CN108693002B - 一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析检测技术领域，涉及一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置。所述模拟生物组织薄片，形态规则、尺寸可控，主要由生物组织材料和组织细胞两部分组成，并含有已知量的目标分子，可以理想地模拟真实生物组织切片的基质。所述制备方法快速简便，可重复性高。所述模拟生物组织标准薄片制备装置，可以实现模拟生物组织自动化制备。本发明所制备的模拟生物组织薄片，为药物、诊断标志物等目标分子的定量质谱成像分析和质谱高通量快速检测提供了一种稳定、可控的标准生物组织样品。在临床前药物研发、临床疾病诊断领域具有重要应用价值。

Description

一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置，应用于定量质谱成像分析及质谱快速检测。

技术背景

质谱成像技术是一种基于质谱分析，对待测样品(多为生物组织)表面上的多种分子按空间位置进行检测、获取其质荷比强度与位置关系并形成多维数据，通过数据处理与软件重构对离子强度进行图像可视化，最终实现多分子的同时检测并显示其空间分布的分子影像技术。它无需放射性同位素、荧光或免疫标记，可以直接获得如细胞、组织等生物样本表面的复杂基质中多肽、蛋白质、脂类、药物及其它小分子代谢物等多种内源性和外源性化合物的类型、含量和空间分布信息。在新药研发、疾病分子诊断等生命科学研究领域具有巨大的应用前景。

生物组织切片作为临床诊断、药物研发等领域重要的检测样本，其组织形态及内含的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等不同类别的化学成分，不仅可以为癌症等疾病的分期、分型诊断提供依据，还可以反映受试药物对病变组织的修复(疗效)或器质性损伤(毒性)等情况。以生物组织切片作为研究对象，通过质谱成像技术进行疾病诊断或药物的药效与毒性评价时，目标分子(疾病诊断标志物、候选药物等)的含量信息与疾病发生、发展进程、以及药物的药效与毒性作用直接相关。然而，受组织基质效应的影响，单纯以目标分子的离子信号强弱并不能准确反映其绝对含量信息。因此，需要构建一种目标分子含量可控且均质化的模拟生物组织，为实际生物组织切片中目标分子的绝对定量检测提供一种参照样品。一种理想的定量用模拟生物组织薄片，应具有如下特点：(1)组织结构应具有“均质性”，其目标分子和内源性成分应呈均匀分布；(2)尽可能真实模拟目标分子与生物组织之间的相互作用；(3)生物组织尺寸规则，组织密度和目标成分含量准确可控；(4)模拟组织制备方法稳定、重复性好，精密度高。

如何构造一种目标分子掺入量可控且接近于实际生物组织的模拟参照样品，是定量分析生物组织表面目标分子的关键问题与难点。目前，在生物组织内目标成分的定量分析方法研究中，主要基于“组织匀浆混合”(in-tissue strategy)和“组织表层添加”(on-tissue strategy)两种策略来构建含目标分子的模拟生物组织，前者主要是将外源性目标分子掺入到经分散处理的组织匀浆液中，再制备冰冻切片的方法实现；后者又分为滴加法和喷涂法：滴加法采用口径极细的微量移液枪将不同浓度的目标分子滴加至组织表面不同区域；喷涂法采用一种商品化的基质喷涂器将稳定同位素标记的目标分子作为内标，均匀喷涂于组织样品表面。然而，上述制备方案均有不足之处：使用匀浆切片法制备模拟组织，匀浆组织冰冻块的质地松软易碎，不易切制，样本间切片形状、面积难以一致，且在组织匀浆的过程中细胞破损率极高，难以模拟目标分子与实际组织之间的相互作用；采用微量移液枪将目标分子滴加于组织表面的方法，并不适用于微小尺寸的组织样本，且目标分子滴加到哪一个器官层面、组织微区完全由操作者选择，而不同组织区域的特异性基质效应对目标分子的影响并不相同，因此难以保证不同批次样本之间的结果平行性；均匀喷涂的方法虽能保证目标分子的均匀涂布，但由于目标分子分布于生物组织切片的表层，并未完全深透至组织深层，组织基质效应对于其信号响应强度的影响明显低于实际生物样品对目标分子的影响。

针对上述模拟组织样品制备方法的不足，本发明采用“分级平行处理-混合重构”的策略，将构成生物组织的核心要素：细胞、胞外间质成分、天然高分子骨架系统(如纤维蛋白、胶原蛋白、层黏蛋白等)，重新整合为一个与实际生物组织的分子组成类似的模拟生物组织。该方法既能有效地避免匀浆均质化操作造成的细胞破损现象，又可以实现相同的组织均质化效果。制备出的一系列目标分子含量已知的模拟生物组织样品，在组织形态学、组织密度、与目标化合物分子的相互作用等方面与实际生物组织切片无统计学上的显著性差异，因此可用于对生物组织切片样本中目标化合物分子的定量检测分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种目标分子含量可控、均匀分布的模拟生物组织薄片及其制备方法和应用，为准确阐明目标分子在不同生物组织中的含量与其离子信号强弱之间的量化关系提供标准参照。此模拟生物组织薄片样品可应用于对生物组织切片样本中目标化合物分子进行定量检测分析。

本发明解决的技术问题之二是提供一种制备模拟生物组织薄片的装置。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了模拟生物组织薄片的制备方法，主要包括以下步骤：

(i)赋形膜材的加工：选取适宜高分子聚合物材料刻制塑形用模具，确定模拟生物组织的形状、尺寸以及样本布局；

(ii)含化合物的水性分散介质的制备：向水性介质中加入适量已知浓度的标准化合物溶液，超声除去水性分散介质中的气泡，待用；

(iii)组织料液的制备：将生物组织的分散处理，确定生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比，使团块状的生物组织样品转为均匀分散的生物组织料液，以确保沉积形成的模拟组织在组织形态、组织密度一致；

