WO2024115394A1 - Diagnose von metabolischen veränderungen der leber mittels metabolischer analyse von erythrozyten durch massenspektrometrie - Google Patents

Diagnose von metabolischen veränderungen der leber mittels metabolischer analyse von erythrozyten durch massenspektrometrie Download PDF

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WO2024115394A1
WO2024115394A1 PCT/EP2023/083183 EP2023083183W WO2024115394A1 WO 2024115394 A1 WO2024115394 A1 WO 2024115394A1 EP 2023083183 W EP2023083183 W EP 2023083183W WO 2024115394 A1 WO2024115394 A1 WO 2024115394A1
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lpe
lpc
erythrocytes
metabolites
cerium
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PCT/EP2023/083183
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Adrian Tibor Press
Dustin BEYER
Markus H. GRÄLER
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Universitätsklinikum Jena
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    • G16H10/40—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data for data related to laboratory analysis, e.g. patient specimen analysis

Definitions

  • the invention relates to methods for analyzing a biological sample for changes in signatures of metabolites in a liver disease, and to the use of the results of the method in personalized medicine.
  • the invention lies in the field of individualized medicine. This plays a particularly important role in complex disease processes.
  • the concept of "individualized” or “personalized” care which implies stratification of the patient based on a better assessment of the complex disease process, is challenging but promising for the seriously ill.
  • More comprehensive monitoring of metabolism using mass spectrometry to assess the "metabolome”, i.e. "metabolomics” is currently entering clinical routine (Kiehntopf et al., 2013).
  • This technique can be performed in an "untargeted” approach or to monitor specific groups of analytes.
  • the metabolome as a complex reaction network summarizes all characteristic metabolic properties of a cell, tissue or organism.
  • metaboi ome was coined as the "sum of all metabolic products (metabolites)" in analogy to the terms genome, transcriptome and proteome and was named accordingly. The word is derived from metabolism.
  • metabonome is also occasionally used for metaboi ome, especially in connection with the toxicity assessment of active substances.
  • the metabolome includes:
  • Another aspect is the influence of the nutrient supply as well as the effect of active substances on the metabolism and the various functions of the cells, such as cell proliferation, differentiation and apoptosis.
  • metabolomics or metabonomics
  • the study of the metabolome is called metabolomics (or metabonomics). This includes the interaction of the metabolites contained therein, their identification and quantification (cf. proteome and genome).
  • the main analysis methods used in metabolomics are GC/MS and LC/MS as well as NMR spectroscopy and ion mobility spectrometers. The methods can be split into separation techniques, ionization techniques and detection techniques. Since the metabolites can vary greatly in their chemical composition and structure, it is often not enough to use just one analysis method to fully elucidate the metabolome of an organism. In addition, it is still not known how many metabolic products there are.
  • the most common sample types are body fluids such as plasma or serum, but also urine, cerebrospinal fluid, synovial fluid, sputum or lavage. In addition, tissue hornogenates or cells or supernatants from cell cultures can be considered.
  • analytes such as unconjugated and glycine/taurine-conjugated primary bile acids are detected using mass spectrometry, as in the study by Vanwijngarden et al. While bilirubin is traditionally used exclusively to monitor excretory liver function in the intensive care unit, e.g.
  • liver function-associated metabolites cholesterol, bilirubin, albumin
  • exogenous clearance assays are used clinically. These include: the indocyanine green test (fluorescence-based measurement of excretory function); the galactose tolerance test (injection of galactose and measurement of the proportion excreted via the kidney); the C 14 -aminopyrine or 14 C-galactose breath test; and caffeine clearance.
  • Biochemical assays often require complex sample preparation and pre-analytics. The transport of the usually sensitive biological samples is critical. Breath gas analysis is very complex. In addition, there are numerous clinical disadvantages. Biochemical assays are often imprecise, ie they have a low specificity, and do not provide precise information about the level of dysfunction. The assessment is often based on liver damage parameters, which only partially indicate the loss of function and the type of loss of function. Differentiation of liver damage is not possible with these assays. Breath gas analysis is usually time-consuming and offers little added value. Only individual analytes are examined. The information provided here, as with fluorescence angiography (indocyanine clearance test), is limited to the information on liver function. The type of dysfunction can only be assessed indirectly.
  • sample preparation is very complex: Special coated (matrix) slides are used. Different coatings must be used for different metabolite groups. Certain metabolite groups cannot be measured on a sample at the same time. The sample is usually destroyed by imaging, and subsequent analysis is not possible. The maximum achievable resolution is relatively low (micrometer scale).
  • WO 2022/167521 Al relates to a method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in a disease, comprising
  • step (b) an image-based screening of the desired measurement areas determined in step (a) using at least one spectroscopic method, comprising o the identification and quantification of key metabolites of the metabolic disease, o the detection of changes in the key metabolites of the metabolic disease, and
  • the method according to WO 2022/167521 Al is particularly suitable for the diagnosis of metabolic diseases and proliferative diseases, but is complex in terms of measurement technology and corresponding machines are not yet fully established and certified for routine clinical use.
  • the object of the invention was to provide methods for a more comprehensive assessment of metabolism and the metabolome, which do not have the disadvantages of the state of the art and can be established in clinically established infrastructures using the measurement method of mass spectrometry.
  • the invention provides a method for analyzing a biological sample for changes in signatures of bowl metabolites in a liver disease according to claim 1.
  • a “biological sample” is understood to mean any type of biological material in which erythrocytes are present or from which erythrocytes can be isolated.
  • the amount of key metabolites is detected in a body fluid sample derived from a mammal, most preferably a human.
  • body fluid refers to all fluids present in the human body in which erythrocytes are present or from which erythrocytes can be isolated.
  • body fluids within the meaning of the invention are selected from blood and urine.
  • a blood sample is particularly preferred.
  • the blood sample can be treated before use, e.g. with an anticoagulant such as EDTA.
  • the biological sample can also be a tissue sample or a biopsy that contains traces of blood and therefore erythrocytes.
  • the biological sample can also be a sample from a cell culture of erythrocytes.
  • the biological sample is a sample selected from the group comprising blood, urine, a tissue sample, a biopsy, and a cell culture, wherein the biological sample contains erythrocytes.
  • the method for analyzing biological samples for changes in signatures of key metabolites in a disease includes the step of taking the biological sample from a test subject.
  • the method according to the invention is carried out on a biological sample that has previously been taken from a test subject.
  • subject refers to a mammal that suffers from or is suspected of suffering from a disease such as a metabolic disease or cancer.
  • subject refers to a human.
  • the method according to the invention is based in particular on using erythrocytes as a cellular compartment to reveal potential differences in the lipid profile and to enable early diagnosis and treatment of liver diseases.
  • the lipids present in erythrocytes are the key metabolites that are analyzed using the method of the invention.
  • Erythrocytes represent the largest cellular fraction of blood, with 4-5 million erythrocytes per microliter of blood. In terms of their morphology, erythrocytes are biconcave, circular cells with a diameter of about 7.5 pm. Hemoglobin is the molecular equivalent that causes the red color. It is the iron-containing metalloprotein for oxygen transport that enables the main function of erythrocytes. As they pass through the pulmonary capillaries, red blood cells bind oxygen to hemoglobin, forming oxyhemoglobin for peripheral transport. (Kuhn et al, 2917) But erythrocytes are also involved in other physiological processes, such as regulating the tone of blood vessels caused by shear stress.
  • the surrounding cell membrane consists mainly of a typical lipid bilayer. Cholesterol and phospholipids are the essential elements of the inner and outer layers of the membrane. Comparing both structures reveals differences in the lipid distribution. While phosphatidylcholines (PC) and sphingomyelins (SM) are more common on the surface, phosphatidylethanolamines (PE) and phosphatidylserines (PS) predominate in the intracellular layer (see also Figure 1). This defined lipid distribution is crucial for cell integrity and is maintained by the enzymes flippase and scramblase. (Mohandas et al., 2008) A network of more than 50 membrane proteins enables the cell to fulfill the above-mentioned functions in all their diversity.
  • PC phosphatidylcholines
  • SM sphingomyelins
  • PE phosphatidylethanolamines
  • PS phosphatidylserines
  • erythrocytes mainly focuses on a quantitative and morphological pattern.
  • the characterization of the properties of erythrocytes is essentially based on the number and volumetric characteristics in general.
  • the microscopic appearance of erythrocytes in a blood smear can show abstract formations such as acanthocytes, fragmentocytes or spherocytes, which can facilitate the diagnostic procedure in many cases.
  • the composition of the erythrocytes as an independent compartment is now used for the detection of various organic diseases, preferably diseases of the liver.
  • the analysis of erythrocyte lipids is carried out using spectroscopic methods, particularly preferably using mass spectrometry (MS).
  • Mass spectrometry is a widely used and well-established method for quantifying various molecular changes in different samples.
  • the principle of mass spectrometry is to analyze the mass charge quotient for a single molecule, which can be easily compared to a standard mixture or a worldwide database technology. Molecules passing through the spectrometer must be desorbed in a first step, followed by an ionization step to introduce a specific molecular charge. Powerful turbo pumps create a high vacuum in the MS so that the molecules can pass without friction. The induced ions can then be accelerated and separated in electric fields to guide them to the surface of the detector.
  • Lipidomics is a subfield of metaboi omics that mainly focuses on different lipid subgroups involved in signaling, membrane or metabolic pathways.
  • Lique et al., 2020, Züllig et al., 2020 Many recent studies show that lipids play a central role in the pathophysiology of sepsis and could become a central component of potential diagnostic and therapeutic targets.
  • Amungama et al., 2021
  • Phospholipids which are involved in various important molecular processes, can be divided into glycerophospholipids and sphingolipids. Both molecules are bound to phosphate, but differ in the structure of the lipid backbone. While glycerophospholipids contain glycerol and two fatty acid chains, sphingolipids contain sphingosine and an additional fatty acid chain (see also Figure 2).
  • Preferred key metabolites for the process of the invention are therefore lipids from erythrocytes, preferably phospholipids and sphingolipids, particularly preferably Lipids independently selected from the group comprising phosphatidylcholines (PC), ceramides (Cer), sphingomyelins (SM), lysophosphatidylethanolamines (LPE), and lysophosphatidylcholines (LPC).
  • PC phosphatidylcholines
  • Cer ceramides
  • SM sphingomyelins
  • LPE lysophosphatidylethanolamines
  • LPC lysophosphatidylcholines
  • Phosphatidylcholines suitable for the process according to the invention are selected, for example, from
  • PC (28:0), PC (30:0), PC (30:1), PC (32:0), PC (32:1), PC (34:1), PC (34:2), PC (36:0), PC (36:1), PC (36:2), PC (36:3), PC (36:4), PC (38:0), PC (38:1), PC (38:2), PC (38:3) and PC (38:4).
  • Sphingomyelins suitable for the method according to the invention are selected, for example, from
  • Lysophosphatidylethanolamines suitable for the process according to the invention are selected, for example, from
  • Ceramides suitable for the process according to the invention are selected, for example, from
  • Lysophosphatidylcholines suitable for the process according to the invention are selected, for example, from
  • a particular advantage of the invention is that the method provided can be used to analyze a combination of a large number of different lipids as key metabolites of erythrocytes. This allows changes in signatures of key metabolites in biological samples to be recognized in the case of a disease and used to diagnose a metabolic disease or metabolic disorder, particularly in the liver. This is not yet known from the prior art.
  • At least one mass spectrum of the biological sample is measured with at least one key metabolite.
  • more than one mass spectrum is measured for more than one key metabolite of the biological sample.
  • mass spectrometry requires only small amounts of samples to be carried out. Accordingly, in one embodiment of the invention, between 1 pl and 150 pl, preferably between 30 pl and 100 pl, most preferably 50 pl of the biological sample is used for measurement by mass spectrometry. Since biological samples from the field of medical diagnostics have a limited volume, it is a great advantage that only a small part of the biological sample is necessary to carry out the method according to the invention. This enables general, untargeted screening diagnostics for all samples before or in parallel with targeted conventional laboratory diagnostics. Nevertheless, a predominant part of a biological sample is available for carrying out further diagnostics, such as routine medical diagnostics in the laboratory.
  • a correlation can be made between the type or amount of one or more key metabolites and a likely diagnosis of a disease.
  • a statistically significant increase in the amount of one or more key metabolites compared to the control samples is sufficiently predictive that the subject has a disease typical for the key metabolite(s) or a specific pattern of key metabolites.
  • a normal amount of one or more key metabolites or a normal pattern of key metabolites indicates that the patient does not have a disease typical for the key metabolite(s) or a specific pattern of key metabolites.
  • a positive indication of disease based on an increased or decreased amount of one or more key metabolites or an altered pattern of key metabolites compared to a normal control is generally considered along with other factors in making a definitive diagnosis of a particular disease. Therefore, the increased or decreased amounts of one or more key metabolites or an altered pattern of key metabolites of the tested subject are generally considered along with other accepted clinical signs of the particular disease in making a definitive diagnosis of such a disease.
