WO2019065609A1 - Ｐｒｄｍ１４発現を確認する方法 - Google Patents

Ｐｒｄｍ１４発現を確認する方法 Download PDF

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今井　浩三
均 前佛
博昭 谷口
杏里 斎藤
洋平 宮城
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国立大学法人 東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for confirming the expression of PRDM14 gene from blood or lymph collected from a subject, and more specifically, (1) a peripheral blood circulating tumor cell biomarker for use in the confirmation method, a cancer Diagnostic method, method for determining the efficacy and prognosis of a therapeutic agent for cancer, kit containing the biomarker detection reagent, method for identifying peripheral blood circulating tumor cells, and method for diagnosing a disease associated with gene expression of PRDM14
  • the present invention relates to a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for a disease, a method for determining a therapeutic course for the disease and / or a method for determining a prognosis after treatment of the disease, and a cancer metastasis marker and kit that can be used for these methods.
  • PRDM (PR domain-containing protein) 14 is identified as a nuclear transcription factor transiently expressed in ES cells (embryonic stem cells) and primordial germ cells, and contains PR domains with high homology with the SET domain and six It consists of a Zn finger domain. Although the expression of PRDM14 molecules is enhanced locally at tumor sites in breast cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer and the like, its expression is not observed in adult normal tissues (Non-patent documents 1 to 3).
  • the PRDM14 gene product as a biomarker for these cancers is not a secreted protein or a cell membrane protein, and is present in the nucleus, so it is difficult to handle it as a tumor marker that can be easily detected from blood.
  • the present invention relates to a method and biomarker for detecting invasively from breast cancer, pancreatic cancer or non-small cell lung cancer from a subject and a method of diagnosing as a disease accompanied by gene expression of PRDM14, PRDM14 targeted disease It is an object of the present invention to provide a method of evaluating the efficacy of a therapeutic agent, a method of determining a therapeutic course for the disease and / or a method of determining the prognosis after treatment of the disease.
  • CTC peripheral blood circulating tumor cells
  • PRDM14-positive CTCs can be detected, and furthermore, the concentrations of these secreted proteins in the sample are measured and compared with the reference range concentrations identified by the present inventors for the first time.
  • concentrations of these secreted proteins in the sample are measured and compared with the reference range concentrations identified by the present inventors for the first time.
  • the present invention relates to the following matters.
  • PRDM PR domain-containing protein
  • PRDM14-positive CTC peripheral blood circulating tumor cells
  • MDC macrophage-derived chemokine
  • IFN ⁇ interferon ⁇
  • the anti-PRDM14 antibody or a fragment thereof is a biomarker for judging that it is effective as a therapeutic agent for cancer, wherein the antibody and the fragment thereof bind to PRDM14 protein, according to [4] Biomarker.
  • a method of determining a cancer treatment policy comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an expression inhibitor of PRDM14 gene or an anti-PRDM14 antibody or a fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an expression inhibitor of PRDM14 gene or an anti-PRDM14 antibody or a fragment thereof.
  • kits for determining the presence or absence of PRDM14-positive CTCs comprising a reagent for detecting a biomarker according to any of [2] to [8].
  • the reagent is a reagent for staining PRDM14 protein, cytokeratin, CD45 and cell nucleus, respectively.
  • a method for detecting PRDM14-positive CTCs from blood collected from a subject comprising the steps of: (I) collecting a band containing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from the blood by density gradient centrifugation; (Ii) isolating EpCAM positive cells from said band using an anti-EpCAM (CD326) antibody; (Iii) Staining PRDM14 protein, cytokeratin, CD45 and cell nuclei on EpCAM positive cells, The method wherein, in step (iii), the EpCAM cells in which PRDM14 protein, cytokeratin and cell nuclei are stained but not CD45 are identified as PRDM14-positive CTCs.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the therapeutic agent comprises an expression inhibitor of PRDM14 gene selected from antisense, siRNA or shRNA that inhibits expression of PRDM14 gene.
  • the therapeutic agent comprises an anti-PRDM 14 antibody or fragment thereof, The method according to [16] or [17], wherein said antibody and fragment thereof bind to PRDM14 protein.
  • the sample is blood, If the reference concentration range of LEPR is 4.3 ng / ml or more, The reference concentration range of MDC is 11.2 pg / ml or less, or The reference concentration range of IFN ⁇ is 3.2 pg / ml or less The method according to any one of [16] to [19].
  • a cancer metastasis marker comprising at least one protein selected from the group consisting of LEPR, MDC and IFN ⁇ , for use in the method described in [20].
  • the presence or presence of a cancer such as breast cancer or pancreatic cancer is less invasive to the subject It can be conveniently identified.
  • diagnosis of a disease accompanied by gene expression of PRDM14 can be easily and easily performed from a low invasive sample such as blood without directly collecting a target lesion tissue.
  • the efficacy of a therapeutic agent for a disease that can be performed and that targets PRDM 14 the disease can be treated without applying an unnecessary therapeutic agent to the subject. It is possible to determine the therapeutic course for the disease of administering a PRDM14-targeted therapeutic agent, and to determine the prognosis after treatment of the disease.
  • cancer metastasis markers and kits that can be used in those methods can also be provided.
  • the present inventors tried to detect CTCs from 36 breast cancer patients, and found CTCs to be detected from 29 cases (80%), of which about 65% of 19 cases were positive for PRDM14. (Example 1), the use of the biomarker according to the present invention also makes it possible to administer such a therapeutic agent as a therapeutic policy whether or not the PRDM 14 targeted therapeutic agent is effective. Also, it can be judged whether the prognosis after treatment is poor or not. As a result, for example, among breast cancer patients, breast cancer patients having PRDM14 positive or negative can be distinguished, so that more appropriate treatment can be given to each patient.
  • FIG. 1 is a view schematically showing one aspect of the PRDM14-positive CTC identification method according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a graph comparing the amount of tumor marker CA15-3 contained in plasma collected from breast cancer patients with the number of CTCs for each patient.
  • FIG. 3 shows a graph comparing the amount of CA15-3 contained in plasma collected from breast cancer patients with the PRDM14 positive rate of CTC for each patient.
  • FIG. 4 is a diagram plotting the number of CTCs and the PRDM14 positive rate of CTCs, respectively, against the amount of CA15-3 contained in plasma collected from breast cancer patients.
  • FIG. 5-1 shows a photomicrograph of CTC isolated from the blood of a patient with pancreatic cancer.
  • FIG. 5-2 shows photomicrographs of PRDM14-positive CTCs isolated from blood of breast cancer patients and pancreatic cancer patients.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram outlining a series of screening methods for the identification of serum biomarkers that correlate with the expression level of the PRDM14 gene.
  • FIG. 7 shows the results of experiments in which the correlation between the PRDM14 gene expression level and the LEPR gene expression level as an example was verified.
  • FIG. 8 is a box and whisker plot showing statistical significant differences in PRDM14 high expression and low expression groups of LEPR, MDC and IFN ⁇ identified as serum biomarkers correlated with the expression level of PRDM 14 gene.
  • FIG. 9 is a diagram outlining an index of the efficacy of a PRDM14-targeted therapeutic agent and a method of evaluating the efficacy.
  • PRDM14 means a protein that is PRDM14 (PR domain-containing protein 14) itself, and when described as “PRDM14 gene”, PRDM14
  • PRDM14 also refers to the gene encoding PRDM14.
  • PRDM14 used in the present invention is a protein having a PR domain and a zinc finger domain, called PR domain-containing protein 14 (alias PFM11 or MGC59730), for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 1
  • PR domain-containing protein 14 alias PFM11 or MGC59730
  • SEQ ID NO: 1 the amino acid represented by SEQ ID NO: 1
  • proteins that contain an amino acid sequence that is identical or substantially identical to the sequence are proteins that contain an amino acid sequence that is identical or substantially identical to the sequence.
  • an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • An amino acid sequence having a homology of% or more, more preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more can be exemplified.
  • the PRDM14 gene used in the present invention is, for example, a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a hybridization specifically under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 Included are DNAs encoding proteins having substantially the same properties as the proteins containing the base sequence to be soyed and containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 above.
  • the DNA or the like contains a base sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 98% or more Can be used.
  • the “stringent conditions” are usually the conditions of 42 ° C., 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS, preferably 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS. is there.
  • cancer is also used to mean “malignant tumor” which is not limited to “carcinoma”.
  • cancer is also used to mean "malignant tumor” which is not limited to “carcinoma”.
  • gene expression refers to a series of biological reactions that start from transcription of the gene and include translation.
  • known techniques such as hybridization techniques (Northern hybridization method, dot hybridization method, RNase protection assay, cDNA microarray, etc.), gene amplification techniques (reverse transcription polymerase chain reaction) (RT-PCR) (including competitive RT-PCR, real-time PCR, etc.) and the like can be used.