(iv)细胞悬液的制备：采用细胞筛分、分级的方法制备的完整的离体细胞，并采用水性分散介质配制成一定浓度的细胞悬液；

(v)组织料液与细胞悬液的混合：将组织料液与细胞悬液按一定比例充分混合；

(vi)混合液的共沉积：准确吸取一定体积的组织料液与细胞悬液混合液，采取手动点样或自动化点样的方式，将混合液加载于贴有赋形膜材的载体底物上，使组织成分、细胞、目标分子在沉积的过程中完成塑形处理；

(vii)模拟组织的固定成型：通过常温自然干燥、常温减压干燥或惰性干燥气流通干燥的方式，除去模拟生物组织中的水分，使模拟组织薄片与载体底物粘贴紧密。

其中，所述模拟生物组织薄片，主要包括生物组织材料和组织细胞，并含有已知量的标准化合物分子。

其中，(i)项中所述赋形膜材以低通透性的粘性薄膜作为膜材；赋形膜材的加工，采用机械切割或激光刻蚀方式实现。

其中，(i)项中所述赋形膜材主要用于限定模拟组织样本的形态、尺寸及厚度，该赋形膜材尺寸可根据具体实验需要而准确刻制，单个样本呈规则矩形或正方形，或制作成多样本槽阵列模式。

其中，(i)项中所述水性分散介质包括超纯水、等渗生理盐水、磷酸盐缓冲液、含天然高分子的水凝胶溶液，所述的天然高分子包括胶原蛋白或纤维蛋白。

其中，(iii)项中所述组织料液的制备是将组织细胞与细胞间隙组织预先通过细胞筛分、分级方式进行物理分离，组织细胞经过纯化、富集，液氮冻存，待临用时重新分散至适宜浓度。

其中，(iii)项所述的确定生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比，是根据被模拟的实际组织切片的组织密度大小而进行优化调整的；根据被模拟的器官组织的不同，其组织匀浆浓度参考范围见表1所示。

表1实际组织切片的组织密度与组织匀浆浓度参考范围

注1：上述各器官组织的组织密度参考范围基于切片厚度在8～40μm内确定

注2：组织匀浆的沉积体积为5μL，模型组织薄片面积为10mm²

最优选的模拟生物组织薄片的制备方法包括如下步骤：

(1)赋形膜材的加工

以高分子聚合物粘性薄膜作为模拟生物组织薄片的赋形膜材，采用高精度数控机器通过机械切割或激光刻蚀方式加工赋形模板。

进一步地，根据具体实验需要，准确设计模板框的外型及尺寸，单个样本呈规则矩形或正方形，一般尺寸在2.0～10.0mm²。用于生物组织内目标分子的定量标准曲线建立，每行刻制5～7个矩形槽。用于大批量组织样本的快速定量筛查，可加工制作成多样本槽阵列模式如5×5、10×10样本。

进一步地，待使用时，将刻制的高分子聚合物模板框撕去背面保护膜，粘性一侧加少量超纯水浸润、干燥后，再粘贴至载体底物(例如正电荷防脱载玻片)上，形成模拟生物组织薄片的矩形模具。

(2)水性分散介质的制备

水性分散介质包括超纯水、等渗生理盐水、磷酸盐缓冲液、天然高分子(如含胶原蛋白、纤维蛋白、层黏蛋白)构成的水凝胶溶液。根据所目标分子的性质，结合所选实际器官或组织的组成成分特点，选取适当的分散介质，向水性介质中加入一定浓度的目标分子或内标溶液，超声除去水性分散介质中的气泡。

(3)组织料液浓度的优选

根据所选取的具体脏器、组织的不同(例如心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、脑、实体瘤组织、食管组织)，结合实际切片的厚度(一般多为8～40μm)，应使生物组织匀浆浓度控制在30～500mg/mL范围内，生物组织密度(单位面积内生物组织的质量)控制在2～20μg/mm²范围。

进一步地，建立不同匀浆浓度与组织密度之间的量化回归曲线，准确确定与一定厚度的某器官或组织切片相等效的组织匀浆沉积量。

(4)生物组织的分散处理

取新鲜的生物组织，称重后剪碎，加少量生理盐水，搅拌分散，采用150-200目细胞筛滤过。

截留的上层生物组织碎屑，按照步骤(3)“生物组织匀浆浓度的优选”下确定的适宜比例加入水性介质和已知浓度的微量药物溶液，进行组织匀浆操作，制成生物组织料液(简称“组织料液”)。

(5)细胞悬液的制备

收集步骤(4)过滤得到的细胞悬液于离心管中，更进一步地，可用更多的水性分散介质，反复步骤(4)中滤过步骤，以收集更多的游离细胞。

当细胞收集至一定数量后，将细胞悬液低温离心5-10min(10℃)，弃去上清液，取一定体积的胎牛血清(含10％二甲亚砜)作为细胞冻存液，将沉积于离心管底层的细胞重新吹散后分装，于液氮罐中低温保存。待用时复苏，根据实际生物组织的细胞密度稀释成适宜浓度的细胞悬液。

(6)组织料液与细胞悬液的混合

根据所需模拟的器官或组织切片中的细胞密度与组织密度，将收集的细胞悬液与组织料液按照一定比例充分混匀，重新调制成模拟生物组织混合液。

(7)混合液的共沉积

微量移液枪准确吸取2.0～5.0μL预混合充分的模拟生物组织液，均匀涂布于载体底物与赋形膜材形成的矩形凹槽内，使组织成分、细胞、目标分子在沉积的过程中完成塑形处理。