  • the method for analyzing a biological sample for changes in signatures of bowl metabolites in a liver disease comprises the steps
  • step (e) detecting changes in the signatures of the key liver disease metabolites identified in step (d), and
  • the method according to the invention can further comprise conventional steps for sample preparation for mass spectrometry which are familiar to the person skilled in the art.
  • the invention further relates to the use of the method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in a disease for diagnosing a metabolic disease, metabolic disorder or a proliferative disease.
  • erythrocytes from a biological sample.
  • Whole blood from a test subject is preferably used for the isolation.
  • agents to prevent blood clotting preferably ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Further steps for isolating erythrocytes from a biological sample usually include sedimenting the erythrocytes by centrifugation (e.g. at 1,000 g for 10 min. at 20 °C) to separate the cellular blood components, washing the sedimented erythrocytes with a buffer solution (e.g.
  • the method according to the invention is an in vitro method and the step of taking the biological sample is not part of the method.
  • sample preparation steps are usually necessary for the analysis of key metabolites using mass spectrometry. It is particularly preferred if sample preparation is carried out under standardized conditions in order to comply with the requirements of Good Laboratory Practice (GLP) and to achieve reproducible results.
  • GLP Good Laboratory Practice
  • a stored red blood cell sample is thawed, a predefined volume is removed and mixed with a predefined volume of solvent and a predefined volume of an internal standard mixture (see Table 1).
  • 80 pl of isolated erythrocytes are mixed with 790 pl of methanol and 10 pl of the internal standard mixture.
  • Sample preparation for mass spectrometry typically includes further steps known to those skilled in the art, such as: a step of rotating the mixture for a predefined period of time at room temperature; a step of precipitating overnight at a temperature of -80°C; a step of centrifuging; a step of evaporating the supernatant after centrifugation; a step of dissolving the evaporated sample in a solvent; and storing the sample at a temperature of -80°C.
  • the step of rotating the mixture for a predefined period of time at room temperature can, for example, be carried out in a vortex mixer at high speed for 1 min. and then in a rotary mixer for 20 min. at 15 revolutions per minute. Centrifugation can be carried out, for example, at 10,000 g for 10 min. at 4°C.
  • the step of evaporating the supernatant can be carried out, for example, at 50°C for 90 min. in a vacuum centrifuge.
  • the sample can then be resuspended in a solvent such as methanol, preferably 100 ⁇ l methanol.
  • the resuspended sample can then be directly analyzed by mass spectrometry or temporarily stored at a temperature of -80 °C.
  • sample preparation for mass spectrometry comprises the following steps: a step of rotating a mixture of 80 pl of isolated erythrocytes with 790 pl of methanol and 10 pl of the internal standard mixture at room temperature for 1 min. at high speed in a vortex mixer and then in a rotary mixer for 20 min. at 15 revolutions per minute; a step of precipitation overnight at a temperature of -80°C; a step of centrifugation at 10,000 g for 10 min. at 4°C; a step of evaporating the supernatant after centrifugation at 50°C for 90 min. in a vacuum centrifuge; a step of dissolving the evaporated sample in 100 pl of methanol; and optionally storing the sample at a temperature of -80°C.
  • the invention further relates to the use of the method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in a disease for diagnosing a metabolic disease or metabolic disorder, in particular of the liver.
  • the step “diagnosis of the disease” of the method according to the invention then further comprises the steps: • comparing the detected amount of one or more key metabolites in the biological sample with an amount of the key metabolites characteristic of a normal control sample (reference range); and/or
  • the method according to the invention is based on the examination of blood samples, whereby the analysis of the signatures of lipids or the lipid profile of erythrocytes is carried out.
  • the data evaluation of the method according to the invention usually comprises steps such as:
  • the diagnosis of metabolic changes in the liver according to step v. is carried out on the basis of the changes in predefined lipid fractions, ie on the basis of key metabolites/lipids which are typical for a particular liver disease.
  • the key metabolites are preferably identified by correlation with a spectral reference library of pure substances. Such a procedure is known to the person skilled in the art.
  • the step of analyzing and evaluating the metabolic signature is preferably carried out using statistical methods.
  • the spectroscopy data can be analyzed by purely visual comparison in order to extract the disease-relevant information, or by applying suitable statistical methods that are known to the person skilled in the art and are selected. All unsupervised and supervised statistical methods are suitable for this.
  • Supervised statistical methods include, for example, principal component analysis.
  • Supervised statistical models include, for example, linear discriminant analysis, support vector machine, partial least squares regression, random forest, neural network analysis and machine learning.
  • methods for sample classification and visualization of the component distribution can be used. Suitable methods for sample classification and visualization are, for example: abundance analyses and cluster analysis methods. These include, for example: vector component analysis, NFINDR and k-means clustering.
  • principal component analysis is used in the method according to the invention to analyze and evaluate the metabolic signature.
  • the evaluation of data using principal component analysis is known to the person skilled in the art, see e.g. https://de.wikipedia.org/wiki/Hauptkomponentenanalysis.
  • cluster analyses it is also preferred if the principal component analysis of the measured lipid profiles of the erythrocytes is subsequently used in a cluster analysis.
  • the implementation of cluster analyses is also known to the person skilled in the art, see e.g. https://de.wikipedia.org/wiki/Clusteranalysis.
  • a liver disease that can be diagnosed using the method according to the invention is, for example, a disease selected from
  • Typical key metabolites/lipids for toxic, acute liver damage are gamma-glutaryltransferase, alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase, glutamate dehydrogenase.
  • Typical key metabolites/lipids for obstructive, cholestatic liver damage are gamma-glutaryltransferase, alkaline phosphatase, direct and indirect bilirubin, taurine or glycine conjugated and unconjugated bile acids (such as lithocholic acid, cholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, obeticholic acid,
  • Typical key metabolites/lipids for ischemic liver damage are alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase.
  • Typical key metabolites/lipids for fibrotic, chronic liver damage are synthesis parameters (such as albumin, coagulation factors, haptoglobin), alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and cholinesterase.
  • Typical key metabolites/lipids for septic liver damage are alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and glutamate dehydrogenase.
  • the invention has numerous advantages. It makes it possible to identify metabolites in erythrocytes using statistical methods such as abundance mapping and cluster analyses.
  • the erythrocytes can thus be used as "metabolic marker cells" for the identification of pathophysiological metabolic changes.
  • the method according to the invention now allows targeted metabolomics in erythrocytes based on mass spectrometry.
  • the method also allows the analysis of the lipid profile in erythrocytes, which allows statements to be made about the severity of a disease progression or the stage of a disease, particularly of the liver.
  • metabolic fingerprints can be created and used to identify liver diseases Due to the much larger amount of information processed in the method according to the invention, a more precise diagnosis is possible than in laboratory diagnostics.
  • results of the method according to the invention can be used advantageously in individualized medicine. Early diagnosis is made possible.
  • results of the method according to the invention can be used to prevent progressive organ failure. Therapies can be individually adapted and used in a more targeted manner.
  • the method according to the invention was able to distinguish between septic and non-septic conditions in mammals.
  • the lipid composition of the erythrocytes was analyzed using high performance liquid chromatography and triple quadrupole mass spectrometry. Principal component analysis (PCA) and uniform manifold approximation and projection (UMAP) were performed to cluster the animal cohorts. XGboost, implemented in R, was used to identify critical metabolites.
  • Lipidomic analysis showed that it is possible to distinguish septic from healthy individuals based on the lipid composition of the red blood cells.
  • PCA shows two clusters of animals that correspond to the underlying groups.
  • healthy and septic animals can be separated by dimensionality reduction.
  • XGBoost was successfully trained for the classification of PCI animals and tested using cross-validation.
  • XGBoost was also used to determine which features are informative to distinguish between PCI animals and other groups.
  • the lipid composition of the red blood cells was at least as informative as the conventional use of cytokines.
  • Lipid composition was analyzed using HPLC/MS to quantify the chemical composition of the red blood cell membrane.
  • the panel of 57 lipids (see Table 1 above) was analyzed to create a cluster model that attempts to distinguish between septic and non-septic conditions. To To meet expectations, statistical methods were used to visualize the data set to enable clear clustering.
  • the first step was to perform a principal component analysis (PCA), shown in Figures 3 and 4, to reduce the number of variables.
  • PCA looks for the orthogonal vectors that capture the variance of the dataset in as few dimensions as possible.
  • PCA dimensions are linear combinations of the original dimensions. This makes it possible to infer the variable of the original dataset from the vector. This way, it is possible to determine which metabolites contribute most to clustering. By combining different dimensions, it is possible to determine which parameters allow a clear distinction between the groups.
  • the lipids PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) and LPC(16:0) are therefore identified as key metabolites.
  • the lipids PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) and LPC(16:0) are identified as key metabolites for the diagnosis of peritoneal contamination and infection (PCI) or sepsis.
  • Sepsis is a life-threatening condition caused by an overwhelming immune response of the body to an infection. It is a medical emergency that requires immediate diagnosis and treatment. Early diagnosis of sepsis is crucial to prevent serious complications and improve patient outcomes. Current diagnostics rely mainly on rather non-specific laboratory values. Blood culture is the gold standard for detecting bloodstream infections.
  • imaging procedures and scoring systems allow further quantification of the extent of organ damage caused by sepsis. The need for new diagnostic procedures, especially those that detect sepsis, remains unabated in order to reduce the number of deaths caused by sepsis.
  • the invention deals with the explicit evaluation of the use of lipidomic profiles of erythrocytes in a human patient collective.
  • Lipid analysis was performed using PCA to reduce data complexity and improve interpretability.
  • the first three dimensions are crucial for clustering the dataset by lipid profile, comprising 74.2% of the variables.
  • Fig. 3 B different subtypes of lipids are essential for each dimension.
  • sphingomyelin, phosphatidylcholine, and lysophosphatidylcholines are represented in the first dimension.
  • the most prominent unit is PC(36:3), which is not known to play a crucial role in sepsis pathology. Short-chain and long-chain sphingomyelins are also crucial for the classification process of erythrocytes.
  • SM is a major component of lipid structures required for various cellular processes, such as cellular signaling, membrane trafficking, and interaction with pathogens.
  • the second dimension consists of a few variables, including C14-SM and several PCs (PC(28:0) and PC(30:l) > 0.5).
  • the third dimension which accounts for 13.8% of the explained variables, consists of individual lipid metabolites.
  • SolP, C26 SM and PC(32:1) are the most important. SolP is a quite relevant and bioactive lipid in inflammation and vascular development.
  • the lipidomic analysis as performed according to the invention is a phenomenological approach to interpret the results of the Mass spectrometry of erythrocytes. It was able to significantly distinguish septic mice from control mice.
  • erythrocytes are an interesting cell type for clinical sepsis diagnosis. Erythrocytes are easy to obtain from blood samples and are simple to process. Obtaining molecular information about the metabolic composition allows us to better understand the pathophysiology of sepsis and related diseases to enable better diagnosis and tailored treatment strategies.
  • Figure 1 shows the isolation of erythrocytes and composition of the membrane (created with BioRender.com);
  • Figure 2 shows the basic structure of various phospho- and sphingolipids, where R, Ri and R2 can be fatty acid residues of different chain lengths (modified from Cui, L., & Decker, E. A. (2016). Phospholipids in foods: prooxidants or antioxidants? Journal of the science of food and agriculture, 96(1), 18-31;
  • Figure 3 shows a scree plot (Fig. 3A) and corrplot analysis (Fig. 3B) for the principal component analysis.
  • the scree plot (Fig. 3A) shows the eigenvalues for each dimension in descending order. The first three dimensions account for about 74.2% of the explained variance in the PCA.
  • Fig. 3B The corrplot shown here illustrates the importance of the individual measured metabolites for the dimensions.
  • Figure 4 the principal component analysis based on all lipids.
  • Figure 4A shows three different PCAs. All are based on the complete dataset and use all lipids that were measured. Dimensions: Fig. 4A 1:2; Fig. 4B 1:3; Fig. 4C 2:3.
  • Figure 5 a scree plot (Fig. 5A) and PCAs (Fig. 5B, 5C and 5D) after
  • Fig. 5B PCA with dimensions 1:2; Fig. 5C 1:3 and Fig. 5D 2:3.
  • Figure 6 the contribution of lipid components to the cluster analysis. Shown are six
  • Figure 7 the principal component analysis based on the 3 key metabolites
  • Figure 8 shows the principal component analysis for evaluating the lipid data obtained by mass spectrometry from a previous animal experiment. The meanings are:
  • Example 1 Isolation of erythrocytes from a whole blood sample
  • PCI peritoneal contamination and infection
  • CCS Clinical Severity Score
  • Table 2 CSS scoring system used for organ procurement.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Example 2 Sample preparation for mass spectrometry
  • Sample preparation for mass spectrometry was performed according to a standard operating procedure.
  • the sample was then measured immediately or temporarily stored at -80°C.
  • Metabolomic analyses were performed using mass spectrometry to measure the lipid composition of red blood cells and to demonstrate the changes in the different lipid fractions to further characterize disease at a molecular level.
  • Hepatic excretory function was assessed mainly by bile acid measurements in spleen and liver samples.
