CN107389776A - 一种用于检测药物分布的分析方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测药物分布的分析方法及其应用，属于药物分析检测领域。该分析方法包括：采用固定处理法处理施用待测药物后的生物组织，切片后制得待测样品；随后采用二次离子质谱仪分析待测样品。采用该分析方法，可获知待测药物在各种组织、细胞和亚细胞结构中的分布，实现药物分子在细胞、亚细胞尺度的检测，并可获知待测药物在目标位点的累积情况。由此，该分析方法可广泛使用在检测药物的转运、吸收和代谢的研究中，或使用在检测药物功效、筛选药物的研究中。

Description

一种用于检测药物分布的分析方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物分析检测领域，具体而言，涉及一种用于检测药物分布的分析方法及其应用。

背景技术

二次离子质谱仪(SIMS)，是利用质谱法分析初级离子入射靶面后，溅射产生的二次离子而获取材料表面信息的一种方法。二次离子质谱可以分析包括氢在内的全部元素，并能给出同位素的信息、分析化合物组分和分子结构。二次离子质谱具有很高的灵敏度，可达到ppm甚至ppb的量级，还可以进行微区成分成像和深度剖面分析。

现行常用的药物分布分析方法只能检测到药物在组织尺度的分布，而无法检测到药物在细胞和亚细胞结构中的分布，难以真实反映药物在受试者体内的分布情况。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于检测药物分布的分析方法，能够实现药物分子在细胞、亚细胞尺度的检测，并可获知待测药物在目标位点的累积情况。

本发明的第二目的在于提供一种该分析方法的用途，由于该分析方法能够实现细胞、亚细胞尺度的检测，在检测药物的转运、吸收和代谢的应用中或在检测药物功效、筛选药物的应用中，能得到更加详细、准确的药物分布信息。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于检测药物分布的分析方法，其包括：

采用固定处理法处理施用待测药物后的生物组织，切片后制得待测样品；随后采用二次离子质谱仪分析待测样品。

上述分析方法在检测药物的转运、吸收、和代谢中的应用或在检测药物功效、筛选药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本公开内容提供的这种用于检测药物分布的分析方法，在对生物样品进行固定处理后，采用二次离子质谱仪对生物组织进行检测，可获知待测药物在各种组织、细胞和亚细胞结构中的分布，实现药物分子在细胞、亚细胞尺度的检测，并可获知待测药物在目标位点的累积情况。

本公开内容提供的该分析方法的用途，由于该分析方法能够实现细胞、亚细胞尺度的检测，在检测药物的转运、吸收和代谢的应用中，或在检测药物功效、筛选药物的应用中，能得到更加详细、准确的药物分布信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施方式实验例1中胺碘酮在巨噬细胞中的分布检测图，其中，EM为扫描电子显微镜成像图；³¹P，为二次离子质谱仪收集的³¹P的信号分布图；¹²⁷I，为二次离子质谱仪收集的¹²⁷I的信号分布图；

图2为实施方式实验例2中顺铂在HeLa细胞中的分布检测图，其中，³¹P，为二次离子质谱仪收集的³¹P的信号分布图；¹⁹⁵Pt，为二次离子质谱仪收集的¹⁹⁵Pt的信号分布图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种用于检测药物分布的分析方法，其包括：

步骤S1:采用固定处理法处理施用待测药物后的生物组织，切片后制得待测样品。

该生物组织可以为离体生物组织，比如动物的肌肉组织、神经组织，植物的营养组织等。采用这种离体生物组织作为研究对象，试验样本更加真实，检测所得到的药物分布信息也更接近于真实状态。例如，可以使用癌症患者的癌细胞扩散处的离体组织来作为试验样本，通过该分析方法可准确获知待测药物分子在该患者的癌细胞扩散处的组织中的分布情况，为该患者后期的治疗提供宝贵的信息。

该生物组织也可以为人为构建的体外组织模型，相比于单细胞、或者其它细胞模型，这种体外组织模型在组织微观结构、细胞空间分布、特定细胞表型等方面更接近真实的生物组织，因此所得到的药物分布信息有着更好的可信度。此外，采用这种人为构建的体外组织模型对药物进行检测，也可减少实验动物的使用。

进一步的，这种体外组织模型的构建方法包括：将天然软组织去细胞，并与动物细胞进行体外共培养。这种天然软组织去细胞基质作为细胞培养支架，其含有微脉管系统和生物因子等微环境,有助于细胞培养支架在再细胞化过程中，细胞获取氧气和营养物质，以及细胞的增殖、迁移和分化。

