CN102901780A

CN102901780A - 一种在中药、保健食品或化妆品中同时检测七种非法添加减肥类化学成分的方法

Info

Publication number: CN102901780A
Application number: CN201210394033XA
Authority: CN
Inventors: 黎银波; 孟庆玉; 蒋秋桃; 殷帅; 李文莉; 钟庆元
Original assignee: HUNAN INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: HUNAN INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明公开了一种在中药、保健食品或化妆品中同时检测七种非法添加减肥类化学成分的方法。该方法在液相分离时选用了合适的流动相和合理的洗脱梯度，使需要检测的减肥类成分在12min内得到有效分离，使样品仪器分析时间缩短了88%，极大地提高了工作效率。同时结合了HPLC技术的高分离能力与质谱较高的灵敏度与较强的定性能力等优点，可以在一次运行中同时完成筛选和确证。本发明的方法既能使西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黄碱，咖啡因，N,N-双去甲基西布曲明和呋塞米7种化学成分达到有效的分离，又能缩短检验时间，准确有效地甄别中药、保健食品或化妆品中的非法添加减肥类化学成分。

Description

一种在中药、保健食品或化妆品中同时检测七种非法添加减肥类化学成分的方法

技术领域

本发明属于食品药品检测技术领域，具体涉及一种在中药、保健食品或化妆品中同时检测七种非法添加减肥类化学成分的方法。

背景技术

随着人们对健康体重的日益关注，减肥已成为爱美人士的最大话题，各类减肥产品相应而生。一些商家为了使自己的产品具有快速、明显的减肥效果，在健康产品中非法添加具有减肥效果的化学成分（如西布曲明等），这样虽然使产品有了显著的降低体重的效果，但同时对使用者的身体健康会产生危害甚至可能危及生命。因此亟需建立一种快速、准确的分析方法来检测中药、保健食品或化妆品中非法添加的减肥类化学成分。

目前，这些成分的测定方法主要为：1、薄层色谱法（TLC），该方法简便直观，分离时间短，耐“污染”，但分离效率较低，常常有假“阳性”干扰，主要用于初筛；2、高效液相色谱法(HPLC)，该方法的优点是分离性能高，通过比较色谱峰与对照品色谱峰的保留时间及紫外光谱图，可以基本确证是否含有与对照品一致的化学成分，但对于有些同分异构体来说，鉴别仍较困难，而且高效液相色谱法利用光谱图定性易受杂质干扰；3、气相色谱-质谱法(GC-MS)，该方法准确，可靠，但检测成分必须能气化，大大限制了采用一种方法检测多个成分的可能，气相色谱-质谱法只局限于挥发性成分的检测；4、液相色谱-质谱法（HPLC-MS），它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在液相部分经色谱柱分离，质谱部分与流动相分离并被离子化后，在质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。但是，国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件2006004采用液相色谱-质谱法仅对麻黄碱、西布曲明、芬氟拉明三种成分三种成分进行检测；食药监办许[2010]114号文件附件2：减肥类保健食品违法添加药物的检测方法中仅对咖啡因、呋塞米、酚酞、西布曲明、芬氟拉明共5种成分进行检测。也就是说，普通的高效液相-质谱检测目前检测西布曲明、麻黄碱、咖啡因、芬氟拉明、酚酞、呋塞米六种（两标准中有两成分重复，故总的检验成分为6个）减肥类化学成分需要使用两种检测方法，使得样品分析时间成倍增加，耗时较长，两种检验方法所需的检验时间分别长达50分钟。

