CN102175783A - 一种用于多组分中药的药物代谢动力学的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种用于多组分中药的药物代谢动力学的分析方法属于药物组分分析的技术领域。采用液相色谱-串联质谱法的多重反应监测扫描方式，以原料药为“标准品”，建立原料药中各组分的定量反应离子，相对定量生物样品中各中药组分的浓度。具体步骤有配制原料药溶液、建立液相色谱-质谱分析条件、体内试验、生物样品测定和数据处理。本发明初步解决了在没有标准品的情况下，实现对生物样品中多组分中药进行定量分析。采用该方法，对中药制剂中的已知和未知组分进行了药代动力学分析。结果表明，本方法的精密度和准确度符合SFDA相关规范的要求。
Description
技术领域：
本发明属于药物组分分析的技术领域，特别涉及用于评价中药多组分药物代谢动力学的分析方法。更具体地说，是测定生物样品中中药各组分含量的液相色谱-质谱LC/MS/MS分析方法。
背景技术：
药物代谢动力学是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律：依据测得的生物样品中药物浓度，运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律的一门学科。
中药复方具有多味、多成分、多剂型的特点，存在复杂环境下及病症模型条件下的多因素相互作用。因中药化学成分众多，很难购买到所有标准品。中药药动学评价目前是按化学药物研究方法，测定多种组分中的一种或几种，这显然无法揭示多组分中药药物代谢动力学规律。由于中药成分复杂，即使一味中药也含有十几类数百种化学成分，因此以往仅以有限几种成分的药物动力学研究结果来代表某味中药或某一复方药物的药代动力特征是不准确的。因此需要建立全新的可整体评价中药药动学的分析方法。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是，建立一种新的中药药代动力学评价方法，以代替传统的依赖于有限标准品的评价方法，使其达到在没有标准品的情况下，也可对生物样品中多组分中药进行定量，进而全面评价中药的药代动力学行为。
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的快速扫描和多重反应监测(MRM)检测模式，可很好地满足生物样品中多组分中药对分析速度和专属性的要求。同时本发明以中药原料药作为标准品，利用LC-MS/MS建立各组分的定量测定方法，标定生物样品中原料药对应的各组分相对浓度，依据该浓度结果建立药-时曲线，进而计算各组分的药代动力学参数。该方法可定量地描述中药多组分进入机体后的吸收、分布、代谢和排泄等过程的动态变化规律，研究给药后体内中药的分布、浓度、疗效与时间之间的关系，整体揭示中药在体内的经时变化，对中药的临床安全合理用药具有重要指导意义。
以升麻口服片剂为模型药物，将本发明提出的定量方法与传统的定量方法进行了方法学验证的比较研究。结果表明：两者的线性范围是一致的，本法的精密度和准确度也符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的要求，采用该法成功地对升麻口服片进行了多组分体内药代动力学评价。
本发明的技术方案是：
一种用于多组分中药的药物代谢动力学的分析方法，有下述的步骤，
(1)称取原料药，配制原料药溶液；再以同样的溶剂分别稀释成不同浓度，作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度；
(2)建立液相色谱-质谱分析条件：利用质谱Q1全扫描方式选择原料药中物质的离子对，即待测物质；建立待测物质色谱-质谱分析条件、生物样品前处理方法、以内标法建立待测物质定量方法，即为原料药体内药物代谢动力学分析方法；
(3)体内试验：健康受试动物给予相同批次原料药后，按照设计时间点采集生物样品；
(4)生物样品测定：采用步骤(2)中建立的液相色谱-质谱分析条件对生物样品中离子对代表的物质进行定量分析；
