KR102004350B1 - 조직 내 표적분자를 검출하고 정량하는 방법 - Google Patents

조직 내 표적분자를 검출하고 정량하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조직에 대한 하나 이상의 표준분자의 희석범위를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 표준분자가 첨가되는 조직 균질액이 사용되고, 결과 혼합물은 상기 조직의 박편의 분석 전에 컨디셔닝 및 박편화된다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 표준범위를 사용하여 하나 이상의 조직에서 하나 이상의 표적분자를 검출하고 정량하는 방법에 관한 것이다.

Description

조직 내 표적분자를 검출하고 정량하는 방법{METHOD FOR DETECTING AND QUANTIFYING A TARGET MOLECULE IN A TISSUE}
본 발명은 조직에 대한 분자의 희석범위(dilution range)의 제조(preparation)에 관한 것이며, 예를 들어 질량분석에 의한, 상기 조직 내 상기 분자의 정량을 위한 상기 희석범위의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 희석범위는 관심 조직에서 정량될 분자의 특이적 행동을 고려한다. 특히, 본 발명은 질량분석 이미징, 특히 MALDI 이미징을 사용함으로써 조직의 표면 상에 표적분자를 직접적으로 검출 및/또는 정량할 수 있게 하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 검출 및/또는 정량 방법을 검증하는 방법, 및 검출 및/또는 정량 방법의 품질 및 재현성을 조절하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 발명은 조직 내 분자의 검출 및/또는 정량이 유용/필요한 분야에 걸쳐 적용가능하다. 예를 들어, 본 발명은 다른 생물학적 조직 내 의약의 분포 및 약동학(pharmacokinetics)을 연구하는 약학 분야에 적용가능하다. 유사하게, 본 발명은 예를 들어 병리학적 조직에서 주어진 순간에 주어진 바이오마커(biomarker)를 검출, 식별 및 추적하기 위해 생의학 분야에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 예를 들어 식물 내 식물위생(phytosanitary) 제품과 같은 분자의 독성 및 분해성을 평가하기 위해 농업화학 분야에 적용될 수 있다.
시료, 특히 조직에서 분자를 검출하고 식별하는데 다양한 기법이 현재 사용되고 있다. 예를 들어, 질량분석은 시료에서 관심 분자를 검출하고 식별하기 위해화학 및 생화학 분석에 있어서 널리 알려져 있고 사용되는 기법이다. 수년 동안, 생물학적 조직의 박편에 직접적으로 관심분자의 분포를 시각화할 수 있도록, MALDI 이미징과 같은 질량분석에 의한 분자 이미징이 개발되어 왔다. MALDI 이미징은 이의 매우 높은 감도 덕분에, 매우 많은 양의 다른 분자의 분포를 동시에 조직의 표면에 직접적으로 시각화할 수 있게 한다. 약학 분야에서, 상기 기법은 예를 들어 다른 장기의 분자의 분포를 다른 치료 시간에 비교할 수 있게 한다.
그러나, t 순간에서 이와 같이 검출된 분자의 정량이 필요한 경우에, 상기 이미징 기법은 종래의 또는 기기적인 방법에 기반한 정량 화학 분석과 결합되어야 한다. 상기 두번째 단계는 조작 및 번역 오류의 근원이다. 더욱이, 관심 분자의 존재와 조직 내 이의 정량 분포 사이의 직접적인 연관관계를 허용하지 않는다.
또한, 주어진 농도의 주어진 분자는 이것이 검출되는 조직에 따라 동일한 강도의 신호를 방출하지 않는다. 유사하게, 주어진 조직에서 동일한 농도의 두가지의 다른 분자는 다른 신호 강도를 나타낸다.
상기 현상은 각 분자 및 각 조직에 특이적인 조직 소광계수(Tissue Extinction Coefficient: TEC), 또는 조직효과, 또는 이온 억제효과의 존재에 의해 설명된다. TEC는 비활성 분석 지지체 상의 상기 분자로부터의 신호에 대한, 조직 및/또는 조직에서 이의 위치에 따라 주어진 분자로부터의 신호 강도의 손실 또는 증가를 나타낸다. TEC는 다양한 요인, 특히 조직(동물 또는 식물)의 성질, 화학적 환경, 조직의 화학치료 여부 등에 의존한다. 상기 TEC의 존재는 분석, 특히 질량분석 동안에 조직 내 분자에 의해 방출된 신호의 강도를 해석하기 어렵게 한다.
본 발명은 주어진 조직에 대한 주어진 분자의 희석범위 또는 표준범위를 제조할 수 있게 하는 방법을 제안한다. 본 발명에 따른 표준범위는 단편화된 조직으로부터의 관심 조직의 재구성의 박편을 사용함으로써 제조된다. 본 발명자에 의해, 주어진 분자는 이와 같은 조직 및 대응되는 전체 조직에서 동등한 방식으로 행동한다는 것이 발견되었다. 질량분석에 의한 분석의 경우, 재구성된 조직 내 분자의 질량 스펙트럼은 대응되는 전체 조직 내 동일한 농도의 동일한 분자의 질량 스펙트럼과 실질적으로 동일하다. 유사하게, 형광에 의한 분석의 경우, 재구성된 조직 내 표지된 분자에 의해 방출된 형광 신호의 강도는 대응되는 전체 조직 내 동일한 농도의 동일한 표지된 분자에 의해 방출된 형광 신호의 강도와 실질적으로 동일하다. 또한, 주어진 조직 내 주어진 분자의 정량분석을 위한 본 발명에 따른 표준범위를 사용함으로써, TEC를 고려할 필요가 없다. 상기 조직 내 상기 분자의 분석에서 획득된 신호는 대응되는 표준범위의 신호에 직접 연관될 수 있다.
