CN114019065A - 一种共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从氨基酸水平定量分析共价药物及其代谢产物对蛋白质修饰水平的方法，并应用于药代动力学的研究。该方法步骤包括：(1)将共价药物和捕获试剂加入体外孵育体系中孵育，取孵育液进行分析，鉴定共价药物及其代谢产物与捕获试剂形成的加合物，确定具有共价修饰能力的代谢产物结构及被修饰的目标氨基酸；(2)制备步骤(1)中所述加合物的标准品，通过UHPLC‑QQQ‑MS检测标准品的色谱及质谱数据，建立定量分析方法；(3)对所述共价药物的生物给药样本进行酶解，对所得酶解产物采用UHPLC‑QQQ‑MS进行检测，依据检测结果结合(2)中所述色谱及质谱数据确定所述生物给药样本中的所述加合物的含量。

Description

一种共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法
技术领域
本发明属于药物分析化学领域，具体涉及一种共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法。
背景技术
共价药物是通过共价键与靶蛋白残基相互作用，从而改变蛋白质构象，抑制蛋白质活性的一类药物。这种作用机制使共价药物的药代动力学(PK)具有特殊性，并诱导超出PK预测范围或药物消除时间的药效学反应。因此，如果像常规研究一样使用游离药物和/或代谢产物进行共价药物的PK研究，就会忽略共价药物与常规非共价药物的作用机制的差异，而无法准确地对共价药物进行评估。近年来，研究者也开始认识到，用血浆和组织间游离药物平衡的替代方法来检测共价药物是不合适的。以上这些问题使得研究共价修饰对共价药物的研究具有重要意义。
共价修饰不仅可以由原型药物诱导，还可以由保留了活性基团的代谢产物诱导。代谢产物-蛋白质加合物的检测可以直接证明是否存在意外的代谢产物诱导的生物学效应。因此，研究药物及其代谢产物对蛋白质的共价修饰对于评价共价药物的PK至关重要。
目前应用于共价药物PK检测的方法多是基于放射性、荧光性质、LC和LC-MS/MS等方法开发的。然而，这些方法或是需要引入标记基团，或是忽略了对共价结合形式的检测。基于胰蛋白酶解的肽段的质谱分析通常被用于识别和表征药物及其代谢产物对蛋白质的修饰，这种策略可以提供蛋白靶点的位置信息和修饰形式。然而，它的操作过程相当复杂和困难，药物及其代谢产物-蛋白质加合物的低丰度也阻碍了对加合物的检测。因此对于共价药物来说，仍需要针对共价结合进行检测的快速、灵敏的定量方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法，具体的，通过体外模型对有共价修饰能力的代谢产物进行鉴定，进一步建立基于氨基酸水平的超高效液相色谱/三重四极杆质谱(UHPLC-QQQ-MS)定量方法，最后对体内样本进行应用和分析。该方法不仅能够快速、灵敏的定量检测蛋白修饰水平，同时还能区分原型药物与代谢产物对蛋白质的修饰。
本发明的第一方面，提供一种共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将共价药物和捕获试剂加入体外孵育体系中孵育，取孵育液进行分析，鉴定共价药物及其代谢产物与捕获试剂形成的加合物，确定具有共价修饰能力的代谢产物结构及被修饰的目标氨基酸；
(2)制备步骤(1)中所述加合物的标准品，通过UHPLC-QQQ-MS检测标准品的色谱及质谱数据，建立定量分析方法；
(3)对所述共价药物的生物给药样本进行酶解，对所得酶解产物采用UHPLC-QQQ-MS进行检测，依据检测结果结合(2)中所述色谱及质谱数据确定所述生物给药样本中的所述加合物的含量。
在本发明的一些实施方式中，所述捕获试剂为氨基酸及其衍生物。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述捕获试剂为N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸、赖氨酸、或谷胱甘肽；优选半胱氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述体外孵育体系包括微粒体、S9混合物、肝细胞、或重组代谢酶；优选微粒体。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中，鉴定方法为超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)法。