレーション(Side Population)（ＳＰ）画分に濃縮される。ＳＰ画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるメインポピュレーション(Main Population)（ＭＰ）画分に対して、ＡＢＣトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分のことを指す。また、幹細胞はＯｃｔ３/４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４などのマーカー分子により特定することもできる。

本発明はまた、一態様において、乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんと診断するための、上記バイオマーカーを提供し、別の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、該対象が、上記がんに罹患しているか、または、上記がんに罹患していたと診断する方法あるいはその診断を補助する方法を提供するものである。

本明細書において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、スナネズミ、モルモットなどの齧歯類、ネコ、ピューマ、トラなどのネコ科動物、シカ、オオシカなどのシカ科動物等の他、ウサギ、イヌ、ミンク、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなど、特に好ましくはヒトを意味する。また別の態様において、対象からヒトを除くこともできる。対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。

さらに本発明は、一態様において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんを治療薬として有効であると判断するための、上記バイオマーカーを提供し、別の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、上記ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんの治療薬として有効であると判断する方法を提供するものである。また、本発明は一態様において、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断するための、上記バイオマーカーを提供し、別の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断する方法を提供するものである。なお、本明細書において、「ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤」および「抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片」を併せて「ＰＲＤＭ１４標的治療薬」ということもある。また、本発明において、抗ＰＲＤＭ１４抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、かかる抗体の断片もまた、抗ＰＲＤＭ１４抗体と同程度にＰＲＤＭ１４タンパク質に結合することができる。なお、ＰＲＤＭ１４標的治療剤としては、特許第5219818号に記載のものを制限なく使用することができる。

ある態様において、本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定するための、上記バイオマーカーを提供し、他の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、上記医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定する方法を提供するものである。また本発明は、さらなる態様において、かかる化学療法を開始後１以上サイクルが終了したとき、血液中のＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの数を化学療法開始前と各サイクル終了後とで比較することによって、期待された治療効果を判定することもできる。

いくつかの態様において、本発明は、がん治療後の予後が不良であると判断するための、上記バイオマーカーを提供し、他の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、がん治療後の予後が不良であると判断あるいはその判断を補助する方法を提供するものである。

＜ＣＴＣの同定方法／キット＞
本発明は、以下のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、対象から採取された血液の中から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出するための方法であって、ステップ（ｉｉｉ）において、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチンおよび細胞核は染色されるがＣＤ４５は染色されないＥｐＣＡＭ細胞を、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣであると同定する方法を提供するものである。
（ｉ）前記血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップ。
（ｉｉ）前記バンドから、抗ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップ。
（ｉｉｉ）ＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップ。

ステップ（ｉ）：
ステップ（ｉ）は、対象から採取された血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップである。
密度勾配遠心法および密度勾配遠心分離媒体は夫々、当該技術分野における血球分離として通常行われるものであれば、とくに限定されない。一態様において、図１に示されるとおり、採取した血液を適宜希釈し、密度勾配遠心分離媒体としてHistopaque（登録商標）-1077（10771、SIGMA-ALDRICH社製）を用いる密度勾配遠心法を実施すると、ＰＢＭＣは血漿と赤血球（Histopaque）との界面でバンド（または層あるいはバフィーコート）を形成する。
ＰＢＭＣが含まれるバンドには、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、顆粒球、樹状細胞などの他に、対象ががんに罹患しているまたはしていた場合ＣＴＣも含まれ得る。

ステップ（ｉｉ）：
ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）で回収されたバンドから、抗ＥｐＣＡＭ(epithelial cell adhesion molecule；上皮細胞接着分子)抗体または抗ＣＤ３２６抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップである。
一態様において、回収されたバンドを再懸濁したものをAbnova社製のCytoQuest（商標）CRシステムにロードすると、ＥｐＣＡＭ陽性細胞は、CytoChipNano（U0095、Abnova社）上に固定化されたＥｐＣＡＭ（KA4439、Abnova社）によって捕捉される。ＣＴＣは、もし存在していても、血液１０ｍＬあたり数個〜数十個程度しか含まれていないため、ステップ（ｉｉ）はＥｐＣＡＭ陽性細胞を濃縮する効果がある。

