CN104833748A - 一种用于中药药代动力学评价的多组分高通量定量分析技术 - Google Patents

Abstract

本发明属于组分药物分析技术领域。采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)多反应监测(MRM)扫描模式，建立生物体内多组分的定量反应离子，以典型结构类型的代表组分作为“内参比物”，定量分析生物体内的中药原形组分与生物体内代谢产物的浓度，并以中药原形组分与代谢产物制备混合质控样品验证方法并监控分析过程。本发明建立的基于不加校正因子的内参比物多组分高通量分析技术，解决了多组分定量分析缺乏标准对照品的技术障碍，实现仅以少数组分的标准对照品即可对生物样品中可监测中药原形组分及其代谢产物进行多组分的整体定量。采用本技术对中药复方的已知与未知组分及代谢产物进行了多组分整体药代动力学评价。结果表明，本技术符合CFDA的相关技术要求。

Description

一种用于中药药代动力学评价的多组分高通量定量分析技术

技术领域

本发明涉及生物药物分析领域，具体涉及用于评价中药药代动力学的生物样品中多组分同时定量分析的UPLC-MS/MS技术。

背景技术

中药药代动力学是中药药效物质基础研究与阐述的重要手段，是采用现代分析技术测定生物样品中各中药组分的浓度，运用数学原理和模型阐述生物体内中药组分随时间变化的规律，并与中药的临床表征关联以阐释中药的药效物质。传统的中药药代动力学常规方法依照化学药物药代动力学模式，仅仅检测生物样品中极少数可获得标准对照品的指标成分并评价其药代动力学行为特征，但少数指标成分的药动学行为难以阐释整体中药的多组分、多靶点的协同作用机制。因此，中药药效物质的整体药代动力学评价方法亟待建立。但是，中药的药效物质组分复杂、并且其中的大多数难以获得标准对照品，这是中药多组分整体药代动力学评价的技术瓶颈。

为了解决这一技术瓶颈，吉林大学顾景凯等提出了“一种用于多组分中药的药物代谢动力学的分析方法”(中华人民共和国国家知识产权局.发明专利.发明申请号：201010613662.8；申请公布号：CN102175783A)，该方法以原料药为“标准品”，相对定量生物样品中各组分的浓度，并以此评价中药多组分的药动学行为特征，初步解决了在没有标准品的情况下，实现对生物样品中多组分中药进行“相对定量”分析。他们运用该技术以升麻总皂苷原料药为“标准品”，对升麻总皂苷中的14种已知和未知组分进行了药代动力学评价，并对其中3种已知组分与对照品外标法进行了比较，部分药动学参数，如体内滞留时间MRT_0-t、达峰时间T_max和半衰期t_1/2等评价结果一致。

然而，该技术仍然存在2个无法克服的缺陷：①运用该技术测得的数据，仅能够对诸如体内滞留时间MRT(h)、达峰时间T_max(h)和半衰期t_1/2(h)等以时间为单位的药动学参数进行定量评价；而无法评价诸如峰浓度C_max(μg/mL)、曲线下面积AUC(μg/mL*h)、表观分布容积Vd(L/kg)及肾清除率CL(L/kg/h)等多项与浓度或量有关的重要指标；②原料药进入生物体内后可产生I相与II相代谢产物，这些代谢产物常与中药的原形组分具有协同作用，需要同时分析与评价。但该技术仅能够实现对原料药中存在的原形组分的监测，而对于生物体内产生的代谢产物则无法进行监测与评价。

发明内容

为了克服常规方法与上述新技术的缺陷，本发明建立了一种基于不加校正因子的内参比物多组分高通量分析技术，以实现仅需少数标准对照品即可对生物样品中中药的原形组分及其代谢产物进行多组分的同时定量，进而全面评价中药的整体药代动力学特征。具体的技术方案是：

(1)制备一定浓度的中药(单味或复方)提取物溶液(以下称为“原药液”)；

(2)给予实验动物原药液后收集动物尿液(以下称为“尿液”)；

(3)采用液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)多反应监测(MRM)模式，建立原药液与尿液中各组分及代谢产物的离子反应的母离子与子离子等定性定量参数；

