DE102016109753A1

DE102016109753A1 - Bestimmung der freien und der gesamten fettsäuren mit hilfe der desorptions-ionisationsmassenspektrometrie

Info

Publication number: DE102016109753A1
Application number: DE102016109753.5A
Authority: DE
Inventors: Donald Mason; Michael Balogh; Giuseppe Astarita
Original assignee: Waters Technologies Corp
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2016-12-01
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: US9880147B2; GB2539098A; GB2539098B; GB201609264D0; US20160349233A1; DE102016109753B4

Abstract

Die vorliegende Offenlegung bezieht sich auf Methoden und Geräte für die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren in einer Probe. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Offenlegung auf die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren mit Hilfe der Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie. Die Methoden und Geräte können entweder eine Ionen-Quelle oder nach der Ionisation erfolgte Fragmentierung der Verbindungen, die die Fettsäuren enthalten, umfassen.

Description

GEBIET DER TECHNIK
Die vorliegende Offenlegung bezieht sich allgemein auf Methoden und Geräte für die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren in einer Probe. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Offenlegung auf die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren mit Hilfe der Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie. Die Methoden und Geräte können entweder eine Fragmentierung der Verbindungen, die die Fettsäuren enthalten, während oder nach der Ionisation umfassen.
STAND DER TECHNIK
Fettsäuren können in Proben sowohl in nicht veresterter (freier) als auch in veresterter Form (z.B. als Glycerolipide, Glycerophospholipide, Sterollipide und Sphingolipide) vorkommen. Der Fettsäuregehalt einer Probe kann mit analytischen Testmethoden, die nur auf freie Fettsäuren testen, unterschätzt werden. In einigen Fällen kann der gesamte Fettsäuregehalt für den Gesamtstatus eines biologischen Systems oder den Nährwert eines Lebensmittels repräsentativer sein.
Derzeitige Testmethoden zur Bestimmung der Fettsäuren erfordern arbeits- und zeitaufwendige Verfahren, die sich auf die Empfindlichkeit der Erkennung negativ auswirken. So ist z.B. die Massenspektrometrie per Gaschromatographie (GC-MS) traditionell die bevorzugte Technik gewesen. Die Analyse per GC-MS erfordert jedoch ein Verfahren in mehreren Schritten für die Hydrolyse und Derivatisierung der Fettsäuren in Fettsäuremethylester und eine chromatographische Trennung. Alternativ ist die Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS) eingesetzt worden; sie erlaubt eine direkte Messung der freien und der veresterten Fettsäuren ohne die Notwendigkeit einer Hydrolyse oder Derivatisierung. Dennoch erfordert die LC-MS weiterhin die arbeitsintensive und zeitraubende chromatographische Trennung. Die superkritische Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie und andere ähnliche Techniken sind ebenfalls verwendet worden, aber auch diese Techniken haben den Nachteil derselben Voraussetzung. Darüber hinaus ist eine detaillierte räumliche Verteilung dieser Spezies auf der Oberfläche einer Probe mit den herkömmlichen Protokollen zur Vorbereitung und Extraktion einer Probe nicht darstellbar.
Die vorliegende Offenlegung bezieht sich auf Methoden und Geräte für die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren mit weniger Zeitaufwand und Ressourcenverbrauch.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen bezieht sich die vorliegende Offenlegung auf Methoden und Geräte zur Bestimmung und gleichzeitigen Profilierung der freien und der gesamten Fettsäuren in einer Probe. In einigen Ausführungsformen kann die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren mit Hilfe der Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie in Verbindung mit einer Ionenquelle oder einer Fragmentierung in der Zelle erfolgen. Die Energie der Anregungsquelle (z.B. Laser, Ionen, Wärme) im Zusammenhang mit der Desorptions-Ionisationsquelle (z.B. Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation, REIMS (Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry), direkte Echtzeitanalyse) kann erhöht werden, um die Fragmentierung einer komplexen Verbindung, die Fettsäuren enthält (z.B. eine komplexe Lipidspezies) in ihre Grundkomponenten (z.B. Fettsäuren) auszulösen, die mit der Massenspektrometrie im negativen Ionisationsmodus erkannt werden können. Alternativ kann die Energie in einer Stoßzelle hinter der Post-Ionisationsquelle erhöht werden, um die Fragmentierung einzuleiten. Die Methode und die Geräte nach der vorliegenden Offenlegung können sowohl für die direkte Analyse, Anwendungen der Echtzeit-Massenspektrometrie und die Bildgebung mit Hilfe der Massenspektrometrie verwendet werden. Die Verteilung der gesamten Fettsäuren in einer Probe, z.B. Gewebe, kann dargestellt werden.
Methode und Geräte nach der vorliegenden Offenlegung bieten zahlreiche Vorteile. So sind z.B. die Methoden und Geräte für die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren weniger zeitaufwendig und ressourcenintensiv als herkömmliche Methoden. Als Ergebnis können die Methoden und Geräte dazu herangezogen werden, Subjekte proaktiv zu analysieren, zu überwachen und zu behandeln. Zusätzlich erlaubt die vorliegende Technologie In-situ-Studien an Proben (z.B. Gewebe). So können z.B. Bildgebungstechniken dazu eingesetzt werden, die Verteilung von Fettsäuren in einer Probe zu kartieren und zu verfolgen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorstehenden und weiteren Vorteile durch die vorliegende Offenlegung lassen sich anhand der folgenden Beschreibung beispielhafter Ausführungen besser verstehen, wenn sie zusammen mit den zugehörigen Zeichnungen gelesen werden. Dabei gilt:
zeigt ein Beispiel einer freien Fettsäure und einer komplexen Verbindung, die Fettsäuren enthält, z.B. veresterte Fettsäuren.