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述UHPLC-Q-TOF-MS的检测参数包括保留时间、二级质谱信息。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述UHPLC-Q-TOF-MS的色谱柱为BEH C18色谱柱。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述UHPLC-Q-TOF-MS的色谱柱规格为2.1mm×100mm,1.7μm。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述UHPLC-Q-TOF-MS采用ESI正离子模式；进一步地，流动相A为含甲酸的水溶液，流动相B为含甲酸的乙腈；更进一步地，甲酸的含量均为0.05-0.15％。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述UHPLC-Q-TOF-MS的条件为：流速0.2-0.3mL/min，柱温22-28℃，进样量1-3μL，梯度洗脱的程序包括:0-0.5min,10％B；0.5-4min,B从10％线性增加到28％；4-7min,B从28％线性增加到32％；7-7.5min,B从32％线性增加到95％；7.5-8.5min,95％B。
进一步地，氮气作为鞘气，干燥气温度为290-310℃，流速为8-12L/min，雾化器压力为34-36psi，毛细管电压为3400-3600V，碰撞电压28-32eV。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(2)包括采取液相色谱技术对加合物标准品进行分离纯化。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述步骤(2)采取的液相色谱技术为：采用VsionHT C18 HL柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，利用Agilent 1100系列毛细管LC系统进行分离纯化。
进一步地，流动相A为水，流动相B为乙腈；流速为0.5-1.5mL/min，梯度洗脱的程序包括:0-0.5min,20％B；0.5-3min,B从20％线性增加到30％；4-6min，30％B；6-10min,B从30％线性增加到31％；10-13min,B从31％增加到95％。
在本发明的一些实施方式中，所述UHPLC-QQQ-MS的色谱柱为反相色谱柱，优选C18色谱柱，更优选BEH C18色谱柱。
在本发明的一些实施方式中，所述UHPLC-QQQ-MS的色谱柱规格为2.1mm×100mm,1.7μm。
在本发明的一些实施方式中，所述UHPLC-QQQ-MS采用ESI正离子模式，扫描方式采用多反应监测(MRM)模式。
在本发明的一些实施方式中，所述UHPLC-QQQ-MS的流动相A为含甲酸的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈；优选流动相A为含0.05-0.15％甲酸的10mmol/L乙酸铵水溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述UHPLC-QQQ-MS的条件为：流速0.2-0.3mL/min，柱温22-28℃，进样量1-3μL，梯度洗脱的程序包括:0-0.5min,10％B；0.5-4min,B从10％线性增加到28％；4-7min,B从28％线性增加到32％；7-7.5min,B从32％线性增加到95％；7.5-8.5min,95％B。
进一步地，以氮气作为鞘气，干燥气温度为240-260℃，流速为11-15L/min，雾化器压力为24-26psi，毛细管电压为3400-3600V，碎裂电压360-400V。
在本发明的一些实施方式中，所述UHPLC-QQQ-MS的检测参数包括保留时间、母离子、子离子和碰撞能量信息。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(2)包括利用标准品对建立的定量方法进行方法学验证；进一步地，所述方法学验证项目包括定量限、线性范围、准确度和精密度。