(8)模拟组织的固定成型

模拟组织通过干燥处理如常温自然干燥、常温减压干燥、惰性干燥气流通干燥，除去模拟生物组织中的水分，使模拟组织与载体底物粘贴紧密。待干燥后去除底物载体上的赋形膜材，即完成含药模拟生物组织薄片的制备。

本发明技术方案的第二方面是提供了第一方面制备方法制备得到的模拟生物组织薄片主要组成包括：

(i)确定添加量的标准化合物分子；

(ii)来源于被模拟器官或组织的生物组织材料、组织细胞。

其中，(i)项所述的标准化合物分子，选自生物大分子，或生物内源性小分子代谢物，或外源性添加物；所述的生物大分子包括蛋白质、多肽、多糖，所述的生物内源性小分子代谢物包括脂类、氨基酸、脂肪酸、寡糖、单糖、核苷，所述的外源性添加物包括化学合成药物及其代谢产物、中药草天然产物。

其中，(ii)项所述的生物组织材料，指来源于某脏器或组织，起到支撑、缓冲、保护作用的细胞间质成分，所述生物组织材料包括纤维蛋白、胶原蛋白、层黏蛋白。

其中，(ii)项所述的组织细胞，指来源于某一特定器官或组织，经过细胞筛选、分级后制备得到的细胞或不同类别细胞的集合。

其中，(ii)项所述的被模拟器官或组织，包括临床前实验动物来源的实质性脏器，或空腔脏器或异体移植实体瘤组织；所述实质性脏器包括心、脑、肾、肝、脾、肺、胸腺，所述空前脏器如食管、胃、小肠、大肠。

最优选的模拟生物组织薄片，其组织密度的确定方法如下：

(i)根据具体生物组织及其实际切片厚度的不同，控制生物组织匀浆浓度在100～1000mg/mL范围内；

(ii)以组织密度(单位面积内组织质量，μg/mm²)、质谱采集范围内的总离子流强度、平均质谱图相似度等，作为模拟组织薄片与真实组织切片一致性的量化评价指标；

(iii)建立不同匀浆浓度与组织密度之间的量化回归曲线，准确确定某种器官组织的一定厚度切片相等效的组织匀浆沉积量，实际组织切片的组织密度与组织匀浆浓度参考范围见表1。

其中，(i)项中所述具体生物组织及其实际切片厚度，其组织密度参考范围见表2。

表2不同厚度实际组织切片的组织密度

其中，(iii)项中所述不同匀浆浓度与组织密度之间的量化回归曲线，如表3所示。

表3匀浆浓度(X)与组织密度(Y)之间的量化关系

注1：匀浆浓度范围为100-800mg/mL，匀浆组织涂布量为5.0μL，模拟组织面积均为10mm²

注2：Y代表生物组织密度(μg/mm²)，X代表生物组织匀浆浓度(mg/mL)

最优选的模拟生物组织薄片，其相似性评价方法如下：

为评价模拟生物组织薄片与实际组织切片的相似程度，并尽可能地模拟生物组织对于目标分子的解吸离子化抑制行为。首先，以模拟生物组织薄片在光学显微镜下的组织形态学特点，作为与真实组织切片相似性比较的定性指标。

更进一步地，采用质谱成像分析技术，以质谱采集范围内的总离子流强度值(TIC)、平均质谱图轮廓相似度、生物组织密度、目标分子的组织提取系数(TEC)，作为模拟生物组织薄片与真实组织切片一致性的量化评价指标。

本发明所制定的模拟生物组织薄片与真实组织切片的相似性量化评价限度值，反映了对数据采集最终结果的变异控制，包含本发明所涉及的模拟生物组织薄片制备方法重复性、以及所采用质谱成像系统信号波动因素的影响。

相似性量化指标初步制定如下：

(i)总离子流强度控制：相同质谱条件下，模拟生物组织薄片与相应的实际组织切片采集得到的两张平均质谱图，其TIC值的相对偏差应不大于±20％；

(ii)高丰度共有峰控制：模拟组织薄片与实际组织切片采集的平均质谱图中的共有峰应基本相同，所述共有峰不包括载体本底离子、喷雾溶剂离子及其同位素离子或加合离子。所述两张平均质谱图中的某一质荷比离子是否为同一离子，是指在高分辨质谱仪所采集的数据中，相对误差不大于5.0ppm的两个离子，且其同位素峰的相对丰度及质荷比偏差也应在质谱仪性能所能达到的范围内。所述基本相同，是指两张图谱中共有峰占总峰数的百分比，应不低于90％；

(iii)整体质谱轮廓相似度控制：以皮尔逊相关系数(Pearson correlationcoefficient)或夹角余弦值(Cosine)作为测度，评价两张平均质谱图的相似度，其测度值不应低于0.80；

(iv)生物组织密度控制：精密电子天平(十万分之一)通过差重法计算模拟组织薄片及实际组织切片的质量；采用图像处理软件对光学图像下，样本区域内的像素数求和，经过像素尺寸与标尺间的比例换算，折算出组织切片的面积，进而求算生物组织密度值，模拟生物组织薄片与实际生物组织薄片各取5份，计算生物组织密度，经独立样本t检验，应无显著性差异，即P>0.05；

(v)组织提取系数控制：所述组织提取系数(TEC)，是以相同物质的量的目标分子作用在载玻片上产生的解吸离子化强度值(I_on-slide)，与其作用在组织表面上的解吸离子化强度值(I_on-tissue)的比值。将模拟组织薄片的TEC_model，实际组织切片得到的TEC_native值，经独立样本t检验，应无显著性差异，即P>0.05。