zeigt eine beispielhafte Illustration der Methodik nach der vorliegenden Offenlegung. Eine komplexe Verbindung, die Fettsäuren enthält, oder ein komplexes Lipid kann auf einem niedrigen Energieniveau, auf dem im Wesentlichen keine Fragmentierung auftritt, z.B. bei 100 °C, getestet werden und bei einem höheren Energieniveau, bei dem eine Fragmentierung in freie Fettsäuren auftritt, z.B. 400 °C. Die freien Fettsäuren sind über einen weiten Bereich hoher Energieniveaus stabil (d.h. sie werden nicht weiter fragmentiert).
zeigt drei verschiedene Ausführungen nach der vorliegenden Offenlegung. Es werden drei verschiedenen Ionisationsquellen, z.B. DESI, DART^® und REIMS, gezeigt, die Energie sowohl auf niedrigem als auch auf hohen Niveaus liefern können, um eine Fragmentierung komplexer Verbindungen, die Fettsäuren enthalten, zu bewirken, bevor sie einem Massenspektrometer zugeführt werden.
zeigt ein Beispiel einer Zelle, die verschiedene molekulare Verbindungen enthält, bei denen der Gehalt an Fettsäuren und gesamten Fettsäuren mit Hilfe der Methoden und Geräte nach der vorliegenden Offenlegung bestimmt und identifiziert werden kann. Die Zelle kann DNA/RNA, Protein/Saccharide, Lipide/Metaboliten, Nukleotide, Aminosäuren und Zucker, Fettsäuren, Ceramide usw. enthalten.
zeigt ein Beispiel von Vollblut und roten Blutzellen, bei denen der Gehalt an Fettsäuren und gesamten Fettsäuren mit Hilfe der Methoden und Geräte nach der vorliegenden Offenlegung bestimmt und identifiziert werden kann. Die Auswirkungen von Ernährung, körperlicher Betätigung und anderer Faktoren können ebenfalls durch Bestimmung des gesamten Fettsäuregehalts in einer Probe, z.B. roten Blutzellen, bewertet werden. Die durchschnittliche Lebensdauer einer Blutzelle beträgt 120 Tage.
zeigt zwei Beispiele von Methoden nach der vorliegenden Offenlegung, nämlich die In-situ-Analyse von Fettsäuren und der gesamten Fettsäure in einer Probe und der Bildgebung von Fettsäuren und der gesamten Fettsäure. Die In-situ-Analyse kann die Menge und Identität der Fettsäuren und der gesamten Fettsäuren in einer Probe bestimmen. Die Bildgebung kann eine Kartierung mit den Positionen der Fettsäuren und der gesamten Fettsäuren in einer Probe liefern.
zeigt Beispielbilder der vorliegenden Offenlegung mit der räumlichen Verteilung der Fettsäuren und der gesamten Fettsäuren in einer Probe. Der Verlust von Fettacylgruppen oder das Auftreten von Fettacylsignalen kann über die Probe kartiert werden. Durch Erhöhen der Ionisationsenergie (z.B. Energie der Anregungsquelle, Temperatur) kann die Zusammensetzung des gesamten Fettsäuregehalts (z.B. freie/unveresterte Fettsäuren plus veresterte Fettsäuren) pro Pixel erhalten werden. Alternativ kann ein Gesamt-Fragementierungsmodus nach der Ionisation oder ein datenunabhängiger Modus in einer Stoßzelle (z.B. Konus, Kapillare oder Stoßzelle) vor der Detektierung mit Hilfe der Massenspektrometrie ähnliche Informationen liefern, indem sie die Analyse der Zusammensetzung der gesamten Fettsäuren ermöglicht.
zeigt Beispielbilder von Gewebeproben. Die Proben wurden mit der Methode und Geräten nach der vorliegenden Offenlegung untersucht. Der Fettsäure- und der Gesamt-Fettsäuregehalt im Gewebe wurden bestimmt. Insbesondere kann FA20:4, ein Entzündungsmarker, identifiziert und bestimmt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Offenlegung bezieht sich auf Methoden und Geräte für die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren in einer Probe. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Offenlegung auf die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren mit Hilfe der Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie. Die Geräte und Methoden können eine Ionisationsquelle einschließen, die in der Lage ist, sowohl die freien Fettsäuren als auch die gesamten Fettsäuren in einer Probe zu analysieren. Die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren in einer Probe kann therapeutische, klinische und pharmazeutische Anwendungen haben.
In einer Ausführung bezieht sich die vorliegende Offenlegung auf eine Methode zur Bestimmung der gesamten Fettsäuren in einer Probe einschließlich der Erzeugung von Probeionen einer Probe, die veresterte und freie Fettsäuren enthält, mit Hilfe einer Desorptions-Ionisationsquelle, wobei die Ionen in ein Massenspektrometer eingebracht werden und dort vor oder nach dem Einbringen in das Massenspektrometer eine Fragmentierung der veresterten Fettsäuren in freie Fettsäuren bewirken, und zur Identifizierung der gesamten Fettsäuren in der Probe.
Der Begriff „gesamte Fettsäure“ in einer Probe bezeichnet die Summe der freien Fettsäuren und der Fettsäuren, die in komplexen Verbindungen (z.B. veresterten Fettsäuren) enthalten sind, und mit den Methoden und Geräten nach der vorliegenden Offenlegung fragmentiert und bestimmt werden können. Zu den gesamten Fettsäuren gehören veresterte Fettsäuren, z.B. Glycerolipide, Glycerophospholipide, Sterollipide und Sphingolipide.
Die freien Fettsäuren sind die Fettsäuren, die nicht verestert oder in anderer Weise in einer komplexen Verbindung enthalten sind. Freie Fettsäuren sind z.B. Arachidonsäure, Docosahexaensäure, Eicosapentaensäure, Linolensäure und α-Linolensäure.
Bei der Probe kann es sich um eine beliebige Probe handeln, die Fettsäure in komplexen Verbindungen, z.B. veresterten Fettsäuren, enthält, die mit den hier beschriebenen Methoden und Geräten zur Oberflächen-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie effektiv untersucht werden können. In einer Ausführung kann die Probe eine Diät, ein Nahrungsmittel, ein Nahrungsergänzungsmittel, eine Darreichungsform oder eine biologische Probe sein. So können z.B. die Methode und die Geräte nach der vorliegenden Offenlegung dazu verwendet werden, den gesamten Fettsäuregehalt in einer biologischen Probe, z.B. Vollblut, Plasma oder roten Blutzellen zu bestimmen.