  • oligonucleotides or polynucleotides capable of hybridizing to a polynucleotide encoding PRDM14 or a part thereof can be used as a probe, and when using gene amplification techniques, such oligonucleotides Alternatively, polynucleotides can be used as primers.
  • the “polynucleotide encoding PRDM14 or a part thereof” includes both DNA and RNA, and includes, for example, mRNA, cDNA, cRNA and the like.
  • the nucleotides constituting the oligonucleotide or polynucleotide may be either deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • the base length of the oligonucleotide to be used for quantifying the expression level of mRNA encoding PRDM14 in the present invention is not particularly limited, but is usually 15 to 100 bases, preferably 17 to 35 bases, and it is also possible to use
  • the base length of the nucleotide is not particularly limited, but is usually 50 to 1000 bases, preferably 150 to 500 bases.
  • the expression of the gene is significantly high” means that the expression level of the mRNA (expression amount) and / or the expression level of the polypeptide including the protein (expression amount) is statistically significant compared to the control. High (more), or preferably at least 1.5 times, more preferably at least 2 times, more preferably at least 3 times, most preferably at least 5 times higher (more).
  • the expression level of the PRDM14 gene is based on the expression level of the internal standard gene, using as an internal standard gene a gene whose expression level does not greatly fluctuate between tissues or individuals (for example, a housekeeping gene such as ⁇ -actin gene, GAPDH gene). It is preferable to correct.
  • LPR gene the protein which is a leptin receptor
  • macrophage origin chemokine macrophage-derived chemokine
  • interferon gamma interferon-gamma
  • Examples of LEPR, MDC and IFN ⁇ used in the present invention include, for example, proteins containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 and 3.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 is about 70% or more of the amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3.
  • the amino acid sequence etc. which preferably have about 80% or more, more preferably about 90% or more, still more preferably about 95% or more, most preferably about 98% or more of homology can be exemplified.
  • the present invention detects the expression of PRDM14 gene from blood or lymph collected from a subject, (1) detecting peripheral blood circulating tumor cells (PRDM14-positive CTC) expressing PRDM14 gene, or (2) leptin reception
  • PRDM14-positive CTC peripheral blood circulating tumor cells
  • MDC macrophage-derived chemokine
  • IFN ⁇ interferon ⁇
  • the present inventors have also investigated whether members other than 14 of the PRDM family, cancer markers and stem cell markers can be used for diagnosis of cancer etc. in place of PRDM 14 in the present invention, but more useful than PRDM 14 No indication of sex has yet been found.
  • the present invention also provides a biomarker for use in the confirmation method (1), including PRDM14 positive CTC.
  • PRDM14-positive CTCs may be cancer stem cells.
  • Cancer stem cells refer to cells having the stem cell property among cancer cells, and “stem cells” refer to cells maintaining differentiation ability even after cell division.
  • Cancer stem cells are stained with Hoechst fluorescent dye (Hoechst 33342), and flow cytometry is used for detection using a UV laser (wavelength about 350 nm) as excitation light, and the Side Population (SP) fraction Concentrated to The SP fraction refers to the fraction that is not stained by discharging the dye outside the cell via the ABC transporter or the like to the Main Population (MP) fraction that is stained by the Hoechst fluorescent dye.
  • Point to Stem cells can also be identified by marker molecules such as Oct3 / 4, Nanog, SSEA1 and SSEA4.
  • the present invention also provides, in one aspect, the above biomarker for diagnosing at least one type of cancer selected from the group consisting of breast cancer, pancreatic cancer and non-small cell lung cancer, and in another aspect, The present invention provides a method for diagnosing that the subject suffers from the cancer, or that the subject suffers from the cancer when the biomarker is detected from the subject, or provides a method for assisting the diagnosis thereof. .
  • the term "subject" refers to any living individual, preferably a vertebrate, more preferably a mammal, eg, a rodent, such as a mouse, a rat, a gerbil, a guinea pig, a feline such as a cat, a pumer, a tiger, etc.
  • a rodent such as a mouse, a rat, a gerbil, a guinea pig, a feline such as a cat, a pumer, a tiger, etc.
  • deer, deer animals such as deer, etc., rabbits, dogs, minks, sheep, goats, cattle, horses, monkeys, humans and the like, particularly preferably humans.
  • a human can be excluded from the subject.
  • the subject may be healthy or may suffer from any disease, but when treatment of the disease is intended, typically the disease is or is at risk of suffering from the disease Means an object.
  • the present invention provides, in one aspect, an antisense that inhibits expression of the PRDM14 gene, an expression inhibitor of the PRDM14 gene selected from siRNA or shRNA, in which the cancer is judged to be effective as a therapeutic agent.
  • the present invention provides a biomarker, and in another aspect, provides a method for determining that the PRDM14 gene expression inhibitor is effective as a therapeutic agent for cancer when the biomarker is detected from a subject. .
  • the present invention also provides, in one aspect, the above-mentioned biomarker for judging that an anti-PRDM 14 antibody or a fragment thereof is effective as a therapeutic agent for cancer, and in another aspect, the above-mentioned biomarker from a subject When detected, the anti-PRDM14 antibody or a fragment thereof provides a method for determining that it is effective as a therapeutic agent for cancer.
  • the “expression inhibitor of PRDM14 gene” and the “anti-PRDM14 antibody or fragment thereof” may be collectively referred to as “PRDM14-targeted therapeutic agent”.
  • the anti-PRDM14 antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and a fragment of such an antibody can also bind to the PRDM14 protein to the same extent as the anti-PRDM14 antibody.
  • PRDM14 target therapeutic agent the thing of patent 5219818 can be used without a restriction
  • the present invention relates to the above-mentioned biomarker for determining a cancer treatment strategy of administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an expression inhibitor of PRDM14 gene or an anti-PRDM14 antibody or a fragment thereof
  • the present invention provides a method of determining a cancer treatment policy of administering the pharmaceutical composition to a subject when the biomarker is detected from the subject.
  • the present invention is also expected in a further aspect, by comparing the number of PRDM14-positive CTCs in the blood before the start of chemotherapy and after the end of each cycle, when one or more cycles after starting such chemotherapy have ended. The therapeutic effect can also be determined.
  • the present invention provides the above biomarker for determining that the prognosis after cancer treatment is poor, and in other embodiments, when the above biomarker is detected from a subject, It provides a method to judge or assist the judgment that the prognosis after cancer treatment is poor.
  • the present invention provides a method for detecting PRDM14-positive CTCs from blood collected from a subject, comprising the following steps (i) to (iii), wherein in step (iii) PRDM 14 protein, site It provides a method to identify EpCAM cells in which keratin and cell nuclei are stained but not CD45 are identified as PRDM14 positive CTCs.
  • PRDM 14 protein site It provides a method to identify EpCAM cells in which keratin and cell nuclei are stained but not CD45 are identified as PRDM14 positive CTCs.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Ii isolating EpCAM positive cells from the band using an anti-EpCAM (CD326) antibody.
  • Step (i) is a step of collecting a band containing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from the blood collected from the subject by density gradient centrifugation.
  • the density gradient centrifugation and the density gradient centrifugation medium are not particularly limited as long as they are commonly performed as blood cell separation in the art.
  • the collected blood is appropriately diluted and density gradient centrifugation is performed using Histopaque®-1077 (10771, manufactured by SIGMA-ALDRICH) as a density gradient centrifugation medium.
  • Histopaque®-1077 10771, manufactured by SIGMA-ALDRICH
  • PBMCs form a band (or layer or buffy coat) at the interface between plasma and erythrocytes (Histopaque).
  • Bands containing PBMCs can include T cells, B cells, monocytes, granulocytes, dendritic cells, etc., as well as CTCs when the subject suffers from or has cancer.
  • Step (ii) is a step of isolating EpCAM-positive cells from the band recovered in step (i) using an anti-EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) antibody or an anti-CD326 antibody .
  • EpCAM-positive cells are EpCAM (KA4439) immobilized on CytoChipNano (U0095, Abnova). , Abnova, Inc.).
  • Step (ii) has the effect of concentrating EpCAM-positive cells, since CTCs, if present, contain only a few to a few tens per 10 mL of blood.
  • Step (iii) is a step of staining PRDM14 protein, cytokeratin, CD45 and cell nuclei on the EpCAM-positive cells isolated in step (ii).
  • an anti-PRDM14 antibody labeled with a red fluorescent dye or the like such as Alexa Fluor (registered trademark) 647
  • cytokeratin (CK) for staining of cytokeratin (CK)
  • FITC Anti-cytokeratin antibody eg, anti-PanCK antibody
  • Anti-CD45 labeled with an orange fluorescent dye or the like such as PE (R-phycoerythrin) for staining with CD45
  • a blue fluorescent dye DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) which strongly binds to DNA can be used for staining of cell nuclei.