  • Example 4 Lipid identification in erythrocytes The lipid profile was measured on erythrocytes. Sample preparation for lipid quantification was carried out as described in Example 2. For the internal standard mixture (30 pmol per injection volume) as a reference for normalization and quantification, see Table 1 below.
  • an autosampler L-7250, a Peltier sample cooler from Merck for L-7250, an L-2130 liquid chromatograph with the column oven L-2300 with a 60x2 mm MultoHigh 100 RP 18 column with 3 pm particle size (CS Chromatography Service, Germany) were combined with an Elite LaChrom LC system (Hitachi Europe GmbH, Germany) and kept at 50 °C.
  • the mobile phase A consisted of 1.0% (v/v) formic acid in ddH2O, the mobile phase B of 100% methanol (Chromasolv, Honeywell Riedel-de Haen, Seelze, Germany).
  • the column was run at a flow rate of 0.5 ml min' 1 in 10% B.
  • the mobile phase changed to 100% B after sample injection.
  • the flow rate increased linearly from 0.5 ml min' 1 at 5 min to 1.0 ml min' 1 at 7 min and remained constant until 10 min. Thereafter, the mobile phase was switched to 10% B and the flow rate decreased linearly again from 1.0 ml min' 1 at 10 min to 0.5 ml min' 1 at 10.5 min and remained constant until the end of the program at 11.3 min. Detection was performed between 2 and 10 min.
  • Table 1 List of target ions/MRM transitions, assignment to internal standard and analysis mode
  • Example 5 Lipid quantification in erythrocytes
  • the scree plot shown in Figure 3 A was created before choosing the dimensions for creating the PCA plots. It visualizes the eigenvalues of the principal components in the data analysis to assume the weight of each calculated dimension for cluster analysis.
  • the first dimension represents 44.8% of the explained variances and symbolizes almost half of the explained variables. This is the central part compared to the following data. Dimensions two and three account for 15.6% and 13.8% within the dataset.
  • Figure 3B shows the effects of the measured lipids for each dimension.
  • the first five dimensions are shown to illustrate the differences between them.
  • the analysis of the first dimension shows a clear structure.
  • Sphingomyelins (SM), phosphatidylcholines (PC), lysophosphatidylethanolamines (LPE) and lysophosphatidylcholines (LPC) are predominantly present.
  • PC(36:3), PC(36:4) and (PC34:1) are the most important factors in distinguishing the dimensions in the cluster analysis with p-values of p>0.85.
  • Short-chain sphingomyelins (CI 2 SM and C14 SM) are mainly weighted in dimension 2.
  • PC(28:0) and PC(30:l) also show a higher correlation magnitude for the second dimension.
  • LPCs mainly LPC 20:1 and 20:3
  • the second dimension is structured differently by different lipid classes. It is therefore comparable to the first dimension, although fewer metabolites are present in the second dimension.
  • the third dimension is very different from the first two. It consists of only a few metabolites with high correlation strength.
  • D18: ISolP, C26 SM, PC(32: 1) and PC(38:2) are characteristic of this dimension.
  • the LPEs seem to influence this dimension.
  • LPE(18:0) which is also found in the second dimension
  • LPEs are mainly found in the third dimension.
  • dimensions two and three show a visible clustering of sepsis and non-sepsis.
  • Each entity can split into two vertically distinct subunits (in dimension 2) that show no obvious correlation with the dataset itself (Fig. 4C).
  • Figure 5A shows the scree plot for the reduced number of variables.
  • the first dimension accounts for 53.2% of the explained variance, which is more than in Figure 3A and symbolizes more than half of the variables.
  • Dimensions two and three account for another 20.6% and 13% of the explained variance, respectively.
  • the PCA analysis showed that it is possible to visually distinguish between septic and healthy animals based on the lipid profile of the red blood cells.
  • the following steps involved further analysis of the lipid dataset to investigate which lipid metabolites help to cluster the dataset based on pathophysiology.
  • Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction is therefore an excellent approach to dimension reduction to determine the similarity of data points.
  • the data points are related to their k-nearest neighbors by a nonlinear kernel and further projected down to the number of dimensions. This makes it possible to extract the essential variables of the data set.
  • the UMAP and the previously performed PCA suggest that it should be possible to distinguish between PCI and sham-treated animals based on the lipidomics analysis of the erythrocytes.
  • XGBoost implemented in R was used (Chen & Guestrin).
  • Ten cross-validation steps with a 90/10 split were performed and resulted in an average classification error of 18%.
  • the lipids PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) and LPC(16:0) are the main factors (Fig. 6), with the lipids PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) being dominant.
  • Figure 7 shows the principal component analysis based on the three main metabolites PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2).
  • the PCA shows the clustering of septic and healthy individuals between dimension one and dimension two.
  • the lipid composition of the erythrocytes was determined by high performance liquid chromatography and triple quadrupole mass spectrometry analysed. Principal component analysis (PCA) and uniform manifold approximation and projection (UMAP) were performed to cluster the animal cohorts. XGboost, implemented in R, was used to identify critical metabolites.
  • PCA Principal component analysis
  • UMAP uniform manifold approximation and projection
  • Lipidomic analysis showed that it is possible to distinguish septic from healthy individuals based on the lipid composition of the red blood cells.
  • PCA shows two clusters of animals that correspond to the underlying groups.
  • healthy and septic animals can be separated by dimensionality reduction.
  • XGBoost was successfully trained for the classification of PCI animals and tested using cross-validation.
  • XGBoost was also used to determine which features are informative to distinguish between PCI animals and other groups.
  • the lipid composition of the red blood cells was at least as informative as the conventional use of cytokines.
  • the principal component analysis in Figure 8 is also based on the experimentally collected data on the lipid composition of the erythrocytes.
  • the principal component analysis was created using R.
  • the dimensions 1 and 2 are shown, with each point shown corresponding to an individual.
  • the assignment to the corresponding animal model is made using the symbols shown.
  • Lipidomics An omics discipline with a key role in nutrition. Taianta, 219, 121197. https://doi.Org/10.1016/j.talanta.2020.121197 Züllig, T., Trötzmüller, M., & Köfeler, H. C. (2020). Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and bioanalytical chemistry, 412(10), 2191-2209. https://doi .org/10.1007/s00216-019-02241 -y

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung der Leber, umfassend (a) die Isolierung von Erythrozyten aus der biologischen Probe, (b) die Identifikation und gegebenenfalls Quantifizierung von Lipiden aus den Erythrozyten als Schlüsselmetaboliten für eine Leber- und Infektionserkrankung, umfassend die Lipide PC (28:0), PC (30:0), PC (30:1), PC (32:0), PC (32:1), PC (34:0), PC (34:1), PC (34:2), PC (36:0), PC (36:1), PC (36:2), PC (36:3), PC (36:4), PC (38:0), PC (38:1), PC (38:2), PC (38:3) und PC (38:4); SM (17:0), SM (12:0), SM (14:0), SM (16:0), SM (18:0), SM (18:1), SM (20:0), SM (22:0), SM (24:0), SM (24:1), SM (26:0) und SM (26:1); LPE (16:0), LPE (16:1), LPE (18:0), LPE (18:1), LPE (18:2) und LPE (20:4). Cer (15:0), Cer (12:0), Cer (14:0), Cer (16:0), Cer (18:0), Cer (18:1), Cer (20:0), Cer (22:0), Cer (24:0) und Cer (24:1); LPC (16:0), LPC (16:1), LPC (17:0), LPC (18:0), LPC (18:1), LPC (18:2), LPC (20:0), LPC (20:1), LPC (20:3) und LPC (20:4), und LPE (16:0), LPE (16:1), LPE (17:1), LPE (18:0), LPE (18:1), LPE (18:2) und LPE (20:4); (c) Hauptkomponentenanalyse der Proben und Clustering nach Subgruppen; (d) Identifikation von Schlüsselmetaboliten mittels XGBoost Algorithmus; (e) die Erfassung von Änderungen der Signaturen der in Schritt (d) identifizierten Schlüsselmetabolite der Lebererkrankung, und (f) die Diagnose einer Erkrankung der Leber. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Ergebnisse des Verfahrens in der personalisierten Medizin.

Description

Universitätsklinikum Jena Dekanat Medizinische Fakultät Drittmittel anträge / Patentverfahren Kastanienstraße 1 07747 Jena
Diagnose von Metabolischen Veränderungen der Leber mittels metabolischer Analyse von Erythrozyten durch Massenspektrometrie
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung der Leber, und die Verwendung der Ergebnisse des Verfahrens in der personalisierten Medizin.
Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der individualisierten Medizin. Diese spielt insbesondere bei komplexen Krankheitsverläufen eine Rolle. Das Konzept der "individualisierten" oder "personalisierten" Versorgung, das eine Stratifizierung des Patienten auf der Grundlage einer besseren Einschätzung des komplexen Krankheitsverlaufs impliziert, ist eine Herausforderung, die für Schwerkranke jedoch viel versprechend ist. Eine umfassendere Überwachung des Stoffwechsels mit Hilfe der Massenspektrometrie zur Beurteilung des "Metaboi oms", d.h. der "Metaboi omik", hält derzeit Einzug in die klinische Routine (Kiehntopf et al., 2013). Diese Technik kann in einem "ungezielten" Ansatz oder zur Überwachung spezifischer Gruppen von Analyten durchgeführt werden. Das Metabolom als komplexes Reaktionsnetzwerk fasst alle charakteristischen Stoffwechsel-Eigenschaften einer Zelle bzw. eines Gewebes oder Organismus zusammen. Der Begriff Metaboi om wurde als „Summe aller Stoffwechselprodukte (Metabolite)“ in Analogie zu den Begriffen Genom, Transkriptom und Proteom geprägt und entsprechend benannt. Das Wort leitet sich von Metabolismus (= Stoffwechsel) ab. Gelegentlich wird für Metaboi om auch die Bezeichnung Metabonom verwendet, besonders im Zusammenhang mit der Toxizitätsbeurteilung von Wirkstoffen.
Das Metabolom umfasst:
• die Durchflussraten (= Umsatzraten), Metabolit-Spiegel und Enzymaktivitäten der einzelnen Stoffwechselwege,
• die Interaktionen zwischen den verschiedenen Stoffwechselwegen sowie
• die Kompartimentierung der verschiedenen Stoffwechselwege innerhalb der Zellen.
Ein weiterer Gesichtspunkt ist der Einfluss des Nährstoff-Angebotes sowie der Effekt von Wirksubstanzen auf den Stoffwechsel und die verschiedenen Funktionen der Zellen, wie Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose.
Die Erforschung des Metaboloms wird als Metabolomik bezeichnet (im Englischen metabolomics oder metabonomics). Diese umfasst die Wechselwirkung der darin enthaltenen Metabolite, deren Identifizierung und Quantifizierung (vgl. Proteom und Genom). Als wesentliche Analysenmethoden werden in der Metabolomik GC/MS und LC/MS sowie NMR-Spektroskopie und lonen-Mobilitäts-Spektrometer eingesetzt. Dabei kann man die Methoden aufspalten in Separationstechniken, lonisationstechniken und Detektionstechniken. Da die Metaboliten von ihrer chemischen Zusammensetzung und Struktur sehr unterschiedlich sein können, reicht es oft nicht aus, nur eine Analysemethode zu benutzen, um das Metabolom eines Organismus komplett aufzuklären. Dazu kommt, dass es bis heute nicht bekannt ist, wie viele Stoffwechselprodukte es überhaupt gibt. Die häufigsten Probentypen sind Körperflüssigkeiten wie Plasma oder Serum, aber auch Harn, Liquor cerebrospinalis, Synovialflüssigkeit, Sputum oder Lavagen. Daneben kommen Geweb shorn ogenate bzw. Zellen oder Überstände von Zellkulturen in Betracht.
Im Bereich der Lebererkrankungen werden mit Hilfe der Massenspektrometrie Analyten wie z.B. die unkonjugierten und Glycin/Taurin-konjugierten primären Gallensäuren erfasst, wie in der Studie von Vanwijngarden et al. Während Bilirubin traditionell ausschließlich zur Überwachung der ausscheidenden Leberfunktion auf der Intensivstation dient, z.B., im am weitesten verbreiteten Scoringsystem für multiple Organdysfunktionen, dem Sepsis- related (manchmal auch Sequential) organ failure assessment (SOFA)-Score (Vincent et al., 1996), deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Gallensäuren eine Leberfunktionsstörung mit höherer Sensitivität und Spezifität anzeigen könnten, (Recknagel et al., 2012) oder zumindest weitgehend unabhängig von Bilirubin erhöht sein könnten (Vanwijngaerden et al., 2014). In jedem Fall können diese bescheidenen Erhöhungen des Bilirubins, selbst unter Berücksichtigung der Ungenauigkeit der gegenwärtigen klinischen Methoden zur Beurteilung kleinster Veränderungen, mit einer ausgeprägten Beeinträchtigung des Metabolismus der Phasen I und II in Verbindung gebracht werden, was bei diesen Patienten mit einer negativen Prognose assoziiert ist (Kruger et al., 2009). Neben der Analyse von Metaboliten aus dem Plasma und Serum mit der Massenspektrometrie werden in der klinischen Funktionsdiagnostik bislang zahlreiche verschiedene Methoden eingesetzt, um Stoffwechselstörungen zu diagnostizieren. Dazu gehören biochemische Assays (die sogenannte klinische Chemie), die Atemgasanalytik und die Pulsdensitometrie. Stoffwechselstörungen der Leber werden zum einen mit Hilfe von endogenen Clearance-Assays untersucht. Die biochemische Messung von Enzymaktivitaten (Transaminasen, alkaline Phosphatase) werden zur Beurteilung des Leberschadens herangezogen, und zusammen mit Leberfunktion assoziierten Metaboliten (Cholesterin, Bilirubin, Albumin) zur Untersuchung der Leberfunktion kombiniert.