또한, 본 발명은 특히 이온화, 방사능 또는 형광에 의한 검출방법에 관계없이, 조직 내 표적분자를 검출 및/또는 정량하는 방법을 제안한다. 예를 들어, 조직 내 상기 표적분자의 분포 및 양의 이미지를 재구축하기 위해, 본 발명에 따른 방법은 질량분석 또는 질량분석 이미징을 사용함으로써 조직의 박편 상에 직접적으로 분자의 질량 스펙트럼에 연결된 신호의 자동화된 획득을 가능하게 한다. 이를 위해, 본 발명에 따르면, 분석될 조직과 동일한 조직으로부터의 재구성된 조직의 박편을 사용함으로써 제조된 유사한 물리화학적 특징을 나타내는 표적분자 또는 분자의 희석범위가 사용된다. 이때, 희석범위로부터의 결과와 직접적인 비교를 통해 조직 내 분자의 정확한 정량이 가능하다.
또한, 본 발명은 조직의 박편을 사용함으로써 조직 내 표적분자를 검출 및/또는 정량하는 방법을 검증하는 방법을 제공하다. 본 발명에 따른 검증방법은 주어진 조직 및 주어진 분자에 대해, 상기 조직의 박편 상에 직접적으로 상기 분자에 대해 획득된 분석결과가 조직 효과와는 독립적으로 상기 조직을 나타낼 것이라는 것을 확인할 수 있게 한다.
또한, 본 발명은 조직의 박편을 사용함으로써 조직 내 표적분자를 검출 및/또는 정량하는 방법의 품질 및/또는 재현성을 제어하는 방법을 제안한다. 이와 같은 방법은 예를 들어 다른 분석간의 관심 화합물(들)을 상대적으로 정량하기 위해, 실험적 가변성을 추적하거나, 및/또는 특히 상기 품질 제어에 상대적으로 각 분석에 대해 획득된 값을 정규화함으로써 고려할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명의 대상은 하기의 단계를 포함하는, 조직에 대한 하나 이상의 표준분자의 희석범위를 제조하는 방법이다:
(i)　조직을 분쇄하여 조직 균질액(homogenate)을 획득하는 단계;
(ii) (i)단계로부터의 조직 균질액의 제1시료와 표준분자를 혼합하는 단계, 여기서 상기 표준분자는 알려진 제1농도임;
(iii)　(ii)단계로부터 획득된 조직 균질액의 제1시료를 컨디셔닝(conditioning)하여 조직 균질액의 상기 시료를 박편화할 수 있게 하는 단계;
(iv) (i)단계로부터의 조직 균질액의 하나 이상의 제2시료, 및 제1농도와 다른 알려진 제2농도의 표준분자를 이용하여, (ii)단계 및 (iii)단계를 반복하는 단계; 및
(v) (iii)단계로부터 획득된 조직 균질액의 컨디셔닝된 시료 각각의 하나 이상의 박편을 분석하여, 상기 시료 분자의 농도 각각에 대한 조직 내 표준분자의 양을 나타내는 신호를 획득하는 단계.
본 발명에 따른 방법은 동물이던지 식물이던지 어떠한 생물학적 조직에도 적용될 수 있다. "조직"은 일반적으로 동일한 기능에 기인한 기능적 조합에 의해 함께 결합된 동일한 근원의 세포의 조합으로 이해된다. 특정 경우에, 조직은 장기 또는 장기의 일부로 이해된다.
표준분자는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 핵산, 지질, 대사물질, 약물과 같은 소형 분자 등일 수 있다. 더욱 일반적으로, 표준분자는 약학적으로, 생물학적으로 또는 다른 방법으로 활성인 분자이다. (v)단계에서 수행되는 분석에 따라, 표준분자는 미표지 또는 표지, 특히 방사능표지 또는 GFP(Green Fluorescent Protein)와 같은 형광분자에 의해 표지된다.
(i)분쇄단계에서, 조직은 단편화되어 더욱 또는 덜 고운 균질액, 특히 액체, 반액체, 페이스트(pasty) 등을 형성한다. 조직 균질액은 균질하지 않을 수 있고, 예를 들어 다른 크기의 조직 단편을 포함할 수 있다. 필요하면, 획득된 균질액에 균질화 용액, 특히 수성액을 첨가하여 상기 균질액을 희석하고 이를 덜 조밀하게 할 수 있다. 균질화 용액은 분쇄단계 동안에 상류 또는 하류에 첨가될 수 있다.
분쇄는 특히 수동적 또는 기계적인 어떠한 수단으로도 수행될 수 있다. 예를 들어, 조직 균질액은 블렌더(blender)를 사용한 전단(blender) 또는 막자(pestle)를 사용한 파쇄(crushing)에 의해 획득될 수 있다.
본 발명에 따르면, (i)단계에서 사용되는 조직은 유리하게는 신장, 간 등과 같은 장기이다. 표준범위를 제조하기 위해, 전체 장기 또는 상기 장기의 일부만이 구분없이 사용될 수 있다. 적어도 제조될 표준범위에 희석지점이 있는 만큼 많은 조직 규질액의 시료로 세분되기 전에, 조직이 분쇄될 수 있다. 또한, 상기 조직의 분배를 분쇄 전에 진행하는 것도 가능하며, 각 시료는 개별적으로 분쇄된다. 또한, 전체던지 아니던지 하나 이상의 다른 장기를 표준범위의 희적지점 각각에 대해 사용할 수 있고, 각 시간에 하나의 동일한 시리즈(series)의 제조에 사용되는 장기는 동일한 성질 및 근원을 갖는다. 예를 들어, 4개의 희석지점 또는 농도를 포함하는 래트(rat)의 간 내 분자의 표준범위의 제조를 위해, 새로운 래트의 간이 각 농도에 대해 사용된다.