  • DAPI blue fluorescent dye
  • ⁇ DAPI negative and CD45 negative are cell debris and dust.
  • -DAPI positive and CD45 positive cells are non-cancer PBMC.
  • ⁇ DAPI positive and CD45 negative cells are CTCs, Furthermore, it can be identified as PRDM14 positive CTC as cytokeratin positive and PRDM14 positive.
  • the present invention also provides, in one aspect, a kit for determining the presence or absence of PRDM14-positive CTC from the blood of a subject, comprising a reagent for detecting the above-mentioned biomarker, and in a further aspect As reagents, PRDM14 protein, cytokeratin, CD45 and reagents for staining cell nuclei can be included, respectively.
  • the kit of the present invention may contain CytoChipNano (U0095, Abnova) or CytoQuestTM CR (Abnova), and may also include instructions for using the kit.
  • the present invention relates to (A) A method for assisting diagnosis of a disease associated with gene expression of PRDM14 (herein also simply referred to as “diagnostic method”), (B) A method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for the aforementioned disease targeting PRDM 14 (herein also referred to simply as “method for evaluating efficacy”), (C) A method for aiding in the determination of a therapeutic course for the above-mentioned disease (herein also referred to simply as a “method for determining a therapeutic course”) and / or (D) A method for aiding in the determination of prognosis after the treatment of the disease (herein also referred to simply as “a method of determination of prognosis”).
  • each of these methods involves the following steps (i) and (ii): (I) performing the confirmation method (2) according to the present invention, that is, measuring the concentration of at least one protein selected from the group consisting of LEPR, MDC and IFN ⁇ from blood or lymph collected from a subject . (Ii) When at least one of the concentrations obtained by measurement in step (i) satisfies the reference concentration range, In (A), the subject is diagnosed as having the disease, In (B), the therapeutic agent is evaluated to be effective for a subject having the disease, In (C), decide on a treatment policy of administering the therapeutic agent to the subject, In (D), it is determined that the prognosis after the treatment of the disease is not good.
  • the “diseases with gene expression of PRDM14” are diseases including lesions in which gene expression of PRDM14 is observed except for transient gene expression of PRDM14 in ES cells (embryonic stem cells) or primordial germ cells, Preferably, it is cancer, more preferably breast cancer, pancreatic cancer, or non-small cell lung cancer with a low degree of differentiation.
  • diagnosis includes, for example, identifying or classifying a disease or disorder associated with gene expression of PRDM14 and its stage.
  • One aspect of diagnosing is measuring a protein in a sample collected from a subject, and when the obtained concentration satisfies a reference concentration range, a method for aiding in the diagnosis that the subject has the disease, or a method for diagnosing such It is a method.
  • the term "therapeutic agent” may be any drug or agent for treating a disease, such as, but not limited to, for example, a drug, a pharmaceutical composition, a therapeutic agent, an internal agent, an external agent, etc. And further includes a therapeutic agent for cancer, and further a therapeutic agent for breast cancer or pancreatic cancer.
  • the therapeutic agent is an antisense that inhibits expression of the PRDM14 gene, an expression inhibitor of the PRDM14 gene selected from siRNA or shRNA, and the like.
  • such a therapeutic agent comprises an anti-PRDM14 antibody or fragment thereof, wherein a fragment of said antibody binds to PRDM14 protein as well as said antibody.
  • these therapeutic agents targeting PRDM14 may be simply referred to as "PRDM14-targeted therapeutic agents", and those described in Patent No. 5219818 can be used without limitation.
  • such a therapeutic agent may be used in companion diagnostics for targeted cancer molecule therapy.
  • the cancer to be targeted for the cancer molecule target treatment may include not only the cancer included in the disease accompanied by the gene expression of PRDM14 described above but also the cancer metastasized from the cancer accompanied by the gene expression of PRDM14 (but metastasized Cancer does not necessarily involve gene expression of PRDM14).
  • Such metastatic cancer includes, but is not limited to, for example, cancers such as lung, bone and brain where breast cancer is likely to metastasize, and cancers such as liver and peritoneum which easily metastasize from pancreatic cancer.
  • treatment includes treatment, and further, all medically acceptable types of prophylactic and / or therapeutic purpose for curing, temporary remission or prevention of disease etc. Includes interventions. Also, for example, “treatment” includes medically acceptable interventions of various purposes, including delaying or stopping the progression of the disease, regression or disappearance of the lesion, prevention of the onset of the disease or prevention of recurrence.
  • evaluating efficacy refers to determining whether or not there is a cure, temporary remission or prevention of a disease, or the like, and in the case of being or if there is an effect. Is meant to be effective. Note that one aspect of evaluating the efficacy is to measure the protein in the sample collected from the subject, and if the obtained concentration satisfies the reference concentration range, the therapeutic agent is effective for the subject having the disease. It is a method to evaluate.
  • determining the course of treatment means determining the direction of a treatable means in anticipation of a cure, a temporary remission or prevention of a disease.
  • One aspect of determining the therapeutic course is to measure the protein in the sample collected from the subject, and when the obtained concentration satisfies the reference concentration range, assist in determining the therapeutic course to administer the therapeutic agent to the subject Or a method of determining such a treatment strategy.
  • determining the prognosis after treatment means to predict whether the disease has an effect such as curing, temporary remission or prevention.
  • One aspect of determining the prognosis after treatment is to measure the protein in a sample collected from the subject, and if the obtained concentration satisfies the reference concentration range, it is determined that the prognosis after treatment of the disease is not good. It is a method to assist or such a determination method.
  • determining not good means determining that the cure, temporary remission or prevention of the disease can not be expected or that there is no effect.
  • sample collected from the subject is preferably blood or lymph, more preferably blood, but is not particularly limited as long as it is a body fluid having the same or substantially the same composition as serum.
  • the protein to be measured in the sample is preferably a secreted protein, more preferably LEPR, MDC and IFN ⁇ .
  • the number of proteins to be measured is at least one, and preferably a plurality (eg, two or three).
  • the protein to be measured may be, for example, at least one protein selected from the group consisting of LEPR, MDC and IFN ⁇ , and further at least two selected from the group consisting of LEPR, MDC and IFN ⁇ It may be a protein, and furthermore, each protein of LEPR, MDC and IFN ⁇ may be measured.
  • the diagnosis, efficacy evaluation, and treatment policy according to the method of the present invention It is possible to make decisions and make a prognosis decision. In this case, it is not necessary to measure the concentration for the other two types, but if the result is 2 or 3 as a result of the measurement, diagnosis, effectiveness evaluation, treatment policy determination, and prognosis judgment will be highly reliable. There is.
  • the reference concentration range of the measured protein is, for example, 4.3 ng / mL or more for LEPR, 11.2 pg / mL or less for MDC, or 3.2 pg / mL or less for IFN ⁇ .
  • another aspect of the present invention is a method for evaluating the effectiveness of the method of assisting diagnosis of the present invention by dividing measured values by the above-mentioned reference concentration cut-off value, scoring them, and then totaling those values. It may be used as a method, a method of aiding in the determination of a treatment course, or a method of aiding in the determination of prognosis.
  • Specific embodiments of the invention are, for example, LEPR cutoff values ⁇ 4.3 ng / ml,> 4.3 ng / ml, MDC cutoff values ⁇ 11.2 pg / ml, 11.211.2 pg / ml
  • the cutoff value of IFN ⁇ is ⁇ 3.2 pg / ml, 3.2 3.2 pg / ml, etc.
  • the score when the measured value of LEPR is ⁇ 4.3 ng / ml, the score is 0, when> 4.3 ng / ml, the score is 1 and the measured MDC is ⁇ 11.2 pg / ml When score is 1 when score is 11.211.2pg / When score is 0 when IFN ⁇ is ⁇ 3.2pg / ml, when score is ⁇ 3.2pg / when score is 1
  • the value of each score can be summed up with 0 as 0 and used in the present invention. If the total score is 1 or more, the subject can be diagnosed as (A) suffering from a disease accompanied by gene expression of PRDM14, and (B) it may be evaluated that the PRDM14-targeted therapeutic agent is effective.
  • the method of measuring the concentration of protein may be any method known in the art, preferably a method such as ELISA.
  • ⁇ Cancer metastasis marker> another aspect of the present invention is selected from the group consisting of LEPR, MDC and IFN ⁇ , for use in the aforementioned diagnostic method, efficacy evaluation method, treatment strategy determination method and / or prognosis determination method.
  • the present invention relates to a cancer metastasis marker comprising at least one protein.