在本发明的一些实施方式中，当所述药物为奥西替尼时，标准曲线为y＝1590x-1971(r2＝0.9929，权重为1/x)，AC1标准液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性范围为5～500ng/mL，定量限为1ng/mL(S/N≥10)。
在本发明的一些实施方式中，所述生物样本为实验动物的血清和/或组织样本。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述实验动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬中的至少一种；所述组织取自肝脏、肾脏、大脑或肺中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述混合酶包括链霉蛋白酶和糜蛋白酶混合酶、或链霉蛋白酶串联羧肽酶Y及亮氨酸氨肽混合酶；优选链霉蛋白酶和糜蛋白酶混合酶。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述混合酶为2.8-9单位链霉蛋白酶E和6-24单位糜蛋白酶；优选为7-9单位链霉蛋白酶E和15-17单位糜蛋白酶；更优选8.4单位链霉蛋白酶E和16单位糜蛋白酶。
链霉蛋白酶E是一种商业化的具有广泛特异性的混合酶，由至少10种酶组成，包括肽内酶和肽外酶，它们能够非特异性酶解肽段成为游离氨基酸。然而，链霉蛋白酶E的水解并不完全，因此本发明混合链霉蛋白酶与糜蛋白酶进一步提高蛋白质的水解效率。
在本发明的一些优选的实施方式中，酶解时间为15-25h；优选为18-22h。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(3)包括采取HLB柱对酶解后的产物进行纯化。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述纯化步骤包括：用甲醇-水进行预处理，取酶解产物上样，用40-60％的甲醇冲洗，最后用70-100％的甲醇洗脱，干燥洗脱液。
在本发明的一些实施方式中，所述共价药物为奥西替尼。
根据本发明实施方式的共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法，至少具备如下有益效果：
(1)UHPLC-QQQ-MS的检测方法可以快速、灵敏、准确地对目标化合物进行分离及检测，并且可以同时对多种目标化合物进行定量。
(2)本发明不仅可以鉴定出具有共价修饰能力的代谢产物，而且以此建立的共价药物及其代谢产物-蛋白质加合物的定量分析方法还可以准确测定原型药物以及具有共价修饰能力的代谢产物对蛋白质的修饰；
(3)与基于胰蛋白酶解的肽段的质谱分析相比，本发明将被修饰的蛋白质酶解为被修饰的氨基酸，通过检测氨基酸的修饰水平代替检测蛋白质的修饰水平，不仅简化了操作过程，且大大提高了药物及其代谢产物与蛋白质加合物的丰度，可以提高检测方法的灵敏度和准确性；
(4)与检测共价药物及其代谢产物的游离形式相比，本发明检测加合物在体内的变化，充分考虑了加合物对靶器官的高效力和长时间影响，以及共价药物分布与共价占据蛋白之间存在滞后关系等因素，更能真实体现共价药物的药代动力学特征和作用机制。
本申请中术语：
按照本领域的惯例，“体外孵育体系”是指使共价药物产生代谢的反应体系。
“捕获试剂”是指小分子亲核试剂，其结构中带有富电子基团，在生化反应中可进攻药物分子中的亲电基团，并通过一定的构象变化或过渡态最终形成共价键。
“微粒体”是指肝脏组织均质化后，从内质网的碎片所得到的小型囊泡，其中含有细胞色素P450(CYP)酶；“S9混合物”是指S9肝匀浆和代谢酶活性所必需的辅助因子的混合物，为体外代谢活化系统；“肝细胞”是指经人类或动物肝原代细胞培养的具有肝代谢酶等可以满足体外代谢条件的细胞；“重组代谢酶”是指利用细胞重组技术生产的具有催化活性的各种代谢酶。
生物给药样本经酶解后所获得的是共价药物及其代谢产物与蛋白质中的氨基酸残基形成的加合物，捕获试剂与此残基为相同结构或为其衍生物。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为奥西替尼及其代谢产物-半胱氨酸加合物的LC-MS/MS色谱图(A)，加合物的结构和MRM定量分析中使用的片段离子(B)。
图2为给药6h后，以AC1和AC2水平为代表的奥西替尼和代谢产物-蛋白质加合物的组织分布，以AC1在肝脏中的峰面积为100％，并据此计算AC1和AC2在所有组织中的百分比(每组样本量：n＝4)。