ステップ（ｉｉｉ）：
ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で単離されたＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップである。
例えば、ＰＲＤＭ１４タンパク質の染色には、例えばAlexa Fluor（登録商標）647などの赤色蛍光色素等で標識された抗ＰＲＤＭ１４抗体などを；サイトケラチン(cytokeratin)（ＣＫ）の染色には、例えばＦＩＴＣなどの緑色蛍光色素等で標識された抗サイトケラチン抗体（例として抗PanCK抗体）などを；ＣＤ４５の染色には、例えばＰＥ（Ｒ−フィコエリスリン）などのオレンジ色蛍光色素等で標識された抗ＣＤ４５（白血球共通抗原ＬＣＡ）抗体などを；細胞核の染色には、例えばＤＮＡに対して強く結合する青色蛍光色素ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）などを用いることができる。
ステップ(ｉｉｉ)で行ってもよい免疫染色については、当該技術分野において通常行われる手順を採用することができる。

ステップ（ｉｉｉ）の結果、
●ＤＡＰＩ陰性かつＣＤ４５陰性のものは、細胞片やゴミ等である。
●ＤＡＰＩ陽性かつＣＤ４５陽性の細胞は、非がんＰＢＭＣである。
●ＤＡＰＩ陽性かつＣＤ４５陰性の細胞は、ＣＴＣであって、
さらにサイトケラチン陽性かつＰＲＤＭ１４陽性であると、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣと特定することができる。
本発明はまた、一態様において、対象の血液から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの有無を判定するためのキットであって、上記バイオマーカーを検出するための試薬を含むキットを提供し、さらなる態様において、かかる試薬として、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を夫々染色するための試薬を含むことができる。さらに本発明のキットは、CytoChipNano（U0095、Abnova社）またはCytoQuest（商標）CR（Abnova社）を含んでもよく、キットの使用説明書も含むことができる。

＜診断方法／有効性評価方法／治療方針の決定方法／予後の判定方法＞
本発明は、対象において、
（Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を補助する方法（本明細書中、単に「診断方法」ともいう。）、
（Ｂ）ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価する方法（本明細書中、単に「有効性評価方法」ともいう。）、
（Ｃ）前記疾患に対する治療方針の決定を補助する方法（本明細書中、単に「治療方針の決定方法」ともいう。）、および／または、
（Ｄ）前記疾患治療後の予後の判定を補助する方法（本明細書中、単に「予後の判定方法」ともいう。）
に関し、これらの方法は夫々、以下のステップ（ｉ）および（ｉｉ）を含む：
（ｉ）本発明に係る確認方法（２）を実施するステップ、すなわち対象から採取された血液またはリンパ液から、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定するステップ。
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で測定して得られた濃度のうち、少なくとも１つが基準濃度範囲を満たす場合、
（Ａ）において、対象が前記疾患を有すると診断し、
（Ｂ）において、前記疾患を有する対象にとって前記治療薬が有効であると評価し、
（Ｃ）において、対象へ前記治療薬を投与するという治療方針を決定し、
（Ｄ）において、前記疾患治療後の予後が良好ではないとの判定を補助する。

「ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患」とは、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）または原始生殖細胞におけるＰＲＤＭ１４の一過性の遺伝子発現を除く、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現が認められる病変を含む疾患であって、好ましくはがんであり、より好ましくは乳がん、すい臓がん、または分化度が低い非小細胞肺がんである。

本明細書において、用語「診断」は、例えば、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患または疾患とその病期とを特定または分類することなどを包含する。診断することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、対象が前記疾患を有するとの診断を補助する方法、またはかかる診断方法である。