  • kits for use in the aforementioned diagnostic method, efficacy evaluation method, treatment strategy determination method and / or prognosis determination method which is selected from the group consisting of LEPR, MDC and IFN ⁇
  • a kit comprising an antibody or fragment thereof that binds to at least one protein of interest.
  • the kit of the present invention is not limited to, for example, reagents (eg, LEPR detection reagents etc.) including antibodies or fragments thereof that bind to proteins such as LEPR, MDC and IFN ⁇ , instruments (eg, pipettes , Syringes, etc.), methods for assisting diagnosis, methods for evaluating efficacy, methods for assisting in the determination of treatment plan, or instructions on methods for assisting in the determination of prognosis (eg, instruction manual, information on usage)
  • Media such as a flexible disk, a CD, a DVD, a Blu-ray disk, a memory card, a USB memory, etc., may be included.
  • Example 1 In the method for detecting PRDM14-positive CTCs according to the present invention, CTCs are detected and counted in 36 samples of 2 mL blood collected from breast cancer patients according to the instruction manual attached to CytoQuest (registered trademark) CR of Abnova. Furthermore, the PRDM14 positive rate was calculated by immunostaining using an anti-PRDM14 antibody (product code: ab187881 and ab192411; Abcam). The results are shown in Table 1.
  • Example 2 Using the tumor marker CA15-3 that is said to be useful for tracking recurrence / metastasis of breast cancer and PRDM14, while measuring the number of CTCs as in Example 1, measure the amount of CA15-3 in plasma Then, the PRDM14 positive rate was calculated. The results are shown in FIGS. 2 to 4 respectively. There was no correlation between the amount of CA15-3 in the plasma and the number of CTCs and the rate of positive for PRDM14 (Fig. 4), but the number of specimens positive for PRDM14 and detectable for CTC was greater than that for CA15-3. . The following shows the stage of breast cancer, the number of CTCs, and the PRDM14 positive rate.
  • Fig. 5-1 shows a microscope image of CTC isolated from peripheral blood of a patient with pancreatic cancer by CytoQuest (registered trademark) CR (Abnova), and a microscope of PRDM14-positive CTC collected from a breast cancer / pancreatic cancer clinical specimen. The image is shown in Figure 5-2.
  • Example 3 Identification of biomarkers correlated with the expression level of PRDM14 gene >> A series of screening methods for identifying biomarkers correlated with the expression level of the PRDM14 gene is schematically outlined in FIG. First, in the primary screening, comprehensive gene expression information was analyzed by microarray for each of 29 breast cancer clinical tissues, and PRDM14 gene was found to be amplified at a high frequency (about 60%) in breast cancer.
  • the expression level is related to (1) a correlation coefficient of 0.7 or more, (2) the slope of the regression line is 0.5 to 2.0, and (3) it is known to be a secreted protein on the database (4) After narrowing down the candidate molecules under the condition that the ELISA kit is available, the results of the reproducibility verification using the comprehensive gene expression information by the microarray for another 50 breast cancer clinical tissues in the secondary screening , LEPR was found to be correlated with the expression level of PRDM14 gene.
  • FIG. 7 shows the correlation between the PRDM14 gene expression level and the LEPR gene expression level was examined with the PRDM14 gene expression level on the vertical axis and the LEPR gene expression level on the horizontal axis based on the above screening results.
  • the upper left figure in FIG. 7 shows the result of the primary screening, the upper right figure shows the result of the secondary screening, and the lower figure corresponds to the combination of the above.
  • the PRDM14 gene expression level and the LEPR gene expression level have a positive correlation.
  • the biomarker according to the present invention When the biomarker according to the present invention is detected from the subject, the presence or presence of cancer such as breast cancer or pancreatic cancer is identified, and the PRDM 14-targeted therapeutic drug is effective. It is possible to determine a therapeutic course of administering a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a PRDM14-targeted therapeutic agent, and to judge that the prognosis after treatment is poor. Furthermore, for example, among breast cancer patients, breast cancer patients having PRDM14 positive or negative can be distinguished, so that more appropriate treatment can be given to each patient. In addition, according to one aspect of the present invention, although the efficacy of a PRDM14-targeted therapeutic agent can be evaluated, for example, not all subjects suffering from breast cancer express the PRDM14 gene. Prior to administering a PRDM14-targeted therapeutic agent, it can be determined whether the PRDM14-targeted treatment is effective or ineffective for the subject.

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Abstract

本発明は、一態様において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から、（１）ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現しているＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出するか、または（２）レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定することによって確認する方法に関する。

Description

ＰＲＤＭ１４発現を確認する方法
　本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から確認する方法に関し、さらに詳細には、（１）該確認方法に使用するための末梢血循環腫瘍細胞バイオマーカー、がんの診断方法、がんの治療薬の有効性および予後を判断する方法、該バイオマーカー検出用試薬を含むキット、末梢血循環腫瘍細胞の同定方法、ならびに、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患の診断方法、該疾患の治療薬の有効性評価方法、該疾患に対する治療方針の決定方法および／または該疾患の治療後の予後の判定方法ならびにそれらの方法に使用し得るがん転移マーカーおよびキットに関する。
　ＰＲＤＭ(PR domain-containing protein)１４は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、原始生殖細胞に一過性に発現する核内転写因子として同定され、ＳＥＴドメインとの相同性が高いＰＲドメインおよび６つのＺｎフィンガードメインから構成されている。ＰＲＤＭ１４分子は、乳がん、膵臓がん、非小細胞肺がんなどにおいて腫瘍部位限局的に発現が亢進されているものの、成人正常組織ではその発現が認められない（非特許文献１～３）。これらのがんに対するバイオマーカーとしてのＰＲＤＭ１４遺伝子産物は、分泌タンパク質でも細胞膜タンパク質でもなく核内に存在することから、血中から容易に検出できる腫瘍マーカーとして取り扱うことは難しい。
Nishikawa N., et al., Cancer Res. (2007) 67(20) pp. 9649-9657 Taniguchi H., et al., Oncotarget (2017) 8(29) pp. 46856-46874 Moriya C., et al., Carcinogenesis (2017) 38(6) pp. 638-648
　本発明は、乳がん、膵臓がんまたは非小細胞肺がんを対象から低侵襲的に検出するための方法やバイオマーカーならびにＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患と診断する方法、ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価する方法、前記疾患に対する治療方針を決定する方法および／または前記疾患治療後の予後を判定する方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を続ける中で、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現と相関するものとして、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の３種の分泌タンパク質の血中濃度またはリンパ液中濃度と、末梢血循環腫瘍細胞ＣＴＣ(circulating tumor cells)に着目した。ＣＴＣとは、原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から遊離し血中へ浸潤した腫瘍細胞として知られており、固形がん患者の末梢血中に微小量存在している。