Des Weiteren kommen klinisch exogene Clearance-Assays zum Einsatz. Dazu gehören unter anderem: der Indocyaningrün-Test (fluoreszenzbasierte Messung der exkretori sehen Funktion); der Galaktosebelastungstest (Injektion von Galaktose und Messung des Anteils, der über die Niere ausgeschieden wird); der C14-Aminopyrin oder 14C-Galaktose Atemtest; und die Koffein-Clearance.
Unterstützt werden diese Assays im experimentellen Bereich mit bildgebenden Untersuchungsmethoden, die auf dem Matrix- Assistierten Laser-Desorption-Ionisierungs (MALDI) Imaging beruhen.
Die konventionell eingesetzten Methoden weisen jedoch zahlreiche Nachteile auf. Biochemische Assays bedürfen oft einer aufwändigen Probenvorbereitung und Präanalytik. Kritisch ist der Transport der meist empfindlichen biologischen Proben. Atemgasanalytik ist sehr aufwändig. Dazu kommen zahlreiche klinische Nachteile. Biochemische Assays sind oft unpräzise, d.h. besitzen eine geringe Spezifität, und geben keinen genauen Aufschluss über den Stand der Dysfunktion. Oftmals basiert die Einschätzung auch auf Leberschädigungsparametern, die nur teilweise auf den Funktionsverlust und die Art des Funktionsverlusts hinweisen. Eine Differenzierung des Leberschadens ist mit diesen Assays nicht möglich. Die Atemgasanalytik ist in der Regel zeitaufwändig und bringt wenig Mehrgewinn. Es werden nur einzelne Analyte untersucht. Die Aussagekraft beschränkt sich hier, genauso wie bei der Fluoreszenzangiographie (Indocyanin Clearance Test) auf die Aussage der Leberfunktion. Die Art der Funktionsstörung kann nur indirekt beurteilt werden.
Bei der Bildgebung von Metaboliten (Forschung) mittels MALDI gestaltet sich die Probenpräparation sehr aufwendig: Es werden spezielle beschichtete (Matrix) Objektträger verwendet. Für verschiedene Metabolitengruppen müssen verschiedene Beschichtungen verwendet werden. Bestimmte Metabolitengruppen können nicht gleichzeitig an einer Probe vermessen werden. Durch die Bildgebung wird die Probe in der Regel zerstört, eine Analytik im Anschluss ist nicht möglich. Die maximale erzielbare Auflösung ist relativ gering (Mikrometer-Maßstab).
Es besteht deshalb der Bedarf, verbesserte Methoden für eine umfassendere Beurteilung des Stoffwechsels und des Metaboloms bereitzustellen. Im Bereich der Lebererkrankungen werden solche verbesserten Methoden wahrscheinlich die vorgefasste Vorstellung einer Leberfunktionsstörung, die ein eher spätes und seltenes Ereignis auf der Intensivstation widerspiegelt, in Frage stellen und könnten geeignete Instrumente sein, um die hepatobiliäre Funktion besser zu überwachen sowie die metabolischen Bedürfnisse und die Emährungsunterstützung bei Schwerkranken zu personalisieren (Bauer & Kiehntopf, 2014).
Die WO 2022/167521 Al betrifft ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung, umfassend
(a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe,
(b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend o die Identifikation und Quantifizierung von Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, o die Erfassung von Änderungen der Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, und
(c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüssel-Metaboliten in der biologischen Probe.
Das Verfahren gemäß WO 2022/167521 Al eignet sich besonders für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen und proliferativen Erkrankungen, ist aber messtechnisch aufwändig und entsprechende Maschinen sind noch nicht vollends für den klinischen Routine-Gebrauch etabliert und zertifiziert.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, Methoden für eine umfassendere Beurteilung des Stoffwechsels und des Metaboloms bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen und sich durch die Messmethode der Massenspektrometrie in klinisch etablierten Infrastrukturen etablieren lässt.
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung der Leber gemäß Anspruch 1 bereit.
Erfindungsgemäß wird unter einer „biologischen Probe“ jede Art biologischen Materials verstanden, in dem Erythrozyten vorhanden sind bzw. aus dem Erythrozyten isoliert werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an Schlüsselmetaboliten in einer Körperflüssigkeitsprobe nachgewiesen, die von einem Säugetier, am meisten bevorzugt einem Menschen, stammt. Der Begriff "Körperflüssigkeit" bezieht sich auf alle Flüssigkeiten, die im menschlichen Körper vorhanden sind und in denen Erythrozyten vorhanden sind bzw. aus denen Erythrozyten isoliert werden können. Vorzugsweise sind Körperflüssigkeiten im Sinne der Erfindung ausgewählt aus Blut und Urin. Eine Blutprobe ist besonders bevorzugt. Die Blutprobe kann vor der Verwendung behandelt werden, z. B. mit einem Antikoagulans, wie z. B. EDTA.
Die biologische Probe kann auch eine Gewebeprobe oder eine Biopsie sein, in der Reste von Blut und somit Erythrozyten enthalten sind. Die biologische Probe kann auch eine Probe einer Zellkultur von Erythrozyten sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Probe eine Probe, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Blut, Urin, eine Gewebeprobe, eine Biopsie, und eine Zellkultur, wobei die biologische Probe Erythrozyten enthält.
In einer Ausführungsform der Erfindung schließt das Verfahren zur Analyse von biologischen Proben nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung den Schritt der Entnahme der biologischen Probe von einem Probanden ein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn das erfindungsgemäße Verfahren an einer biologischen Probe durchgeführt, die zuvor von einem Probanden entnommen worden ist.
Der Begriff "Proband" bezieht sich auf ein Säugetier, das an einer Erkrankung, wie beispielsweise einer Stoffwechselerkrankung oder einer Krebserkrankung leidet oder bei dem der Verdacht besteht, dass es daran leidet. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff "Proband" auf einen Menschen.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht insbesondere darauf, Erythrozyten als zelluläres Kompartiment zu verwenden, um potenzielle Unterschiede im Lipidprofil aufzudecken und eine frühzeitige Diagnose und Behandlung von Lebererkrankungen zu ermöglichen. Die in Erythrozyten vorhandenen Lipide sind dabei die Schlüsselmetabolite, die mit dem Verfahren der Erfindung analysiert werden.
Die Erythrozyten stellen mit 4-5 Millionen Erythrozyten pro Mikroliter Blut die größte zelluläre Fraktion des Blutes dar. Was ihre Morphologie betrifft, so sind die Erythrozyten bikonkave, kreisförmige Zellen mit einem Durchmesser von etwa 7,5 pm. Hämoglobin ist das molekulare Äquivalent, das die rote Farbe verursacht. Es ist das eisenhaltige Metalloprotein für den Sauerstofftransport, das die Hauptfunktion der Erythrozyten ermöglicht. Beim Passieren der Lungenkapillaren binden die roten Blutkörperchen Sauerstoff an Hämoglobin, wodurch Oxyhämoglobin für den peripheren Transport gebildet wird. (Kuhn et al, 2917) Erythrozyten sind aber auch an anderen physiologischen Vorgängen beteiligt, z. B. an der Regulierung des Tonus der Blutgefäße, der durch Scherstress verursacht wird. (Sun et al, 2021) Die Ausschüttung von Adenosintriphosphat (ATP) oder S-Nitrosothiolen kann die Gefäßwände direkt entspannen und so die mikrovaskuläre Transfusion verbessern. (Barvitenko et al,., 2005, Kuhn et al., 2017) Interessanterweise fehlt den roten Blutkörperchen ein Zellkern, Ribosomen und ein endoplasmatisches Retikulum. (Smith, J. E., 1987) Erythrozyten sind nicht in der Lage, eine Proteinsynthese oder aerobe Zellatmung durchzuführen. Die anaerobe Glykolyse bleibt daher die einzig mögliche Strategie zur ATP-Gewinnung. Eine weitere Schlussfolgerung aus der Erythrozytenphysiologie ist, dass proteomische Veränderungen aufgrund der ungeeigneten Proteinsynthesemaschinerie nicht so stark an Veränderungen der Mikroumgebung angepasst werden können, was die Erythrozyten zu einem interessanten Ziel für den Nachweis molekularer Veränderungen macht.
Die umgebende Zellmembran besteht hauptsächlich aus einer typischen Lipiddoppelschicht. Cholesterin und Phospholipide sind die wesentlichen Elemente der inneren und äußeren Schicht der Membran. Vergleicht man beide Strukturen, so zeigen sich Unterschiede in der Lipidverteilung. Während Phosphatidylcholine (PC) und Sphingomyeline (SM) an der Oberfläche häufiger vorkommen, überwiegen Phosphatidylethanolamine (PE) und Phosphatidylserine (PS) in der intrazellulären Schicht (siehe auch Figur 1). Diese definierte Lipidverteilung ist entscheidend für die Zellintegrität und wird durch die Enzyme Flippase und Scramblase aufrechterhalten. (Mohandas et al., 2008) Ein Netzwerk von mehr als 50 Membranproteinen ermöglicht es der Zelle, die oben genannten Funktionen in ihrer Vielfalt zu erfüllen.
Bei der Diagnostik von Erythrozyten wird heutzutage hauptsächlich auf ein quantitatives und morphologisches Muster geachtet. Die Charakterisierung der Eigenschaften der Erythrozyten basiert im Wesentlichen auf der Anzahl und den volumetrischen Merkmalen im Allgemeinen. Das mikroskopische Erscheinungsbild der Erythrozyten in einem Blutausstrich kann abstrakte Formationen wie Akanthozyten, Fragmentozyten oder Sphärozyten zeigen, die das Diagnoseverfahren in vielen Fällen erleichtern können. (Düzenli et al., 2020, Ford, J., 2013)
Im Rahmen des Verfahrens der Erfindung wird nunmehr die Zusammensetzung der Erythrozyten als unabhängiges Kompartiment, insbesondere die Lipidzusammensetzung, für die Erkennung verschiedener organischer Krankheiten, vorzugsweise von Erkrankungen der Leber, genutzt. Die Analyse der Lipide der Erythrozyten erfolgt mit spektroskopischen Methoden, besonders bevorzugt mittels Massenspektrometrie (MS).
Die Massenspektrometrie (MS) ist eine weit verbreitete und gut etablierte Methode zur Quantifizierung verschiedener molekularer Veränderungen in unterschiedlichen Proben. Das Prinzip der Massenspektrometrie besteht in der Analyse des Massenladungsquotienten für ein einzelnes Molekül, das leicht mit einer Standardmischung oder einer weltweiten Datenbanktechnologie verglichen werden kann. Moleküle, die das Spektrometer passieren, müssen in einem ersten Schritt desorbiert werden, gefolgt von einem lonisierungsschritt, um eine spezifische molekulare Ladung einzuführen. Leistungsstarke Turbopumpen erzeugen ein Hochvakuum im MS, so dass die Moleküle ohne Reibung passieren können. Die induzierten Ionen können anschließend beschleunigt und in elektrischen Feldern getrennt werden, um sie auf die Oberfläche des Detektors zu leiten. (Loos et al., 2016) Die bisherige Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ermöglicht die effektive Trennung von Molekülen in komplexen Probenmatrizes durch Fraktionierung. Die Kombination beider Techniken ermöglicht wertvolle Messungen in verschiedenen Anwendungsbereichen. (Wilson et al., 2005)
Die Lipidomik ist ein Teilgebiet der Metaboi omik, das sich hauptsächlich auf verschiedene Lipiduntergruppen konzentriert, die an Signal-, Membran- oder Stoffwechselwegen beteiligt sind. (Luque et al., 2020, Züllig et al., 2020) Viele neuere Studien zeigen, dass Lipide eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der Sepsis spielen und zum zentralen Bestandteil potenzieller Diagnose- und Therapieziele werden könnten. (Amungama et al., 2021)
Phospholipide, die an verschiedenen wichtigen molekularen Prozessen beteiligt sind, können in Glycerophospholipide und Sphingolipide eingeteilt werden. Beide Moleküle sind an Phosphat gebunden, unterscheiden sich aber in der Struktur des Lipidrückgrats. Während Glycerophospholipide Glycerin und zwei Fettsäureketten enthalten, enthalten die Sphingolipide Sphingosin und eine zusätzliche Fettsäurekette, (siehe auch Figur 2).
Bevorzugte Schlüsselmetabolite für das Verfahren der Erfindung sind daher Lipide aus Erythrozyten, vorzugsweise Phospholipide und Sphingolipide, besonders bevorzugt Lipide, die unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Phosphatidylcholine (PC), Ceramide (Cer), Sphingomyeline (SM), Lysophosphatidylethanolamine (LPE), und Lysophosphatidylcholine (LPC).