本明細書において、用語「治療薬」は、疾患を処置するための任意の薬または剤などであってよく、限定されないが、例えば医薬、医薬組成物、治療剤、内用剤、外用剤などを包含し、さらにがん用治療薬、さらには乳がん用またはすい臓がん用治療薬などをも包含する。なお、治療薬の一態様は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤などである。また特定の態様において、かかる治療薬が、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を含有し、ここで該抗体の断片は、該抗体と同程度にＰＲＤＭ１４タンパク質に結合するものである。なお本明細書中、ＰＲＤＭ１４を標的とするこれらの治療薬を、単に「ＰＲＤＭ１４標的治療薬」ともいい、特許第5219818号に記載のものを制限なく使用することができる。

さらに別の態様において、かかる治療薬は、がん分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用されてもよい。なお、がん分子標的治療となるがんは、上記したＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患に含まれるがんだけでなく、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴うがんから転移したがんも含み得る（ただし、転移したがんは必ずしもＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴うものではない）。かかる転移がんとしては、限定されないが、例えば、乳がんが転移しやすい肺、骨、脳などのがんや、膵がんから転移しやすい肝臓、腹膜などのがんを含む。

なお、本明細書において、用語「処置」は、治療を包含し、さらに疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。また例えば、「処置」は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。

本明細書において、用語「有効性を評価」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などに資するかどうかまたはそれらの効果があるかを判断することであり、資する場合または効果がある場合を有効である、と意味するものである。なお、有効性を評価することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、疾患を有する対象にとって治療薬が有効であると評価する方法である。

本明細書において、用語「治療方針の決定」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを期待して行う処置しうる手段の方向を決めることを意味する。治療方針の決定することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、対象へ治療薬を投与するという治療方針の決定を補助する方法、またはかかる治療方針の決定方法である。

本明細書において、用語「治療後の予後の判定」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などの効果を有するかどうかを予測することを意味する。治療後の予後の判定することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、疾患治療後の予後が良好ではないと判定を補助する方法、またはかかる判定方法である。

本明細書において、用語「良好ではないとの判定」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などが期待できないまたはそれらの効果がないとの判断することを意味する。

「対象から採取されるサンプル」は、好ましくは血液またはリンパ液であり、より好ましくは血液であるが、血清と同じまたはほぼ同じ組成を有する体液であれば、とくに限定されない。

サンプル中の測定されるタンパク質は、好ましくは分泌タンパク質であり、より好ましくはＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγなどである。なお、測定するタンパク質の数は、少なくとも１つであり、好ましくは複数個（例えば２つ、３つ）である。本発明の一態様において、測定されるタンパク質は、例えば、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質でもよく、さらにＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質でもよく、さらにはＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγの夫々のタンパク質を測定してもよい。

また、これら３種のタンパク質のうち１種について濃度を測定した結果、以下の基準濃度範囲を参照してスコアが１であった場合、本発明の方法に係る診断、有効性評価、治療方針の決定、予後の判定を行うことができる。この場合他の２種について濃度を測定する必要はないが、測定した結果、スコアが２や３となれば、診断、有効性評価、治療方針の決定、予後の判定の信ぴょう性が高くなる場合がある。