另外，2010年1月21日,欧洲药品管理局(EMA)建议在欧盟范围内暂停西布曲明上市许可,我国国家食品药品监督管理局于2010年10月30日发布通知停止生产销售使用西布曲明。西布曲明的使用安全越来越受到关注,而它的双去甲基衍生物的使用安全性未见相关研究。若患者在不知情的情况下长期、大量服用添加了西布曲明及其衍生物的减肥类保健食品，极易引起严重的后果。目前，相关部分查处在减肥类保健食品中违禁添加西布曲明化学成分的情况较多，为逃避监管部门的检测，有的不法厂家添加具有更好活性的N,N-双去甲基西布曲明。N,N-双去甲基西布曲明为白色结晶体，是西布曲明的主要活性代谢物品，用量是西布曲明的一半，减肥效果相比西布曲明明显，目前有山东维宜精细化工有限公司等生产。由于没进行安全性评价及临床试验，国内外还未有药品上市。目前对西布曲明去甲基衍生物检测的报道较少,杨春华等采用甲基化西布曲明代谢物的方法测定了西布曲明及其代谢物的总量,陈稚等采用HPLC/ESI-MS单级质谱法测定减肥保健食品中的N,N-双去甲基西布曲明。

因此，开发一种能同时检测西布曲明、麻黄碱、咖啡因、芬氟拉明、酚酞、呋塞米和N,N-双去甲基西布曲明七种减肥类化学成分的方法显得意义深远。

发明内容

本发明旨在克服现有检测方法的不足，提供一种在中药、保健食品或化妆品中同时检测七种非法添加减肥类化学成分的方法，可以准确、快速的检测出西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黄碱，咖啡因，N,N-双去甲基西布曲明，呋塞米7种减肥类化学成分。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述检测中药、保健食品或化妆品中七种非法添加减肥类化学成分的方法是将样品经有机溶剂萃取，超高效液相梯度洗脱分离，三重四级杆质谱检测；通过比较样品峰与对照品峰的保留时间、相对分子质量和二级质谱碎片信息，确定样品中是否非违法添加了减肥类化学成分。

具体包括如下步骤：

（1）将样品用有机溶剂萃取，该步骤为常规的甲醇萃取步骤；

（2）将萃取后的样品溶液注入液质联用仪进行超高效液相梯度洗脱分离和质谱检测；该步骤中，所述液质联用仪为Quattro Premier XE三重四极杆液质联用仪；

其中，所述七种非法添加减肥类化学成分为西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黄碱，咖啡因，N,N-双去甲基西布曲明和呋塞米；

步骤（2）中的色谱条件为：色谱柱为Agilent EC-C18；柱温为30±5℃；进样量为1～10μL；流速为0.2～0.4mL·min^-1；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%的乙酸铵溶液（即质量体积浓度为0.1g/100ml的乙酸铵溶液），以体积百分比计，A+B=100%；梯度洗脱程序为：0～2min，80～90%B；6～8min，10～20%B；10～12min，80～90%B；12min为一个循环，12min后开始下一针进样；

步骤（2）中的质谱条件为：离子源为ESI源；正离子方式（正离子方式是质谱仪上的一种模式，指准离子峰质荷比是在分子量的基础上加一个电荷，如芬氟拉明的分子量为231.3，则其准离子峰质荷比为232.3）检测西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黄碱，咖啡因，N,N-双去甲基西布曲明；负离子方式（负离子方式是质谱仪上的一种模式，指准离子峰质荷比是在分子量的基础上减一个电荷，如呋塞米的分子量为330.1，则其准离子峰质荷比为329.1）检测呋塞米；毛细管电压为3.5±0.5KV；锥孔电压为20～35V；萃取锥孔电压为3±0.5V；聚焦电压为0.1±0.01V；脱溶剂温度为300±50℃；鞘气流速为500～600L·h^-1；碰撞能量为10～35V。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的检测方法同时结合了HPLC技术的高分离能力与质谱较高的灵敏度与较强的定性能力等优点，高效液相色谱-质谱法技术能够对检测目标进行准确地定性、定量，可以在一次运行中同时完成筛选和确证。本发明的核心价值在于液相分离时选用了合适的流动相和合理的洗脱梯度，使需要检测的减肥类成分在12min内得到有效分离，使样品仪器分析时间缩短了88%，极大地提高了工作效率。本实验室近几年的研究数据表明，某些减肥类保健食品中存在添加N,N-双去甲基西布曲明的现象，添加率达5.0%，而现行的国家标准中没有检验该种成分，这可能给不法商人带来可趁之机，给人民群众的生命安全带来隐患，本发明将其列入非法添加检测成分中，有利于加大对非法添加不法行为的打击力度。本发明的测定方法在同一色谱条件下可检验7种非法添加化学成分，不仅克服目前检测西布曲明、麻黄碱、咖啡因、芬氟拉明、酚酞、呋塞米六种减肥类化学成分需要使用两种检测方法的缺点，而且增加了N,N-双去甲基西布曲明的检验，能对检验成分准确定性和定量，缩短了检验时间，提高了检验效率，为打击健康产品中非法添加减肥类化学成分提供科学依据。