Für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignete Schlüsselmetabolite sind die Lipide gemäß Tabelle 1 (siehe Ausführungsbeispiel 4).
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Phosphatidylcholine sind beispielsweise ausgewählt aus
PC (28:0), PC (30:0), PC (30: 1), PC (32:0), PC (32:1), PC (34: 1), PC (34:2), PC (36:0), PC (36: 1), PC (36:2), PC (36:3), PC (36:4), PC (38:0), PC (38: 1), PC (38:2), PC (38:3) und PC (38:4).
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Sphingomyeline sind beispielsweise ausgewählt aus
SM (14:0), SM (16:0), SM (18:0), SM (18: 1), SM (20:0), SM (22:0), SM (24:0), SM (24: 1), SM (26:0) und SM (26: 1).
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Lysophosphatidylethanolamine sind beispielsweise ausgewählt aus
LPE (16:0), LPE (16: 1), LPE (18:0), LPE (18: 1), LPE (18:2) und LPE (20:4).
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Ceramide sind beispielsweise ausgewählt aus
Cer (14:0), Cer (16:0), Cer (18:0), Cer (18: 1), Cer (20:0), Cer (22:0), Cer (24:0) und Cer (24: 1)
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Lysophosphatidylcholine sind beispielsweise ausgewählt aus
LPC (16:0), LPC (16: 1), LPC (18:0), LPC (18: 1), LPC (18:2), LPC (20:0), LPC (20: 1), LPC (20:3) und LPC (20:4).
In den hier aufgeführten Beispielverbindungen symbolisieren die Zahlen in den Klammern die Kettenlänge des Lipids und die Anzahl an Doppelbindungen im Molekül (Kettenlänge des Lipids : Anzahl an Doppelbindungen im Molekül). Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass mit dem bereitgestellten Verfahren die Analyse einer Kombination aus einer Vielzahl verschiedener Lipide als Schlüsselmetabolite der Erythrozyten durchgeführt werden kann. Damit können in biologischen Proben Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung erkannt werden und zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung oder Stoffwechselstörung, insbesondere in der Leber, genutzt werden. Dies ist so aus dem Stand der Technik noch nicht bekannt.
Erfindungsgemäß wird mindestens ein Massenspektrum der biologischen Probe mit mindestens einem Schlüsselmetaboliten gemessen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird mehr als ein Massenspektrum für mehr als einen Schlüsselmetaboliten der biologischen Probe gemessen. Vorzugsweise werden zwischen 2 bis 100 Massenspektren, besonders bevorzugt zwischen 2 bis 75 oder 2 bis 50 Massenspektren, insbesondere bevorzugt zwischen zwei bis zehn oder zwei bis fünf Massenspektren für die entsprechende Anzahl an Schlüsselmetaboliten gemessen.
Besonders gute Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Massenspektren von 57 Schlüsselmetaboliten, insbesondere von den 57 Lipiden gemäß Tabelle 1 (siehe Ausführungsbeispiel 4), gemessen wurden.
Vorteilhafterweise benötigt die Massenspektrometrie nur geringe Mengen an Proben zur Durchführung. Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der Erfindung zwischen I pl und 150pl, bevorzugt zwischen 30pl und lOOpl, am meisten bevorzugt 50pl der biologischen Probe zur Messung mittels Massenspektrometrie verwendet. Da biologische Proben aus dem Bereich der medizinischen Diagnostik ein begrenztes Volumen haben, ist es von großem Vorteil, dass nur ein kleiner Teil der biologischen Probe zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig ist. Dies ermöglicht eine allgemeine ungezielte Screening-Diagnostik für alle Proben vor oder parallel zu einer gezielten konventionellen Labordiagnostik. Dennoch steht ein überwiegender Teil einer biologischen Probe zur Durchführung weiterer Diagnostik, wie z. B. der medizinischen Routinediagnostik im Labor, zur Verfügung. Basierend auf den ermittelten Unterschieden in der Art, der Menge bzw. dem Muster an Schlüsselmetaboliten (hierin zusammenfassend auch als „Signatur“ der Schlüsselmetabolite bezeichnet), die in einer von einem Probanden gewonnenen biologischen Probe im Vergleich zu einer normalen Kontrollprobe vorhanden ist, kann eine Korrelation der Art oder Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten mit einer wahrscheinlichen Diagnose einer Erkrankung hergestellt werden. Ein statistisch signifikanter Anstieg der Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten im Vergleich zu den Kontrollproben ist hinreichend prädiktiv dafür, dass der Proband an einer für den oder die Schlüsselmetaboliten oder ein bestimmtes Muster an Schlüsselmetaboliten typischen Erkrankung leidet. Eine normale Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder ein normales Muster an Schlüsselmetaboliten, wie sie für eine Kontrollprobe, die aus einer normalen Population isoliert wurde, charakteristisch ist, zeigt an, dass der Patient keine für den oder die Schlüsselmetaboliten oder ein bestimmtes Muster an Schlüsselmetaboliten typische Erkrankung hat. Ein positiver Hinweis auf eine Erkrankung, der auf einer erhöhten oder reduzierten Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder einem veränderten Muster an Schlüsselmetaboliten im Vergleich zu einer normalen Kontrolle basiert, wird im Allgemeinen zusammen mit anderen Faktoren bei der endgültigen Bestimmung einer bestimmten Erkrankung berücksichtigt. Daher werden die erhöhten oder verringerten Mengen eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder ein verändertes Muster an Schlüsselmetaboliten des getesteten Probanden in der Regel zusammen mit anderen akzeptierten klinischen Symptomen der jeweiligen Krankheit bei der Erstellung einer bestimmenden Diagnose solch einer Erkrankung berücksichtigt.
Schlüsselmetabolite sind krankheitsspezifisch und werden ggf. erst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und detektiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung der Leber die Schritte
(a) Isolierung von Erythrozyten aus der biologischen Probe,
(b) Identifikation und gegebenenfalls Quantifizierung von Lipiden aus den Erythrozyten als Schlüsselmetaboliten für eine Leber- und Infektionserkrankung, umfassend die Lipide PC (28:0), PC (30:0), PC (30: 1), PC (32:0), PC (32: 1), PC (34:0), PC (34:1), PC (34:2), PC (36:0), PC (36: 1), PC (36:2), PC (36:3), PC (36:4), PC (38:0), PC (38: 1), PC (38:2), PC (38:3) und PC (38:4);
SM (17:0), SM (12:0), SM (14:0), SM (16:0), SM (18:0), SM (18: 1), SM (20:0), SM (22:0), SM (24:0), SM (24: 1), SM (26:0) und SM (26: 1);
LPE (16:0), LPE (16: 1), LPE (18:0), LPE (18: 1), LPE ( 18 :2) und LPE (20:4). Cer (15:0), Cer (12:0), Cer (14:0), Cer (16:0), Cer (18:0), Cer (18: 1), Cer (20:0), Cer (22:0), Cer (24:0) und Cer (24: 1);
LPC (16:0), LPC (16: 1), LPC (17:0), LPC (18:0), LPC (18: 1), LPC (18:2), LPC (20:0), LPC (20: 1), LPC (20:3) und LPC (20:4), und
LPE (16:0), LPE (16: 1), LPE (17: 1), LPE (18:0), LPE (18: 1), LPE (18:2) und LPE (20:4);
(c) Hauptkomponentenanalyse der Proben und Clustering nach Subgruppen;
(d) Identifikation von Schlüsselmetaboliten mittels XGBoost Algorithmus;
(e) Erfassung von Änderungen der Signaturen der in Schritt (d) identifizierten Schlüsselmetabolite der Lebererkrankung, und
(f) Diagnose einer Erkrankung der Leber.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin übliche, dem Fachmann geläufige Schritte zur Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung.
Dies betrifft z.B. das Isolieren der Erythrozyten aus einer biologischen Probe. Vorzugsweise wird für die Isolierung Vollblut eines Probanden verwendet. Bei der Probenahme werden dem Vollblut für die weiteren Verarbeitungsschritte Mittel zum Verhindern der Blutgerinnung, vorzugsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugesetzt. Weitere Schritte zur Isolation der Erythrozyten aus einer biologischen Probe, umfassen üblicherweise das Sedimentieren der Erythrozyten mittels Zentrifugation (z.B. bei 1.000 g für 10 min. bei 20 °C) zur Abtrennung der zellulären Blutbestandteile, das Waschen der sedimentierten Erythrozyten mit einer Pufferlösung (z.B. PBS) und erneutes Zentrifugieren (bei 1.000 g für 10 Minuten bei 20 °C), und das Einlagern bei -80 °C. In einer Ausführungsform ist des erfindungsgemäße Verfahren ein in vitro Verfahren und der Schritt der Entnahme der biologischen Probe ist nicht Bestandteil des Verfahrens.
Weitere Schritte der Probenvorbereitung sind üblicherweise für die Analyse von Schlüsselmetaboliten mittels Massenspektrometrie notwendig. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Probenvorbereitung unter standardisierten Bedingungen durchgeführt, um den Vorgaben der Guten Laborpraxis (GLP) gerecht zu werden und um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
So wird eine eingelagerte Probe der Erythrozyten aufgetaut, ein vordefiniertes Volumen entnommen und mit einem vordefinierten Volumen eines Lösungsmittels und einem vordefinierten Volumen einer internen Standardmischung (siehe Tabelle 1) gemischt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden 80 pl isolierte Erythrozyten mit 790 pl Methanol und 10 pl der internen Standardmischung gemischt.
Die Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie umfasst üblicherweise weitere, dem Fachmann bekannte Schritte, wie: einen Schritt des Rotierens der Mischung für eine vordefinierte Zeitdauer bei Raumtemperatur; einen Schritt des Präzipitierens über Nacht bei einer Temperatur von -80°C; einen Schritt des Zentrifugierens; einen Schritt des Verdampfens des Überstands nach der Zentrifugation; einen Schritt des Lösens der eingedampften Probe in einem Lösungsmittel; und das Einlagern der Probe bei einer Temperatur von -80°C.
Der Schritt des Rotierens der Mischung für eine vordefinierte Zeitdauer bei Raumtemperatur kann beispielsweise in einem Vortex-Mi scher bei Hochgeschwindigkeit für 1 min. durchgeführt werden und anschließend in einem Rotationsmischer für 20 min. bei 15 Umdrehungen pro Minute. Das Zentrifugieren kann beispielsweise bei 10.000 g für 10 min. bei 4°C durchgeführt werden.
Der Schritt des Verdampfens des Überstands kann beispielsweise bei 50°C für 90 min. in einer Vakuumzentrifuge durchgeführt werden.
Danach kann die Probe beispielsweise in einem Lösungsmittel, wie Methanol, vorzugsweise 100 pl Methanol, resuspendiert werden.
Die resuspendierte Probe kann dann direkt der Analyse mittels Massenspektrometrie zugeführt werden oder bei einer Temperatur von -80 °C zwischengelagert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie folgende Schritte: einen Schritt des Rotierens einer Mischung aus 80 pl isolierte Erythrozyten mit 790 pl Methanol und 10 pl der internen Standardmischung bei Raumtemperatur für 1 min. bei Hochgeschwindigkeit in einem Vortexmischer und anschließend in einem Rotationsmischer für 20 min. bei 15 Umdrehungen pro Minute; einen Schritt des Präzipitierens über Nacht bei einer Temperatur von -80°C; einen Schritt des Zentrifugierens bei 10.000 g für 10 min. bei 4°C; einen Schritt des Verdampfens des Überstands nach der Zentrifugation bei 50°C für 90 min. in einer Vakuumzentrifuge; einen Schritt des Lösens der eingedampften Probe in 100 pl Methanol; und optional das Einlagern der Probe bei einer Temperatur von -80°C.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schlüsselmetaboliten bei einer Erkrankung zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung oder Stoffwechselstörung, insbesondere der Leber.
Der Schritt „Diagnose der Erkrankung“ des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dann weiterhin die Schritte: • Vergleichen der nachgewiesenen Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit einer für eine normale Kontrollprobe charakteristischen Menge der Schlüsselmetabolite (Referenzbereich); und/oder
• Vergleichen der Identität eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit den in einer normalen Kontrollprobe bzw. Referenzbereich vorhandenen Schlüsselmetaboliten; wobei die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite oder die Abwesenheit von Schlüsselmetaboliten, vorzugsweise die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist; und/oder
• Vergleichen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe mit dem Muster an Schlüsselmetaboliten in einer normalen Kontrollprobe bzw. mit einem Referenzbereich; wobei die Änderungen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist.
In einer besonders bevorzugten Variante stützt sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Untersuchung von Blutproben, wobei die Analyse der Signaturen von Lipiden bzw. des Lipidprofils von Erythrozyten durchgeführt wird.
Dadurch kann anhand der Signatur der Lipide festgestellt werden, ob das untersuchte Gewebe, insbesondere der Leber, und damit der Proband, erkrankt ist oder nicht.