最优选的模拟生物组织薄片，其质量控制方法如下：

为实现本发明所涉及的模拟生物组织薄片的制备方法稳定可控，本发明制定了关于模拟生物组织薄片制备方法的方法学验证指标及限度值，所述指标及限度值，是结合了采用的空气动力辅助离子化接口稳定性、质谱仪固有的检测信号随机波动因素后，所能实际达到的对数据采集结果的变异控制。主要包括如下三项：

(i)均匀性：模拟生物组织薄片区域内的目标分子，应尽可能地呈均匀分布，像素点间信号强度变异(inter-pixel variance)应小于30％。对模拟生物组织薄片区域内各个像素点的目标分子信号强度作直方图和正态拟合，信号强度分布应呈正态或近似正态分布，即峰态系数(kurtosis,k)的绝对值应趋近于3.0，偏态系数值(skewness,s)应趋近于0.0；

(ii)精密度：在连续三个分析周期内，每个周期平行制备含有低、中、高三个含量水平目标分子的模拟生物组织薄片各5份。对目标分子进行质谱成像数据采集，以目标分子在各薄片区域内的平均信号强度，作批间/批内精密度(inter-batch/intra-batchprecision,RSD％)计算，其RSD％值不得大于15％。所述分析周期，是指能够保证质谱成像系统性能、模拟组织样品稳定的一段时间周期内；

(iii)线性：模拟生物组织中的目标分子的量，应与该目标分子的信号强度之间呈现理想的线性关系。采用最小二乘法或加权最小二乘法进行回归曲线的拟合，如果以目标分子的原始响应信号强度对目标分子的量作回归拟合，其回归系数应不小于0.90；如果以目标分子经内标或总离子流归一化校正后的信号强度，对目标分子的量作回归拟合，其回归系数应不小于0.95。

本发明技术方案的第三方面是提供了第二方面所述模拟生物组织薄片在质谱分析中的应用，包括如下：

(i)生物组织内目标分子的定量质谱成像分析；

(ii)药物、诊断标志物的质谱快速检测。

其中，所述质谱分析中的应用，是对生物组织切片中目标分子进行定量质谱成像分析及质谱快速检测；通过常压敞开式或真空环境下实现的样品表面成分解吸离子化技术，包括采用空气动力辅助离子化(AFAI)、解吸电喷雾离子化(DESI)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)、二次离子质谱(SIMS)。

其中，(i)项所述的生物组织内目标分子的定量质谱成像分析，是指临床前受试药物在受试动物体内的吸收、分布、代谢、排泄与毒性研究。

其中，(ii)项所述的药物、诊断标志物的质谱快速检测，是指生物组织、生物体液中药物的快速检测，或基于分子诊断的临床疾病分期、分型、预后评价、术中活检、手术边界确定。

最优选的生物组织内目标分子的定量质谱成像分析包括如下步骤：

(i)样品的制备

按照本发明技术方案的第一方面说明内容，制备一系列不同含量目标分子的模拟生物组织薄片，并布置于载玻片同一水平采集行上，用于建立目标分子的含量-离子响应强度定量标准曲线；

将制备的待测生物组织切片置于系列模拟生物组织薄片的邻近位置，待检。(ii)质谱成像数据采集

根据目标分子产生的离子峰(目标离子)，质谱采集的质荷比区间应覆盖该目标离子；

更进一步地，根据该目标离子的响应强弱以及该目标离子附近干扰峰的强弱，进一步地确定质谱采集模式如全扫描采集(Full MS)、选择离子检测(SIM)、多反应监测(MRM)，以及相应采集参数值的大小，确保最佳的质谱采集灵敏度；

以含目标分子的模拟生物组织样品作为受试对象，对质谱成像离子源的各关键参数进行优化考察，得到最佳的质谱成像检测条件；

根据待检测样品尺寸大小、质谱成像空间分辨率、完整样品采集周期，确定载样平台的横向移动速度和纵向行间距；

(iii)质谱成像数据处理与定量分析

将质谱采集得到的元数据(raw data)进行格式转换，使其可以被商品化或开源的质谱成像软件可读取的格式类型；

重构目标离子的质谱图像，圈定各模拟生物组织样本的感兴趣区域(ROI₁～ROI₅)；

计算各模拟生物组织区域内目标离子的平均离子强度

对相应区域内已知的目标分子的物质的量(pmol/pixel)进行回归拟合，建立定量质谱成像标准曲线，将实际组织切片样品区域中检出目标分子的各像素点强度值代入定量质谱成像标准曲线，计算相应像素点内目标分子的物质的量。

最优选的药物、诊断标志物的质谱快速检测包括如下步骤：

(i)样品的制备

将待测生物组织进行匀浆分散处理，转移至高分子聚合物模板框与载玻片形成的赋形模具内，干燥脱水固定，形成待检测匀浆组织样品；

按照本发明技术方案的第一方面说明内容，制备一系列不同含量目标分子的模拟生物组织薄片，并与待测匀浆组织样品置于同一水平采集行上，待检；

(ii)质谱成像数据采集

根据目标分子产生的离子峰(目标离子)，质谱采集的质荷比区间应覆盖该目标离子；

更进一步地，根据该目标离子的响应强弱以及该目标离子附近干扰峰的强弱，进一步地确定质谱采集模式如全扫描采集(Full MS)、选择离子检测(SIM)、多反应监测(MRM)，以及相应采集参数值的大小，确保最佳的质谱采集灵敏度；