Die Probe kann ohne wesentliche Vorbereitung, z.B. Filterung, Extraktion, Isolation oder Kombinationen daraus, analysiert werden. Die Probe kann rein oder ohne Probenaufbereitung analysiert werden. So können z.B. Proben auf Glaskapillare gestrichen und in eine Ionisationsquelle gehalten, platziert oder in anderer Weise eingebracht werden, indem sie z.B. in einem metastabilen Gasstrahl zwischen der direkten Analyse in Echtzeit in der Ionenquelle und einem Massenspektrometer-Detektor gehalten werden. In einer Ausführung ist die Vorbereitung der Probe so einfach, dass die Probe eine biologische Probe sein kann, z.B. ein getrockneter Blutstropfen auf einem Glasträger oder Gitter. Die biologische Probe kann auch gelöstes Blut sowie Haut, Sebum oder Speichel sein.
Die Probe kann auch einer Diät zugeordnet werden. Die Probe kann aus einem oder mehreren Nahrungsmitteln bzw. einem oder mehreren Nahrungsergänzungsmitteln bestehen. Die Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel können in beliebiger Form, z.B. fest oder flüssig, vorkommen. Die Probe kann einer Darreichungsform zur Behandlung eines Zustands zugeordnet werden. Die Darreichungsform ist beliebig, z.B. Tablette, Kapsel, Pille, Filmkapsel, Flüssigkeit usw. Je nach der Darreichungsform kann die Probe in ihrer ursprünglichen Form verwendet oder so verändert werden, dass ein Zugang zur Probe möglich wird. Die Vorbereitung der Probe kann beinhalten, dass ein Teil des Inhalts aus dem Inneren der Kapsel entfernt wird.
Die Probenionen können mit einer beliebigen Quelle oder Technik zur Desorptionsionisation (DI) erzeugt werden, die in der Lage ist, die freien Fettsäuren und Verbindungen, die Fettsäuren enthalten (z.B. veresterte Fettsäuren), aus einer Probe zum Einbringen in ein Massenspektrometer effektiv zu erfassen. Die Quelle oder Technik zur Desorptionsionisation kann auch eine beliebige Quelle oder Technik sein, die eine schnelle In-situ-Untersuchung fester oder flüssiger Proben in Echtzeit erlaubt. In einer Ausführung ist die Quelle zur Desorptionsionisation eine Quelle oder Technik zur Oberflächendesorptionsionisation.
Bei der Desorptionsionisation kann der Ionisationsprozess eingeleitet werden, indem ein definierter Punkt auf einer Probe, z.B. einer festen Probe, mit einer fokussierten Energiequelle bestrahlt oder anderweitig exponiert wird. Bei der Energiequelle kann es sich um einen Anregerstrahl, z.B. Laser, Ionen oder geladene Lösungsmitteltröpfchen, handeln. Beim Auftreffen wird an der Oberfläche der Probe eine Wolke ionisierter Moleküle freigesetzt, die in ein Massenspektrometer geleitet werden können. Alternativ kann eine akustische oder Wärmedesorption den Ionisationsprozess auslösen.
In einer Ausführung erfolgt die Analyse der Fettsäuren mit einem System zur Oberflächendesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie. Fettsäuren eignen sich besonders für die Oberflächendesorptionsionisation, da Fettsäuren in biologischen und Lebensmittelproben in hohen Mengen vorkommen können und im negativen Modus unter DI-Bedingungen gut ionisieren können.
Die Quelle zur Oberflächendesorptionsionisation kann mit einer Technik arbeiten, die aus einer Gruppe stammt, die die Elektrospray-Ionisation, die Nano-Elektrospray-Ionisation, Matrix-unterstützte Laser-Desorptionsionisation, die chemische Ionisation unter Atmosphärendruck, die Desorptions-Elektrospray-Ionisation, die Ionisation durch dielektrische Barriereentladung unter Atmosphärendruck, die Niedertemperatur-Plasma-Desorptionsionisation unter Atmosphärendruck, die Laser-unterstützte Elektrospray-Ionisation und die Elektrospray-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation umfasst.
Insbesondere kann die Quelle zur Oberflächendesorptionsionisation mit einer Technik arbeiten, die aus einer Gruppe ausgewählt wird, die die ASAP (Atmospheric Solid Analysis Probe), die direkte Echtzeitanalyse (DART^®), die REIMS-Methode (Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry), die Desorptions-Elektrospray-Ionisation (DESI), die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation (MALDI), die Laser-Absorptions-Elektrospray-Ionisation (LAESI) sowie die NIMS-Methode (Nanostructure and Initiated Mass Spectrometry) umfasst.
Die Desorptions-Ionisationsquelle kann auch für die Massenspektrometrie bei Umgebungsdruck geeignet oder zu ihr kompatibel sein, z.B. ein Massenspektrometer, das bei oder im Bereich des Umgebungsdrucks arbeitet. In einer Ausführung ist die Quelle oder Technik zur Desorptionsionisation DART^®, ASAP, REIMS oder DESI. Diese Ionisationsquelle kann klein und zur Massenspektrometrie bei Umgebungsdruck kompatibel sein.
Direktanalyse in Echtzeit ist eine Ionenquelle bei Umgebungsdruck, die Gase, Flüssigkeiten oder Feststoffe an der Luft unter Umgebungsbedingungen augenblicklich ionisieren kann. Es handelt sich um eine Ionisationstechnik bei Umgebungsdruck, die keine Vorbereitung der Probe erfordert, wodurch feste oder flüssige Materialien mit Hilfe der Massenspektrometrie in ihrem Ursprungszustand analysiert werden können. Die Ionisation kann direkt an der Oberfläche der Probe erfolgen. Flüssigkeiten können z.B. analysiert werden, indem ein Objekt (z.B. ein Glasstab) in eine Probe der Flüssigkeit getaucht und danach vor die DART^®-Ionenquelle gebracht wird. Dämpfe können direkt in den DART^®-Gasstrom eingebracht werden.