2 이상의 다른 농도에서 표준분자의 조제물질이 제조된다. 예를 들어, 표준분자는 알려진 다른 농도의 가용화 용액(수성 또는 용매 포함) 중의 현탁액에 위치된다. 그 후, 동일한 양의 용액이 조직 균질액의 시료 각각에 첨가되고, 각각의 상기 표준분자의 다른 알려진 농도를 갖는다. 다른 실시예에서, 표준분자는 가용화 용액 중의 현탄액에 위치되고, 다른 양의 상기 용액이 조직 균질액의 시료 각각에 첨가되어, (ii)단계로부터 획득된 조직 균질액의 시료 각각은 상기 표준분자의 다른 알려진 농도를 갖는다. 바람직하게는, 희석범위(dilution range)는 2 내지 10개의 희석지점(dilution point)을 포함한다.
유리하게는, 조직 균질액의 시료 내 표준분자의 균일한 분포를 획득하기 위해, (iii)컨디셔닝 단계 전에 균질화 단계가 제공된다. 예를 들어, 상기 균질화 단계는 볼텍스와 같은 혼합장치를 사용하여 수행된다.
일 구현예에서, (i)단계, (ii)단계 및 적절한 경우 균질화 단계는 연속적으로 수행되고, 상기 단계들 전부 또는 일부는 동시에 수행하는 것도 분명히 가능하다. 예를 들어, 조직은 표준분자를 포함하는 용액과 분쇄된다.
(iii)컨디셔닝 단계는 조직 균질액의 시료를 가공 및/또는 성형하여 상기 균질액의 하나 이상의 박편을 획득하기 위해 절단될 수 있게 할 수 있게 하는 것으로 이루어진다.
예를 들어, 컨디셔닝은 조직 균질액의 시료를 동결하는 단계를 포함한다. 이를 위해, 예를 들어 조직 균질액의 시료는 임의의 형태의 몰드에 위치되고, 그 전체는 그 후 임의의 적절한 기법에 의해 동결된다. 예를 들어, 상기 몰드는 모든 질량의 순간적인 동결을 유발하기 위해 액체 질소에 침지되고, 그 후 절단 단계까지 -18℃에서 유지된다.
다른 실시예에서, 컨디셔닝 단계는 조직 균질액의 상기 시료를 파라핀, 수지 또는 젤라틴으로 코팅하는 것으로 이루어진다. 코팅은 조직 균질액의 시료를 전체적으로 둘러싸도록 덮는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 코팅단계는 특히 몰드를 사용함으로써 수행될 수 있다.
분명히, 동결단계 후에 코팅단계가 이어질 수 있다.
컨디셔닝의 선택은 특히 조직 균질액의 시료의 상태에 의존할 수 있다. 예를 들어, (ii)단계로부터 획득된 조직 균질액이 액체이면, 유리하게는 그 후에 절단될 수 있도록 조직 균질액의 시료를 동결하도록 선택될 것이다. 균질액이 거칠게 분쇄된 조직 또는 조밀한 페이스트로 구성되는 경우, 파라핀 또는 유사물질로의 코팅은 이것이 절단될 수 있도록 하기에 충분할 수 있다.
일 구현예에서, 하나의 동일한 표준범위의 조직 균질액의 시료의 전부 또는 일부를 컨디셔닝하기 위해 동일한 몰드를 사용하는 것이 가능하다. 이와 같은 경우, 다른 시료 간의 물리적인 분리를 가능하게 하기 위해, 몰드는 다른 세포를 포함한다. 유리하게는, 세포의 경계를 짓는 파티션은 제거가능하고, 및/또는 조직 균질액의 시료와 동일한 조건에서 절단될 수 있는 소재로 제조된다. 따라서, 몰드의 내용물로부터 박편을 제조하는 것이 가능하고, 이는 각각 제조되는 희석범위의 조직 균질액의 연속된 시료를 포함한다. 바람직하게는, 조직 균질액은 연속적인 세포의 농도가 연속적으로 증가하도록(또는 감소하도록) 배열된다.
컨디셔닝되면, 조직 균질액의 시료는 우선순위 없이 이들의 몰드에서 또는 몰드에서 벗겨진 채로 이들이 절단 및/또는 (v)분석단계에서 사용될 때까지 컨디셔닝의 조건, 예를 들어 동결된 채로 유지되거나, 이들의 온전성이 유지되는 것을 보장하는 조건(예를 들어, 약 +5℃의 온도)에서 보존될 수 있다.
유리하게는, (iii)단계로부터 획득된 조직 균질의 시료는 대응되는 전체 조직과 동일한 밀도를 나타낸다. 유사하게, (iii)단계로부터 획득된 조직 균질액의 시료는 유리하게는 대응되는 전체 조직과 동일한 조직 소광계수(TEC)를 나타낸다.