Die Datenauswertung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst üblicherweise Schritte wie:
- Datenvalidierung;
- Interpretation;
Vergleich mit Referenzen; und
- Kategorisierung.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Diagnose von metabolischen Veränderungen der Leber gemäß Schritt v. anhand der Veränderungen vordefinierter Lipidfraktionen, d.h. anhand von Schlüsselmetaboliten / Lipiden durchgeführt, die für eine bestimmte Lebererkrankung typisch sind. Die Identifikation der Schlüsselmetabolite erfolgt vorzugsweise durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen. Eine solche Vorgehensweise ist dem Fachmann bekannt. Der Schritt der Analyse und Auswertung der metabolischen Signatur erfolgt vorzugsweise mittels statistischer Methoden. Die Spektroskopie Daten können durch rein visuellen Vergleich analysiert werden, um die krankheitsrelevanten Informationen zu extrahieren, oder durch Anwendung geeigneter statistischer Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und ausgewählt werden. Hierzu eignen sich sämtliche unüberwachte und überwachte statistische Methoden. Zu den überwachten statistischen Methoden gehören zum Beispiel die Hauptkomponentenanalyse. Zu den überwachten statistischen Modellen gehören zum Beispiel die lineare Diskriminanzanalyse, Support- Vektor-Maschine, Partielle Kleinste-Quadrate-Regression, Random -Forest, neuronale Netzwerkanalyse und Maschinelles Lernen. Weiterhin können Verfahren für die Probenklassifizierung und Visualisierung der Komponentenverteilung (alleine oder in Kombination mit überwachten und unüberwachten statistischen Methoden) eingesetzt werden. Geeignete Verfahren zur Probenklassifizierung und Visualisierung sind zum Beispiel: Abundanz Analysen und Clusteranalysemethoden. Zu diesen gehören zum Beispiel: Vektorkomponentenanalyse, NFINDR und k-means-Clustering.
Besonders bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Hauptkomponentenanalyse zur Analyse und Auswertung der metabolischen Signatur verwendet. Die Auswertung von Daten mittels Hauptkomponentenanalyse ist dem Fachmann bekannt, siehe z.B. https://de.wikipedia.org/wiki/Hauptkomponentenanalyse.
Weiterhin bevorzugt ist es, wenn die Hauptkomponentenanalyse der gemessenen Lipidprofile der Erythrozyten nachfolgend in einer der Clusteranalyse verwendet werden. Die Durchführung von Clusteranalysen ist dem Fachmann ebenfalls bekannt, siehe z.B. https://de.wikipedia.org/wiki/Clusteranalyse.
Eine Erkrankung der Leber, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert werden kann ist, ist beispielsweise eine Erkrankung ausgewählt aus
- toxischen, akuten Leberschäden; obstruktiv, cholestatischen Leberschäden;
- ischämischen Leberschäden; - fibrotisch, chronischen Leberschäden; und septischen Leberschäden.
Typische Schlüsselmetabolite / Lipide für toxische, akute Leberschäden sind Gamma- Glutaryltransferase, Alanin-Aminotransferase und Aspartat-Aminotransferase, Glutamatdehydrogenase.
Typische Schlüsselmetabolite / Lipide für obstruktiv, cholestatische Leberschäden sind Gamma-Glutaryltransferase, Alkalische Phosphatase, Direktes und indirektes Bilirubin, Taurin- oder Glyzin-konjugierte und unkonjugierte Gallensäuren (wie z.B. Litochol säure, Cholsäure, Chenodeoxychol säure, Ursodeoxychol säure, Ob etichol säure,
Dehy drochol säure) .
Typische Schlüsselmetabolite / Lipide für ischämische Leberschäden Alanin- Aminotransferase und Aspartat-Aminotransferase.
Typische Schlüsselmetabolite / Lipide für fibrotisch, chronische Leberschäden sind Syntheseparameter (wie z.B. Albumin, Gerinnungsfaktoren, Haptoglobin), Alanin- Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase und Cholinesterase.
Typische Schlüsselmetabolite / Lipide für septische Leberschäden sind Alanin- Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase und Glutamatdehydrogenase.
Die Erfindung hat zahlreiche Vorteile. So wird es ermöglicht, Metaboliten in Erythrozyten mit Hilfe statistischer Methoden, wie z.B. Abundanz-Mapping und Cluster- Analysen, zu identifizieren. Die Erythrozyten können so als „Metabolische Markerzelle" für die Identifikation von pathophysiologischen metabolischen Veränderungen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt nunmehr die gezielte Metabolomik (targeted metabolomics) in Erythrozyten basierend auf der Massenspektrometrie. Weiterhin erlaubt das Verfahren die Analyse des Lipidprofils in Erythrozyten, wodurch Aussagen über die Schwere eines Krankheitsverlaufs bzw. über das Stadium einer Erkrankung, insbesondere der Leber, getroffen werden können.
Als Bestandteil der Funktionsdiagnostik im klinischen Alltag können sogenannte metabolische Fingerabdrücke erstellt und zur Identifikation von Lebererkrankungen eingesetzt werden. Aufgrund der viel größeren Informationsmenge, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verarbeitet wird, ist eine präzisere Diagnostik als in der Labordiagnostik möglich.
Die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens können vorteilhafterweise in der individualisierten Medizin eingesetzt werden. Eine frühe Diagnosestellung wird ermöglicht. Darüber hinaus können die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Prävention von progredientem Organversagen genutzt werden. Therapien können individuell adaptiert werden und zielgerichteter eingesetzt werden.
Wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben, konnte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zwischen septischen und nicht-septischen Bedingungen in Säugern unterschieden werden. Die Lipidzusammensetzung der Erythrozyten wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wurden durchgeführt, um die Tierkohorten zu clustem. XGboost, implementiert in R, wurde zur Identifizierung kritischer Metaboliten verwendet.
Die Lipidomanalyse ergab, dass es möglich ist, septische von gesunden Individuen anhand der Lipidzusammensetzung der Erythrozyten zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigt die PCA zwei Cluster von Tieren, die mit den zugrunde liegenden Gruppen übereinstimmen. Somit können gesunde und septische Tiere durch Dimensionsreduktion getrennt werden. XGBoost wurde erfolgreich für die Klassifizierung von PCI-Tieren trainiert und mittels Kreuzvalidierung getestet. Neben der erfolgreichen Identifizierung der Tiergruppen wurde XGBoost auch verwendet, um zu ermitteln, welche Merkmale informativ sind, um zwischen PCI-Tieren und anderen Gruppen zu unterscheiden. Im Ergebnis wurde herausgefunden, dass die Lipidzusammensetzung der Erythrozyten mindestens genauso aussagekräftig war wie die konventionelle Verwendung von Zytokinen.
Mittels HPLC/MS wurde die Lipidzusammensetzung analysiert, um die chemische Zusammensetzung der Erythrozytenmembran zu quantifizieren. Das Panel von 57 Lipiden (siehe Tabelle 1 oben) wurde analysiert, um ein Clustermodell zu erstellen, das versucht, zwischen septischen und nicht-septischen Bedingungen zu unterscheiden. Um diese Erwartungen zu erfüllen, wurden statistische Methoden zur Visualisierung des Datensatzes eingesetzt, um eine eindeutige Clusterbildung zu ermöglichen.
Der erste Schritt bestand in der Durchführung einer Hauptkomponentenanalyse (PCA), die in den Abbildungen 3 und 4 dargestellt ist, um die Anzahl der Variablen zu reduzieren. Bei der PCA werden die orthogonalen Vektoren gesucht, die die Varianz des Datensatzes in möglichst wenigen Dimensionen erfassen. PCA-Dimensionen sind Linearkombinationen der ursprünglichen Dimensionen. So ist es möglich, von dem Vektor auf die Variable des ursprünglichen Datensatzes zu schließen. Auf diese Weise lässt sich feststellen, welche Metaboliten am meisten zum Clustering beitragen. Durch die Kombination verschiedener Dimensionen lässt sich feststellen, welche Parameter eine klare Unterscheidung zwischen den Gruppen ermöglichen.
Zur weiteren Veranschaulichung der hierarchischen Beziehungen zwischen den beiden Versuchskohorten und den gemessenen Metaboliten wurde eine Heatmap erstellt. Diese zweidimensionale Visualisierung hilft zusätzlich, Trennungen und Verbindungen innerhalb des Datensatzes zu finden. Das hierarchische Cluster, das als Dendrogramm am Rande der Heatmap dargestellt wird, gibt zusätzlich Aufschluss über die Kombinationen und Auswirkungen der Datenpunkte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Unterschiede zwischen PCI- und Scheinbehandelten Tieren auf PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) und LPC(16:0) konzentrieren, was die Spezifität dieser Lipidmetaboliten in der Erythrozytenmembran unterstreicht. Somit können septische und gesunde Tiere anhand der Lipidzusammensetzung der Erythrozyten in Gruppen eingeteilt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden daher die Lipide PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) und LPC(16:0) als Schlüsselmetabolite identifiziert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Lipide PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) und LPC(16:0) als Schlüsselmetabolite für die Diagnose von Peritonealer Kontamination und Infektion (PCI) bzw. Sepsis identifiziert. Sepsis ist ein lebensbedrohlicher Zustand, der durch eine überwältigende Immunreaktion des Körpers auf eine Infektion entsteht. Es handelt sich um einen medizinischen Notfall, der eine sofortige Diagnose und Behandlung erfordert. Die frühzeitige Diagnose einer Sepsis ist entscheidend, um schwere Komplikationen zu verhindern und das Ergebnis für den Patienten zu verbessern. Die derzeitige Diagnostik stützt sich hauptsächlich auf eher unspezifische Laborwerte. Die Blutkultur ist der Goldstandard für den Nachweis von Infektionen der Blutbahn. Darüber hinaus ermöglichen bildgebende Verfahren und Score- Systeme eine weitere Quantifizierung des Ausmaßes der sepsisbedingten Organschädigung. Der Bedarf an neuen diagnostischen Verfahren, die vor allem die Sepsis erkennen, ist nach wie vor ungebrochen, um die Zahl der sepsisbedingten Todesfälle zu verringern.
Die Erfindung befasst sich mit der expliziten Evaluierung des Einsatzes lipidomischer Profile von Erythrozyten in einem menschlichen Patientenkollektiv.
Die Lipidanalyse wurde mittels PCA durchgeführt, um die Komplexität der Daten zu reduzieren und die Interpretierbarkeit zu verbessern. Wie in Abbildung 3 A dargestellt, sind die ersten drei Dimensionen entscheidend für das Clustern des Datensatzes nach dem Lipidprofil, wobei sie 74,2 % der Variablen umfassen. Nach dem Corrplott (Abb. 3B) sind für jede Dimension unterschiedliche Subtypen von Lipiden wesentlich. Interessanterweise sind Sphingomyelin, Phosphatidylcholin und Lysophosphatidylcholine in der ersten Dimension vertreten. Die auffälligste Einheit ist PC(36:3), von dem nicht bekannt ist, dass es eine entscheidende Rolle in der Sepsispathologie spielt. Kurzkettige und langkettige Sphingomyeline sind auch für den Klassifizierungsprozess von Erythrozyten entscheidend. Diese Befunde entsprechen der Vorstellung einer SM-Expression bei Entzündungen und Sepsis. SM ist ein Hauptbestandteil von Lipidstrukturen, die für verschiedene zelluläre Prozesse benötigt werden, z. B. für die zelluläre Signalübertragung, den Membranverkehr und die Interaktion mit Pathogenen. Im Vergleich dazu besteht die zweite Dimension aus einigen wenigen Variablen, darunter C14-SM und mehrere PCs (PC(28:0) und PC(30: l) > 0,5). Die dritte Dimension, die 13,8 % der erklärten Variablen ausmacht, besteht aus einzelnen Lipidmetaboliten. SolP, C26 SM und PC(32: 1) sind am wichtigsten. SolP ist ein recht relevantes und bioaktives Lipid bei Entzündungen und der Gefäßentwicklung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die lipidomische Analyse, wie sie erfindungsgemäß durchgeführt wurde, ein phänomenologischer Ansatz zur Interpretation der Ergebnisse der Massenspektrometrie von Erythrozyten ist. Sie war in der Lage, septische Mäuse signifikant von Kontrollmäusen zu unterscheiden.
Mit der Erfindung konnte gezeigt werden, dass Erythrozyten ein interessanter Zelltyp für die klinische Sepsisdiagnose sind. Erythrozyten sind leicht aus Blutproben zu gewinnen und einfach zu verarbeiten. Die Gewinnung molekularer Informationen über die metabolische Zusammensetzung ermöglicht es uns, die Pathophysiologie der Sepsis und verwandter Krankheiten besser zu verstehen, um eine bessere Diagnose und maßgeschneiderte Behandlungsstrategien zu ermöglichen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von 9 Zeichnungen und 5 Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1 die Isolierung der Erythrozyten und Zusammensetzung der Membran (erstellt mit BioRender.com);
Figur 2 die Grundstruktur verschiedener Phospho- und Sphingolipide, wobei R, Ri und R2 Fettsäurereste unterschiedlicher Kettenlänge sein können (geändert nach Cui, L., & Decker, E. A. (2016). Phospholipids in foods: prooxidants or antioxidants? Journal of the science of food and agriculture, 96(1), 18-31;
Figur 3 einen Screeplot (Fig. 3A) und Corrplot-Analyse (Fig. 3B) für die Hauptkomponentenanalyse. Der Scree Plot (Fig. 3A) zeigt die Eigenwerte für jede Dimension in absteigender Richtung. Auf die ersten drei Dimensionen entfallen etwa 74,2 % der erklärten Varianzen in der PCA. Fig. 3B: Der hier dargestellte Corrplot veranschaulicht die Bedeutung der einzelnen gemessenen Metaboliten für die Dimensionen.