以含目标分子的模拟生物组织样品作为受试对象，对质谱成像离子源的各关键参数进行优化考察，得到最佳的质谱成像检测条件；

对处于同一行的各样品进行单行采集，根据待检测样品尺寸大小、样品间距、质谱采集频率，确定3D载样平台的横向移动速度，保证单个样品区间的采集点数不少于5～10个；

(iii)质谱数据处理与定量分析

在提取离子流图(XIC)上，选定各模拟生物组织样本区域内的目标离子检出区间(ROI₁～ROI₅)；对区间内的信号进行积分，计算各感兴趣区间信号的峰面积；计算各模拟生物组织区域内目标离子的平均离子强度

对相应区域内已知的目标分子的含量(ng/mg)进行回归拟合，建立质谱快速检测标准曲线，将待检测匀浆组织区间中检出信号积分面积值代入质谱快速检测标准曲线，计算相应的目标分子含量。

本发明技术方案的第四方面是提供了一种制备模拟生物组织薄片的装置，其主要组成模块包括：

(i)样品容器；

(ii)混合器；

(iii)点样探针；

(iv)赋形型材

(v)底物载体；

(vi)干燥室；

(vii)移动平台；

其中，(i)项所述的样品容器，是指用于分别灌装组织料液和细胞悬液的容器，外部配有温控模块和搅拌片，用于保护细胞的完整性，并保持细胞悬液和组织料液的均匀分散状态；所述样品容器材料包括玻璃、树脂、聚四氟乙烯惰性材料。

其中，(ii)项所述的混合器，是指用于将组织料液与细胞悬液充分混合的螺形管，上端有两个入口，分别与样品容器的两个出口相连，另一端与点样探针相连，将充分混合后的模拟组织料液输送进点样探针，外部配有温控模块。

其中，(iii)项所述的点样探针，是指一根逐渐变细成尖端的中空管；该中空管内装有预混合充分的细胞与组织成分，在出口一端逐渐变细成尖端；另一端可连接到样品混合容器以提供持续上样；所述探针有机的构成材料包括金属材料、无机非金属材料、有机高分子聚合物材料。

其中，(iv)项所述的赋形型材，是指低通透性的、用于限定模拟组织外形尺寸的模具，所述高分子聚合物材料包括聚氯乙烯、聚四氟乙烯。

其中，(v)项所述的底物载体，是指用于承载组织样品，具有一定机械强度的平面衬底；衬底材料包括金属材料、无机非金属材料、有机高分子聚合物材料。

其中，(vi)项所述的干燥室，是指可装载所述衬底、赋形型材、模拟组织混合液，并可以产生惰性干燥气体或负压环境的腔室装置。

其中，(v)项所述的移动平台，是指可装载底物载体和赋形型材，并在步进电机驱动控制下在正交X轴、Y轴两个方向完成水平移动的装置。

最优选的模拟生物组织薄片制备装置工作步骤如下：

(i)组织料液与细胞悬液的混合

根据所需模拟的器官或组织切片中的细胞密度与组织密度，将收集的细胞悬液与组织料液分别灌入图1所示模拟生物组织自动点样装置的样品容器(附图1部件3)中；操作者设定样品容器加热块(附图1部件4)温度、混合器加热块(附图1部件7)温度、搅拌片(附图1部件2)转速，使细胞悬液与组织料液处于悬浮分散状态；进行混合比例设定，计算机自动计算并确定两个推注活塞(附图1部件1)的蠕动线速度，保证细胞悬液与组织料液按照一定比例调制，经过附图1所示混合器(附图1部件6)充分混匀，重新调制成模拟生物组织混合液。(ii)混合液的共沉积

采用附图1所示模拟生物组织自动点样装置，完成大规模模拟组织样品批量操作；操作者进行点样探针的(附图1部件8)点样体积、移动平台(附图1部件12)的运动路径、移动速度设定；点样探针和移动平台在预设定的参数方法下协同配合，将制备步骤(6)重新调制成的模拟生物组织混合液，精确涂布于底物载体(附图1部件11)与赋形型材(附图1部件9)构成的模具中，使组织成分、细胞、目标分子在沉积的过程中完成塑形处理。

(iii)模拟组织的固定成型

将待处理的含药模拟生物组织薄片置于附图1所示装置的干燥室(附图1部件5)内，在氮气(保护气)流通环境下，完成模拟组织的固定成型。

有益技术效果：

1.本发明的关键创新点和优点在于：既利用了匀浆环境中下组织和目标成分的均匀性特点来保证模拟样本中组织密度和目标成分含量的准确可控，同时又由于对生物组织中的细胞与细胞间隙基质采取了先分步平行处理再混匀重构的策略，保证了细胞的完整性以及与真实组织的近似性。

2.本发明公开了一种添加目标分子的模拟生物组织薄片，该薄片组织呈现均质性特点，形态规则、尺寸可准确控制，且细胞保存完好，与真实生物组织具有极高的形态相似性，可以理想地模拟实际生物组织的基质特征。薄片中目标分子含量可控，分布均匀，为定量质谱成像分析应用提供了一种可参考的标准质控样品，用于质谱成像采集参数的优化、目标分子解吸离子化效率的定量评估、质谱仪数据采集质量的监控。

3.本发明公开了一种模拟生物组织薄片的制备方法和装置，该制备方法稳定、可控，重现性理想。该制备装置操作简便，可以快速地制备出大量模拟生物组织薄片，可用于病理组织样品的快速定量测定，满足临床组织病理诊断对于检测结果信息快速反馈的要求。

4.本发明制定了关于模拟生物组织薄片相似性及其制备方法的方法学验证的量化评价标准，为实现模拟组织样本的稳定、可控，提供了参考。

附图说明

图1.模拟组织自动点样制备装置示意图

1.推注活塞；2.搅拌桨；3.样品容器；4.样品容器加热块；5.干燥室；6.混合器；7.混合器加热块；8.点样探针；9.赋形型材；10.模拟组织薄片；11.底物载体；12.移动平台