"밀도"는 조직 또는 조직 균질액의 시료의 부피 당 질량을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"전체 조직"은 조직의 고유 품질/성질을 유지하는 조직 균질액의 시료를 제조하기 위해 사용된 조직과 동일 조직을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
(v)분석단계는 균질액의 컨디셔닝된 시료로부터 미리 제조된 조직 균질액의 시료의 박편 상에서 수행된다. 질량분석, 형광에 의한 분석, 자가방사 등과 같이, 조직의 박편 상의 분자 분석을 가능하게 하는 모든 기술은 (v)단계를 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, 박편은 (재구성된 또는 전체) 조직의 구획인 것으로 이해된다. 또한, 예를 들어 분광계 또는 현미경에서의 분자 분석, 특히 분자 정량분석에 적합한 모든 박편 크기가 사용될 수 있다. 유리하게는, 박편은 2　㎛ 내지 50　㎛, 특히 약 20　㎛의 두께를 갖는다. 두께는 박편의 평면에 직각으로 연장되는 크기인 것으로 이해된다.
본 발명의 방법이 실행되는 실시예에 따르면, 박편은 분석단계 전에 가공될 수 있다. 예를 들어, 먼저 동결되거나 코팅된 조직 균질액의 시료로부터 획득된 박편의 건조를 진행하는 것이 가능하다. 먼저 동결된 조직 균질액의 시료로부터 획득된 박편의 경우, 상기 박편의 저온건조(cryo-drying)를 진행하는 것이 가능하다. 예를 들어, 박편은 분석단계 전에 밤새 -18℃에 놓인다.
조직의 박편은 여전히 동결된 조직 균질액의 시료 또는 해동된 상기 시료로부터 제조될 수 있다. 유리하게는, 주어진 희석범위의 제조를 위해 동일한 컨디셔닝 및 그 후 가능한 처리가 조직 균질액의 시료 모두에 적용된다. 바람직하게는, 주어진 표준범위의 제조를 위해 사용된 모든 박편의 두께는 실질적으로 동일하다.
유리하게는, 조직 균질액의 시료의 박편은 슬라이드와 같은 지지체에 위치되어, 분광계, 현미경 또는 유사장치에 도입될 수 있게 한다. 바람직하게는, 주어진 표준범위의 제조를 위해 사용된 모든 박편은 분석이 수행될 수 있도록 동일한 지지체에 배열된다.
일반적으로, 유리하게는 동일한 분석조건이 하나의 동일한 희석범위의 조직 균질액의 모든 시료에 적용된다. 분석조건은 특히 분석을 위해 사용된 장비에 적용된 환경 및 파라미터, 및 가능한 세척 단계, 분광광도법(spectrophotometry)에 의한 분석의 경우 매트릭스의 증착 등과 같은 시료 제조 조건을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
분자의 양을 나타내는 신호가 시리즈의 조직 균질액의 시료의 박편 각각에 대해 획득되면, 희석범위를 나타내는 검량선을 제조하는 것이 가능하다.
예를 들어, 질량분석에 의한 분석의 경우, 검량선을 도시하기 위해, 표적분자의 질량 스펙트럼에 연관된 하나의 동일한 신호가 모든 희석지점을 위해 선택될 것이다. 신호는 특히 상기 질량 스펙트럼의 피크의 강도, 피크의 넓이 또는 신호/잡음비일 수 있다.
자가방사에 의한 분석의 경우, 예를 들어 탄소 14에 의해 방사능표지된 표적분자에 의해 방출된 방사능활성의 강도가 사용된다. 형광에 의한 분석의 경우, 형광 분자에 의해 표지된 표준분자의 빛 방출의 강도가 사용된다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 2 이상의 다른 표준범위가 동일한 시간에 제조된다.
예를 들어, 2 이상의 다른 표준분자가 (ii)단계에서 조직 균질액의 시료 각각에 첨가되고, (v)분석단계는 표준분자 각각에 대해 수행되어, 각 농도에 대해 조직 내 표준분자 각각의 양을 나타내는 신호를 획득한다.
표준분자 각각은 조직 균질액의 상기 시료 내 다른 분자의 농도와 다를 수 있는 주어진 농도의 조직 균질액의 주어진 시료에 첨가된다.
본 발명에 따른 희석범위는 주어진 수준의 신뢰도에 의해 조직 내에서 검출될 수 있는 표준분자의 최소량 또는 검출한계(Limit of Detection: LOD)를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 이를 위해, 검출한계 내에서 검출될 수 있는, 즉 3 이상의 신호/잡음값을 나타내는 최소신호가 희석범위 상에 식별된다.
유사하게, 표준범위는 주어진 수준의 신뢰도에 의해 조직 내에서 정량될 수 있는 표준분자의 최소량 또는 정량한계(Limit of Quantification: LOQ)를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 (신호/잡음) 값은 LOD 값의 3배(LOQ　=　3LOD), 및 10 이상이어야 하는 국제적 수준에 고정된다.
또한, 본 발명에 따른 희석범위는 박편의 두께, 및/또는 매트릭스의 성질, 및/또는 검출상 상기 매트릭스 증착의 모드, 및/또는 분자의 정량의 영향을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 조직 및/또는 분자의 함수로 최적 박편 두께 및/또는 가장 적절한 매트릭스를 측정하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 획득된 희석범위는 상기 조직의 분석에서 조직 내 표적분자를 정량하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 대상은 희석범위의 재구성된 조직과 동일한 관심조직 내 표적분자를 정량하기 위한 재구성된 조직 내 표준분자의 희석범위의 용도이다.