Figur 4: die Hauptkomponentenanalyse, aufbauend auf allen Lipiden. In dieser
Abbildung sind drei verschiedene PCAs dargestellt. Alle basieren auf dem vollständigen Datensatz und verwenden alle Lipide, die gemessen wurden. Dimensionen: Fig. 4A 1 :2; Fig. 4B 1 :3; Fig. 4C 2:3. Figur 5: einen Screeplot (Fig. 5A) und PCAs (Fig. 5B, 5C und 5D) nach
Faktorenreduktion. Die Lipidmetaboliten wurden entsprechend dem Korrplot in Fig. 4B reduziert, wobei ein Cut-off von 0,7 verwendet wurde. Ein Screeplot mit einer reduzierten Anzahl von Faktoren. Auf die ersten drei Dimensionen entfallen 86,8 % der erklärten Varianzen. Fig. 5B PCA mit den Dimensionen 1 :2; Fig. 5C 1 :3 und Fig. 5D 2:3.
Figur 6: den Beitrag der Lipidbestandteile zur Clusteranalyse. Dargestellt sind sechs
Lipide, PC(28:0), PC(36:4), LPC (18:2), LPC(16:0), C18:9 SM und C24: l SM, und ihre Beiträge zur Clusteranalyse mit einem Testfehler = 0.
Figur 7: die Hauptkomponentenanalyse basierend auf den 3 Schlüsselmetaboliten
PC(28:0), PC(36:4), LPC (18:2).
Figur 8 die Hauptkomponentenanalyse zur Auswertung der massenspektrometrisch gewonnenen Lipiddaten aus einem vorausgegangenen Tierversuch. Es bedeuten:
CONTROL Gesunde Kontrollgruppe
AP AP Modell des toxischen, akuten Leberschadens BDL Modell zum obstruktiv, cholestatischen Leberschaden
IR Modell zum ischämischen Leberschaden
TAA Modell zum fibrotisch, chronischen Leberschaden
PCI Modell zum septischen Leberschaden
Figur 9: den schematischen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens
110 Probengewinnung, umfassend Bereitstellung von EDTA- Vollblut, Isolation der Erythrozyten, Aufreinigung der Erythrozyten;
120 Massenspektrometriemessungen, umfassend Probenaufreinigung nach standardisierter SOP, Durchführung der Messungen mit definierten Standards;
130 Datenauswertung, umfassend Datenvali di erung,
Interpretation,
Vergleich mit Referenzen, Kategorisierung; und
140 Individualisierte Medizin, umfassend
Frühe Diagnosestellung
Prävention von progredientem Organversagen Adaptierte und zielgerichtete Therapie
Ausführungsbeispiel 1: Isolierung von Erythrozyten aus einer Vollblutprobe
1.1 Tiermodell für Peritoneale Kontamination und Infektion (PCI)
Mittels einer menschlichen Stuhlsuspension wurden Mäuse (n=18) mit einer Peritonealkontamination infiziert. Alle Tiere wurden gewogen und bewertet, z. B. mit dem Clinical Severity Score (CSS). Die Einstufung erfolgte gemäß Tabelle 2. Etwa 60-70 pl menschliche Fäkalien-Suspension, verdünnt in Ringer-Acetat-Lösung (Berlin Chemie RG, Deutschland), wurden i.p. injiziert. Scheinbehandelte Tiere (n=14) erhielten eine Injektion mit adäquater Ringer-Acetat-Lösung, i.p. Die Tiere wurden nach sechs Stunden, 12 Stunden, 15 Stunden, 18 Stunden und 21 Stunden bewertet und mindestens zweimal pro Tag gewogen. Novaminsulfon (2,5 mg, Ratiopharm, Deutschland) als Schmerzmittel wurde alle 6 Stunden per os (p.o.) nach der Infektion verabreicht. Außerdem wurde Meropenem (25 mg kg-1 ; Inresa Arzneimittel GmbH, Deutschland), verdünnt in Ringeracetat (2,5 mg mL-1 ), zweimal sechs Stunden und 18 Stunden nach der Infektion subkutan injiziert.
Tabelle 2: Bei der Organentnahme verwendetes CSS-Bewertungssystem.
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1.2 Blutentnahme und Erythrozytenisolierung
Vollblutproben wurden in 1,2 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Monovetten (Sarstedt, Deutschland) überführt, um eine Blutgerinnung für die weiteren Verarbeitungsschritte zu verhindern. Nach anfänglicher Zentrifugation der Monovetten bei 1.000 g für 10 Minuten bei 20°C wurde die Plasmafraktion in frische Polypropylenröhrchen überführt und bei -80°C für weitere Analysen gelagert. Die verbleibenden Erythrozyten wurden zweimal gewaschen, indem die Menge des extrahierten Plasmas durch PBS (Biozym, Deutschland) ersetzt wurde. Nach Zugabe von etwa 200 pl PBS wurden die Proben erneut bei 1.000 g für 10 Minuten bei 20 °C zentrifugiert. Dieser Schritt des Austausches des Überstandes wurde zweimal durchgeführt. Nach der endgültigen Entfernung des Überstandes wurden die Erythrozyten in Polypropylenröhrchen (Eppendorf, Deutschland) aliquotiert, gewogen und bei -80 °C gelagert.
Ausführungsbeispiel 2: Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie
Die Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie wurde gemäß einer Standardarb eitsanwei sung durchgeführt.
Verwendete Materialien
Methanol (>99,9%)
Interne Standardmischung (siehe Tabelle 1) Glasfläschchen
Verwendete Geräte
- Rotator IKA-Loopster Tissuelyzer Qiagen
- Zentrifuge Speed Vac
- Horizontalschüttler
Vortex-Mi scher
Versuchsablauf
Für die Messungen wurde ein gewichtetes Aliquot von etwa 80 pl Erythrozyten verwendet. Die Vorbereitung für die Lipidquantifizierung begann mit der Zugabe von 790 pl Methanol (>99,9 %, Honeywell Riedel-de-Haen, Deutschland) und 10 pl interner Standardmischung (jeweils 30 pmol pro Injektionsvolumen, Einzelheiten siehe Tabelle 1 in Ausführungsbeispiel 4) als Referenz für die Normalisierung und Quantifizierung) in die Röhrchen mit den Erythrozytenproben. Nach der Fällung über Nacht bei -80°C wurden die Proben bei 10.000 g für 1 Stunde zentrifugiert.
Der Überstand wurde in ein neues Polypropylenröhrchen überführt und im SPD SpeedVac (Thermo Scientific Savant) bei 50°C für 90 min eingedampft. Danach wurde die Rekonstitution in 100 pL Methanol (> 99,9%) auf einem Plattenschüttler bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min durchgeführt. Schließlich wurden die Proben in Glasfläschchen (Dr. R. Forche Chromatographie, Deutschland) und versiegelt.
Je nach Verfügbarkeit des Massenspektrometers wurde die Probe anschließend sofort vermessen oder bei -80°C zwischengelagert.
Ausführungsbeispiel 3: Metabolische Analyse
Metabolomanalysen wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie durchgeführt, um die Lipidzusammensetzung der Erythrozyten zu messen und die Veränderungen der verschiedenen Lipidfraktionen aufzuzeigen, um eine Krankheit auf molekularer Basis weiter zu charakterisieren.
Die Bewertung der Leberausscheidungsfunktion erfolgte hauptsächlich durch Gallensäuremessungen in Milz- und Leberproben.
Daher war die Massenspektrometrie die effizienteste Methode, um die gesamten Veränderungen in verschiedenen organischen Kompartimenten zu identifizieren.
Ausführungsbeispiel 4: Lipididentifizierung in Erythrozyten Das Lipidprofil wurde an Erythrozyten gemessen. Die Probenvorbereitung für die Lipidquantifizierung erfolgte wie Ausführungsbeispiel 2 beschrieben. Zur internen Standardmischung (jeweils 30 pmol pro Injektionsvolumen) als Referenz für die Normalisierung und Quantifizierung siehe Tabelle 1 unten.
Für die Messungen wurden ein Autosampler L-7250, ein Peltier-Probenkühler der Fa. Merck für L-7250, ein L-2130 Flüssigchromatograph mit dem Säulenofen L-2300 mit einer 60x2 mm MultoHigh 100 RP 18-Säule mit 3 pm Partikelgröße (CS-Chromatographie Service, Deutschland) mit einem Elite LaChrom LC-System (Hitachi Europe GmbH, Deutschland) kombiniert und bei 50 °C gehalten. Die mobile Phase A bestand aus 1,0 % (v/v) Ameisensäure in ddH2O, die mobile Phase B aus 100% Methanol (Chromasolv, Honeywell Riedel-de Haen, Seelze, Deutschland). Mit einer Flussrate von 0,5 ml min'1 wurde die Säule in 10% B Die mobile Phase wechselte nach der Probeninjektion zu 100% B. Die Durchflussrate stieg von 0,5 ml min'1 bei 5 min linear auf 1,0 ml min'1 bei 7 min an und blieb bis 10 min konstant. Danach wurde die mobile Phase auf 10 % B umgestellt, und die Flussrate nahm wieder linear von 1,0 ml min'1 bei 10 min auf 0,5 ml min'1 bei 10,5 min ab und blieb bis zum Ende des Programms bei 11,3 min konstant. Die Detektion wurde zwischen 2 und 10 min durchgeführt.
Alle Proben wurden auf 4 °C gekühlt, und es wurden 10,0 pl pro Probe injiziert. Das mit einer ESI- oder APCI-Quelle ausgestattete Hochdruck-Flüssigchromatographiesystem wurde mit dem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer API 2000 (Sciex, Foster City, CA, USA) kombiniert, wobei beide im positiven Modus unter bestimmten Quellenparametern arbeiteten: Quellentemperatur 450 °C, Vorhanggas 40, Kollisionsgas "low", lonensprühspannung 5500, lonenquellengasl 60, Ionenquellengas2 30. Die Zielionen Ql> Q3, die Zuordnung zum internen Standard und die Art der Analyse sind angegeben in Tabelle 1 unten. Alle Ergebnisse wurden mit Hilfe von Analyst 1.6.2 (AB Sciex, Forster City, CA, USA) auf der Grundlage von internen Standardproben und der externen Standardkurve quantifiziert.
Tabelle 1: Liste der Zielionen/MRM-Übergänge, Zuordnung zum internen Standard und Analysemodus
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Ausführungsbeispiel 5: Lipidquantifizierung in Erythrozyten
5.1 Hauptkomponentenanalyse
Der in Abbildung 3 A dargestellte Scree Plot wurde erstellt, bevor die Dimensionen für die Erstellung der PCA-Plots ausgewählt wurden. Er visualisiert die Eigenwerte der Hauptkomponenten in der Datenanalyse, um die Gewichtung jeder berechneten Dimension für die Clusteranalyse anzunehmen. Die erste Dimension stellt 44,8 % der erklärten Varianzen dar und symbolisiert fast die Hälfte der erklärten Variablen. Dies ist der zentrale Teil im Vergleich zu den folgenden Daten. Die Dimensionen zwei und drei machen 15,6 % und 13,8 % innerhalb des Datensatzes aus.
Jede nachfolgende Dimension hat einen Anteil von weniger als 10 % und wird daher in den erstellten PCAs nicht verwendet. Der Cut-off wurde individuell auf der Grundlage der generierten Prozentsätze festgelegt. Die Einbeziehung von PCA-Dimensionen war unnötig und ungeeignet, da sie nur einen winzigen Teil der zur Kategorisierung der Tiere verwendeten Variablen betraf. Hätte eine weitere Analyse die Notwendigkeit ergeben, wäre unser Algorithmus geändert worden, um die Clusterung des Datensatzes zu verbessern.
Abbildung 3B zeigt dagegen die Auswirkungen der gemessenen Lipide für jede Dimension. Dargestellt sind die ersten fünf Dimensionen, um die dazwischen liegenden Unterschiede zu verdeutlichen. Die Analyse der ersten Dimension zeigt eine klare Struktur. Überwiegend sind Sphingomyeline (SM), Phosphatidylcholine (PC), Lysophosphatidylethanolamine (LPE) und Lysophosphatidylcholine (LPC) vorhanden. Auf der Grundlage der Korrelation sind PC(36:3), PC(36:4) und (PC34: 1) die wichtigsten Faktoren bei der Unterscheidung der Dimensionen in der Clusteranalyse mit p-Werten von p > 0,85.