ASAP (Atmospheric Solids Analysis Probe) ist eine Ionenquelle bei Atmosphärendruck, mit deren Hilfe Proben mit einer Ionisationsquelle bei Atmosphärendruck (API) direkt analysiert werden können. ASAP kann feste und flüssige Stoffe, Gewebe oder Materialproben analysieren. Bei ASAP kann die Verdampfung der Probe dann eintreten, wenn sie einem heißen Desolvatisierungsgas, z.B. Stickstoff, aus einer Sonde, z.B. einer Sonde zur Elektrospray-Ionisation oder zur chemischen Ionisation unter Atmosphärendruck, ausgesetzt wird.
Die REIMS-Methode (Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry) ist eine Ionisationstechnik, die als Quelle für die direkte Analyse von Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie verwendet werden kann. REIMS ist eine Ionenquelle bei Umgebungsdruck, die Gase, Flüssigkeiten oder Feststoffe an der Luft unter Umgebungsbedingungen ionisieren kann. Die REIMS-Ionisationsquelle kann eine Sonde sein, die dazu verwendet werden kann, Proben abgesetzt zu testen. Siehe US-Patentveröffentlichung Nr. 2012/0156712 , deren Offenlegung hier in ihrer Gesamtheit einbezogen ist.
Die Desorptions-Elektrospray-Ionisation (DESI) ist eine Ionisationstechnik bei Umgebungsdruck, die in der Massenspektrometrie zur chemischen Analyse eingesetzt werden kann. Es ist eine Ionenquelle bei Umgebungsdruck, die Gase, Flüssigkeiten oder Feststoffe an der Luft unter Umgebungsbedingungen ionisieren kann. DESI ist eine Kombination aus den Methoden zur Elektrospray-(ESI) und Desorptionsionisation (DI). Die Ionisation kann dadurch erfolgen, dass ein elektrisch geladener Nebel auf die Oberfläche der Probe geleitet wird. An der Probe oder am Probenhalter kann eine Spannung angelegt werden, um eine Anziehung des Elektrospraynebels durch die Oberfläche zu bewirken. Nach der Ionisation können die Ionen durch die Luft in die Umgebungsdruckschnittstelle wandern, die mit einem Massenspektrometer verbunden werden kann.
Als Ionisationsmechanismus kann die thermische Desorptionsionisation eingesetzt werden. Die Probe und biologische Komponenten können unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt werden, um die Ionisation auszulösen. Siehe US-Patentveröffentlichung Nr. 2013/0299688 , deren Offenlegung hier in ihrer Gesamtheit einbezogen ist.
Die Probenionen können mit einem beliebigen Mittel oder einer Technik, die geeignet ist, Ionen effektiv an ein Massenspektrometer zu übergeben, mit dem die Bestimmung der freien Fettsäuren und der gesamten Fettsäuren in einer Probe möglich ist, an das Massenspektrometer übergeben bzw. von diesem empfangen werden. So können die Ionen z.B. unter Umgebungsbedingungen übergeben werden.
Das Massenspektrometer kann ein beliebiges Massenspektrometer sein, das in der Lage ist, die Probenionen aufzunehmen, genaue Massenmessungen zu liefern und interessierende Probenanalyte zu identifizieren. Die strukturelle Bestimmung kann von den Geräten nach der vorliegenden Offenlegung ausgeführt werden, indem bei der Ionisation eine erste Generation von Ionen erzeugt wird, diese Ionen getrennt werden, die Ionen in eine zweite Generation von Ionen fragmentiert werden, diese zweite Generation von Ionen mit Hilfe ihrer Mobilität getrennt werden und eine dritte Generation von Ionen für die strukturelle Bestimmung erzeugt wird. Siehe US-Patentveröffentlichung Nr. 14/405,544 im gemeinsamen Eigentum, deren Offenlegung hier in ihrer Gesamtheit einbezogen ist.
Das Massenspektrometer kann ein Quadrupol-Massenspektrometer, ein tragbares Ionenfallen-Massenspektrometer, ein Flugzeit-Massenspektrometer, ein Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer, eine Orbitrap oder ein Ionen-Mobilitäts-Spektrometer sein. Zum Beispiel kann das Massenspektrometer ein einzelner Quadrupol-Detektor sein, wie z.B. ein einzelner Quadrupol-QDa^®-Detektor, wie er im Handel von der Waters Technologies Corporation, Milford, MA, erhältlich ist.
Die interessierenden Analyten können per Selection Reaction Monitoring in einem Quadrupol-Gerät analysiert werden. Der Selection Reaction Monitor arbeitet mit einer Vorauswahl einer Liste interessierender oder aus einem vollständigen Scan genauer Massenspektren extrahierter Ionen, wobei kein Ion vorausgewählt wird, sondern der Quadrupol entlang des gesamten ausgewählten Massenbereichs (z.B. 50–100 m/z) gescannt wird. Der Massenbereich kann 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 m/z einschließen. Diese Werte können Bereiche definieren, z.B. ca. 50 bis ca. 150 m/z.
Das Massenspektrometer kann im positiven oder negativen Modus betrieben werden. In einer Ausführung wird das Massenspektrometer im negativen Modus unter Desorptions-Ionisationsbedingungen betrieben. Fettsäuren lassen sich im negativen Modus besonders gut ionisieren. Die Kopplung des Massenspektrometers, z.B. ein einzelnes Quadrupol-Gerät, mit der Desorptionsionisation kann außerdem die direkte Analyse der Fettsäuren als Funktion der Spitzenintensität oder als Verhältnis zwischen Spitzen oder Spitzengruppen ermöglichen. Das Verhältnis der Fettsäuren kann dazu verwendet werden, die Variation in den Geräteeinstellungen und der Probennahme zu normalisieren. Z.B. wird eine Variation bei der Intensität einer oder mehrerer Fettsäuren durch eine entsprechende Variation einer oder mehrerer anderer Fettsäuren ausgeglichen. Das Verhältnis kann die Differenz zwischen einzelnen Proben ausgleichen.