유사하게, 본 발명의 대상은 하기의 단계를 포함하는, 하나 이상의 관심조직에서 하나 이상의 표적분자를 검출 및 정량하는 방법이다:
a) 조직의 박편을 분석하여 상기 박편 내 표적분자의 양을 나타내는 신호를 획득하는 단계; 및
b) 관심조직과 동일한 재구성된 조직 내 표준분자의 희석범위를 사용함으로써 상기 조직 내 표적분자의 양을 측정하는 단계.
사용되는 희석범위는 조직 균질액을 제조하기위한 관심조직과 동일한 조직을 사용함으로써 전술된 (i)단계 내지 (v)단계에 따라 획득될 수 있다.
조직은 하나 이상의 생물학적 조직(식물 또는 동물)의 적어도 일부로 이해된다.
일 구현예에서, 생물체내 다수의 조직, 특히 인접하는 다수의 조직을 포함하는 조직 시료 내 하나 이상의 표적분자를 정량하는 것이 가능하다. 예를 들어, 조직 시료의 박편은 하나 이상의 장기 또는 하나 이상의 장기 일부를 포함하여, 전체 동물 또는 동물의 일부의 박편으로 구성될 수 있다. 특히, 전체 동물의 박편 상의 분석은 하나의 동일한 시료 상에서 상기 동물의 다른 조직 내 하나 이상의 표적분자의 분포를 비교할 수 있게 한다. 이와 같은 경우, 조직 시료의 각 조직 내 주어진 표적분자의 양을 측정하기 위해, 고려된 조직에 특이적인 상기 표적분자의 희석범위가 사용된다.
표적분자의 a)분석단계는 특히 직접 질량분석(MS) 또는 탠덤(tandem) 질량분석(MSn, MRM, SRM)의 사용에 의한 질량분석, 형광에 의한 분석, 자가방사 등과 같은 임의의 분석방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 유리하게는 질량분석과 함께 사용될 수 있다. 이와 같은 경우, TOF(Time Of Flight), Orbitrap, FTICR(Fourier Transform Ion Cyclotronic Resonance) 등과 같은 다른 종류의 분석장치와 결합된 MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization), LDI(Laser Desorption-Ionization), LESA (Liquid Extraction Surface Analysis), LAESI(Laser Ablation Electrospray Ionization), DESI(Electrospray Desorption-Ionization), NanoDESI 등과 같은 다른 이온화 소스가 사용될 수 있다. 상기 이미징 기법은 상기 조직 시료 내 표적분자의 공간분포에 대응되어, 조직 시료에 대해 획득된 이온 밀도 맵 상에 표적분자를 직접적으로 정량할 수 있게 한다. 실제로, 상기 이온 밀도 맵 상에 획득된 신호를 대응되는 희석범위로 전송하는 것이 가능하다.
MALDI 또는 ME-SIMS와 같은 일부 질량분석 기법은 분석될 조직 시료의 박편이 UV를 흡수하는 소형 유기분자를 포함하는 매트릭스에 의해 먼저 덮힐 것을 요구한다. 상기 매트릭스는 시료에 존재하는 분자의 탈착 및 이온화를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법은 선택된 매트릭스와 관계없이 사용될 수 있다. 상기 매트릭스는 고체 형태(시료 상에서 결정화) 또는 액체 형태를 갖고, 이온성 또는 비이온성이라고 불린다. 매트릭스의 선택은 분석되는 질량 시리즈에 따라 이루어진다. 이들은 대개 용매-수성액 혼합물에서 즉석에서 제조된다.
다양한 매트릭스 증착 방법, 특히 조직 상에 정확한 부피의 매트릭스를 증착할 수 있게 하는 피펫을 사용한 수동 증착이 가능하다. 또한, 분무 또는 기화에 의해 매트릭스를 증착하는 것이 가능하고, 매트릭스는 로봇을 사용하거나 또는 수동으로 조직 시료상에 직접적으로 분무 또는 기화된다. 유사하게, 압전(piezoelectric), 음향(acoustic) 또는 시린지 펌프(syringe pump) 시스템을 통해 조직 시료에 매트릭스가 점(spot)으로 가해지는 미세액적(microdroplet)에 의한 증착이 고려될 수 있다. 또한, 고체 형태의 매트릭스를 증착하기위해, 매트릭스를 스크리닝(screening)에 의해 증착할 수 있다.
질량 범위 및/또는 레이저 강도와 같은 실험 파라미터는 유리하게는 강도, 감도 및 해상도의 면에서 표적분자의 검출이 최적화되도록 정해진다.
다음 단계는 상기 박편 내 표적분자의 양을 나타내는 신호를 획득하는 것이다.
분석이 질량 스펙트럼을 획득하는 것으로 이루어지는 경우, b)단계의 신호, 특히 질량 스펙트럼 피크의 강도, 신호-잡음비(S/N), 피크의 면적 등과 같은 다른 스펙트럼 특성이 사용될 수 있다. 분명히, 표적분자를 정량하기 위해 사용된 스펙트럼 특성은 표준범위의 제조를 위해 사용된 스펙트럼 특성과 동일하다. 그리고, 더욱 일반적으로, 표적분자를 정량하기 위해 고려되는 신호의 특성은 표준범위의 제조를 위해 사용된 신호의 특성과 동일하다.
더욱이, 특정 조건에서 스펙트럼 특성 또는 기술에 의해 측정된 정규화 인자에 기반한 특성을 정규화 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 방법이 MALDI 종류의 질량분석 이미징을 사용하는 경우, 시료 상의 매트릭스 증착의 균일성을 평가하는 단계가 제공된다. 실제로, 사용된 매트릭스에 대응되는 신호가 상기 매트릭스의 증착의 품질/균일성에 대한 정보를 제공할 수 있다. 그 후, 시료의 표면상의 매트릭스 결함이 비검출 또는 고려된 시료 내 표적분자로부터의 신호의 강도의 손실에 연관될 수 있다.