可选的，该天然软组织包括小肠组织，血管组织，肌肉组织，心脏组织，瓣膜组织，肺组织，脾脏组织，肾脏组织，肝脏组织，胃组织，胆囊组织，脂肪组织，软骨组织，气管组织，食道组织，膀胱组织，输尿管组织，输卵管组织或子宫组织。

具体地，体外组织模型的构建方法包括：

a.取灭菌后的天然软组织去细胞基质置于培养皿中；

在一个优选的实施方式中，上述步骤中的培养皿为24孔板；培养皿中预先涂覆纤维连接蛋白再放置天然软组织去细胞基质；放置于培养皿中的天然软组织去细胞基质的厚度优选为0.05-2mm；

b.将含有动物细胞的培养基悬浊液注入培养皿中；

在一个优选的实施方式中，上述步骤中的动物细胞的培养基悬浊液中动物细胞的浓度为20000-500000个/mL；注入培养皿中的动物细胞的培养基悬浊液的液面高度不小于所述天然软组织去细胞基质的厚度。

在一个优选的实施方式中，上述步骤中注入培养皿中的动物细胞的培养基悬浊液的液面高度等于天然软组织去细胞基质的厚度。

c.将培养皿放置于培养箱中3-6小时后，继续添加培养基；

在一个优选的实施方式中，上述步骤中的继续添加的培养基的体积为步骤b中的最初注入培养皿中的动物细胞的培养基悬浊液体积的1-10倍；

d.将动物细胞与天然软组织去细胞基质共培养3-30天得到本发明的组织模型，优选在共培养期间每48小时将培养基完全更换一次。

上述动物细胞包括全能干细胞，多能干细胞，专能干细胞，免疫细胞，软骨细胞，骨来源细胞，平滑肌细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肝细胞，肝来源的干细胞或祖细胞，肝巨噬细胞，星状细胞，上皮细胞，肿瘤细胞，神经细胞，血管细胞，内皮细胞或成纤维细胞。

进一步的，在待测药物中含有与该生物组织不同的元素的情况下，例如待测药物中含有铂、金、溴(⁷⁹Br)、碘(¹²⁷I)等元素，则可直接以这些元素为目标元素，采用二次离子质谱仪检测分析。

可选的，在待测药物中不含有与该生物组织不同的元素的情况下，则需要对待测药物进行同位素标记，可选的，用同位素¹³C、¹⁵N、²H或¹⁸O来标记待测药物，再将同位素标记后的待测药物给药至生物组织，培养一段施加后，采用二次离子质谱仪检测分析追踪。

在给药的过程中，可以将待测药物加入到细胞培养液中进行培养，来分析待测药物在生物组织中的分布情况；也可将待测药物加入至该生物组织的一侧，继续培养后，通过检测待测药物的分布来获得该待测药物在生物组织中的传送情况。

进一步的，固定处理法包括化学固定法和冷冻固定法。固定处理法，即采用一定的手段使生物组织中的液体凝固，从而阻止细胞液的流动，以保证药物分布情况不发生变化，让样品适合于二次离子质谱仪的分析(真空环境)。

其中，冷冻固定法，即为采用低温冷冻的办法，尽可能的保存药物在细胞和组织内的分布。可选的，这种冷冻固定法适宜于检测水溶性的药物。

该冷冻固定法包括干冰冷冻法、液氮冷冻法、高压冷冻法。三种冷冻固定法的操作步骤基本一致，即将给药后的生物组织放入到干冰、液氮或高压冷冻机内进行瞬时冷冻，使生物组织中的水由液体转变为固体。此方法简便，无繁琐步骤，适用于对药物在组织内的宏观分布。但是由于在后续干燥过程中，可能会导致药物分子在小范围内移动，不适合于高分辨的药物分布的分析。此方法可结合组织学的方法，来观测组织尺度上药物的分布。

其中，化学固定法包括：用化学固定剂处理生物组织。该方法适合于用来处理跟生物系统有结合的药物的分布，即能够与组织中的生物大分子形成化学键而结合的药物的分布，来保存药物分布的信息。优选的，化学固定剂包括：戊二醛、多聚甲醛。

进一步的，该分析方法还包括将固定处理后的生物组织，干燥并切片后，制得待测样品的步骤。由于二次离子质谱仪是在真空环境下进行样品检测的，如果是采用化学固定剂处理，则可干燥切片；如果是采用冷冻处理法固定的样品，则可使用带有冷冻台的二次离子质谱仪进行检测,或通过冷冻置换等方法对样品进行后处理后，切片分析。