Außerdem scheinen einige Lipidmetaboliten die erste Dimension nicht zu beeinflussen. Kurzkettige Sphingomyeline (CI 2 SM und C14 SM) werden hauptsächlich in Dimension 2 gewichtet. PC(28:0) und PC(30:l) zeigen ebenfalls eine höhere Korrelationsgröße für die zweite Dimension. Zusammen mit einem geringen Anteil an LPCs (hauptsächlich LPC 20:1 und 20:3) und LPE(18:0) wird die zweite Dimension von verschiedenen Lipidklassen unterschiedlich aufgebaut. Sie ist also mit der ersten Dimension vergleichbar, obwohl in der zweiten Dimension weniger Metaboliten vorhanden sind. Die dritte Dimension unterscheidet sich stark von den ersten beiden. Sie besteht nur aus einigen wenigen Metaboliten mit hoher Korrelationsstärke. D18: ISolP, C26 SM, PC(32: 1) und PC(38:2) sind für diese Dimension charakteristisch. Außerdem scheinen die LPEs diese Dimension zu beeinflussen. Mit Ausnahme von LPE(18:0), der auch in der zweiten Dimension zu finden ist, gibt es LPEs hauptsächlich in der dritten Dimension.
Diese Ergebnisse deuten auf eine hohe Variabilität und Heterogenität innerhalb und zwischen den Dimensionen hin. Die Hauptkomponentenanalyse wurde auf der Grundlage der in Abbildung 3 dargestellten Ergebnisse mit Hilfe von R berechnet. In Abbildung 4 sind die PCA-Diagramme für die ersten drei Dimensionen dargestellt, um die Verteilung der Tiere innerhalb des dimensionalen Systems zu veranschaulichen.
Wie in Abbildung 4A dargestellt, ist es möglich, zwei unabhängige Populationen anhand der Dimensionen eins und zwei zu unterscheiden, während in der gegenüberliegenden Gruppe nur wenige Tiere zu sehen sind.
Während die Darstellung der Dimensionen eins und zwei eine gute Clusterbildung ergibt, lassen die Dimensionen zwei und drei keine markanten Cluster erkennen (Abb. 4B).
Beide Kohorten sind homogen durchmischt, was die Trennung von septischen und gesunden Tieren anhand dieser Metaboliten erschwert.
Ähnlich wie bei der ersten Darstellung zeigen die Dimensionen zwei und drei eine sichtbare Clusterung von Sepsis und Nicht-Sepsis. Jede Entität kann sich in zwei vertikal unterschiedliche Untereinheiten aufteilen (in Dimension 2), die keine offensichtliche Korrelation mit dem Datensatz selbst aufweisen (Abb. 4C).
5.2 Faktorenreduktion und PC A
Im Hinblick auf die klinische Anwendbarkeit wurde weiter untersucht, ob es möglich ist, die Menge der Lipidmetaboliten zu reduzieren, um die Clusteranalyse zu erleichtern. Die Verwendung als Biomarker sollte sich auf ein kleines Panel konzentrieren, um die nforderungen für eine gute Clusterbildung zu erfüllen, anstatt mehr als 50 Parameter zu messen, was in der täglichen Praxis zeitaufwändig und unmöglich ist.
Abbildung 5A zeigt den Scree Plot für die reduzierte Anzahl von Variablen. 53,2 % der erklärten Varianzen entfallen auf die erste Dimension, was mehr ist als in Abbildung 3 A und mehr als die Hälfte der Variablen symbolisiert. Auf die Dimensionen zwei und drei entfallen weitere 20,6 % und 13 % der erklärten Varianzen.
Die PC As für die ersten drei Dimensionen sind in den Abbildungen 5B, 5C und 5D dargestellt. Nach den obigen Erkenntnissen war auch eine Clusterung der Daten mit weniger Variablen möglich.
In Abb. 5B ist eine klare Trennung nicht möglich, aber es gibt eine klare Tendenz, die septische und gesunde Tiere zusammenfasst. Bei anderen Abmessungskombinationen wie 3: 1 (Abb. 5C) und 3:2 (Abb. 5D) ist sie weniger praktikabel als bei den ersten beiden.
5.3 Identifizierung von Schlüssellipiden
Die PCA-Analyse konnte zeigen, dass es möglich ist, anhand des Lipidprofils der Erythrozyten visuell zwischen septischen und gesunden Tieren zu unterscheiden. Die folgenden Schritte umfassten eine weitere Analyse des Lipiddatensatzes. Es sollte untersucht werden, welche Lipidmetaboliten dazu beitragen, den Datensatz auf der Grundlage der Pathophysiologie zu clustern.
Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) ist daher ein ausgezeichneter Ansatz zur Dimensionsreduktion, um die Ähnlichkeit von Datenpunkten zu ermitteln. Die Datenpunkte werden durch einen nichtlinearen Kernel mit ihren k-nächsten Nachbarn in Beziehung gesetzt und weiter auf die Anzahl der Dimensionen herunterprojiziert. So ist es möglich, die wesentlichen Variablen des Datensatzes zu extrahieren.
Die UMAP und die zuvor durchgeführte PCA deuten darauf hin, dass es möglich sein sollte, anhand der lipidomischen Analyse der Erythrozyten zwischen PCI- und Schein-behandelten Tieren zu unterscheiden. Hierfür wurde XGBoost verwendet, das in R implementiert ist (Chen & Guestrin). Zehn Kreuzvalidierungsschritte mit einer Aufteilung von 90/10 wurden durchgeführt und ergaben einen durchschnittlichen Klassifikationsfehler von 18 %. Betrachtet man die Faktoren, die am meisten zur Klassifizierung beitragen, so sind die Lipide PC(28:0), PC(36:4), LPC(18:2) und LPC(16:0) die Hauptfaktoren. (Fig. 6), wobei die Lipide PC(28:0), PC(36:4), LPC (18:2) dominant sind. Figur 7 zeigt die Hauptkomponentenanalyse auf der Grundlage der drei Hauptmetaboliten PC(28:0), PC(36:4), LPC (18:2). Die PCA zeigt die Clusterung von septischen und gesunden Individuen zwischen Dimension eins und Dimension zwei.
5.4 Zusammenfassung
Die Lipidzusammensetzung der Erythrozyten wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wurden durchgeführt, um die Tierkohorten zu clustem. XGboost, implementiert in R, wurde zur Identifizierung kritischer Metaboliten verwendet.
Die Lipidomanalyse ergab, dass es möglich ist, septische von gesunden Individuen anhand der Lipidzusammensetzung der Erythrozyten zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigt die PCA zwei Cluster von Tieren, die mit den zugrunde liegenden Gruppen übereinstimmen. Somit können gesunde und septische Tiere durch Dimensionsreduktion getrennt werden. XGBoost wurde erfolgreich für die Klassifizierung von PCI-Tieren trainiert und mittels Kreuzvalidierung getestet. Neben der erfolgreichen Identifizierung der Tiergruppen wurde XGBoost auch verwendet, um zu ermitteln, welche Merkmale informativ sind, um zwischen PCI-Tieren und anderen Gruppen zu unterscheiden. Im Ergebnis wurde heraus gefunden, dass die Lipidzusammensetzung der Erythrozyten mindestens genauso aussagekräftig war wie die konventionelle Verwendung von Zytokinen.
5.5 Bestimmung anderer Leberschäden mittels Hauptkomponentenanalyse
Die Hauptkomponentenanalyse in Abbildung 8 beruht ebenfalls auf den experimentell erhobenen Daten zur Lipidzusammensetzung der Erythrozyten. Erstellt wurde die Hauptkomponentenanalyse mittels R. Zur Darstellung kommen die Dimensionen 1 und 2, wobei jeder dargestellt Punkt einem Individuum entspricht. Die Zuordnung zum entsprechenden Tiermodell erfolgt durch die dargestellten Symbole.
Das Ergebnis der Hauptkomponentenanalyse zur Auswertung von massenspektrometrisch gewonnenen Lipiddaten aus einem vorausgegangenen Tierversuch zeigt Figur 4. In Figur 4 bedeuten:
CONTROL Gesunde Kontrollgruppe
AP AP Modell des toxischen, akuten Leberschadens
BDL Modell zum obstruktiv, cholestatischen Leberschaden
IR Modell zum ischämischen Leberschaden
TAA Modell zum fibrotisch, chronischen Leberschaden
PCI Modell zum septischen Leberschaden
In dieser Analyse zeigen sich bereits erste eindeutige Clusterstrukturen und Gruppierungen. Es erscheint also plausibel, anhand gewonnener Erythrozyten und anschließender massenspektrometrischen Messung, verschiedene Entitäten der Leberdysfunktion zu detektieren. Die entsprechend durchgeführten Tierexperimente beruhen auf verschiedenen Tiermodellen unterschiedlicher Formen der Leberdysfunktion. Die entsprechenden Entitäten sind der Liste oben zu entnehmen.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung der Leber, umfassend
(a) die Isolierung von Erythrozyten aus der biologischen Probe,
(b) die Identifikation und gegebenenfalls Quantifizierung von Lipiden aus den Erythrozyten als Schlüsselmetaboliten für eine Leber- und Infektionserkrankung, umfassend die Lipide PC (28:0), PC (30:0), PC (30: 1), PC (32:0), PC (32:1), PC (34:0), PC (34:1), PC (34:2), PC (36:0), PC (36: 1), PC (36:2), PC (36:3), PC (36:4), PC (38:0), PC (38: 1), PC (38:2), PC (38:3) und PC (38:4);
SM (17:0), SM (12:0), SM (14:0), SM (16:0), SM (18:0), SM (18: 1), SM (20:0), SM (22:0), SM (24:0), SM (24: 1), SM (26:0) und SM (26: 1);
LPE (16:0), LPE (16: 1), LPE (18:0), LPE (18: 1), LPE (18:2) und LPE (20:4).
Cer (15:0), Cer (12:0), Cer (14:0), Cer (16:0), Cer (18:0), Cer (18: 1), Cer (20:0), Cer (22:0), Cer (24:0) und Cer (24: 1);
LPC (16:0), LPC (16: 1), LPC (17:0), LPC (18:0), LPC (18: 1), LPC (18:2), LPC (20:0), LPC (20: 1), LPC (20:3) und LPC (20:4), und
LPE (16:0), LPE (16: 1), LPE (17: 1), LPE (18:0), LPE (18: 1), LPE (18:2) und LPE (20:4);
(c) Hauptkomponentenanalyse der Proben und Clustering nach Subgruppen;
(d) Identifikation von Schlüsselmetaboliten mittels XGBoost Algorithmus;
(e) die Erfassung von Änderungen der Signaturen der in Schritt (d) identifizierten Schlüsselmetabolite der Lebererkrankung, und
(f) die Diagnose einer Erkrankung der Leber.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutprobe EDTA-Vollblut ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend nach Schritt (d) den Schritt
(dl) Hauptkomponentenanalyse der Proben und Clusterings anhand der in Schritt (d) identifizierten Schlüsselmetabolite. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schlüsselmetabolite PC(28:0), PC(36:4), LPC (18:2) sind. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der Erythrozyten aus der Blutprobe gemäß Schritt (a) von Anspruch 1 das Zentrifugieren der Blutprobe zur Abtrennung der zellulären Blutbestandteileund das Waschen der isolierten Erythrozyten mit einer Puffer-Lösung umfasst. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenaufarbeitung gemäß Schritt (a) von Anspruch 1 das Mischen eines vordefinierten Volumens der isolierten Erythrozyten mit einem vordefinierten Volumen eines Lösungsmittels und einem vordefinierten Volumen einer internen Standardmischung umfasst. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass 80 pl isolierte Erythrozyten mit 790 pl Methanol und 10 pl der internen Standardmischung gemischt werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenaufarbeitung gemäß Schritt (a) von Anspruch 1 weiterhin umfasst: einen Schritt des Rotierens der Mischung für eine vordefinierte Zeitdauer bei Raumtemperatur; einen Schritt des Präzipitierens über Nacht bei einer Temperatur von -80°C; einen Schritt des Zentrifugierens; einen Schritt des Verdampfens des Überstands nach der Zentrifugation; einen Schritt des Lösens der eingedampften Probe in einem Lösungsmittel; und das Einlagern der Probe bei einer Temperatur von -80°C. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifikation und gegebenenfalls Quantifizierung der Lipiden der Erythrozyten gemäß Schritt (b) von Anspruch 1 mittels Massenspektrometrie erfolgt. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Datenauswertung die Teile des Verfahrens gemäß den Schritten (b), (c), (d) und (dl) von
Anspruch 1 die Schritte umfasst:
- Datenanalyse - Datenvalidierung;
- Modellierung
- Interpretation;
Vergleich mit Referenzen; und
- Kategorisierung. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der Hauptkomponentenanalyse der mittels Massenspektrometrie gewonnene Lipiddaten Leberschäden, ausgewählt aus
- toxischen, akuten Leberschäden; obstruktiv, cholestatischen Leberschäden;
- ischämischen Leberschäden;
- fibrotisch, chronischen Leberschäden; und septischen Leberschäden diagnostiziert werden. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der Hauptkomponentenanalyse der mittels Massenspektrometrie gewonnene Lipiddaten septischen Leberschäden diagnostiziert werden.
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