总之，本发明建立了一种在中药、保健食品或化妆品中同时检测七种非法添加减肥类化学成分的方法，既能使7种化学成分达到有效的分离，又能缩短检验时间，准确有效地甄别中药、保健食品或化妆品中的非法添加减肥类化学成分。

附图说明

图1为实施例中对照总离子流图；

图2为实施例中对照特征离子流图；

图3为实施例中对照多反应监测离子流图；

图4为实施例中对照碎片离子流图扫描图；

图5为实施例中样品总离子流图；

图6为实施例中样品特征离子流图；

图7为实施例中样品多反应监测离子流图；

图8为实施例中样品碎片离子流图扫描图。

图中：1．麻黄碱；2．咖啡因；3．芬氟拉明；4．N,N-双去甲基西布曲明；5．西布曲明；6．酚酞；7．呋塞米。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

1仪器与试药

美国Waters公司的Quattro Premier XE三重四极杆液质联用仪，ESI电离源；美国Waters公司的超高效液相色谱仪，四元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱及二极管阵列检测器。

盐酸西布曲明、盐酸芬氟拉明、盐酸麻黄碱、酚酞对照品（均来源中国食品药品检定研究院，批号分别为：100624-200401；100073-200002；171241-200506；0091-9601）；咖啡因对照品（来源：USP REFEREN CESTANDAR，批号：J1D241）；N，N-双去甲基西布曲明对照品（来源：LGC，批号：991.03.09.01）；呋塞米对照品（来源：DR.，批号：00820）。水为超纯水，其它试剂均为色谱纯。样品：从市场上购买获得。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent EC-C18（150mm×2.1mm×2.7μm）；柱温：30℃。进样量:5μL；流速：0.3mL·min-1；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%的乙酸铵溶液（即质量体积浓度为0.1g/100ml的乙酸铵溶液），以体积百分比计，A+B=100%；梯度洗脱程序为：0min，10%A，90%B；6min，90%A，10%B；10min，10%A，90%B；12min，10%A，90%B；12min后开始下一针进样。

2.2质谱条件

离子源为ESI源；正离子方式检测：西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黄碱,咖啡因，N,N-双去甲基西布曲明；负离子方式检测：呋塞米；毛细管电压：3.5KV；锥孔电压：21～35V；萃取锥孔电压：3V；聚焦电压：0.1V；脱溶剂温度：300℃；鞘气流速：500L·h-1；碰撞能量：13～35V。

2.3对照品溶液的配制

2.3.1对照品储备溶液的配制分别取盐酸西布曲明、盐酸芬氟拉明、盐酸麻黄碱、酚酞、咖啡因、N,N-双去甲基西布曲明对照品约10mg置50mL容量瓶中，精密称定，以甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。

2.3.2混合对照品溶液的配制取上述对照品储备溶液各1mL置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.4样品处理

2.4.1固体试样取研细，混匀后样品适量（相当于一次服用量），于具塞三角瓶中，精密称定,精密加入50mL甲醇,称重，超声处理30分钟（功率250W，频率33kHz），取出，放冷至室温，用甲醇补重，过滤,作为供试品溶液。

2.4.2液体试样取50mL以上液体试样，混匀，精密吸取10～20mL（相当于一次服用量），减压浓缩至近干，转移至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀,过滤，作为供试品溶液。