(4)建立并验证所选取的内参比物的分析法，包括：内标物、生物样品预处理、内参比物的线性范围与定量限、方法精密度与准确度、回收率与基质效应等；

(5)实验动物给予原药液后按拟定时间点采集生物样品；

(6)依据步骤(3)建立的各组分及代谢产物的分析条件记录各时间点生物样品中各组分的质谱响应信号；

(7)依据步骤(4)建立的各内参比物标准曲线计算步骤(6)获得的各时间点生物样品中各内参比物及其相关组分的浓度；

(8)建立各组分的浓度-时间曲线，并计算药代动力学参数；

(9)经与药效动力学的生物效应-时间曲线拟合，评价各组分的PK-PD相关性；

(10)将各组分的浓度通过数学模型“整合”后，以“整合”浓度与药效动力学的生物效应响应拟合，最终评价并验证中药的药效物质及其作用机制。

所述的中药为植物性中药材、中成复方及中药的各种现代剂型。所述的中药溶液为用中药制成的供口服或注射用的溶液。所述的给予优选经灌胃或静脉注射给予。所述的实验动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬。所述的生物样品优选动物血清、血浆。所述的动物排泄物优选动物尿液、粪便。所述的现代分析技术优选液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，其中液相色谱优选高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC或Ultra-HPLC)。所述的分析条件优选选择离子监测模式(SIM)的特征离子、多反应离子监测模式(MRM)模式的反应离子对。所述的原形组分为中药中存在的可监测的已知与未知组分。所述的代谢产物为中药在动物体内经I相与II相代谢所产生的I相代谢物与II相代谢物。所述的内参比物为一类具有共同结构特征的系列化合物的典型结构化合物。所述的相关组分为与内参比物具有共同结构特征的同类系列化合物。所述的计算为使用内参比物的标准曲线计算包括内参比物在内的具有共同结构特征的同类系列化合物的浓度。

本发明还提供了基于权利要求1的方法原理编制的数据采集与处理程序。所述的数据为检测的质谱信号以及由此衍生出来的生物样品中各组分浓度、整合组分浓度、中药药代动力学参数。所述的整合组分浓度为生物样品中各效应组分浓度经一定的数学模型整合的表观效应浓度。所述的效应组分为与生物效应存在相关性(包括正相关和负相关)的可检测组分。所述的表观效应浓度为所有可检测效应组分的综合浓度。所述的数学模型包括但不限于以下数学公式：

$\mathrm{Ln}{C^{,}}_i=\underset{j=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\left[k_j\mathrm{Ln}{C}_{\mathrm{ij}}\right]$

式中，C’_i为第i个时间点生物样品中效应组分的“表观效应浓度”；C_ij为第i个时间点生物样品中第j个效应组分的浓度；k_j为第j个效应组分PK-PD拟合曲线的斜率。正相关时符号不变，当负相关时符号相反。所述的正相关为组分浓度变化趋势与效应指标的变化趋势一致；所述的负相关为组分浓度变化趋势与效应指标的变化趋势相反。

本发明具有以下特点：

(1)以典型结构类型的少数组分为内参比物，采用不加校正因子的内参比物法计算各相关组分的浓度，实现仅需少数标准对照品即可对中药的原形组分及其代谢产物进行多组分整体定量，实现中药多组分的整体药代动力学评价。

(2)所采用的UPLC-MS/MS技术具有特异性强、灵敏度高与超快速的特点，可实现同时对生物样品中多组分的高通量快速定性定量，可满足中药或中药制剂的临床前或临床整体药代动力学评价的需要。

(3)通过整体药代动力学-药效动力学(CPK-PD)相关性评价模型，可实现中药药效物质的筛选与评价，为新的中药复方制剂的研究与开发以及临床安全与合理用药提供技术平台与数据支持。

本发明的优点在于解决了中药的初始组分及其代谢产物的多组分整体高通量定性定量监测的技术瓶颈，弥补了传统的中药药代动力学评价缺陷。

附图说明

图1是给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后急性血瘀模型大鼠血浆中44个指标成分〔包括4个内参照物：葛根素(峰12)、大豆苷(峰19)、人参皂苷Rg1(峰39)和人参皂苷Rb1(峰52)〕与2个内标物〔黄芩苷(20:峰baicalin)和地高辛(29:峰digoxin)〕的UPLC-MS/MS图（（1）-（13））。

图2是给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后急性血瘀模型大鼠血浆中44个指标成分〔包括4个内参照物：葛根素(峰12)、大豆苷(峰19)、人参皂苷Rg1(峰39)和人参皂苷Rb1(峰52)〕与2个内标物〔黄芩苷(20:峰baicalin)和地高辛(29:峰digoxin)〕的UPLC-MS/MS图（（14）-（26））。

图3是给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后急性血瘀模型大鼠血浆中44个指标成分〔包括4个内参照物：葛根素(峰12)、大豆苷(峰19)、人参皂苷Rg1(峰39)和人参皂苷Rb1(峰52)〕与2个内标物〔黄芩苷(20:峰baicalin)和地高辛(29:峰digoxin)〕的UPLC-MS/MS图（（27）-（39））。