Die Fragmentierung der komplexen Verbindungen, die Fettsäuren, z.B. veresterte Fettsäuren, enthalten, in freie Fettsäuren kann vor oder nach dem Einbringen in das Massenspektrometer erfolgen. Die Fragmentierung kann z.B. durch die Ionisationsquelle, in der Stoßzelle im Inneren des Massenspektrometers oder in beiden herbeigeführt werden.
Die vorliegende Offenlegung bezieht sich auf eine Methode zur Analyse einer Probe bei verschiedenen Ionisationsenergieniveaus, um die freien Fettsäuren und die gesamten Fettsäuren bei einer gegebenen Ionisationsenergie zu bestimmen. Die vorliegende Offenlegung bezieht sich auf ein Gerät und eine Methode, um verschiedene Energieniveaus zur Analyse einer Probe einzusetzen. Die Werte für die gesamten Fettsäuren können nacheinander aus einer Probe bestimmt werden, indem das Energieniveau immer weiter erhöht wird, bis die Werte der gesamten Fettsäuren abflachen. In einer Ausführung kann das Erhöhen der Ionisationsenergie während mehrerer aufeinanderfolgender Messungen Klassen von Fettsäuren bzw. Lipiden unterscheiden. So können z.B. bei einer niedrigen Temperatur, z.B. 100 °C, ein Teil oder die Mehrzahl der Fettsäuren verestert bleiben. Die Klassen können nach vielen Merkmalen, einschließlich des Molekulargewichts, unterschieden werden. In einer anderen Ausführung können veresterte Fettsäuren anhand der Ionenmobilität über die Post-Desorptionsionisation unterschieden werden.
In einigen Ausführungen kann die Energie oder Temperatur der Ionisationsquelle nicht ausreichend hoch sein, um eine repräsentative Probe effizient zu ionisieren oder zu fragmentieren. Die komplexen Verbindungen, die Fettsäuren enthalten, oder bei der Fragmentierung Fettsäuren erzeugen, können unter Umständen nicht alle bei derselben Ionisationsenergie fragmentiert werden. So kann die Probe z.B. Fettsäuren oder eine Klasse veresterter Fettsäuren mit unterschiedlichen Eigenschaften enthalten, z.B. unterschiedliche Flüchtigkeiten oder Fragmentierungsschwellen. Es kann Klassen komplexer Verbindungen geben, bei denen die Fragmentierung in Fettsäuren nur oberhalb eines bestimmten Energieniveaus erfolgt. Bei einem bestimmten Energieniveau oder einer bestimmten Temperatur können einige Fettsäuren leichter als andere ionisiert oder fragmentiert und ionisiert werden, was bei diesem Energieniveau oder dieser Temperatur zu einer Verschiebung des Verhältnisses führen kann. In einer Ausführung schließt die vorliegende Offenlegung einen Schritt ein, um ein ausreichendes Energieniveau (z.B. die Temperatur bei der thermischen Desorption) zur Ionisation einer repräsentativen Probe aller Komponenten zu bestimmen. So kann z.B. das Energieniveau bei steigenden Werten getestet werden, bis sich die Intensitäten oder das Intensitätsverhältnis der interessierenden Analyten auf einem konstanten Wert stabilisieren, der auf ein repräsentatives Sampling der Analyten hinweist.
In einer Ausführung wird die Fragmentierung dadurch eingeleitet, dass die Energie der Ionisationsquelle ausreichend hoch ist, um die Fragmentierung im Wesentlichen aller komplexen Verbindungen, die Fettsäuren, z.B. veresterte Fettsäuren, enthalten, in freie Fettsäuren zu bewirken.
Die Energieniveaus können von der Ionisationsquelle abhängen. So kann z.B. eine Ionisationsquelle zur thermischen Desorption Energie in Form von Temperaturen von ca. 0 °C bis ca. 750 °C liefern. Die Temperatur der Ionisationsquelle zur thermischen Desorption kann höher oder niedriger als ca. 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 oder ca. 750 °C sein. Diese Werte können einen Bereich definieren, z.B. ca. 400 bis ca. 550 °C.
Die Fragmentierung kann auch in der Stoßzelle im Inneren des Massenspektrometers herbeigeführt werden. In einer Ausführung wird die in der Stoßzelle im Massenspektrometer herbeigeführte Fragmentierung bei einem ausreichend hohen Energieniveau vorgenommen, um im Wesentlichen alle veresterten Fettsäuren in freie Fettsäuren zu fragmentieren. So kann z.B. die Kollisionsenergie (CE) höher oder niedriger als ca. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 oder ca. 75 V sein. Diese Werte können verwendet werden, um einen Bereich zu definieren, z.B. ca. 6 bis ca. 50 V. im Allgemeinen kann das Energieniveau der Ionisationsquellen von niedrigen bis zu hohen Einstellungen eingestellt bzw. hochgefahren werden, wobei die Moleküle bei den niedrigen oder Minimaleinstellungen unbeeinflusst bleiben und die höheren oder Maximaleinstellungen eine vollständige Fragmentierung einer oder mehrerer Klassen von Makromolekülen bewirken können.
Das Gerät kann eine Ionisationsquelle haben, bei der die gelieferte Energie verändert werden kann. So kann die Energie z.B. verringert werden, um die freien Fettsäuren in der Probe zu ionisieren. Die Energie kann auf ein Niveau verringert werden, bei dem die komplexen Komponenten, die Fettsäuren enthalten, keine Fragmentierung zur Erzeugung von Fettsäuren erfahren. Die Energie kann auch erhöht werden, um die Fragmentierung komplexer Komponenten, die Fettsäuren enthalten oder bei der Fragmentierung Fettsäuren erzeugen, herbeizuführen. Die gesamten Fettsäuren, freie und freigesetzte bzw. erzeugte, in der Probe können ionisiert werden.