　近年、末梢血中のがん細胞の数を測定するＣＴＣ検査が注目されているが、本発明者らは、対象の血中から分離されたＣＴＣのうち、さらに特定の分子を染色することによってＰＲＤＭ１４陽性のＣＴＣを検出できることを見出したこと、さらには、これらの分泌タンパク質のサンプル中の濃度を測定し、本発明者らが初めて特定した基準範囲濃度と比較することで、例えば乳がんなどのＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患と診断するか、ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価するか、前記疾患に対する治療方針を決定するか、および／または、前記疾患治療後の予後を判定することができることを見出したことによって、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の事項に関する。
［１］　ＰＲＤＭ(PR domain-containing protein)１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から、
（１）ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現している末梢血循環腫瘍細胞（ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ）を検出するか、または
（２）レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定する
ことによって確認する方法。
［２］　ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを含む、［１］に記載の確認方法（１）に使用するためのバイオマーカー。
［３］　ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣが、がん幹細胞である、［２］に記載のバイオマーカー。
［４］　乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんと診断するための、［２］または［３］に記載のバイオマーカー。
［５］　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんの治療薬として有効であると判断するための、［４］に記載のバイオマーカー。
［６］　抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断するためのバイオマーカーであって、該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、［４］に記載のバイオマーカー。
［７］　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定するための、［５］または［６］に記載のバイオマーカー。
［８］　予後が不良であると判断するための、［４］に記載のバイオマーカー。
［９］　［２］または［３］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
　該対象が、乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんに罹患しているか、または、該がんに罹患していたとの診断を補助する方法。
［１０］　［４］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断する方法であって、
　前記抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、前記方法。
［１１］　［５］または［６］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定する方法。
［１２］　［４］に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
　がん治療後の予後が不良であると判断する方法。
［１３］　ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの有無を判定するためのキットであって、［２］～［８］のいずれかに記載のバイオマーカーを検出するための試薬を含む、前記キット。
［１４］　試薬が、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を夫々染色するための試薬である、［１３］に記載のキット。
［１５］　対象から採取された血液の中から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出するための方法であって、該方法が以下のステップ：
（ｉ）前記血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップ；
（ｉｉ）前記バンドから、抗ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップ；ならびに、
（ｉｉｉ）ＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップ
を含み、
　ステップ（ｉｉｉ）において、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチンおよび細胞核は染色されるがＣＤ４５は染色されないＥｐＣＡＭ細胞を、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣであると同定する、前記方法。
［１６］　対象において、
（Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を補助するか、
（Ｂ）ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価するか、
（Ｃ）前記疾患に対する治療方針の決定を補助するか、および／または、
（Ｄ）前記疾患治療後の予後の判定を補助する
方法であって、該方法が、以下のステップ：
　（ｉ）［１］に記載の確認方法（２）を実施するステップ；ならびに、
　（ｉｉ）得られた濃度のうち少なくとも１つが基準濃度範囲を満たす場合、
（Ａ）において、対象が前記疾患を有するとの診断を補助し、
（Ｂ）において、前記疾患を有する対象にとって前記治療薬が有効であると評価し、
（Ｃ）において、対象へ前記治療薬を投与するという治療方針の決定を補助し、
（Ｄ）において、前記疾患治療後の予後が良好ではないとの判定を補助する
ステップ
を含む、前記方法。
［１７］　疾患が、乳がんまたは膵臓がんである、［１６］に記載の方法。
［１８］　治療薬が、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤を含有する、［１６］または［１７］に記載の方法。
［１９］　治療薬が、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を含有し、
該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、［１６］または［１７］に記載の方法。
［２０］　サンプルが血液であるとき、
ＬＥＰＲの基準濃度範囲が、４．３ｎｇ／ｍｌ以上であるか、
ＭＤＣの基準濃度範囲が、１１．２ｐｇ／ｍｌ以下であるか、または、
ＩＦＮγの基準濃度範囲が、３．２ｐｇ／ｍｌ以下である、
［１６］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］　治療薬が、がん分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用される、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２２］　［２０］に記載の方法に使用するための、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、がん転移マーカー。
［２３］　［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法に使用するためのキットであって、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む、前記キット。
　本発明に係る確認方法（１）に使用するためのバイオマーカーが検出されると、乳がんや膵臓がんなどのがんが存在していることまたは存在していたことが、対象にとって低侵襲かつ簡便に特定され得る。
　また、本発明に係る確認方法（２）によると、対象の病変組織を直接採取することなく、血液などの低侵襲性のサンプルから、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を簡便かつ容易に行うことができ、さらにＰＲＤＭ１４を標的とする疾患の治療薬の有効性を評価することで、対象に不要な治療薬を適用することなく、疾患を処置することができる。ＰＲＤＭ１４標的治療薬を投与するという当該疾患に対する治療方針を決定すること、および、当該疾患治療後の予後を判定することができる。その上、それらの方法に使用し得るがん転移マーカーおよびキットもまた提供することができる。
　本発明者らは、乳がん患者３６例からＣＴＣの検出を試みたところ、２９例（８０％）からＣＴＣが検出され、このうち約６５％の１９例でＰＲＤＭ１４が陽性であったという知見を得ていることから（実施例１）、本発明に係るバイオマーカーを使用すると、ＰＲＤＭ１４標的治療薬が有効であるか否かについても、かかる治療薬を投与することが治療方針として妥当か否かについても、治療後の予後が不良であるか否かついても、判断することができる。それによって、例えば乳がん患者のうち、ＰＲＤＭ１４陽性または陰性の乳がん患者が区別されるため、夫々の患者に対しより的確な治療を施すことができる。
図１は、本発明に係るＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ同定方法の一態様を模式的に示した図である。 図２は、乳がん患者から採取した血漿中に含まれる腫瘍マーカーＣＡ１５－３の量とＣＴＣ数とを患者ごとに比較したグラフを示す。 図３は、乳がん患者から採取した血漿中に含まれるＣＡ１５－３の量とＣＴＣのＰＲＤＭ１４陽性率とを患者ごとに比較したグラフを示す。 図４は、乳がん患者から採取した血漿中に含まれるＣＡ１５－３の量に対し、ＣＴＣ数およびＣＴＣのＰＲＤＭ１４陽性率を夫々プロットした図である。
図５－１は、膵がん患者の血液中から単離されたＣＴＣの顕微鏡写真を示す。 図５－２は、乳がん患者、膵がん患者の血液中から単離されたＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの顕微鏡写真を示す。 図６は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関する血清バイオマーカーの同定に係る一連のスクリーニング方法を概説した模式図を示す。 図７は、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、例としてＬＥＰＲ遺伝子発現量と相関を検証した実験の結果を示す。 図８は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関する血清バイオマーカーとして同定されたＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγの、ＰＲＤＭ１４高発現および低発現の群の統計学的な有意差を示した箱ひげ図である。箱の上限および下限ならびに箱内側の水平線は夫々、第７５および第２５パーセンタイル値ならびに中央値を示す。上下の水平バーは夫々、第９０および第１０パーセンタイル値を意味する。 図９は、ＰＲＤＭ１４標的治療薬の有効性の指標および当該有効性の評価方法を概説した図である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学に関して用いられる用語およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。本明細書中に参照される全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
　また、別記のない限り、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的なおよびより専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992および2000の補遺); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology-4thEd., Wiley & Sons (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990);およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)などが挙げられる。
　本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびに、その実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達ならびに対象の処置に用いるものとする。
　本明細書においては、別記のない限り、タンパク質の名称はアルファベット大文字またはカタカナで表記し、そのタンパク質をコードする遺伝子は、前記のアルファベット大文字またはカタカナで表記したものに「遺伝子」と付記するか、または前記のアルファベット大文字またはカタカナで表記したものに下線を付して表記するものとする。したがって、別記のない限り、例えば、単に「ＰＲＤＭ１４」と表記した場合には、ＰＲＤＭ１４(PR domain-containing protein 14)そのもの自体であるタンパク質を意味し、「ＰＲＤＭ１４遺伝子」と表記した場合には、ＰＲＤＭ１４をコードする遺伝子を意味し、また、「ＰＲＤＭ１４」と表記した場合もＰＲＤＭ１４をコードする遺伝子を意味する。
　本発明において用いられるＰＲＤＭ１４は、上述のとおり、PR domain-containing protein 14（別名ＰＦＭ１１またはＭＧＣ５９７３０）と呼ばれる、ＰＲドメインおよびジンクフィンガードメインを有するタンパク質であり、例として、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列等を例示することができる。