图4是给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后血瘀模型大鼠血浆中44个指标成分的整体组合浓度-时间曲线(A:与大鼠全血粘度相关；B:与大鼠血清粘度相关)。

图5是给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后血瘀模型大鼠血浆中44个指标成分的整体组合血浆浓度-血液粘度相关曲线(A:与大鼠全血粘度相关；B:与大鼠血浆粘度相关)。

具体实施方式

实施例一、三七总皂苷配伍葛根总黄酮在血瘀模型大鼠体内整体药代动力学评价

1溶液的制备

1.1给药溶液的制备

取三七总皂苷与葛根总黄酮，用0.9%氯化钠溶液制成每1ml中含三七总皂苷10mg与葛根总黄酮20mg的溶液。

1.2药物代谢物溶液的制备

健康Wistar大鼠，按5mL/kg剂量给予葛根总黄酮溶液(65.6mg/mL)，于给药后2～4h采集尿液，离心，取上清液即得(含葛根素1.66mg/mL、大豆苷0.130mg/mL)。

2生物样品中移行成分的结构分析

2.1色谱/质谱条件

色谱柱：Capcell pak MG C₁₈色谱柱(3.0mm×7.5cm,3.0μm)；柱温：35℃；流动相A(2mM醋酸铵溶液)-B(乙腈)，梯度洗脱，流速0.75mL/min，分流比2:3；电喷雾离子源(ESI)；正离子模式下的SIM与MRM检测。

2.2生物样品的预处理

血浆样品400μL，加0.1%甲酸乙腈溶液800μL，涡旋混合2min，于4℃下15000r/min离心15min，分离上清液，于35℃下氮气流吹干，残渣加入甲醇-水(1:1)100μL复溶，并于4℃下15000r/min离心15min，取上清液10μL进样分析。

2.3生物样品中移行成分的结构分析

大鼠给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮(2.7mL/kg)后，经上述方法分析，根据一级质谱的准分子离子[M+H]⁺/[M+Na]⁺峰与二级质谱的子离子碎片峰，并与对照品对照确定或与文献数据比较推测血浆中移行成分(峰序编号)如下：葛根素-4’/7-O-葡萄糖醛酸结合物(M1)、葛根素-4’/7-O-硫酸结合物(M2)、3’-甲氧基葛根素-4’/7-O-硫酸结合物(M3)、6”-O-木糖基-4’/7-O-硫酸结合物(M4)、大豆苷-4’/7-O-硫酸结合物(M5)、葛根素芹菜糖苷-4’/7-O-硫酸结合物(M6)、3’-甲氧基大豆苷-4’/7-O-硫酸结合物(M7)、大豆苷元-4’/7-O-葡萄糖醛酸结合物(M8)、大豆苷元-4’/7-O-硫酸结合物(M9)、葛根素-7-O-葡萄糖苷(1)、葛根素-3’-羟基-4’-O-葡萄糖苷(2)、葛根素-4’-O-葡萄糖苷(3)、葛根素-3’-甲氧基-4’-O-葡萄糖苷(4)、大豆苷元-4’,7-O-葡萄糖苷(8)、大豆苷元-3’-羟基-4’,7-O-葡萄糖苷(13)、3’-甲氧基-6”-O-木糖/芹菜糖基葛根素(18)、3’-甲氧基-6”-O-木糖/芹菜糖基大豆苷(36)、大豆苷元-3’-甲氧基-4’,7-O-葡萄糖苷(9)、3’-羟基葛根素(6)、染料木苷(31)、葛根素芹菜糖基-4’-O-葡萄糖苷(7)、3’-羟基-6”-O-木糖基葛根素(10)、3’-羟基-葛根素芹菜糖苷(11)、葛根素(12)、3’-甲氧基葛根素(14)、6”-O-木糖基葛根素(15)、葛根素芹菜糖苷(16)、大豆苷(19)、染料木素-8-C-(6”-O-木糖基)-葡萄糖苷(20)、染料木素-8-C-(6”-O-芹菜糖基)-葡萄糖苷(22)、未知化合物①(23)、大豆苷元-4’-O-葡萄糖苷(24)、染料木素-8-C-葡萄糖苷(25)、未知化合物②(26)、未知化合物③(27)、大豆苷元-3’-羟基-7-O-(6”-O-木糖/芹菜糖基)-葡萄糖苷(28)、芒柄花素-8-C-(6”-O-木糖基)-葡萄糖苷(29)、芒柄花素-8-C-(6”-O-芹菜糖基)-葡萄糖苷(30)、未知化合物III(34)、未知化合物④(35)、三七皂苷R₁(37)、人参皂Rg₁(39)、大豆苷元(40)、人参皂苷Re(41)、毛蕊异黄酮(43)、未知化合物IV(45)、未知化合物V(46)、未知化合物VII(48)、未知化合物IX(50)、未知化合物VIII(49)、未知化合物X(51)、人参皂苷Rb₁(52)、七叶胆苷-XII(53)、人参皂苷Rg₂(54)、三七皂苷Fc/人参皂苷Ra₁/Ra₂(55)、人参皂苷Rb₂/Rb₃(56)、人参皂苷Rd(58)、人参皂苷Rd异构体(59)、人参皂苷F₂(60)、20(S)-人参皂苷Rg₃(61)、人参皂苷Rk₁(63)和人参皂苷Rg₅(64)。