图2.模拟生物组织薄片的实物图

图3.紫杉醇在真实肿瘤组织中分布及含量的定量质谱成像可视化表征结果

图4.紫杉醇的定量标准曲线和肿瘤组织中紫杉醇的经时变化(新型乳剂：Emulsion；白蛋白：Abraxane；紫素：Taxol；脂质体：Liposome)

图5.几种食管癌潜在标志物(稳定同位素标记)的定量标准曲线

图6.几种食管癌潜在标志物的质谱快速检测结果

图7.实际肿瘤组织与模拟肿瘤组织的H&E染色图比对

图8.实际肿瘤组织与模拟组织中紫杉醇质谱图像和整体组织轮廓平均质谱图

(A)(C)为实际肿瘤组织切片在m/z 100-500和m/z 500-1000的全扫描质谱图；

(B)(D)为模拟生物组织薄片在m/z 100-500和m/z 500-1000的全扫描质谱图

图9.模拟肿瘤组织薄片区域各像素点中紫杉醇的信号强度分布

图10.三批次模拟肿瘤组织薄片中紫杉醇的平均信号强度分布

图11.制备的不同含量紫杉醇的模拟肿瘤组织薄片的线性评价结果

具体实施方式

给出以下实施例，但本实施例不以任何方式限定本发明。

实施例1：紫杉醇在肿瘤组织内分布的定量可视化研究

(1)样品制备

以聚氯乙烯(PVC)薄膜作为模拟生物组织薄片的赋形型材，高精度数控机械刻字机在同一行连续刻制5份矩形赋形模板框(4mm×1mm)。临用时，将刻制的PVC模板框撕去背面保护膜，粘性一侧加少量超纯水浸润、干燥后，再粘贴至正电荷防脱载玻片上，与载玻片共同构成用于塑形的矩形模具槽。

将不同浓度的紫杉醇标准溶液加入超纯水中作为水性分散介质。

称取Balb/C雌性裸鼠异体移植瘤组织400mg，剪碎，加入含有紫杉醇标准溶液的水性分散介质1.0mL，冰浴环境中充分匀浆，制成肿瘤组织料液。

将先前收集制备好的同源细胞悬液与肿瘤组织料液按照1:1体积比充分混合后，定量吸取5.0μL模拟肿瘤组织混合液，均匀涂布于载玻片与赋形膜材组成的矩形模具槽内。

常温减压干燥，待匀浆液中的水分蒸干后，撕下PVC膜材料，即制成含药模拟肿瘤组织薄片，实物图见附图2。

采用Leica CM1860切片机制备厚度8.0μm的实际肿瘤组织冰冻切片，待检。

(2)质谱数据采集与成像分析

采用空气动力辅助离子化技术，结合Q Exactive型四极杆轨道阱串联质谱仪对模拟肿瘤组织薄片及实际肿瘤组织切片进行数据采集。

喷雾溶剂组成：甲醇-水(含0.1％甲酸,80:20,v/v)；喷雾溶剂流速：0.005mL/min；喷雾气流量：0.7MPa；喷雾电压：+7.5kV；传输管电压：+3.5kV；抽气流量：45L/min；传输管角度：15°；喷针角度：55°；雾化气、辅助气、反吹气：0；S-透镜电压：55V；毛细管温度：350℃。

采集模式：靶向选择离子检测采集(t-SIM)；扫描范围：m/z 876±2.0；最大离子注入数量(AGC)：3e5；最大注入时间(MIT)：400ms；微扫描(microscan)：1。载样3D平台横向移动速度：0.2mm/s，纵向行间距0.2mm/line。

用Xcalibur软件自带的数据格式转换功能，将组织样本每一行扫描采集的*.raw格式元数据转换为*.cdf通用数据格式，导入MassImager质谱成像软件进行图像重构，以采集质谱图的总离子流强度作为校正因子，对目标离子响应信号进行归一化校正，以消除离子源系统随机波动所引起的响应变异。圈定各模拟生物组织样本的感兴趣区域(ROI₁～ROI₅)，目标离子经归一化校正后的平均离子强度

对紫杉醇含量进行最小二乘法回归拟合，建立定量标准曲线，将实际肿瘤组织感兴趣区域中紫杉醇相应的平均强度值内代入标准曲线，实际生物样本中的药物含量，以各时间点的药物含量对时间做曲线，所包围曲线下面积(AUC)表征紫杉醇在肿瘤组织内的暴露量。

(3)检测结果

对模拟肿瘤组织及实际肿瘤组织样品中的紫杉醇进行定量质谱成像检测的结果见附图3。实验结果表明，不同剂型中的紫杉醇15分钟时即可经血循环分布到肿瘤组织，在3小时附近即可达峰，5天时仍未在肿瘤组织内彻底清除，该紫杉醇制剂均具有缓释效果，四种紫杉醇制剂在空间分布与经时变化两方面均具有生物等效性(附图3与附图4)。

实施例2：食管组织中几种食管癌潜在标志物的快速定量筛查

(1)样品制备

以聚氯乙烯(PVC)薄膜作为模拟生物组织薄片的赋形膜材，高精度数控机械刻字机在连续刻制4行，每行5份矩形赋形模板框(4mm×1mm)。临用时，将刻制的PVC模板框撕去背面保护膜，粘性一侧加少量超纯水浸润、干燥后，再粘贴至正电荷防脱载玻片上，与载玻片共同构成用于塑形的矩形模具槽。