图3为奥西替尼及代谢产物-蛋白质加合物在肝脏(A)、肾脏(B)、大脑(C)和肺(D)组织中随时间的变化(以AC1和AC2的水平为代表)；将AC1在肝脏、肾脏和脑内6h的峰面积设为100％，并据此计算各组织中AC2的百分比；此外，将24h时AC1在肺中的峰面积设为100％，并据此计算AC2在肺中的百分比。
图4为游离奥西替尼和奥西替尼去甲基化代谢产物(AZ5104)以及对应的加合物AC1(奥西替尼-半胱氨酸加合物)和AC2(AZ5104-半胱氨酸加合物)在血清中随时间的变化情况；A：血清中奥西替尼、AZ5104浓度的变化；B：血清中AC1和AC2浓度的变化。AC1和AC2的丰度根据它们的蛋白质浓度换算成每毫升血清中加合物的含量，以供比较。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例
实施例1.基于氨基酸水平的UHPLC-QQQ-MS定量分析方法的建立及验证
1.共价药物的体外孵育及加合物的鉴定
以DMSO为溶剂制备奥西替尼原液，浓度为4mg/mL。用含有NAPDH发生液A、B及半胱氨酸的磷酸钾缓冲液(PBS,pH7.4,0.1mol/L)将奥西替尼原液稀释到终浓度为10.0mmol/L。在37℃预孵育2min，然后加入1.0mg/mL的人肝微粒体启动代谢反应，总孵育体积为400μL。分别在0、10、30、60、120、180、240min收集等量的50μL孵育液。样品经15000g离心10min，收集上清液，用氮气干燥。残留物用50μL 50％甲醇水溶液复溶，离心后取上清液进行UHPLC-Q-TOF-MS分析。
UHPLC-Q-TOF-MS的色谱柱为BEH C18色谱柱，规格为2.1mm×100mm,1.7μm。检测方法：采用ESI正离子模式；流动相A为含甲酸的水溶液，流动相B为含甲酸的乙腈；甲酸的含量为0.05-0.15％。流速0.2-0.3mL/min，柱温22-28℃，进样量1-3μL，梯度洗脱的程序包括:0-0.5min,10％B；0.5-4min,B从10％线性增加到28％；4-7min,B从28％线性增加到32％；7-7.5min,B从32％线性增加到95％；7.5-8.5min,95％B。氮气作为鞘气，干燥气温度为290-310℃，流速为8-12L/min，雾化器压力为34-36psi，毛细管电压为3400-3600V，碰撞电压28-32eV。UHPLC-Q-TOF-MS的检测参数包括保留时间、二级质谱信息。
最终得到奥西替尼及其代谢产物与半胱氨酸加合物的色谱及质谱信息如表1。
表1奥西替尼及其代谢产物与半胱氨酸的加合物
Figure BDA0003311854070000071
Figure BDA0003311854070000081
2.加合物标准品的配制
奥西替尼-半胱氨酸加合物(AC1)标准品制备：精密称取1.6mg奥西替尼(3.2μmol)溶于4mL 10％DMSO中，精密称取2.42mg半胱氨酸(20μmol)溶于10mL 10mmol/L HCl中，将奥西替尼溶液与半胱氨酸溶液在37℃孵育6h后，浓缩至干燥，用50％乙腈复溶样品，离心。采用VsionHT C18 HL柱(250mm×4.6mm,5μm,Grace)，利用Agilent 1100系列毛细管LC系统进行纯化。流动相A为水，流动相B为乙腈，流速为1mL/min，梯度为:0-0.5min,20％B；0.5-3min,B从20％线性增加到30％；4-6min,30％B；6-10min,B从30％线性增加到31％；10-13min,B从31％增加到95％。通过210nm波长处和254nm波长处的紫外吸收光谱进行收集。
HPLC分析纯度为95.26％，HPLC-MS表征结果显示，制备的AC1标准品与体外孵育样品呈相同的色谱特征，高分辨率质谱显示，AC1(C31H40N8O4S)的[M+H]+分子离子峰为m/z621.2968(Δm/z:0.002)，[M+2H]2+分子离子峰为311.1524(Δm/z:0.003)。
3.定量方法实验条件优化
首先对色谱分离条件进行了优化，试验过程中发现，在含乙腈和水的0.1％甲酸溶液中，AC1的双电荷离子峰大于单电荷离子峰，它们的比例随浓度而变化，但是加入乙酸铵可以提高单电荷离子的量。因此，流动相采用含0.1％甲酸的10mmol/L乙酸铵水溶液(流动相A)以及乙腈(流动相B)。
利用AC1标准品和体外孵育样品，建立了AC1-AC6的MRM定量方法，它们的母离子/子离子对质荷比(m/z)如表2及图1。由于这6个加合物的结构和片段相似，因此按照AC1的定标方法对AC2-AC6进行半定量。
表2奥西替尼及其代谢产物与半胱氨酸加合物的MRM检测参数