　また、本発明において用いられるＰＲＤＭ１４遺伝子には、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または、配列番号２で表される塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ前記の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同等の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが含まれる。ここで、配列番号２で表される塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号２で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等を用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、通常、４２℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。
　また、本明細書において、「がん」という用語を「癌腫」に限らない「悪性腫瘍」という意味でも使用する。
　なお、異種動物間はもちろんのこと、同種動物間でも、多型、アイソフォーム等によってＰＲＤＭ１４遺伝子の塩基配列に相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＰＲＤＭ１４をコードする限り、ＰＲＤＭ１４遺伝子に含まれる。
　本発明において「遺伝子の発現」とは、該遺伝子の転写を起点とし、翻訳まで包含する一連の生体反応をいう。ＰＲＤＭ１４をコードするｍＲＮＡの発現量の定量にあたっては、公知の技術、例えばハイブリダイゼーション技術（ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｃＤＮＡマイクロアレイ等）、遺伝子増幅技術（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等を含む））などを利用することができる。ハイブリダイゼーション技術を用いる場合には、ＰＲＤＭ１４をコードするポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を用いる場合には、当該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。「ＰＲＤＭ１４をコードするポリヌクレオチドまたはその一部」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者が含まれ、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。したがって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれであってもよい。本発明におけるＰＲＤＭ１４をコードするｍＲＮＡの発現量の定量にあたっては、用いられるオリゴヌクレオチドの塩基長は、特に限定されないが、通常１５～１００塩基、好ましくは１７～３５塩基であり、また、用いられるポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０～１０００塩基、好ましくは１５０～５００塩基である。
　ＰＲＤＭ１４の発現量の定量にあたっては、公知の技術、公知のタンパク質解析技術、例えば抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を用いた抗原抗体反応に基づくウェスタンブロッティング法、ドットブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色法（ＩＨＣ）等を利用することができる。「遺伝子の発現が有意に高い」とは、ｍＲＮＡの発現レベル（発現量）および／またはタンパク質を包含するポリペプチドの発現レベル（発現量）が、対照と比較して、統計学的に有意に高い（多い）か、あるいは、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは少なくとも３倍、最も好ましくは少なくとも５倍高い（多い）ことをいう。ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量は、組織や個体間で発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えばβ－アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）を内部標準遺伝子として、この内部標準遺伝子の発現量に基づいて補正することが好ましい。
　また、「ＬＥＰＲ」、「ＭＤＣ」および「ＩＦＮγ」と表記した場合には、レプチン受容体(leptin receptor)、マクロファージ由来ケモカイン(macrophage-derived chemokine)およびインターフェロンγ(interferon-gamma)そのもの自体であるタンパク質を夫々意味し、「ＬＥＰＲ遺伝子」、「ＭＤＣ遺伝子」および「ＩＦＮγ遺伝子」と表記した場合には、ＬＥＰＲをコードする遺伝子、ＭＤＣをコードする遺伝子およびＩＦＮγをコードする遺伝子を夫々意味する。さらに、「ＬＥＰＲ」、「ＭＤＣ」および「ＩＦＮγ」と表記した場合も夫々、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγをコードする遺伝子を意味する。
　本発明において用いられるＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγは夫々、例として、配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。ここで、配列番号１、２および３の夫々で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号１、２および３の夫々で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列等を例示することができる。
　本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から、（１）ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現している末梢血循環腫瘍細胞（ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ）を検出するか、または（２）レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定することによって確認する方法（単に確認方法ともいう）を提供するものである。本発明者らは、ＰＲＤＭファミリーの１４以外のメンバーや癌マーカー、幹細胞マーカーについても、本発明においてこれらがＰＲＤＭ１４に代わってがんの診断等に使用し得るか探索しているが、ＰＲＤＭ１４より有用性を示すものは未だ見出されていない。
＜バイオマーカー＞
　本発明はまた、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを含む、確認方法（１）に使用するためのバイオマーカーを提供するものである。
　ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣは、がん幹細胞であってもよい。「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞をいい、「幹細胞」とは細胞分裂を経ても分化能を維持している細胞のことをいう。がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素（Hoechst33342）で染色し、フローサイトメトリーを利用してＵＶレーザー（波長約３５０ｎｍ）を励起光に用いて検出すると、サイドポピュレーション(Side Population)（ＳＰ）画分に濃縮される。ＳＰ画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるメインポピュレーション(Main Population)（ＭＰ）画分に対して、ＡＢＣトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分のことを指す。また、幹細胞はＯｃｔ３/４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４などのマーカー分子により特定することもできる。
　本発明はまた、一態様において、乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんと診断するための、上記バイオマーカーを提供し、別の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、該対象が、上記がんに罹患しているか、または、上記がんに罹患していたと診断する方法あるいはその診断を補助する方法を提供するものである。
　本明細書において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、スナネズミ、モルモットなどの齧歯類、ネコ、ピューマ、トラなどのネコ科動物、シカ、オオシカなどのシカ科動物等の他、ウサギ、イヌ、ミンク、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなど、特に好ましくはヒトを意味する。また別の態様において、対象からヒトを除くこともできる。対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
　さらに本発明は、一態様において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんを治療薬として有効であると判断するための、上記バイオマーカーを提供し、別の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、上記ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんの治療薬として有効であると判断する方法を提供するものである。また、本発明は一態様において、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断するための、上記バイオマーカーを提供し、別の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断する方法を提供するものである。なお、本明細書において、「ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤」および「抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片」を併せて「ＰＲＤＭ１４標的治療薬」ということもある。また、本発明において、抗ＰＲＤＭ１４抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、かかる抗体の断片もまた、抗ＰＲＤＭ１４抗体と同程度にＰＲＤＭ１４タンパク質に結合することができる。なお、ＰＲＤＭ１４標的治療剤としては、特許第5219818号に記載のものを制限なく使用することができる。
　ある態様において、本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定するための、上記バイオマーカーを提供し、他の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、上記医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定する方法を提供するものである。また本発明は、さらなる態様において、かかる化学療法を開始後１以上サイクルが終了したとき、血液中のＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの数を化学療法開始前と各サイクル終了後とで比較することによって、期待された治療効果を判定することもできる。
　いくつかの態様において、本発明は、がん治療後の予後が不良であると判断するための、上記バイオマーカーを提供し、他の態様において、上記バイオマーカーが対象から検出された場合、がん治療後の予後が不良であると判断あるいはその判断を補助する方法を提供するものである。
＜ＣＴＣの同定方法／キット＞
　本発明は、以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、対象から採取された血液の中から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出するための方法であって、ステップ（ｉｉｉ）において、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチンおよび細胞核は染色されるがＣＤ４５は染色されないＥｐＣＡＭ細胞を、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣであると同定する方法を提供するものである。
（ｉ）前記血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップ。
（ｉｉ）前記バンドから、抗ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップ。
（ｉｉｉ）ＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップ。
ステップ（ｉ）：
　ステップ（ｉ）は、対象から採取された血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップである。
　密度勾配遠心法および密度勾配遠心分離媒体は夫々、当該技術分野における血球分離として通常行われるものであれば、とくに限定されない。一態様において、図１に示されるとおり、採取した血液を適宜希釈し、密度勾配遠心分離媒体としてHistopaque（登録商標）-1077（10771、SIGMA-ALDRICH社製）を用いる密度勾配遠心法を実施すると、ＰＢＭＣは血漿と赤血球（Histopaque）との界面でバンド（または層あるいはバフィーコート）を形成する。
　ＰＢＭＣが含まれるバンドには、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、顆粒球、樹状細胞などの他に、対象ががんに罹患しているまたはしていた場合ＣＴＣも含まれ得る。
ステップ（ｉｉ）：
　ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）で回収されたバンドから、抗ＥｐＣＡＭ(epithelial cell adhesion molecule；上皮細胞接着分子)抗体または抗ＣＤ３２６抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップである。