매트릭스의 균일성의 평가는 광학 현미경에 의해 시료의 표면 상의 증착의 균일성을 관찰함으로써 정성적 기준에 따라 수행될 수 있고, 및/또는 시료 상의 매트릭스 자체에 대한 신호의 가변성을 추적함으로써 정량적 기준에 따라 수행될 수 있다.
정성적 기준에 있어서, 고려된 표면 상에 가능한 균일하게 매트릭스가 증착되었다는 것, 매트릭스가 결여된 영역이 없다는 것, 및 이의 결정화는 최적이라는 것을 확인하는 것이 필수적이다.
매트릭스 증착의 균일성의 정량성 평가를 위해, 매트릭스는 시료의 분석시에, 표적분자로부터의 신호와 동일한 방법으로 신호가 검출되는 특이적인 분자로 고려된다. 그 후, 매트릭스 분자로부터의 신호는 이의 기준신호와 비교된다. 이와 같은 경우에 매트릭스의 기준신호는 기준 매트릭스 증착, 즉 매트릭스의 기준신호를 측정하기 위해 특이적으로 사용되는 분석 지지체 및 시료 상에 매트릭스에 의해 방출된 신호에 대응된다.
이와 같은 추가적인 단계에 의해, 매트릭스 증착의 스펙트럼 특성에 영향을 줄 수 있는 매트릭스 증착의 품질의 변화를 고려하기 위해 표적분자로부터의 신호가 검증 및 정규화된다.
이와 같은 매트릭스 효과의 포함은 시간에 따라 표적분자의 존재의 동향을 추적할 필요가 있는 경우에 특히 유리하고, 매트릭스 증착의 품질은 시료마다 다를 수 있다.
사용된 표준범위는 표적분자와 동일한 표준분자를 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 표적분자와 다르고, 유사한 물리화학적 특성을 갖는 표준분자를 사용할 수 있다. 또한, 동위원소에 의해 표지된 표적분자를 희석범위의 제조를 위한 표준분자로서 사용할 수 있다.
사용되는 분석 방법에 따라, 표적분자는 표지될 수 있다. 예를 들어, 형광분석의 경우, 표적분자는 형광분자에 의해 표지될 수 있다. 유사하게, 자가방사에 의한 분석의 경우, 표적분자는 방사능표지된다.
본 발명에 따른 방법은 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 핵산, 지질, 대사물질 등과 같이 모든 종류의 분자의 분석을 위해 사용될 수 있고, 일반적으로 약학적으로 또는 다른 방법에 의해 활성인 분자를 위해, 특히 질량분석에 의한 분석의 경우에, 이온화될 수 있는 임의의 분자에 대해 사용될 수 있다.
표적분자가 분자량이 높은 단백질인 경우, 이를 다수의 펩티드로 나누기 위해 표적분자의 효소 전처리를 수행할 수 있다. 그 후, 상기 단백질을 나타내는 상기 효소 소화로부터 획득된 하나 이상의 펩티드에 대해 검출 및 정량이 수행된다. 예를 들어, 표적 단백질을 미리 식별된 다수의 펩티드로 나누기 위해 트립신이 사용될 수 있다.
유사하게, 분석될 조직을 하나 이상의 용매 및/또는 하나 이상의 세제에 의해 검출단계 전에 처리하여, 배경잡음에 책임이 있는 분자를 제거할 수 있다. 예를 들어, 클로로포름에서의 세척은 특정 등급의 지질을 제거할 수 있게 한다. 이의 부분을 위한 에탄올에서의 세척은 낮은 질량의 분자를 더 잘 검출할 수 있게 한다. 상기 2가지 세척은 유리하게는 특정 분자, 특히 지질 분자를 제거하여, 조직 시료 상에 새로운 이온을 직접적으로 검출할 수 있게 한다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 하나의 동일한 조직 및/또는 다수의 조직을 포함하는 하나의 동일한 조직 시료 상에서 2 이상의 다른 표적분자를 동시에 또는 순차적으로 정량하기 위해 사용될 수 있다. 그 후, 고려된 표적분자 및 고려된 조직에 각각 특이적인 다른 희석범위가 사용된다.
유사하게, 하나의 동일한 표적분자가 질량분석에 의해 또는 다른 방법으로 다수의 조직을 포함하는 조직 시료를 분석함으로써 다른 조직 상에서 동시에 검출 및 정량될 수 있다. 이와 같은 경우, 시료, 예를 들어 전체 동물 박편 내 장기의 조직 각각을 위해, 대응되는 조직/장기 내 상기 표적분자에 대해 제조된 희석범위가 사용된다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 조직의 박편으로부터 조직 내 하나 이상의 표적분자를 검출 및/또는 정량하는 방법을 검증하는 방법을 제안한다:
(x) 검출 및/또는 정량 방법이 적용되어야 하는 조직과 동일한 조직을 분쇄하여 조직 균질액을 획득하는 단계;
(xi) (x)단계로부터의 조직 균질액의 2 이상의 시료와 표준분자를 혼합하는 단계, 여기서 상기 표준분자는 조직 균질액의 2 이상의 시료에 대해 알려진 농도와 동일함;
(xii) (xi)단계에서 획득된 조직 균질액의 시료를 컨디셔닝하여 조직 균질액의 상기 컨디셔닝된 시료를 박편화할 수 있게하는 단계;
(xiii) (xii)단계로부터의 조직 균질액의 컨디셔닝된 시료 각각의 하나 이상의 박편을 분석하여, 박편 각각에 대한 표준분자를 나타내는 신호를 획득하는 단계; 및
(xiv) 박편 각각에 대해 획득된 신호를 서로 비교하는 단계.