将稳定同位素标记的混合标准溶液(L-精氨酸-¹³C₆、L-肉毒碱-d₃和磷脂酰胆碱(18:0)-d₁₃)加入超纯水中作为水性分散介质。

称取对照食管组织样本，剪碎后，按照0.5mL/100mg的料液比加入含不同浓度同位素标记内源性代谢物的水性分散介质，冰浴环境中充分匀浆分散，制成食管组织料液。置于-20℃环境中静置3.0min，定量吸取5.0μL组织料液，均匀涂布于载玻片与赋形膜材组成的矩形模具槽内。常温减压干燥，待匀浆液中的水分蒸干后，撕下PVC膜材料，即制成定量用标准系列食管组织薄片。

利用制得的定量用标准系列食管组织薄片，建立食管组织中几种内源性分子定量测定的标准曲线。对于待检食管组织的处理，除不加同位素标记混标溶液外同法操作。

将5份待检食管组织与定量用标准系列食管组织样品布置成样品多行阵列(4行×5样本/行，行间距5.0mm)，进行质谱快速检测。

(2)质谱数据采集

采用空气动力辅助离子化技术，结合QTRAP 5500型三重四级杆质谱仪的多反应监测扫描模式(MRM)，对食管组织匀浆切片中的上述同位素内标和相应的内源性代谢物进行数据采集。AFAI关键参数同实施例1中“(2)质谱数据采集与成像分析”。载样3D平台横向移动速度0.5mm/s，纵向行间距10.0mm/line。

(3)检测结果

获得的离子强度经数据处理后换算内源性成代谢物的含量。基于模拟食管组织建立的标准曲线，其L-精氨酸-¹³C₆、L-肉毒碱-d₃和磷脂酰胆碱(18:0)-d₁₃分别在62.5～1000ng/mg、25～400ng/mg和125～2000ng/mg浓度范围内线关系良好(r≥0.99)(见附图5)。

对正常大鼠食管组织中三种待测成分进行质谱快速定量检测见附图6，结果表明：L-精氨酸和L-肉毒碱未检出，而磷脂酰胆碱(18:0)的含量为212.6±18.9ng/mg(n＝5)。

实施例3：模拟生物组织薄片的相似度评价及制备方法学验证

将由实施例1制得的模拟组织薄片，连同真实肿瘤组织切片(8μm)一同进行苏木素-伊红染色(H&E染色)，从组织形态学方面，定性评价模拟组织与真实组织的相似性(结果见附图7)。

模拟生物组织薄片与实际生物组织薄片各取5份，电子天平(十万分之一)精密称量载玻片加样前后的质量差，计算各模拟组织薄片及实际组织切片的质量；采集上述10份切片的光学图像，利用Photoshop图像处理软件，对样本区域内的像素数求和，经过像素尺寸与标尺间的比例换算，折算成各样品区域的实际面积，将各样品的质量与相应的面积相除，得出模拟组织薄片及实际组织切片的组织密度值。

利用空气动力辅助离子化(AFAI)技术对模拟组织薄片和实际组织切片进行质谱成像数据采集。在MassImager质谱成像软件中分别圈定模拟组织与实际组织的区域，经过背景离子扣除、峰强度归一化、峰对齐步骤后，形成平均质谱图，统计TIC值和高响应共有峰数(结果见附图8)，以Pearson相关系数或夹角余弦值作为测度，计算两张平均质谱图的相似性。

向AFAI喷雾溶剂系统中加入适当浓度的紫杉醇标准溶液，对空白模拟生物组织薄片和实际组织切片进行多行采集，分别计算模拟组织区域和实际切片区域的平均TEC值，并进行独立样本t检验。

结果如表4显示，制得的模拟生物组织薄片与真实组织切片在TIC值、高响应共有峰数、相似度、TEC值、组织密度方面具有一致性。

表4模拟生物组织薄片与实际组织切片的相似度评价

按照实施例1中的模拟肿瘤组织薄片制备方案，平行制备低、中、高三种药物含量的模拟组织样本各5份，进行质谱成像分析，利用紫杉醇的加钠离子([M+Na]⁺m/z876.3202)重构质谱图像。从均匀性、批间/批内精密度、线性三方面对模拟生物组织薄片的制备方法进行方法学评价。

结果如表5显示，单个模拟生物组织薄片区域内各像素点中的药物信号强度近似正态分布(附图9)，平均信号强度的变异值为24.8％。三个分析批内，同一含量水平的模拟生物组织薄片中，药物的平均信号强度日间精密度为6.78％，日内精密度为5.76％(附图10)。药物在0.5ng/mm²～10.0ng/mm²范围内与其离子信号强度呈理想的线性关系，回归系数r大于0.99(附图11)。

表5模拟生物组织薄片制备方法的方法学验证

实施例1、2表明，该法制备的模拟生物组织薄片，可以成功地应用于生物组织内药物的定量质谱成像分析和组织内源性代谢物的快速定量检测。

实施例3表明，本发明所制备的模拟生物组织薄片，为预测生物组织中目标分子的解吸电离行为提供了一种理想的试验载体，为定量质谱成像分析和质谱高通量快速检测提供了一种可控的标准样品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (21)

1.一种制备模拟生物组织薄片的方法，包括以下步骤：

(i)赋形膜材的加工：选取适宜高分子聚合物材料刻制塑形用模具，确定模拟生物组织的形状、尺寸以及样本布局；

(ii)含化合物的水性分散介质的制备：向水性介质中加入适量已知浓度的标准化合物溶液，超声除去水性分散介质中的气泡，待用；

(iii)组织料液的制备：将生物组织的分散处理，确定生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比，使团块状的生物组织样品转为均匀分散的生物组织料液，以确保沉积形成的模拟组织在组织形态、组织密度一致；