进一步的，该分析方法还包括在固定处理后，采用荧光染色剂处理生物组织，干燥并切片后制得待测样品。采用这种方法制得的生物样品，允许后期同时获得结构信息、特定荧光标记分子的分布和药物分布信息，即采用荧光显微镜与二次离子质谱仪联用检测分析，获得药物在亚细胞结构中的分布情况。

进一步的，该分析方法还包括在固定处理后，采用OsO₄固定、干燥、树脂包埋、切片后制得待测样品。采用这种方法制得的生物样品，有利于提高电子显微镜的对比度，允许后期使用电子显微镜与二次离子质谱仪联用检测分析，以获得更加详尽的药物在亚细胞结构中的分布情况。

步骤S2:随后采用二次离子质谱仪分析待测样品。

在采用二次离子质谱仪分析待测样品过程中，使用初级离子在样品表面扫描，扫描过程中产生二次离子，二次离子被收集，并使用质谱仪分析，得到样品表面的化学信息。其中，用于分析的初级离子源包括：氧、铯、铋和氩离子源。

进一步的，该分析方法还包括采用显微镜设备与二次离子质谱仪联用检测待测样品的步骤。可选的，显微镜设备包括光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、原子力探针显微镜。采用这种与显微镜设备联用的分析方法，可以关联药物分布与组织学检测或者超微结构的检测，从而能够获得更多有用的药物分布信息。

本实施方式提供的这种用于检测药物分布的分析方法，在对生物样品进行固定处理后，采用二次离子质谱仪对生物组织进行检测，可获知待测药物在各种组织、细胞和亚细胞结构中的分布，实现药物分子在细胞、亚细胞尺度的检测，并可获知待测药物在目标位点的累积情况。

本实施方式还提供一种上述分析方法在检测药物的转运、吸收和代谢中的应用或在检测药物功效、筛选药物中的应用。由于该分析方法能够实现细胞、亚细胞尺度的检测，因此在上述研究检测的应用中，能得到更加详细、准确的药物分布信息。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种用于检测药物分布的分析方法，其包括：

步骤a.构建体外心肌组织模型：取灭菌后的去细胞小鼠心肌组织置于预先在内壁涂覆纤维连接蛋白的24孔板中；将含有心肌细胞，浓度为50000个/mL的培养基悬浊液注入24孔板中；将24孔板放置于培养箱中4小时后，继续添加培养基，将心肌细胞与去细胞小鼠心肌组织共培养7天，即得体外心肌组织模型。

步骤b.给药：将同位素¹³C标记过的待测药物加入至体外心肌组织模型的培养液中，在同等条件下继续培养48h。

步骤c.待测样品的制备及检测：用2.5％的戊二醛溶液对步骤b中所得的体外心肌组织模型进行化学固定，固定之后使用一系列浓度由低到高的丙酮(20％,30％,50％,70％,90％and 100％)进行干燥处理，然后使用环氧树脂包埋，包埋后采用切片机切成500nm的薄片，并用二次离子质谱仪进行分析，即可得到药物分布信息。

实施例2

本实施例提供一种用于检测药物分布的分析方法，其包括：

步骤a.构建体外干细胞共培养模型：取灭菌后的去细胞猪小肠黏膜组织置于预先在内壁涂覆纤维连接蛋白的24孔板中；将含有间充质干细胞、浓度为300000个/mL的培养基悬浊液注入24孔板中；将24孔板放置于培养箱中4小时后，继续添加培养基，将间充质干细胞与去细胞猪小肠黏膜组织共培养7天后，即得体外干细胞共培养模型。

步骤b.给药：将同位素¹⁵N标记过的待测药物加入至体外干细胞共培养模型的培养液中，在同等条件下继续培养72h。

步骤c.待测样品的制备：将步骤b中所得的体外干细胞共培养模型进行高压冷冻处理后，进行冷冻置换处理，并使用OsO₄进行染色，置换后用树脂进行包埋，再采用切片机切成400nm的薄片，即为待测样品。

步骤d.检测分析：依次采用电子显微镜和二次离子质谱仪对步骤c中所得待测样品的同一区域进行检测分析，即可得到药物分布信息。

实验例1

胺碘酮在巨噬细胞中的分布检测：

一、实验方法

1.构建体外巨噬细胞共培养模型：采用去细胞的天然软组织与巨噬细胞(NR8383)在培养皿中共培养。

2.给药：在巨噬细胞培养液中加入浓度为1.56μg/mL的胺碘酮溶液，在5％的CO₂和37℃下继续培养72h。

3.样品处理：使用化学固定法处理给药后的巨噬细胞共培养模型，即采用0.5％的单宁酸和2.5％的戊二醛配制的溶液(用0.08m的二甲砷酸钠调节pH至7)来处理巨噬细胞共培养模型，随后使用环氧树脂包埋。树脂固化后使用显微镜用薄片切片机切成500nm薄片并干燥于硅片表面。