Figure BDA0003311854070000091
UHPLC-QQQ-MS条件为：色谱柱为BEH C18(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters)，流速为0.25mL/min，柱温为25℃。洗脱液为含0.1％甲酸的10mmol/L乙酸铵水溶液(流动相A)以及乙腈(流动相B)。进样量2μL，流动相梯度为:0-0.5min,10％B；0.5-4min,B从10％线性增加到28％；4-7min,B从28％线性增加到32％；7-7.5min,B从32％线性增加到95％；7.5-8.5min,95％B。氮气作为鞘气，质谱检测采用ESI正离子模式，干燥气温度为250℃，流量为13L/min，雾化器压力为25psi，毛细管电压为3500V，碎裂电压380V。采用LC-MS/MS-MRM测定分析物。
4.方法学验证
标准溶液的配制：准确称量0.8mg AC1溶解在50％甲醇中，制成浓度为1mg/mL的储备液。将AC1储备液稀释至浓度1-1000ng/mL，制备一系列工作液。将储备液稀释至低(5ng/mL)、中(50ng/mL)和高(500ng/mL)三个浓度作为AC1的质控样品。
标准曲线图以AC1标准液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线，y＝1590x-1971(r2＝0.9929，权重为1/x)，线性范围为5～500ng/mL，定量限为1ng/mL(S/N≥10)。
使用低、中、高浓度质控样品中待测物峰面积，代入建立的标准曲线中，计算得到质控样品中AC1的浓度。日内及日间精密度测试低、中、高三个浓度，准确度为85-115％，精密度为±20％，符合要求(表3)。上述结果表明本方法灵敏度高，线性、准确性和重复性好。
表3奥西替尼-半胱氨酸加合物在低、中、高浓度下日内和日间的准确度和精密度
Figure BDA0003311854070000092
Figure BDA0003311854070000101
实施例2.共价药物给药后大鼠体内样本定量分析
1.完全酶解方法优化
通过比较不同酶混合比例以及酶解时间下得到的AC1的峰面积，得出检测1500μg蛋白所需最优酶比例为8.4单位链霉蛋白酶E和16单位糜蛋白酶，最佳酶解时间为20h。
2.动物给药及样品处理
16只SD大鼠，体重约200g(雄性)、180g(雌性)，随机分为4组(n＝4，雌雄各半)。2、3、4组给予奥西替尼以1％聚山梨酯80混悬液(36mg/kg)，1组给予1％聚山梨酯80作为对照。1、2组大鼠给药后1h处死，3、4组大鼠给药后6h、24h处死并采血。血液室温分层2h，采用3000g离心10min，去除沉淀。血清在-80℃下保存。生理盐水灌注后采集肝、肺、脑、肾组织。0.1g组织在1mL PBS(pH7.4)中匀浆，9000g离心10min以清除沉淀，取上清液。
用DC蛋白定量试剂盒对组织上清液和血清进行蛋白定量，收集含有1500μg蛋白的样品，与4体积冰丙酮混合沉淀，并用4体积冰丙酮洗涤沉淀2次。在3000g离心5min后，收集沉淀并在400μL 50mmol/L NH4HCO3中重新溶解，并用2.5mmol/L的DTT在60℃下还原60min。然后加入16μL 0.75mg/mL的链霉蛋白酶E和20μL 20mg/mL的α-糜蛋白酶，在37℃下孵育20h。
用HLB柱对酶解产物进行纯化。用1.5mL甲醇和1.5mL水进行预处理，取430μL酶解产物上样，用1.5mL 50％甲醇冲洗，最后用1.5mL 85％甲醇洗脱。洗脱液在氮气下干燥，并在-20℃保存。
3.样品的定量分析
将处理好的组织样品用50％甲醇复溶，以本发明方法进行定量。同时定量检测血清中游离的药物及代谢产物(AZ5104)。游离形式的检测中，奥西替尼的母离子/子离子对质荷比为m/z 500→72,AZ5104为m/z 486→72。
最终在肝、肾、肺、脑中均检测到了奥西替尼-半胱氨酸加合物(AC1)以及5种代谢产物-半胱氨酸加合物(AC2-AC6)(表4)。AC2与AC1的丰度相似，而AC3-AC5的浓度较低。其中AC2为奥西替尼的主要代谢产物AZ5104与蛋白结合的加合物。考虑到AZ5104的活性，本发明选择AC2作为代谢产物-蛋白加合物的代表对AC1及AC2进行进一步分析。
表4奥西替尼及其代谢蛋白修饰在单剂量SD大鼠体内的分布
Figure BDA0003311854070000111
aMean±SD,n＝4.