測定したタンパク質の基準濃度範囲は、例えばＬＥＰＲは、４．３ｎｇ／ｍＬ以上、ＭＤＣは、１１．２ｐｇ／ｍＬ以下、またはＩＦＮγは、３．２ｐｇ／ｍＬ以下などである。また本発明の別の側面は、上記の基準濃度のカットオフ値で、測定値を区切りスコアリングした後、さらにそれらの値を合計し、本発明の診断を補助する方法、有効性を評価する方法、治療方針の決定を補助する方法または予後の判定を補助する方法などに用いてもよい。本発明の特定の態様は、例えばＬＥＰＲのカットオフ値は≦４．３ｎｇ／ｍｌ、＞４．３ｎｇ／ｍｌであり、ＭＤＣのカットオフ値は＜１１．２ｐｇ／ｍｌ、≧１１．２ｐｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγのカットオフ値は＜３．２ｐｇ／ｍｌ、≧３．２ｐｇ／ｍｌなどである。また、例えば、ＬＥＰＲの測定値が、≦４．３ｎｇ／ｍｌのときにスコアを０として、＞４．３ｎｇ／ｍｌのときにスコアを１として、ＭＤＣの測定値が、＜１１．２ｐｇ／ｍｌのときにスコアを１として、≧１１．２ｐｇ／のときにスコアを０として、ＩＦＮγの測定値が、＜３．２ｐｇ／ｍｌのときにスコアを１として、≧３．２ｐｇ／のときにスコアを０として、それぞれのスコアの値を合計して、本発明に用いることができる。合計のスコアが１以上であれば、対象は（Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患に罹患していると診断することができ、（Ｂ）ＰＲＤＭ１４標的治療薬が有効であると評価することができ、（Ｃ）前記疾患に対する治療方針として、ＰＲＤＭ１４標的治療薬を投与するという決定をすることができ、および／または、（Ｄ）前記疾患治療後の予後が不良であると判定することができる。スコアが０である場合は、（Ａ）〜（Ｄ）において行えることが全て「行えない」という結果となる。

タンパク質の濃度を測定する方法は、当該技術分野において既知の任意の方法、好ましくはＥＬＩＳＡなどの方法を用いることができる。

＜がん転移マーカー＞
また、本発明の別の側面は、前記の診断方法、有効性評価方法、治療方針の決定方法および／または予後の判定方法に使用するための、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、がん転移マーカーに関する。

＜キット＞
本発明の別の側面は、前記の診断方法、有効性評価方法、治療方針の決定方法および／または予後の判定方法に使用するためのキットであって、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む、キットに関する。

一態様において、本発明のキットは、限定されずに、例えば、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγなどのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む試薬（例えば、ＬＥＰＲ検出試薬等）、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、診断を補助する方法、有効性を評価する方法、治療方針の決定を補助する方法、または予後の判定を補助する方法に関する指示（例えば、使用説明書、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。

以下の実験例は本発明について、さらに具体的に説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者として通常の知識および技術を有するものは、本発明の精神を逸脱しない範囲で、下記実験例で示された態様に多様な改変を行うことができるが、かかる改変された態様も本発明に含まれる。

＜実施例１＞
本発明に係るＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出する方法において、Abnova社のCytoQuest（登録商標）CRに添付の使用説明書に従い、乳がん患者から採取した２ｍＬ血液３６検体からＣＴＣを検出するとともにその数を計測し、さらに抗ＰＲＤＭ１４抗体（製品コード：ab187881およびab192411；Abcam社）を用いる免疫染色によりＰＲＤＭ１４陽性率を算出した。結果を表１に示す。

表１に記載される全３６検体中、ＣＴＣが１個以上存在したのは２９検体（８０．６％）であり、そのうちＰＲＤＭ１４陽性が１９検体（６５．５％）、ＰＲＤＭ１４陰性が１０検体（３４．４％）であった。ＣＴＣ数とＰＲＤＭ１４陽性率との間に相関は見られないように思われるが（表１）、ＣＴＣ検出が可能であった検体のうち約３分の２がＰＲＤＭ１４陽性であることがわかった。

＜実施例２＞
乳がんの再発・転移の追跡に有用であるとされている腫瘍マーカーＣＡ１５−３と、ＰＲＤＭ１４とを用いて、実施例１と同様にＣＴＣ数を計測しつつ、血漿中のＣＡ１５−３量を測定するとともに、ＰＲＤＭ１４陽性率を算出した。その結果を夫々図２〜４に示す。
血漿中のＣＡ１５−３量とＣＴＣ数およびＰＲＤＭ１４陽性率との間に夫々相関はなかったが（図４）、ＰＲＤＭ１４陽性かつＣＴＣの検出可能であった検体数は、ＣＡ１５−３陽性より多かった。
以下に乳がんの病期とＣＴＣ数およびＰＲＤＭ１４陽性率とを示す。