In einer Ausführung umfasst die Technologie in der vorliegenden Offenlegung ein System, das die Energie von einer niedrigeren Einstellung nur zur Bestimmung der freien Fettsäuren bis zu einer höheren Einstellung zur Einleitung der Fragmentierung und Bestimmung des gesamten Fettsäuregehalts und umgekehrt verstellen kann. Die Zeit zwischen den Verstellungen kann weniger als ca. 1 Stunde, 10 Minuten, 5 Minuten, 1 Minuten, 10 Sekunden, 5 Sekunden, 1 Sekunde, 500 Millisekunden, 100 Millisekunden, 50 Millisekunden, 10 Millisekunden, 5 Millisekunden, 1 Millisekunde, 0,5 Millisekunden und ca. 0,1 Millisekunden betragen. Diese Werte können außerdem dazu herangezogen werden, einen Bereich zu definieren, z.B. von ca. 1 Millisekunde bis ca. 0,1 Millisekunden. In einer Ausführung kann das gleiche Gerät dazu verwendet werden, beide Analysen zu erzeugen, um sowohl die Werte bei niedriger als auch hoher Energie oder beide zu erzeugen.
So kann z.B. eine Probe mit einem System zur Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie getestet werden, das verschiedene Energieeinstellungen ermöglicht. Durch Erhöhen der Ionisationsenergie, um die Fragmentierung herbeizuführen, und Einbringen aller Fragmentierungen in das Massenspektrometer können die absoluten Informationen zu den Fettsäuren (oder Fettacylen) gewonnen werden. Fettacylgruppen können im negativen Modus als geladene Ionen [M-H]- detektiert werden. Die postakquisatorische Analyse kann zwischen dem Fettsäure- oder Fettacylgehalt und der Verteilung in verschiedenen Lipidklassen entsprechend den verschiedenen analysierten biologischen Proben differenzieren. Die Zusammensetzung der Fettsäuren (oder Fettacyle) lässt sich in den molekularen Fingerabdruck eines Gewebes umwandeln. Mit Hilfe der Methodik und Geräte nach der vorliegenden Offenlegung können umfassende Screenings und Fingerabdrücke von Fettsäureverbindungen zur Identifizierung von Phänotypen und zur vergleichenden lipidomischen Analyse durchgeführt werden. So können z.B. rote Blutzellen oder andere Gewebebiopsien mit Hilfe der vorliegenden Offenlegung analysiert werden, um den Ernährungszustand und das Krankheitsrisiko eines Patienten zu bewerten.
Die Fettsäuren und die gesamten Fettsäuren können aus den Ergebnissen der Massenspektrometrie berechnet werden. Die Menge (z.B. die relative Menge) kann anhand der Intensität der Spitzen berechnet werden. Die Menge kann mit oder ohne Verwendung eines internen Standards berechnet werden. Die Nutzung eines internen Standards erlaubt eine Semi-Quantifizierung nach der Korrektur eventueller isotopischer Signalanteile. So können z.B. interne Standards dazu herangezogen werden, die Konzentration der Fettsäuren in den Proben zu normalisieren, um eine quantitativere Messung zu erhalten. Zum Beispiel können die Intensitäten der Fettsäuresignale im negativen Modus proportional zu deren Konzentration sein und als Prozentwert der gesamten Fettsäuren normalisiert werden.
Im Allgemeinen sind die Methoden nach der vorliegenden Technologie so robust, dass das Sampling die Komponenten, interessierenden Analyten oder interessierenden Klassen von Analyten, z.B. Omegasäuren, in der Probe nicht erschöpft. Der Ionisationsprozess kann eine kurze Exponierung der Ionisationsquelle gegenüber der Probe umfassen, deren Dauer kürzer als ca. 10 Sekunden, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2 oder ca. 0,1 Sekunden ist. Diese Werte können dazu verwendet werden, einen Bereich zu definieren, z.B. zwischen ca. 0.5 und ca. 2 Sekunden.
Im Allgemeinen können die Methoden nach der vorliegenden Offenlegung die Fettsäuren, den gesamten Fettsäuregehalt oder beides in einer kürzeren Zeit als die Methoden nach dem bisherigen Stand der Technik bestimmen. In einigen Ausführungen kann diese Methode die Werte innerhalb von 10 Minuten, 20, 30, 40, 50 oder 60 Minuten oder 1,5 Stunden, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 24 Stunden im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bestimmen. Diese Werte können dazu verwendet werden, einen Bereich zu definieren, z.B. zwischen ca. 10 Minuten und ca. 60 Minuten. In einer anderen Ausführung kann die vorliegende Offenlegung die Fettsäuren, den gesamten Gehalt an Fettsäuren oder beide bestimmen, ohne dass eine Probe zur Analyse an ein Labor gesandt werden muss. Die Methode kann für die Vor-Ort-Diagnose (z.B. Arztpraxis, Apotheke usw.) eingesetzt werden.
Die vorliegende Offenlegung kann die Fettsäuren, den gesamten Gehalt an Fettsäuren oder beide ohne Extraktion, Hydrolyse, Filterung, Derivatisierung, chromatographische Trennung (z.B. GC-FID) oder Kombinationen aus diesen Methoden bestimmen. Die Methoden nach dem bisherigen Stand der Technik schließen einen oder mehrere dieser Schritte ein und können Stunden beanspruchen, um sie durchzuführen, z.B. mindestens ca. 2 Stunden. Die Methode nach der vorliegenden Offenlegung verkürzt die Analysezeit um ca. 10%, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 500 oder ca. 1000% im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Diese Werte können dazu verwendet werden, einen Bereich zu definieren, z.B. zwischen ca. 20% und ca. 50%.
Die vorliegende Offenlegung bezieht sich auch auf die Bildgebung. Der Werte der Fettsäuren und gesamten Fettsäuren können für einen einzelnen Punkt auf einer Probe bestimmt werden. Es können zusätzliche Punkte auf der Probe getestet werden, um ein Bild der Probe mit den Positionen der Fettsäuren zu erstellen.