(5)数据处理：利用步骤(4)中获得的生物样品中离子对代表的物质定量分析数据，即为离子对代表的物质对于标示量的相对浓度，利用相对浓度建立药-时曲线，进而得到各组分的药物代谢动力学参数。
本发明的用于多组分中药的药物代谢动力学的分析方法，可以先将中药原料药溶解，配制成不同浓度的标准系列溶液，按SFDA生物样品分析指导原则进行方法学验证；所述的方法学确证，内容包括标准曲线、定量下限、精密度与准确度、样品稳定性、提取回收率、基质效应、储备液稳定性。
更细致的实验步骤如下：
(1)称取原料药时，应保证与动物实验用药品所用原料药一致。称取原料药适量，以适当溶剂溶解后作为储备液，用相同溶剂分别稀释适当倍数，作为系列标准溶液，含量以原料药总浓度作为“标示量”标定，即标准溶液中各组分的浓度均以该“标示量”计。
(2)建立LC-MS/MS分析条件：进行质谱参数优化，选择灵敏度高、专属性强的离子对进行定量，输入质谱工作站；优化色谱分析条件。
(3)选择合适的内标以及合适的样品前处理方法进行样品处理。
(4)方法学确证：包括标准曲线、定量下限、精密度与准确度、样品稳定性、提取回收率、基质效应、储备液稳定性。
(5)体内试验：健康受试动物，给予相同批次中药原料药后按照设计时间点采集生物样品。
(7)生物样品测定：用已建立的原料药“标准品”标定生物样品中的不同组分的浓度。
(8)数据处理：有效整合各项试验数据，选择科学合理的数据处理及统计方法，获得各组分的体内药代动力学参数。
本发明的有益效果：
(1)以多组分中药原料药为标准品，使其达到在没有标准品的情况下，也可对生物样品中中药多组分定量，进而进行整体中药药代动力学研究。
(2)LC-MS/MS法：方法快速、灵敏度高、特异性好，可高通量地分析生物样品中多组分中药，能满足中药临床前或临床药代动力学研究的需要。避免逐个分离标准品，大大缩短试验周期，降低试验成本，试验结果准确可靠。
(3)可实现中药有效组分的快速筛选，建立PK-PD关系，为临床安全合理用药提供试验依据。
附图说明
图1是实施例1测定大鼠血浆中待测物和内标Rg3的典型MRM色谱图。
图2是实施例16只大鼠灌服升麻原料药后十四种成分平均血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
实施例1升麻总皂苷药代动力学研究
1、药物溶液的配制
升麻原料药为“标准品”，配制标准系列溶液：准确称取升麻原料药10.0mg，甲醇定容至10mL，作为储备液，用甲醇-水(80∶20，v/v)溶液逐步稀释至0.5，2.0，10，50，200，800μg/mL，作为标准系列溶液。
2、建立升麻总皂苷LC-MS/MS多组分测定方法
以升麻原料药作为物质组的标准品，用甲醇-水(80∶20，v/v)将其稀释到适当倍数：
(1)用注射泵(FIA)进样，质谱的Q1采用全扫描的方式，获得响应较高的升麻物质组的m/z数据；
(2)将这些数据分别作为LC-MS/MS的SIM监测的离子，输入质谱工作站；
(3)色谱采用梯度洗脱的方式，质谱选择[M-H]-信号稳定的准分子离子；
(4)采用MS2扫描方式，寻找母离子相对应的子离子，并对质谱参数进行优化，选择灵敏度高、专属性强的离子对进行定量，输入质谱工作站；十四种组分质谱条件见表1。
表1测定大鼠血浆中十四种成分的质谱条件
(5)优化色谱分析条件，选择内标，按现有国际通用的分析方法确证的要求，建立升麻物质组的体内药物代谢动力学分析方法。
3、药代动力学实验
取健康雌性wistar大鼠6只，灌服升麻总皂苷(10mg/kg)。于给药前0h及给药后5，15，30min，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，18，24，36和48h经眼眶取血0.4mL，置于肝素试管中，离心(3000g)10min，分离血浆并保存于-35℃冰箱中待测。
4、血浆样品测定
4.1血浆样品的处理方法
取血浆样品100μL置10mL试管中，加入内标溶液100μL(1μg/mL Rg3)，补加100μL甲醇-水(80∶20，v/v)混合溶液，涡流混合2min，加入萃取液正己烷∶二氯甲烷∶异丙醇(2∶1.5∶0.1)，涡流混合10min，离心10min(3000g)，取上清于另一试管中，40℃氮气流下吹干，残留物加入100μL流动相溶解，涡流混合，取20μL进行LC-MS/MS分析。