从图2的分布结果可以看出，AC1主要积聚在肝脏和肾脏，其次是肺和脑，且AC2与AC1的分布相似。图3A-C通过比较不同组织中加合物含量的变化，发现在非靶组织(肝、肾、脑)中，6h前加合物均快速增加，6～24h均缓慢减少。不同的是，图3D结果显示在靶组织(肺)中，加合物均持续增加至24h，呈特定趋势。并且靶器官中蛋白加合物的含量呈现出与其他组织不同的累积趋势，这种特殊的长时间增加表明了对靶器官的高效力和长时间影响。
图4A检测结果显示，在2h前，奥西替尼浓度迅速升高，然后下降，而AZ5104浓度持续升高到6h。从6h到24h，AZ5104的下降速度比奥西替尼慢。图4B结果显示，AC1和AC2浓度在给药后约6h达到峰值，比奥西替尼和AZ5104晚。这证明共价药物分布与共价占据蛋白之间存在滞后关系，检测游离药物形式不足以对共价药物在体内的情况进行评估。
综上所述，本方法成功地利用酶解的氨基酸加合物，灵敏、快速地检测共价药物及其代谢产物对蛋白质的修饰水平。在药代动力学评价中，相比检测共价药物及代谢产物游离形式在体内的变化，检测共价药物及代谢产物对蛋白质的共价修饰更能体现药物与药效间的关系。本发明方法可以为共价药物药代动力学发展提供新方法。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将共价药物和捕获试剂加入体外孵育体系中孵育，取孵育液进行分析，鉴定共价药物及其代谢产物与捕获试剂形成的加合物，确定具有共价修饰能力的代谢产物结构及被修饰的目标氨基酸；
(2)制备步骤(1)中所述加合物的标准品，通过UHPLC-QQQ-MS检测标准品的色谱及质谱数据，建立定量分析方法；
(3)对所述共价药物的生物给药样本进行酶解，对所得酶解产物采用UHPLC-QQQ-MS进行检测，依据检测结果结合(2)中所述色谱及质谱数据确定所述生物给药样本中的所述加合物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获试剂为氨基酸及其衍生物；优选N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸、赖氨酸、或谷胱甘肽；更优选半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体外孵育体系包括微粒体、S9混合物、肝细胞、或重组代谢酶；优选微粒体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，鉴定方法为UHPLC-Q-TOF-MS法。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述UHPLC-QQQ-MS的色谱柱为反相色谱柱；优选C18色谱柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述UHPLC-QQQ-MS采用ESI正离子模式，扫描方式采用MRM模式；进一步地，流动相A为含甲酸的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈；更进一步地，以氮气作为鞘气，干燥气温度为240-260℃，流速为11-15L/min，雾化器压力为24-26psi，毛细管电压为3400-3600V，碎裂电压360-400V。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合酶包括链霉蛋白酶和糜蛋白酶混合酶、或链霉蛋白酶串联羧肽酶Y及亮氨酸氨肽混合酶；优选链霉蛋白酶和糜蛋白酶混合酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合酶为2.8-9单位链霉蛋白酶E和6-24单位糜蛋白酶；优选为7-9单位链霉蛋白酶E和15-17单位糜蛋白酶；进一步地，酶解时间为15-25h；优选为18-22h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括采取HLB柱对酶解后的产物进行纯化。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共价药物为奥西替尼。
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