In einer Ausführung bezieht sich die vorliegende Offenlegung auf eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Verteilung der gesamten Fettsäuren auf der Oberfläche einer Probe, z.B. durch Bildgebung, einschließlich der Erzeugung von Probeionen einer ersten Position auf einer Probe, die veresterte und freie Fettsäuren enthält, mit Hilfe einer Ionisationsquelle, wobei die Ionen in ein Massenspektrometer eingebracht werden und dort vor oder nach dem Einbringen in das Massenspektrometer eine Fragmentierung der veresterten Fettsäuren in freie Fettsäuren bewirkt wird, um die gesamten Fettsäuren in der Probe an der ersten Position zu bestimmen und diese Schritte an einer Vielzahl von Positionen zu wiederholen. Die – zeigen Beispielbilder von Gewebeproben, in denen die Fettsäuren an verschiedenen Stellen des Gewebes kartiert sind. Die verschiedenen Fettsäuren können als freie Fettsäuren oder bei der Analyse mit hoher Energie als gesamte Fettsäuren bestimmt werden.
Die erste Position auf der Oberfläche einer Probe kann eine beliebige Position sein. Die zusätzlichen Positionen auf der Oberfläche der Probe, z.B. die Vielzahl von Positionen, können beliebige andere Positionen auf der Oberfläche der Probe sein. In einer Ausführung handelt es sich bei diesen Positionen um lauter getrennte Positionen auf der Oberfläche der Probe. Die Analyse an jeder Position kann entweder durch direktes Sampling von der Oberfläche der Probe durch die Desorptions-Ionisationsquelle oder anhand von Proben erfolgen, die an der Vielzahl der Positionen entnommen worden sind.
Der Abstand zwischen benachbarten Positionen kann je nach der gewünschten Detaillierung und Auflösung für die Analyse der räumlichen Verteilung variieren. Um eine ausreichend detaillierte Analyse der räumlichen Verteilung zu erhalten, kann der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Postionen weniger als ca. 100 mm, 50, 10, 1, 0,5, 0,01, 0,005 oder ca. 0,001 mm betragen. Diese Werte können auch dazu verwendet werden, einen Bereich zu definieren, z.B. zwischen ca. 1 und 0,001 mm.
Die Technologie nach der vorliegenden Offenlegung kann dazu verwendet werden, die freien Fettsäuren oder die gesamten Fettsäuregehalt in Vollblut, Plasma, roten Blutzellen und anderen Proben zu bestimmen. In einigen Ausführungen hat die Probenmatrix keine wesentlichen Auswirkungen auf die Analyse. Insbesondere kann die Bestimmung der freien und der gesamten Fettsäuren an roten Blutzellen erfolgen. Da die durchschnittliche Lebensdauer einer roten Blutzelle ca. 120 Tage beträgt, kann die Analyse roter Blutzellen Informationen zum Fettsäureprofil einer Person über einen vergleichsweise längeren Zeitraum (z.B. Wochen oder Monate) liefern. Rote Blutzellen reagieren weniger empfindlich auf Änderungen der Ernährung oder die Aufnahme von Fettsäuren. Andere Proben können mehr oder weniger empfindlich auf Änderungen über die Zeit reagieren. So unterliegen Urinproben z.B. eher stündlichen oder täglichen Schwankungen in Abhängigkeit von der aktuellen Ernährung, Nahrungsmitteln, Trinkgewohnheiten usw. Hirngewebeproben können weniger empfindlich auf stündliche, tägliche, wöchentliche usw. Änderungen reagieren.
Die Analyse der gesamten Fettsäuren in roten Blutzellen kann viele Vorteile gegenüber anderen potenziellen Quellen haben, z.B. (i) die Doppellipidschicht kann bei Fettsäuren in Geweben reflektierender sein als bei Fettsäuren in Serum, (ii) Fettsäuren in roten Blutzellen haben eine 4 bis 6 mal längere Halbwertzeit als Fettzellen im Serum, wodurch langfristige Bedingungen besser wiedergegeben werden können, (iii) das Fettsäureniveau in roten Blutzellen wird durch einen gesättigten oder nüchternen Zustand nicht wesentlich beeinflusst, (iv) das Fettsäureniveau in roten Blutzellen reagiert auf zunehmende Aufnahme, (v) die Zusammensetzung der roten Blutzellen wird weniger durch Fettstoffwechselstörungen beeinflusst als die Fettsäuren im Serum, (vi) die Fettsäuren in roten Blutzellen unterliegen geringeren Schwankungen als deren Werte im Serum, (vii) die labortechnische Bewertung der Fettsäurewerte in roten Blutzellen ist einfacher als bei Fettsäuren in Lipoprotein oder der Lipidfraktion und (viii) die roten Blutzellen sind weniger empfindlich gegenüber Schwankungen bei den Lagerbedingungen vor der Analyse.
Die Methode nach der vorliegenden Offenlegung kann bei roten Blutzellen und anderen Blutbestandteilen (z.B. Plasma, Serum, Lymphozyten) oder Gewebebiopsien, Sebum und Bioflüssigkeiten angewandt werden. Die Methode kann auch bei allen molekularen Zellbestandteilen, z.B. Zucker, Nukleotiden und Aminosäuren aus Oligosacchariden, Oligonukleotiden und Peptiden bzw. Proteinen, angewandt werden. Die Methode kann sowohl bei flüssigen als auch festen Proben biologischen Ursprungs und Nahrungsmitteln angewandt werden. Chemische Unterstrukturen können auch als Serien von Fragment-Ionen identifiziert werden, die physiologisch als neutrale molekulare Spezies auftreten können. So sind z.B. Fragmente, die durch die Desorptions-Ionisationsanalyse komplexer Lipidspezies mit hoher Energie erzeugt werden, auch häufige Produkte der enzymatischen Hydrolyse (z.B. Lysophospholipide und Fettsäuren) oder einer chemischen Umlagerung (z.B. Produkte der intramolekularen Zyklisierung von Phosphatgruppen).