이와 같은 방법은 특히 검출 및/또는 정량방법의 상류에서 주어진 재구성된 조직, 즉 컨디셔닝된 조직 균질액이 대응되는 전체 조직을 나타내는 것을 확인할 수 있게한다. 상기 방법은 주어진 분자 및 주어진 시료에 대한 본 발명에 따른 검출 및/또는 정량방법의 감도를 특히 LOD에 의해 평가할 수 있게 한다.
유리하게는, (xi)단계는 조직 균질액의 3개 이상의 시료 상에서 수행된다.
(xiv)단계에서 수행된 신호의 비교는 유리하게는 10진법값 또는 퍼센트로 주어진 상대표준편차(relative standard deviation: RSD)를 계산함으로써, 주어진 조직 내 주어진 분자의 검출 및/또는 정량의 재현성을 평가할 수 있게 한다.
분명히, 희석범위의 제조에 대해 전술된 바와 같이, 조직 및/또는 표준분자의 성질과 같이 조직 균질액의 제조, 컨디셔닝, 표준분자의 제조, 분석 등의 모든 특정 방법은 검증방법의 실시에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 조직의 박편으로부터 관심조직 내 하나 이상의 표적분자를 검출 및/또는 정량하는 방법의 품질 및/또는 재현성을 제어하는 방법을 제안한다:
(xx)　관심조직과 동일한 조직을 분쇄하여 조직 균질액을 획득하는 단계;
(xxi)　알려진 농도의 표준분자를 (xx)단계로부터의 조직 균질액의 시료와 혼합하는 단계;
(xxii)　(xxi)단계로부터 획득된 조직 균질액의 시료를 컨디셔닝하여, 조직 균질액의 상기 컨디셔닝된 시료를 박편화할 수 있게 하는 단계;
(xxiii)　분석될 관심조직의 박편 각각에 대해 (xxii)단계로부터의 조직 균질액의 컨디셔닝된 시료의 박편을 동시에 분석하여, 각 시간에 (xxii)단계로부터의 조직 균질액의 컨디셔닝된 시료의 박편에 대한 표준분자를 나타내는 신호, 및 관심조직에 대한 표적분자를 나타내는 신호를 획득하는 단계; 및
(xxiv) (xxii)단계로부터의 조직 균질액의 컨디셔닝된 시료의 박편 각각에 대해 획득된 신호를 비교하는 단계.
따라서, 본 발명에 따르면, 하나 이상의 화합물을 포함하는 도핑된 조직, 특히 장기, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 식물조직 등의 박편이 검출 및/또는 정량 연구에 있어서 수행되는 각 분석을 위한 품질제어로서 사용되거나, 및/또는 분석기기의 성능을 관찰하기 위해 사용될 수 있다.
관심조직은 검출 및/또는 정량이 수행될 조직인 것으로 이해되어야 한다.
(xxiii)단계는 유리하게는 하나의 동일한 지지체, 특히 하나의 동일한 슬라이드에 분석될 관심조직의 박편 및 조직 균질액의 도핑된/컨디셔닝된 시료의 박편을 증착함으로써 수행된다. 동일한 지지체 제조 조건(예를 들어, 사용된 매트릭스, 증착의 품질) 및 분석 조건이 이와 같이 양 박편 모두에 적용된다.
(xxiv)단계에서 획득된 신호의 변화는 매트릭스 효과와 같은 파라미터의 변화를 고려하기 위해 예를 들어 대응되는 가중 평균(weighting average)을 사용함으로써 정규화될 수 있다.
이와 같은 방법은 예를 들어 박편으로부터의 신호를 서로 간단히 비교하여 분자를 상대적으로 정량하는 것, 시간 내 분자의 생체이용성(bioavailability)의 동향을 관찰하는 것 등을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는, 관심조직 내 하나 이상의 표적분자를 상대적으로 정량하는 방법을 제안하는 것이다:
(xxx)　관심조직과 동일한 조직을 분쇄하여 조직 균질액을 획득하는 단계;
(xxxi)　(xxx)단계로부터의 조직 균질액의 시료를 알려진 농도의 표준분자와 혼합하는 단계;
(xxxii)　(xxxi)단계로부터 획득된 조직 균질액의 시료를 컨디셔닝하여, 조직 균질액의 상기 컨디셔닝된 시료를 박편화할 수 있게 하는 단계;
(xxxiii)　분석될 관심조직의 박편 각각에 대해 (xxxii)단계로부터의 조직 균질액의 컨디셔닝된 시료의 박편을 동시에 분석하여, 각 시간에 (xxxii)단계로부터의 조직 균질액의 컨디셔닝된 시료의 박편에 대한 표준분자를 나타내는 신호, 및 관심조직에 대한 표적분자를 나타내는 신호를 획득하는 단계;
(xxxiv)　분석될 관심조직의 박편 각각에 대해, 재구성된 조직 내 표준분자로부터의 신호에 대한 조직 내 표적분자로부터의 신호의 비를 계산하는 단계; 및
(xxxv)　표적분자의 상대적인 정량을 위해 관심조직의 박편 각각에 대해 획득된 비를 비교하는 단계.