　一態様において、回収されたバンドを再懸濁したものをAbnova社製のCytoQuest（商標）CRシステムにロードすると、ＥｐＣＡＭ陽性細胞は、CytoChipNano（U0095、Abnova社）上に固定化されたＥｐＣＡＭ（KA4439、Abnova社）によって捕捉される。ＣＴＣは、もし存在していても、血液１０ｍＬあたり数個～数十個程度しか含まれていないため、ステップ（ｉｉ）はＥｐＣＡＭ陽性細胞を濃縮する効果がある。
ステップ（ｉｉｉ）：
　ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で単離されたＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップである。
　例えば、ＰＲＤＭ１４タンパク質の染色には、例えばAlexa Fluor（登録商標）647などの赤色蛍光色素等で標識された抗ＰＲＤＭ１４抗体などを；サイトケラチン(cytokeratin)（ＣＫ）の染色には、例えばＦＩＴＣなどの緑色蛍光色素等で標識された抗サイトケラチン抗体（例として抗PanCK抗体）などを；ＣＤ４５の染色には、例えばＰＥ（Ｒ－フィコエリスリン）などのオレンジ色蛍光色素等で標識された抗ＣＤ４５（白血球共通抗原ＬＣＡ）抗体などを；細胞核の染色には、例えばＤＮＡに対して強く結合する青色蛍光色素ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）などを用いることができる。
　ステップ(ｉｉｉ)で行ってもよい免疫染色については、当該技術分野において通常行われる手順を採用することができる。
　ステップ（ｉｉｉ）の結果、
●ＤＡＰＩ陰性かつＣＤ４５陰性のものは、細胞片やゴミ等である。
●ＤＡＰＩ陽性かつＣＤ４５陽性の細胞は、非がんＰＢＭＣである。
●ＤＡＰＩ陽性かつＣＤ４５陰性の細胞は、ＣＴＣであって、
さらにサイトケラチン陽性かつＰＲＤＭ１４陽性であると、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣと特定することができる。
　本発明はまた、一態様において、対象の血液から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの有無を判定するためのキットであって、上記バイオマーカーを検出するための試薬を含むキットを提供し、さらなる態様において、かかる試薬として、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を夫々染色するための試薬を含むことができる。さらに本発明のキットは、CytoChipNano（U0095、Abnova社）またはCytoQuest（商標）CR（Abnova社）を含んでもよく、キットの使用説明書も含むことができる。
＜診断方法／有効性評価方法／治療方針の決定方法／予後の判定方法＞
　本発明は、対象において、
（Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を補助する方法（本明細書中、単に「診断方法」ともいう。）、
（Ｂ）ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価する方法（本明細書中、単に「有効性評価方法」ともいう。）、
（Ｃ）前記疾患に対する治療方針の決定を補助する方法（本明細書中、単に「治療方針の決定方法」ともいう。）、および／または、
（Ｄ）前記疾患治療後の予後の判定を補助する方法（本明細書中、単に「予後の判定方法」ともいう。）
に関し、これらの方法は夫々、以下のステップ（ｉ）および（ｉｉ）を含む：
（ｉ）本発明に係る確認方法（２）を実施するステップ、すなわち対象から採取された血液またはリンパ液から、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定するステップ。
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で測定して得られた濃度のうち、少なくとも１つが基準濃度範囲を満たす場合、
（Ａ）において、対象が前記疾患を有すると診断し、
（Ｂ）において、前記疾患を有する対象にとって前記治療薬が有効であると評価し、
（Ｃ）において、対象へ前記治療薬を投与するという治療方針を決定し、
（Ｄ）において、前記疾患治療後の予後が良好ではないとの判定を補助する。
　「ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患」とは、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）または原始生殖細胞におけるＰＲＤＭ１４の一過性の遺伝子発現を除く、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現が認められる病変を含む疾患であって、好ましくはがんであり、より好ましくは乳がん、すい臓がん、または分化度が低い非小細胞肺がんである。
　本明細書において、用語「診断」は、例えば、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患または疾患とその病期とを特定または分類することなどを包含する。診断することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、対象が前記疾患を有するとの診断を補助する方法、またはかかる診断方法である。
　本明細書において、用語「治療薬」は、疾患を処置するための任意の薬または剤などであってよく、限定されないが、例えば医薬、医薬組成物、治療剤、内用剤、外用剤などを包含し、さらにがん用治療薬、さらには乳がん用またはすい臓がん用治療薬などをも包含する。なお、治療薬の一態様は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤などである。また特定の態様において、かかる治療薬が、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を含有し、ここで該抗体の断片は、該抗体と同程度にＰＲＤＭ１４タンパク質に結合するものである。なお本明細書中、ＰＲＤＭ１４を標的とするこれらの治療薬を、単に「ＰＲＤＭ１４標的治療薬」ともいい、特許第5219818号に記載のものを制限なく使用することができる。
　さらに別の態様において、かかる治療薬は、がん分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用されてもよい。なお、がん分子標的治療となるがんは、上記したＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患に含まれるがんだけでなく、ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴うがんから転移したがんも含み得る（ただし、転移したがんは必ずしもＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴うものではない）。かかる転移がんとしては、限定されないが、例えば、乳がんが転移しやすい肺、骨、脳などのがんや、膵がんから転移しやすい肝臓、腹膜などのがんを含む。
　なお、本明細書において、用語「処置」は、治療を包含し、さらに疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。また例えば、「処置」は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本明細書において、用語「有効性を評価」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などに資するかどうかまたはそれらの効果があるかを判断することであり、資する場合または効果がある場合を有効である、と意味するものである。なお、有効性を評価することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、疾患を有する対象にとって治療薬が有効であると評価する方法である。
　本明細書において、用語「治療方針の決定」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを期待して行う処置しうる手段の方向を決めることを意味する。治療方針の決定することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、対象へ治療薬を投与するという治療方針の決定を補助する方法、またはかかる治療方針の決定方法である。
　本明細書において、用語「治療後の予後の判定」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などの効果を有するかどうかを予測することを意味する。治療後の予後の判定することの一態様は、対象から採取されたサンプル中のタンパク質を測定し、得られた濃度が基準濃度範囲を満たす場合、疾患治療後の予後が良好ではないと判定を補助する方法、またはかかる判定方法である。
　本明細書において、用語「良好ではないとの判定」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などが期待できないまたはそれらの効果がないとの判断することを意味する。
　「対象から採取されるサンプル」は、好ましくは血液またはリンパ液であり、より好ましくは血液であるが、血清と同じまたはほぼ同じ組成を有する体液であれば、とくに限定されない。
　サンプル中の測定されるタンパク質は、好ましくは分泌タンパク質であり、より好ましくはＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγなどである。なお、測定するタンパク質の数は、少なくとも１つであり、好ましくは複数個（例えば２つ、３つ）である。本発明の一態様において、測定されるタンパク質は、例えば、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質でもよく、さらにＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質でもよく、さらにはＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγの夫々のタンパク質を測定してもよい。
　また、これら３種のタンパク質のうち１種について濃度を測定した結果、以下の基準濃度範囲を参照してスコアが１であった場合、本発明の方法に係る診断、有効性評価、治療方針の決定、予後の判定を行うことができる。この場合他の２種について濃度を測定する必要はないが、測定した結果、スコアが２や３となれば、診断、有効性評価、治療方針の決定、予後の判定の信ぴょう性が高くなる場合がある。
　測定したタンパク質の基準濃度範囲は、例えばＬＥＰＲは、４．３ｎｇ／ｍＬ以上、ＭＤＣは、１１．２ｐｇ／ｍＬ以下、またはＩＦＮγは、３．２ｐｇ／ｍＬ以下などである。また本発明の別の側面は、上記の基準濃度のカットオフ値で、測定値を区切りスコアリングした後、さらにそれらの値を合計し、本発明の診断を補助する方法、有効性を評価する方法、治療方針の決定を補助する方法または予後の判定を補助する方法などに用いてもよい。本発明の特定の態様は、例えばＬＥＰＲのカットオフ値は≦４．３ｎｇ／ｍｌ、＞４．３ｎｇ／ｍｌであり、ＭＤＣのカットオフ値は＜１１．２ｐｇ／ｍｌ、≧１１．２ｐｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγのカットオフ値は＜３．２ｐｇ／ｍｌ、≧３．２ｐｇ／ｍｌなどである。また、例えば、ＬＥＰＲの測定値が、≦４．３ｎｇ／ｍｌのときにスコアを０として、＞４．３ｎｇ／ｍｌのときにスコアを１として、ＭＤＣの測定値が、＜１１．２ｐｇ／ｍｌのときにスコアを１として、≧１１．２ｐｇ／のときにスコアを０として、ＩＦＮγの測定値が、＜３．２ｐｇ／ｍｌのときにスコアを１として、≧３．２ｐｇ／のときにスコアを０として、それぞれのスコアの値を合計して、本発明に用いることができる。合計のスコアが１以上であれば、対象は（Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患に罹患していると診断することができ、（Ｂ）ＰＲＤＭ１４標的治療薬が有効であると評価することができ、（Ｃ）前記疾患に対する治療方針として、ＰＲＤＭ１４標的治療薬を投与するという決定をすることができ、および／または、（Ｄ）前記疾患治療後の予後が不良であると判定することができる。スコアが０である場合は、（Ａ）～（Ｄ）において行えることが全て「行えない」という結果となる。
　タンパク質の濃度を測定する方法は、当該技術分野において既知の任意の方法、好ましくはＥＬＩＳＡなどの方法を用いることができる。
＜がん転移マーカー＞
　また、本発明の別の側面は、前記の診断方法、有効性評価方法、治療方針の決定方法および／または予後の判定方法に使用するための、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、がん転移マーカーに関する。
＜キット＞
　本発明の別の側面は、前記の診断方法、有効性評価方法、治療方針の決定方法および／または予後の判定方法に使用するためのキットであって、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む、キットに関する。
　一態様において、本発明のキットは、限定されずに、例えば、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγなどのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む試薬（例えば、ＬＥＰＲ検出試薬等）、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、診断を補助する方法、有効性を評価する方法、治療方針の決定を補助する方法、または予後の判定を補助する方法に関する指示（例えば、使用説明書、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。
　以下の実験例は本発明について、さらに具体的に説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者として通常の知識および技術を有するものは、本発明の精神を逸脱しない範囲で、下記実験例で示された態様に多様な改変を行うことができるが、かかる改変された態様も本発明に含まれる。
＜実施例１＞
　本発明に係るＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出する方法において、Abnova社のCytoQuest（登録商標）CRに添付の使用説明書に従い、乳がん患者から採取した２ｍＬ血液３６検体からＣＴＣを検出するとともにその数を計測し、さらに抗ＰＲＤＭ１４抗体（製品コード：ab187881およびab192411；Abcam社）を用いる免疫染色によりＰＲＤＭ１４陽性率を算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に記載される全３６検体中、ＣＴＣが１個以上存在したのは２９検体（８０．６％）であり、そのうちＰＲＤＭ１４陽性が１９検体（６５．５％）、ＰＲＤＭ１４陰性が１０検体（３４．４％）であった。ＣＴＣ数とＰＲＤＭ１４陽性率との間に相関は見られないように思われるが（表１）、ＣＴＣ検出が可能であった検体のうち約３分の２がＰＲＤＭ１４陽性であることがわかった。