3生物样品中指标成分的定量分析

3.1生物样品的预处理

血浆样品500μL，加甲醇-水(1:4)100μL、内标溶液50μL，涡旋混合1min，加10%VC溶液10μL与0.1%甲酸乙腈溶液1000μL，涡旋混合2min，于4℃下15000r/min离心15min，分离上清液，于35℃下氮气流吹干，残渣加甲醇-水(1:4)100μL，超声溶解1min，涡旋混合2min，于4℃下15000r/min离心15min，取上清液10μL进样分析。

3.2色谱/质谱条件

色谱柱：Capcell pak MG C₁₈色谱柱(3.0mm×7.5cm,3.0μm)；柱温：35℃；流动相A(2mM醋酸铵溶液)-B(乙腈)，梯度洗脱，流速0.75mL/min，分流比2:3；电喷雾离子源(ESI)；采用正离子模式下的MRM检测；44个指标成分及内标物的定量参数见表1；UPLC-MS/MS色谱图见图1-3。

表1.44个指标成分及内标物的UPLC-MS/MS定量分析MRM参数

3.3内参比物UPLC-MS/MS分析

3.3.1内参比物

根据各组分的结构归属，给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后，采集给药后2h的血浆样品，照“3.1”条下方法处理后照“3.2”条下色谱/质谱条件检测，大鼠血浆中可定量(S/N＞10)的44个指标成分可分为4大类：

碳苷型葛根异黄酮类包括：峰12(葛根素)、M2、M3、6、14、40；

氧苷型葛根异黄酮类包括：峰19(大豆苷)、M1、M5、M6、M8、M9、M10、3、15、16、18、22、8、9、24、23、29、30；

原人参二醇型人参皂苷类包括：峰52(人参皂苷Rb1)、46、48、50、53、55、56、58、59、60、61；

原人参三醇型人参皂苷类包括：峰39(人参皂苷Rg1)、34、37、41、45、49、51、54、64。

选择葛根素、大豆苷、人参皂苷Rb₁和人参皂苷Rg₁作为内参比物。

3.3.2内参比物标准溶液的制备

精密称取内参比物葛根素、大豆苷、人参皂苷Rb₁和人参皂苷Rg₁各适量，用甲醇分别制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液；精密量取各标准储备液适量，用甲醇-水(1:4)逐级稀释制成系列标准溶液(葛根素0.4～120μg/mL、大豆苷0.01～30μg/mL、人参皂苷Rb₁0.03～90μg/mL和人参皂苷Rg₁0.02～60μg/mL)。

3.3.3内参比物QC溶液的制备

精密量取各标准储备液适量，用甲醇-水(1:4)稀释制成高、中、低三个浓度的内参比物QC溶液。

3.3.4混合QC溶液的制备

精密量取药物代谢物溶液适量，精密加入三七总皂苷标准溶液〔2.0mg/mL，甲醇-水(1:1)〕适量，用甲醇-水(1:4)稀释成系列混合QC(m-QC)溶液。

3.3.5内标溶液的制备

精密称取黄芩苷(葛根异黄酮类组分测定的内标物)和地高辛(人参皂苷类组分测定的内标物)各适量，分别用甲醇制成浓度为0.20mg/mL的内标储备液；精密量取各内标储备液适量，用甲醇稀释制成内标溶液(含黄芩苷40μg/mL、地高辛25μg/mL)。