4.2建立血浆标准曲线
取空白血浆样品100μL置10mL试管中，加入内标溶液100μL(1μg/mL Rg3)，加“升麻总皂苷系列溶液”100μL，配制成相当于“升麻原料药”血浆浓度为0.5，2.0，10，50，200，800μg/mL标示浓度的样品，按“血浆样品处理”项下依法操作，建立标准曲线。以升麻原料药总浓度(X)为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值(Y)为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程。升麻原料药标准品在0.5～800μg/mL范围内线性良好，升麻原料药中十四种成分的典型回归方程见表2。
表2十四种组分典型标准曲线、精密度和准确度
5、准确度与精密度
制备升麻原料药标准溶液低、中、高三个浓度(分别为0.1、10、600μg/mL)的质量控制(QC)样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3天，根据当日的标准曲线，计算QC样品的浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度。
6、大鼠药代动力学研究
6只雌性大鼠，灌胃给予升麻原料药100mg/kg后，十四种成分和内标Rg3的典型MRM色谱图见图1，十四种成分的平均血药浓度-时间曲线见图2，采用DAS 2.0软件计算药代动力学参数，结果见表3。由于标准系列溶液是由升麻原料药稀释不同倍数所得到的，因此测得的各成分血药浓度是一个“标示量”，用软件计算得到的药代动力学参数也是表观参数，但依然能表示出各成分在体内的动力学过程。表4给出6只大鼠灌服升麻原料药后采用2种方法测定三种组份动力学参数比较。
通过上述方法学验证实验，表明空白血浆中的内源性物质不干扰测定，方法的日间日内精密度均低于15％，符合SFDA的有关要求。
以该法测得药-时曲线进行动力学参数计算，可得如下结论：1、数量单位中不涉及浓度或在计算中浓度被消除的动力学参数，如MRT(0-t)、Tmax和t1/2等这些参数与有标准品的计算结果进行统计比较，结果表明无显著性差异(P＞0.05)；2、涉及浓度单位的动力学参数如AUC、Cmax虽然所得结果为相对值，但在进行生物利用度计算和多剂量药代试验参数比较时仍可提供科学可靠的数据。
表3 6只大鼠灌服升麻原料药后十四种成分平均药动学参数
表4 6只大鼠灌服升麻原料药后采用2种方法测定三种组份动力学参数比较
综上所述，采用原料药为“标准品”的LC-MS/MS法进行中药多组分药代动力学研究是可行的。
Claims (2)
1.一种用于多组分中药的药物代谢动力学的分析方法，有下述的步骤，
(1)称取原料药，配制原料药溶液；再以同样的溶剂分别稀释成不同浓度，作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度；
(2)建立液相色谱-质谱分析条件：利用质谱Q1全扫描方式选择原料药中物质的离子对，即待测物质；建立待测物质色谱-质谱分析条件、生物样品前处理方法、以内标法建立待测物质定量方法，即为原料药体内药物代谢动力学分析方法；
(3)体内试验：健康受试动物给予相同批次原料药后，按照设计时间点采集生物样品；
(4)生物样品测定：采用步骤(2)中建立的液相色谱-质谱分析条件对生物样品中离子对代表的物质进行定量分析；
(5)数据处理：利用步骤(4)中获得的生物样品中离子对代表的物质定量分析数据，即为离子对代表的物质对于标示量的相对浓度，利用相对浓度建立药-时曲线，进而得到各组分的药物代谢动力学参数。
2.根据权利要求1所述的用于多组分中药的药物代谢动力学的分析方法，其特征在于，先将中药原料药溶解，配制成不同浓度的标准系列溶液，按国家食品药品监督管理局生物样品分析指导原则进行方法学验证；所述的方法学确证，内容包括标准曲线、定量下限、精密度与准确度、样品稳定性、提取回收率、基质效应、储备液稳定性。
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