(iv)细胞悬液的制备：采用细胞筛分、分级的方法制备的完整的离体细胞，并采用水性分散介质配制成一定浓度的细胞悬液；

(v)组织料液与细胞悬液的混合：将组织料液与细胞悬液按一定比例充分混合；

(vi)混合液的共沉积：准确吸取一定体积的组织料液与细胞悬液混合液，采取手动点样或自动化点样的方式，将混合液加载于贴有赋形膜材的载体底物上，使组织成分、细胞、目标分子在沉积的过程中完成塑形处理；

(vii)模拟组织的固定成型：通过常温自然干燥、常温减压干燥或惰性干燥气流通干燥的方式，除去模拟生物组织中的水分，使模拟组织薄片与载体底物粘贴紧密。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述模拟生物组织薄片，包括生物组织材料和组织细胞，并含有已知量的标准化合物分子。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(i)项中所述赋形膜材以低通透性的粘性薄膜作为膜材；赋形膜材的加工，采用机械切割或激光刻蚀方式实现。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(i)项中所述赋形膜材用于限定模拟组织样本的形态、尺寸及厚度，该赋形膜材尺寸可根据具体实验需要而准确刻制，单个样本呈规则矩形或正方形，或制作成多样本槽阵列模式。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(i)项中所述水性分散介质包括超纯水、等渗生理盐水、磷酸盐缓冲液、含天然高分子的水凝胶溶液，所述的天然高分子包括胶原蛋白或纤维蛋白。

6.根据权利要求1所述所述的制备方法，其特征在于，(iii)项中是将组织细胞与细胞间隙组织预先通过细胞筛分、分级方式进行物理分离，组织细胞经过纯化、富集，液氮冻存，待临用时重新分散至适宜浓度。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过对生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比的准确控制，可以实现模拟生物组织中组织密度与实际生物组织一致，进而使模拟组织的基质与实际组织相近。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的模拟生物组织薄片组成包括：确定添加量的标准化合物分子，来源于被模拟器官或组织的生物组织材料、组织细胞。

9.根据权利要求8所述的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的标准化合物分子选自生物大分子，或生物内源性小分子代谢物，或外源性添加物；所述的生物大分子包括蛋白质、多肽、多糖，所述的生物内源性小分子代谢物包括脂类、氨基酸、脂肪酸、寡糖、单糖、核苷，所述的外源性添加物包括化学合成药物及其代谢产物、中药草天然产物。

10.根据权利要求8所述的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的生物组织材料指来源于某脏器或组织，起到支撑、缓冲、保护作用的细胞间质成分，所述生物组织材料包括纤维蛋白、胶原蛋白、层黏蛋白。

11.根据权利要求8所述的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的组织细胞指来源于某一特定器官或组织，经过细胞筛选、分级后制备得到的细胞或不同类别细胞的集合。

12.根据权利要求11所述的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的器官或组织包括临床前实验动物来源的实质性脏器，或空腔脏器或异体移植实体瘤组织；所述实质性脏器包括心、脑、肾、肝、脾、肺、胸腺，所述空腔脏器如食管、胃、小肠、大肠。

13.权利要求8-12任一项所述的模拟生物组织薄片在质谱分析中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的质谱分析是对生物组织切片中目标化合物进行定量质谱成像分析及质谱快速检测，通过常压敞开式或真空环境下实现的样品表面成分解吸离子化技术，包括采用空气动力辅助离子化(AFAI)、解吸电喷雾离子化(DESI)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)、二次离子质谱(SIMS)。

15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的质谱分析中的应用包括临床前受试药物在受试动物体内的吸收、分布、代谢、排泄与毒性研究；生物组织、生物体液中药物的快速检测；基于分子诊断的临床疾病分期、分型、预后评价、术中活检、手术边界确定。

16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的质谱分析中的应用包括质谱分析中标准曲线制备中的应用。

17.一种用于制备模拟生物组织薄片的装置，包括：样品容器、混合器、点样探针、赋形型材、底物载体、干燥室、移动平台部件；其中所述样品容器中呈分散状态的生物组织料液和组织细胞悬液被输送至所述混合器中充分混合为生物组织混合液，再经所述点样探针将生物组织混合液加载到覆有所述赋形型材的所述底物载体上，并在所述干燥室内对生物组织混合液干燥固化成所述赋形型材形状的模拟组织薄片样品；所述的赋形型材是指低通透性的高分子聚合物材料，包括聚氯乙烯或聚四氟乙烯，用于限定模拟组织外形尺寸的模具；所述的底物载体是指用于承载组织样品，具有一定机械强度的平面衬底；衬底材料包括金属材料、无机非金属材料或有机高分子聚合物材料；所述移动平台是指可装载底物载体和赋形型材，并在步进电机驱动控制下在正交X轴、Y轴两个方向完成水平移动的装置。

18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述的样品容器是指用于分别灌装组织料液和细胞悬液的容器，外部配有温控模块和搅拌片，用于保护细胞的完整性，并保持细胞悬液和组织料液的均匀分散状态，所述样品容器材料包括玻璃、树脂、聚四氟乙烯惰性材料。

19.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述的混合器是指用于将组织料液与细胞悬液充分混合的螺形管，上端有两个入口，分别与样品容器的两个出口相连，另一端与点样探针相连，将充分混合后的模拟组织料液输送进点样探针，外部配有温控模块。

20.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述的点样探针是指一根逐渐变细成尖端的中空管；该中空管内装有预混合充分的细胞与组织成分，在出口一端逐渐变细成尖端；另一端可连接到样品混合容器以提供持续上样；所述探针有机的构成材料包括金属材料、无机非金属材料、有机高分子聚合物材料。

21.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述的干燥室是指可装载所述赋形型材、生物组织混合液、底物载体、移动平台，并可以产生惰性干燥气体或负压环境的腔室装置。

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