2.5样品测定

取供试品溶液和混合对照品溶液各5μL注入液质联用仪，按照上述测定条件进行测定分析。

2.6质谱条件的优化

分别精密量取7种对照品储备溶液1mL，置100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度,摇匀，作为优化质谱条件的对照品溶液。选用ESI离子化模式,通过马达直接进样,进行质谱条件优化。首先,采用一级质谱的扫描方式可得到准分子离子峰,在确定准分子离子的基础上,进行锥孔电压的优化,得到各化学成分的最佳锥孔电压,再用MS/MS碰撞的方式，选择两个以上最佳丰度的子离子作为检测离子并分别确定其相应的最佳碰撞能量。多反应监测(MRM)扫描方式即采用多通道对各化学成分的检测离子在其最佳锥孔电压和碰撞能量的条件下分别进行扫描。7种减肥化学药物的质谱条件优化结果见表1。

表1：

注：1为负离子模式，其余为正离子模式。

2.77种化学药品的谱图特性

按上述条件将对照品溶液测定，混合对照品总离子流图见图1，特征离子流图见图2，多反应监测离子流图见图3，碎片离子流图见图4。

2.8样品检测结果分析

按上述条件将供试品溶液测定，某批保健品供试品总离子流图中色谱峰的保留时间5.70min，6.02min与混合对照品溶液中西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明的色谱峰的保留时间（5.66min，5.98min）基本一致。供试品特征离子流图中，两色谱峰的峰的准分子离子分别为280.52、252.48，也与混合对照品溶液中西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明的准分子离子280.19、252.12基本一致。对该供试品溶液进行多反应离子监测扫描，供试品的保留时间和特征碎片离子（280.20→124.50、152.69；252.20→124.85、153.02）均与对照品（280.06→125.08、153.18；252.13→125.06、153.19）一致，因而可判定该供试品中含有西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明。相应质谱图见图5-8。同理，采用上述液相色谱及质谱条件对进行市场监督检查时购买的50批减肥类保健食品进行了检测，结果其中2批减肥保健食品检出西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明，2批减肥保健食品检出西布曲明、酚酞，3批减肥保健食品只检出西布曲明。

2.9检测限

取混合对照品溶液适量,加甲醇逐步稀释,按上述液质联用条件进行测定,计算信噪比为3时各化学成分的检测限。7种化学成分在MRM方式下的检出限除取决于其本身的性质外,还与离子化的效率有很大相关性，更能准确地反应仪器的性能。7种化合物的检测限均小于1ng，7种减肥化学药物的检测限结果见表2。

表2：

本方法采用超高效液相色谱仪作为分离仪器，最迟出峰成分的保留时间由22分钟缩减为6分钟，极大地提高了工作效率；同时所得峰形比普通高效液相分离的峰形对称性更好。

Claims

1.一种在中药、保健食品或化妆品中同时检测七种非法添加减肥类化学成分的方法，包括如下步骤：

（1）将样品用有机溶剂萃取；

（2）将萃取后的样品溶液注入液质联用仪进行超高效液相梯度洗脱分离和质谱检测；

步骤（2）中的色谱条件为：色谱柱为Agilent EC-C18；柱温为30±5℃；进样量为1～10μL；流速为0.2～0.4mL·min^-1；流动相A为甲醇，流动相B为质量体积浓度为0.1g/100ml的乙酸铵溶液，以体积百分比计，A+B=100%；梯度洗脱程序为：0～2min，80～90%B；6～8min，10～20%B；10～12min，80～90%B；

步骤（2）中的质谱条件为：离子源为ESI源；正离子方式检测西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黄碱，咖啡因，N,N-双去甲基西布曲明；负离子方式检测呋塞米；毛细管电压为3.5±0.5KV；锥孔电压为20～35V；萃取锥孔电压为3±0.5V；聚焦电压为0.1±0.01V；脱溶剂温度为300±50℃；鞘气流速为500～600L·h^-1；碰撞能量为10～35V。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述有机溶剂是甲醇。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述液质联用仪为Quattro PremierXE三重四极杆液质联用仪。