Die Offenlegungen aller zitierten Referenzen einschließlich Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden hier als Referenz in ihrer Gesamtheit ausdrücklich einbezogen.
Wenn eine Menge, eine Konzentration oder ein anderer Wert oder Parameter entweder als Bereich, bevorzugter Bereich oder eine Liste bevorzugter oberer Werte und bevorzugter unterer Werte angegeben ist, so ist dies als spezifische Offenlegung aller aus beliebigen Paaren aus oberen Bereichsgrenzen oder bevorzugten Werten und unteren Bereichsgrenzen oder bevorzugten Werten zu verstehen, ungeachtet dessen, ob Bereiche getrennt offengelegt werden. Wenn hier ein Bereich numerischer Werte angegeben wird, schließt dieser Bereich, soweit nicht anders angegeben, dessen Endpunkte und alle ganzzahligen Werte und Brüche innerhalb dieses Bereichs ein. Es ist nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung auf die bei der Definition eines Bereichs angegebenen spezifischen Werte zu beschränken.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter definiert. Es versteht sich, dass diese Beispiele, auch wenn sie bevorzugte Ausführungen der Erfindung zeigen, nur zur Veranschaulichung gezeigt werden.
Beispiele
Beispiel 1
Der Fettsäure- und der Gesamt-Fettsäuregehalt in Hirngewebe wurden anhand der Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie bestimmt. Das verwendete Gerät bestand aus einer Oberflächen-Ionisationsdesorption z.B. der direkten Echtzeitanalyse (DART^®, IonSense, MA, USA) in Verbindung mit einem einzelnen Quadrupol-Massenspektrometer, z.B. Acquity^® QDa^®, Waters Corporation, Milford, MA, USA. Die Erfassungszeit betrug ca. 5–10 Sekunden, Ionisation DART^®+ve und –ve; Konusspannung 20,0 V; Quelltemperatur 120,0 °C; DART^®-Temperatur 50 bis 450 °C.
Der gesamte Prozentwert der Omega-3 DHA in verschiedenen Hirnregionen wurde bestimmt durch Einsatz einer Hochenergiefragmentierung nach der DI und Überwachung von m/z relativ zum Verlust der DHA-Acylgruppe (m/z 327,3) im negativen Modus. Aus den Ergebnissen kann ein Bild der Verteilung der Omega-3 DHA erstellt werden. Andere Fettsäuren wurden ebenfalls überwacht und deren Gehalt nach der Akquisition bestimmt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2012/0156712 [0031]
US 2013/0299688 [0033]
US 14/405544 [0035]

Claims

Beansprucht wird: Eine Methode zur Bestimmung der gesamten Fettsäuren in einer Probe, bestehend aus: (i) Erzeugung von Probenionen aus einer Probe, die veresterte und freie Fettsäuren enthält, mit Hilfe einer Desorptions-Ionisationsquelle; (ii) Einbringen der Ionen in ein Massenspektrometer; (iii) Herbeiführung der Fragmentierung der veresterten Fettsäuren in freie Fettsäuren vor oder nach dem Einbringen in das Massenspektrometer und (iv) Identifizieren der gesamten Fettsäuren in der Probe.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei die veresterten Fettsäuren Glycerolipide, Glycerophospholipide, Sterollipide oder Sphingolipide bzw. Kombinationen daraus umfassen.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei die Desorptions-Ionisationsquelle mit einer Technik arbeitet, die aus einer Gruppe ausgewählt wird, die die Elektrospray-Ionisation, die Nano-Elektrospray-Ionisation, Matrix-unterstützte Laser-Desorptionsionisation, die chemische Ionisation unter Atmosphärendruck, die Desorptions-Elektrospray-Ionisation, die Ionisation durch dielektrische Barriereentladung unter Atmosphärendruck, die Niedertemperatur-Plasma-Desorptionsionisation unter Atmosphärendruck, die Laser-unterstützte Elektrospray-Ionisation und die Elektrospray-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation umfasst.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei die Desorptions-Ionisationsquelle mit einer Technik arbeitet, die aus einer Gruppe ausgewählt wird, die die ASAP, die direkte Echtzeitanalyse, die REIMS-Methode, die Desorptions-Elektrospray-Ionisation, die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation, die Laser-Absorptions-Elektrospray-Ionisation sowie die NIMS-Methode umfasst.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei das Massenspektrometer ein Quadrupol-Massenspektrometer, ein tragbares Ionenfallen-Massenspektrometer, ein Flugzeit-Massenspektrometer, ein Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer, eine Orbitrap oder ein Ionen-Mobilitäts-Spektrometer ist.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei das Massenspektrometer im negativen Ionisationsmodus betrieben wird.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei die Fragmentierung dadurch eingeleitet wird, dass die Energie der Ionisationsquelle ausreichend hoch ist, um die Fragmentierung im Wesentlichen aller veresterten Fettsäuren in freie Fettsäuren zu bewirken.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei die Fragmentierung in einer Stoßzelle im Massenspektrometer eingeleitet wird, wobei die Energie in der Stoßzelle ausreichend hoch ist, um die Fragmentierung im Wesentlichen aller veresterten Fettsäuren in freie Fettsäuren zu bewirken.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Probe um eine biologische Probe handelt.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei die Schritte (i) bis (iv) in weniger als 24 Stunden ausgeführt werden.
Eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Verteilung der gesamten Fettsäuren auf der Oberfläche einer Probe, bestehend aus: (i) Erzeugung von Probenionen an einer ersten Probenposition aus einer Probe, die veresterte und freie Fettsäuren enthält, mit Hilfe einer Ionisationsquelle; (ii) Einbringen der Ionen in ein Massenspektrometer; (iii) Herbeiführung der Fragmentierung der veresterten Fettsäuren in freie Fettsäuren vor oder nach dem Einbringen in das Massenspektrometer; (iv) Identifizieren der gesamten Fettsäuren in der Probe an der ersten Position, und (v) Wiederholen der Schritte (i) bis (iv) an einer Vielzahl von Positionen.