ＣＡ１５−３が初期の乳がんでは陽性を示すことはほとんどないところ、表２から、ＰＲＤＭ１４は、従来の腫瘍マーカーとは異なり、ステージＩを含む早期の乳がん患者においても、診断に利用できる可能性が示唆された。

＜参考例＞
膵がん患者末梢血からCytoQuest（登録商標）CR（Abnova社）により単離されたＣＴＣの顕微鏡画像を図５−１に、乳がん・膵がん臨床検体から分取されたＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの顕微鏡画像を図５−２に示す。

＜実施例３＞
《ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関するバイオマーカーの同定》
ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関するバイオマーカーの同定に係る一連のスクリーニング方法を図６に模式的に概説する。まず、１次スクリーニングにおいて、２９例の乳がん臨床組織に対し、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現情報を夫々解析し、乳がんにおいて高頻度（約６０％）に遺伝子増幅していると発見したＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と（1）相関係数０．７以上の関連を示し、（2）回帰直線の傾きが０．５〜２．０、（3）データベース上、分泌タンパクであることが知られている、（4）ＥＬＩＳＡキットが入手可能という条件で候補分子を絞った後、２次スクリーニングにおいて、別の５０例の乳がん臨床組織に対するマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現情報を用いる再現性検証を実施した結果、ＬＥＰＲは、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関することが判明した。

また、１次スクリーニングの後に、別の観点、すなわち、血清タンパク質のスクリーニングツールであるサスペンションアレイに搭載可能な分泌タンパクの中から、ＰＲＤＭ１４発現量と強い相関をもつ上位３８タンパクにつき検討した結果、ＭＤＣおよびＩＦＮγがＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関することが判明した。

次に、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量とＬＥＰＲ遺伝子の検証実験を行った（図７）。検証試験は、上記スクリーニング結果を基に、縦軸をＰＲＤＭ１４遺伝子発現量、横軸をＬＥＰＲ遺伝子発現量として、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量とＬＥＰＲ遺伝子発現量との相関を調べた。図７のうち左上図は１次スクリーニングの結果を、右上図は２次スクリーニングの結果を夫々示し、下図は、上記を併せたものに相当する。その結果、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量とＬＥＰＲ遺伝子発現量は、正の相関があることが判明した。

さらに、上記と同様に、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、ＭＤＣまたはＩＦＮγの血中濃度との相関を調べた。その結果、１次スクリーニングの後、サスペンションアレイおよびＥＬＩＳＡによる分泌タンパク遺伝子スクリーニングをしたところ、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、血中ＬＥＰＲ濃度とは、正の相関があり、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、ＭＤＣおよびＩＦＮγの血中濃度とは、負の相関があることが判明した（図８）。すなわち、血液中へのＬＥＰＲ分泌量が多ければ、ＰＲＤＭ１４遺伝子は高発現されていることが分かり、ＭＤＣおよびＩＦＮγの分泌量が夫々少なくても、ＰＲＤＭ１４遺伝子は高発現されていることがわかる。

本明細書に記載された種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、全て本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示に過ぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。

本発明に係るバイオマーカーが対象から検出されると、乳がんや膵臓がんなどのがんが存在していることまたは存在していたことが特定されるとともに、ＰＲＤＭ１４標的治療薬が有効であること、ＰＲＤＭ１４標的治療薬の有効量を含む医薬組成物を投与するという治療方針を決定すること、治療後の予後が不良であることの判断が可能である。さらに、例えば乳がん患者のうち、ＰＲＤＭ１４陽性または陰性の乳がん患者が区別されるので、夫々の患者に対しより的確な治療を施すことができる。
また、本発明の一態様によると、ＰＲＤＭ１４標的治療薬の有効性を評価することができるが、例えば乳がんに罹患している対象の全てがＰＲＤＭ１４遺伝子を発現しているとは限らないことから、ＰＲＤＭ１４標的治療薬を投与する前に、ＰＲＤＭ１４標的治療が対象にとって有効か無効かを判断することができる。