4.电子显微镜成像：采用扫描电子显微镜检测干燥后的薄片，使用2kV的电压、100pA的电流、2.5mm的工作距离显像(如图1中的EM)。

5.二次离子质谱仪分析：在电子显微镜扫描的同一区域使用二次离子质谱仪进行分析：使用16kV的铯离子为离子源、聚焦离子束扫描样品表面，收集了磷元素(³¹P)的信号以及碘元素(¹²⁷I)的信号。结果如图1所示，其中，磷元素(³¹P)的信号能够显示出细胞核，碘元素(¹²⁷I)信号能够显示胺碘酮在细胞中的分布。

二、实验结果：

结果如图1所示，其中，EM为扫描电子显微镜成像图；磷元素(³¹P)为二次离子质谱仪收集的³¹P信号分布图，其能够显示出细胞核的位置；碘元素(¹²⁷I)为二次离子质谱仪收集的¹²⁷I信号分布图，即胺碘酮在细胞中的分布图。将³¹P信号分布图与¹²⁷I信号分布图重合，并结合电镜图片，可知：胺碘酮在巨噬细胞中的主要分布在溶酶体中。

实验例2

一、实验方法

1.构建体外HeLa细胞共培养模型：采用去细胞的天然软组织与HeLa细胞在硅片上共培养。

2.给药：在HeLa细胞培养液中加入浓度为8g/mL的顺铂溶液，在5％的CO2和37℃下继续培养8h。

3.样品处理：使用化学固定法处理给药后的HeLa细胞，即采用2.5％的戊二醛配制的溶液(用0.08m的二甲砷酸钠调节pH至7)来处理HeLa细胞，再采用由低到高浓度的乙醇干燥(30％，50％，70％，90％和100％)。

4.二次离子质谱仪分析：在光镜下选择一些干燥后细胞，使用二次离子质谱仪进行分析：使用16kV的铯为离子源、聚焦离子束扫描样品表面，收集了铂元素(¹⁹⁵Pt)的信号以及磷元素(³¹P)的信号。

二、实验结果：

结果如图2所示，其中，磷元素(³¹P)为二次离子质谱仪收集的³¹P信号分布图，其能够显示出细胞的形貌；铂元素(¹⁹⁵Pt)为二次离子质谱仪收集的¹⁹⁵Pt信号分布图，即顺铂在细胞中的分布图。可知：顺铂在HeLa细胞中的分布广泛，在细胞的各个部位都有。

综上所述，这种用于检测药物分布的分析方法，在对生物样品进行固定处理后，采用二次离子质谱仪对生物组织进行检测，可获知待测药物在各种组织、细胞和亚细胞结构中的分布，实现药物分子在细胞、亚细胞尺度的检测，并可获知待测药物在目标位点的累积情况。由此，该分析方法可广泛使用在检测药物的转运、吸收和代谢的研究中，或在检测药物功效、筛选药物的研究中。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，其包括：

采用固定处理法处理施用待测药物后的生物组织，切片后制得待测样品；随后采用二次离子质谱仪分析所述待测样品。

2.根据权利要求1所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，在给所述生物组织施用的所述待测药物中，含有元素¹³C、¹⁵N、²H、¹⁸O、⁷⁹Br或¹²⁷I。

3.根据权利要求1所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，所述固定处理法包括化学固定法和冷冻固定法。

4.根据权利要求3所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，所述冷冻固定法包括干冰冷冻法、液氮冷冻法、高压冷冻法。

5.根据权利要求3所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，所述化学固定法包括：用化学固定剂处理所述生物组织；优选的，所述化学固定剂包括：戊二醛、多聚甲醛。

6.根据权利要求1所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，所述生物组织包括体外组织模型，所述体外组织模型的构建方法包括：将天然软组织去细胞基质与动物细胞进行体外共培养。

7.根据权利要求1所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，所述分析方法还包括采用显微镜设备与二次离子质谱仪联用检测所述待测样品的步骤。

8.根据权利要求7所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，所述显微镜设备包括光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、原子力探针显微镜。

9.根据权利要求7所述的用于检测药物分布的分析方法，其特征在于，所述显微镜设备为荧光显微镜，该分析方法还包括：在采用固定处理法处理所述生物组织后，再采用荧光染色剂处理所述生物组织。

10.如权利要求1～9任一项所述的分析方法在检测药物的转运、吸收和代谢的应用或在检测药物功效、筛选药物中的应用。