＜実施例２＞
　乳がんの再発・転移の追跡に有用であるとされている腫瘍マーカーＣＡ１５－３と、ＰＲＤＭ１４とを用いて、実施例１と同様にＣＴＣ数を計測しつつ、血漿中のＣＡ１５－３量を測定するとともに、ＰＲＤＭ１４陽性率を算出した。その結果を夫々図２～４に示す。
　血漿中のＣＡ１５－３量とＣＴＣ数およびＰＲＤＭ１４陽性率との間に夫々相関はなかったが（図４）、ＰＲＤＭ１４陽性かつＣＴＣの検出可能であった検体数は、ＣＡ１５－３陽性より多かった。
　以下に乳がんの病期とＣＴＣ数およびＰＲＤＭ１４陽性率とを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　ＣＡ１５－３が初期の乳がんでは陽性を示すことはほとんどないところ、表２から、ＰＲＤＭ１４は、従来の腫瘍マーカーとは異なり、ステージＩを含む早期の乳がん患者においても、診断に利用できる可能性が示唆された。
＜参考例＞
　膵がん患者末梢血からCytoQuest（登録商標）CR（Abnova社）により単離されたＣＴＣの顕微鏡画像を図５－１に、乳がん・膵がん臨床検体から分取されたＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの顕微鏡画像を図５－２に示す。
＜実施例３＞
《ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関するバイオマーカーの同定》
　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関するバイオマーカーの同定に係る一連のスクリーニング方法を図６に模式的に概説する。まず、１次スクリーニングにおいて、２９例の乳がん臨床組織に対し、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現情報を夫々解析し、乳がんにおいて高頻度（約６０％）に遺伝子増幅していると発見したＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と（1）相関係数０．７以上の関連を示し、（2）回帰直線の傾きが０．５～２．０、（3）データベース上、分泌タンパクであることが知られている、（4）ＥＬＩＳＡキットが入手可能という条件で候補分子を絞った後、２次スクリーニングにおいて、別の５０例の乳がん臨床組織に対するマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現情報を用いる再現性検証を実施した結果、ＬＥＰＲは、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関することが判明した。
　また、１次スクリーニングの後に、別の観点、すなわち、血清タンパク質のスクリーニングツールであるサスペンションアレイに搭載可能な分泌タンパクの中から、ＰＲＤＭ１４発現量と強い相関をもつ上位３８タンパクにつき検討した結果、ＭＤＣおよびＩＦＮγがＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量と相関することが判明した。
　次に、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量とＬＥＰＲ遺伝子の検証実験を行った（図７）。検証試験は、上記スクリーニング結果を基に、縦軸をＰＲＤＭ１４遺伝子発現量、横軸をＬＥＰＲ遺伝子発現量として、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量とＬＥＰＲ遺伝子発現量との相関を調べた。図７のうち左上図は１次スクリーニングの結果を、右上図は２次スクリーニングの結果を夫々示し、下図は、上記を併せたものに相当する。その結果、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量とＬＥＰＲ遺伝子発現量は、正の相関があることが判明した。
　さらに、上記と同様に、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、ＭＤＣまたはＩＦＮγの血中濃度との相関を調べた。その結果、１次スクリーニングの後、サスペンションアレイおよびＥＬＩＳＡによる分泌タンパク遺伝子スクリーニングをしたところ、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、血中ＬＥＰＲ濃度とは、正の相関があり、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現量と、ＭＤＣおよびＩＦＮγの血中濃度とは、負の相関があることが判明した（図８）。すなわち、血液中へのＬＥＰＲ分泌量が多ければ、ＰＲＤＭ１４遺伝子は高発現されていることが分かり、ＭＤＣおよびＩＦＮγの分泌量が夫々少なくても、ＰＲＤＭ１４遺伝子は高発現されていることがわかる。
　本明細書に記載された種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、全て本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示に過ぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
　本発明に係るバイオマーカーが対象から検出されると、乳がんや膵臓がんなどのがんが存在していることまたは存在していたことが特定されるとともに、ＰＲＤＭ１４標的治療薬が有効であること、ＰＲＤＭ１４標的治療薬の有効量を含む医薬組成物を投与するという治療方針を決定すること、治療後の予後が不良であることの判断が可能である。さらに、例えば乳がん患者のうち、ＰＲＤＭ１４陽性または陰性の乳がん患者が区別されるので、夫々の患者に対しより的確な治療を施すことができる。
　また、本発明の一態様によると、ＰＲＤＭ１４標的治療薬の有効性を評価することができるが、例えば乳がんに罹患している対象の全てがＰＲＤＭ１４遺伝子を発現しているとは限らないことから、ＰＲＤＭ１４標的治療薬を投与する前に、ＰＲＤＭ１４標的治療が対象にとって有効か無効かを判断することができる。

Claims (23)

  1. 　ＰＲＤＭ(PR domain-containing protein)１４遺伝子の発現を、対象から採取された血液またはリンパ液から、
    （１）ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現している末梢血循環腫瘍細胞（ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣ）を検出するか、または
    （２）レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定する
    ことによって確認する方法。
  2. 　ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを含む、請求項１に記載の確認方法（１）に使用するためのバイオマーカー。
  3. 　ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣが、がん幹細胞である、請求項２に記載のバイオマーカー。
  4. 　乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんと診断するための、請求項２または３に記載のバイオマーカー。
  5. 　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤が、がんの治療薬として有効であると判断するための、請求項４に記載のバイオマーカー。
  6. 　抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断するためのバイオマーカーであって、該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、請求項４に記載のバイオマーカー。
  7. 　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定するための、請求項５または６に記載のバイオマーカー。
  8. 　予後が不良であると判断するための、請求項４に記載のバイオマーカー。
  9. 　請求項２または３に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
    　該対象が、乳がん、膵臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される少なくとも１種のがんに罹患しているか、または、該がんに罹患していたとの診断を補助する方法。
  10. 　請求項４に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
    　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片が、がんの治療薬として有効であると判断する方法であって、
    　前記抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、前記方法。
  11. 　請求項５または６に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
    　ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤あるいは抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片の有効量を含む医薬組成物を対象へ投与するという、がんの治療方針を決定する方法。
  12. 　請求項４に記載のバイオマーカーが対象から検出された場合、
    　がん治療後の予後が不良であると判断する方法。
  13. 　ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣの有無を判定するためのキットであって、請求項２～８のいずれか一項に記載のバイオマーカーを検出するための試薬を含む、前記キット。
  14. 　試薬が、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を夫々染色するための試薬である、請求項１３に記載のキット。
  15. 　対象から採取された血液の中から、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣを検出するための方法であって、該方法が以下のステップ：
    （ｉ）前記血液から、密度勾配遠心により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれるバンドを回収するステップ；
    （ｉｉ）前記バンドから、抗ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）抗体を使用して、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を単離するステップ；ならびに、
    （ｉｉｉ）ＥｐＣＡＭ陽性細胞に対し、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチン、ＣＤ４５および細胞核を染色するステップ
    を含み、
    　ステップ（ｉｉｉ）において、ＰＲＤＭ１４タンパク質、サイトケラチンおよび細胞核は染色されるがＣＤ４５は染色されないＥｐＣＡＭ細胞を、ＰＲＤＭ１４陽性ＣＴＣであると同定する、前記方法。
  16. 　対象において、
    （Ａ）ＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を伴う疾患との診断を補助するか、
    （Ｂ）ＰＲＤＭ１４を標的とする前記疾患の治療薬の有効性を評価するか、
    （Ｃ）前記疾患に対する治療方針の決定を補助するか、および／または、
    （Ｄ）前記疾患治療後の予後の判定を補助する
    方法であって、該方法が、以下のステップ：
    　（ｉ）請求項１に記載の確認方法（２）を実施するステップ；ならびに、
    　（ｉｉ）得られた濃度のうち少なくとも１つが基準濃度範囲を満たす場合、
    （Ａ）において、対象が前記疾患を有するとの診断を補助し、
    （Ｂ）において、前記疾患を有する対象にとって前記治療薬が有効であると評価し、
    （Ｃ）において、対象へ前記治療薬を投与するという治療方針の決定を補助し、
    （Ｄ）において、前記疾患治療後の予後が良好ではないとの判定を補助する
    ステップ
    を含む、前記方法。
  17. 　疾患が、乳がんまたは膵臓がんである、請求項１６に記載の方法。
  18. 　治療薬が、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択されるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現阻害剤を含有する、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 　治療薬が、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を含有し、
    該抗体およびその断片が、ＰＲＤＭ１４タンパク質に結合する、請求項１６または１７に記載の方法。
  20. 　サンプルが血液であるとき、
    ＬＥＰＲの基準濃度範囲が、４．３ｎｇ／ｍｌ以上であるか、
    ＭＤＣの基準濃度範囲が、１１．２ｐｇ／ｍｌ以下であるか、または、
    ＩＦＮγの基準濃度範囲が、３．２ｐｇ／ｍｌ以下である、
    請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 　治療薬が、がん分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用される、請求項１８または１９に記載の方法。
  22. 　請求項２０に記載の方法に使用するための、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、がん転移マーカー。
  23. 　請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、ＬＥＰＲ、ＭＤＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む、前記キット。
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