3.3.5标准曲线的与定量下限

以血浆中内参比物的浓度为横坐标(x)，内参比物与内标物的峰面积比值为纵坐标(y)，用加权最小二乘法进行线性回归，权重系数1/x²计算，4个内参比物的标准曲线回归方程、相关系数(r)、线性范围与定量下限(LLOQ)见表2。

表2.4种内参比物的线性范围与定量下限

3.3.6精密度与准确度

取空白血浆，精密加入内参比物QC溶液适量，制备QC3(高)、QC2(中)、QC1(低)三个系列浓度的QC样品，每个浓度5样本，连续分析3天，根据标准曲线，计算各QC样品中内参比物的测得浓度，验证葛根素、大豆苷、人参皂苷Rb₁和人参皂苷Rg₁测定的准确度与精密度。结果符合CFDA关于生物样品分析的要求。

取空白血浆，精密加入混合QC溶液适量，制备mix-QC5、mix-QC4、mix-QC3、mix-QC2、mix-QC1五个系列浓度的混合QC样品，每个浓度3样本，用于除内参比物(葛根素、大豆苷、人参皂苷Rb₁和人参皂苷Rg₁)外的其他相关成分的精密度验证。每个色谱峰选取相应的高、中、低三浓度，以峰面积用各相应的内参比物标准曲线计算，进行方差分析，验证相关成分测定的精密度，结果符合CFDA关于生物样品分析的要求。

4.药代动力学评价

4.1生物样品采集

雄性Wistar大鼠，随机分为1.0～6.0h共9个时间组，于急性血瘀模型造模18h后给予三七总皂苷(27mg/kg)配伍葛根总黄酮(54mg/kg)。按各组所示时间点取血，制备血浆，于-80℃冷冻备用。

4.2血浆样品中多组分高通量分析

取“4.1”条下采集的血浆样品，照“3.3”条下方法对血浆中44个移行成分进行同步高通量分析。急性血瘀证模型大鼠给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后，血浆中44个移行成分的血药浓度分析结果见表3。

表3.44个色谱峰血浆浓度

4.3多组分定量组合与整体组合药代动力学

将上述各时间点44个指标成分的浓度用数学模型整合后，“整合”血浆浓度-时间曲线见图4。

4.4.CPK-PD相关性评价

将上述44个成分的“整合”血浆浓度-时间曲线与血液黏度-时间曲线进行相关分析，相关曲线见图5。

综上所述，采用基于不加校正因子内参比法的UPLC-MS/MS高通量分析技术进行中药整体药代动力学评价是可行的。

Claims (10)

1.一种用于中药药代动力学评价的多组分高通量分析方法，具有以下步骤：

制备一定浓度的供口服或注射用的中药溶液；

经灌胃或静脉注射给予实验动物由步骤(1)制备的溶液后收集动物尿液或粪便排泄物，并制成相应的溶液；

采用液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等现代分析技术，建立由步骤(1)与步骤(2)制备的溶液中所含的中药原形组分及其已知或未知I相或II相代谢产物的定性定量参数；

采用由步骤(3)建立的组分分析条件，建立并验证所选取的内参比物的分析方法，包括：生物样品预处理、内参比物的线性范围与定量限、方法精密度与准确度、回收率与基质效应等；

给予实验动物由步骤(1)制备的溶液后按拟定时间点采集生物血清、血浆样品；

采用由步骤(3)建立的分析条件，检测并记录各时间点生物样品中各组分的质谱响应信号；采用步骤(4)建立的方法计算各内参比物及其相关组分的浓度；建立各组分的浓度-时间曲线，并计算药代动力学参数。

2.一种中药药代动力学评价软件，其特征在于：基于权利要求1的方法原理编制的数据采集与处理程序。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的中药为植物性中药材、中成复方及中药的各种现代剂型。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的实验动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的内参比物为一类具有共同结构特征的系列化合物的典型结构化合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的计算为使用内参比物的标准曲线计算包括内参比物在内的具有共同结构特征的同类系列化合物的浓度。

7.根据权利要求2所述的软件，其特征在于：所述的数据为检测的质谱信号以及由此衍生出来的生物样品中各组分浓度、整合组分浓度、中药药代动力学参数。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的整合组分浓度为生物样品中各效应组分浓度经一定的数学模型整合的表观效应浓度。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的表观效应浓度为所有可检测效应组分的综合浓度。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的数学模型包括但不限于以下数学公式：

LnC’_i=                                               

式中，C’ _i为第i个时间点生物样品中效应组分的“表观效应浓度”；C _ij为第i个时间点生物样品中第j个效应组分的浓度；k _j为第j个效应组分PK-PD拟合曲线的斜率，正相关时符号不变，当负相关时符号相反。