Claims (23)

1. ＰＲＤＭ(PR domain-containing protein)１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から、
   （１）ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現している末梢血循環腫瘍細胞（ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ）を検出するか、または
   （２）レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定する
   ことによって確認する方法。
2. ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを含む、請求項１に記載の確認方法（１）に使用するためのバイオマーカー。
3. ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣが、がん幹細胞である、請求項２に記載のバイオマーカー。
4. 乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんと診断するための、請求項２または３に記載のバイオマーカー。
5. ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんの治療薬として有効であると判断するための、請求項４に記載のバイオマーカー。
6. 抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断するためのバイオマーカーであって、該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、請求項４に記載のバイオマーカー。
7. ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定するための、請求項５または６に記載のバイオマーカー。
8. 予後が不良であると判断するための、請求項４に記載のバイオマーカー。
9. 請求項２または３に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
   該対象が、乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんに罹患しているか、または、該がんに罹患していたとの診断を補助する方法。
10. 請求項４に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
    ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断する方法であって、
    前記抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、前記方法。
11. 請求項５または６に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
    ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定するための方法。
12. 請求項４に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
    がん治療後の予後が不良であると判断するための方法。
13. ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの有無を判定するためのキットであって、請求項２〜８のいずれか一項に記載のバイオマーカーを検出するための試薬を含む、前記キット。
14. 試薬が、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を夫々染色するための試薬である、請求項１３に記載のキット。
15. 対象から採取された血液の中から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出するための方法であって、該方法が以下のステップ：
    （ｉ）前記血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップ；
    （ｉｉ）前記バンドから、抗ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップ；ならびに、
    （ｉｉｉ）ＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップ
    を含み、
    ステップ（ｉｉｉ）において、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチンおよび細胞核は染色されるがＣＤ４５は染色されないＥｐＣＡＭ細胞を、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣであると同定する、前記方法。
16. 対象において、
    （Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を補助するか、
    （Ｂ）ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価するか、
    （Ｃ）前記疾患に対する治療方針の決定を補助するか、および／または、
    （Ｄ）前記疾患治療後の予後の判定を補助する
    方法であって、該方法が、以下のステップ：
    （ｉ）請求項１に記載の確認方法（２）を実施するステップ；ならびに、
    （ｉｉ）得られた濃度のうち少なくとも１つが基準濃度範囲を満たす場合、
    （Ａ）において、対象が前記疾患を有するとの診断を補助し、
    （Ｂ）において、前記疾患を有する対象にとって前記治療薬が有効であると評価し、
    （Ｃ）において、対象へ前記治療薬を投与するという治療方針の決定を補助し、
    （Ｄ）において、前記疾患治療後の予後が良好ではないとの判定を補助する
    ステップ
    を含む、前記方法。
17. 疾患が、乳がんまたは膵臓がんである、請求項１６に記載の方法。
18. 治療薬が、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤を含有する、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 治療薬が、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を含有し、
    該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、請求項１６または１７に記載の方法。
20. サンプルが血液であるとき、
    ＬＥＰＲの基準濃度範囲が、４．３ｎｇ／ｍｌ以上であるか、
    ＭＤＣの基準濃度範囲が、１１．２ｐｇ／ｍｌ以下であるか、または、
    ＩＦＮγの基準濃度範囲が、３．２ｐｇ／ｍｌ以下である、
    請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 治療薬が、がん分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用される、請求項１８または１９に記載の方法。
22. 請求項２０に記載の方法に使用するための、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、がん転移マーカー。
23. 請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む、前記キット。

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