분명히, 희석범위의 제조에 대해 전술된 바와 같이, 조직 및/또는 표준분자의 성질과 같이 조직 균질액의 제조, 컨디셔닝, 표준분자의 제조, 분석 등의 모든 특정 방법은 본 발명에 따른 품질 및/또는 재형성을 제어하는 방법, 상대적인 또는 절대적인 정량 방법, 및 본 발명에 따른 조직에서 검출 및/또는 정량될 수 있는 표적분자의 최소량을 평가하는 방법의 실시에 적용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 정량의 목적을 위한 소스 데이터(source data)의 정규화, 즉 조직 내 표적분자로부터의 신호와 동일한 재구성된 조직 내 표준분자의 희석범위로부터의 대응되는 농도의 연관이 상기 인자를 전부 또는 부분적으로 통합하는 컴퓨터 프로그램에 의해 수행될 수 있다.
이와 같은 컴퓨터 프로그램 또는 데이터 재처리 소프트웨어는 유리하게는 질량분석에 의한 이미징의 경우에 이미지를 가공할 때 매트릭스 효과 또는 표준(동위원소 또는 비동위원소)에 의해 상기 값을 가중한다.
유리하게는, 본 발명에 따른 컴퓨터 프로그램은 관심조직 상의 표적분자의 강도를 재구성된 조직 상의 표준분자의 강도와 비교하여, 다른 조직 간의 관심화합물의 상대적인 정량을 각각에 대해 획득된 비를 비교함으로써 수행할 수 있게 하는 비에 도달한다.
따라서, 본 발명의 다른 대상은 예를 들어, 질량분석에 의한 분석으로부터 획득된 미가공 데이터의 판독, 및/또는 검량선의 측정, 및/또는 표적분자의 정량값을 획득하기 위해 검량선에 의한 미가공 데이터의 정규화와 같이 컴퓨터에 의해 실행될 수 있는 명령을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이터 매체이다. 유리하게는, 컴퓨터에 의해 실행될 수 있는 상기 명령은 컴퓨터 시스템이 적어도 본 발명에 따른 정량방법의 b)단계, 및/또는 검출/정량방법의 품질/재현성을 제어하는 방법의 (xxiv)단계, 및 적적한 경우 본 발명의 따른 상대적인 정량 방법의 (xxxiv)단계 및/또는 (xxxv)단계와 같은 (xxiv)단계에 따른 결과를 사용한 가중단계를 실행할 수 있도록 조정된다.
데이터 매체는 유리하게는 2 이상의 다른 조직 내 하나 이상의 표적분자의 하나 이상의 표준범위를 포함한다. 바람직하게는, 전체 동물의 박편과 같은 생물학적 시료의 경우, 데이터베이스는 상기 시료의 다른 조직 내 하나 이상의 표적분자의 희석범위를 포함한다.
또한, 데이터 매체는 질량분석 이미징에서 사용되는 하나 이상의 매트릭스의 기준신호(reference signal)의 데이터베이스를 포함할 수 있다. 따라서, 데이터 매체를 이용하여 이미징에 의해 시료를 분석하는 경우에, 매트릭스 효과를 고려하는 것이 가능하다.
도 1a 및 도 1b: 본 발명에 따른 희석범위를 제조하기 위한 방법을 적용하는 경우에 사용될 수 있는, 다수의 격실을 갖고, 각 격실은 특정 농도의 표준분자에 의해 도핑된 조직 균질액의 시료를 수용할 수 있는 몰드(mould)를 도식적으로 나타낸 것(도　1a), 및 조직 균질액의 시료는 인접한 시료로부터 파티션에 의해 분리된, 컨디셔닝되고 몰드에서 동결 후에 몰드로부터 벗겨진 조직 균질액의 시료를 도식적으로 나타낸 것(도 1b).
도 2: 질량분석에서 프로프라놀롤(y축)에 의해 방출된 강도의 함수로서 프로프라놀롤(Propranolol)의 농도(㎍/g - x축)를 나타내는, 본 발명의 제조방법에 따라 획득된 조직(신장) 내 표준분자(프로프라놀롤)의 검량선.
도 3: 재구성되고 하나의 동일한 프로프라놀롤 농도에 의해 도핑된 신장 조직 종류의 품질 제어를 사용하여 측정된 MSI에서 분석 가변성을 나타내는 가중 직선(weighting straight line).
장비 및 방법
장비
Sigma-Aldrich사의 프로프라놀롤이 1.10-10 mol/㎕ 프로프라놀롤 용액을 제조하기 위해 사용되었다.
상기 용액을 6개의 다른 정밀 서브볼륨(sub-volume)으로 나누고, 조직 균질액의 시료에 각각 첨가하여 0, 2.8, 5.6, 11.2, 22.4 및 44.8　㎍/g의 시료의 농도를 획득하였다(표 1).
조직 균질액의 시료
Charles River(프랑스)로부터의 25-40　g 무게의 스위스형 수컷 마우스가 사용되었다.
희석범위의 제조를 위해, 대조 마우스(즉, 어떠한 특정 치료도 거치지 않음)로부터 2개의 신장을 적출하였다. 2개의 신장은 미리 살균되고 얼음에 놓인 용기에서 메스(scalpel)를 사용하여 기계적으로 분쇄되었다. 신장 균질액이 획득되면, 상기 균질액의 6개의 1.5　ml 튜브에 대략적으로 분배되고, 조직 균질액의 6개 시료 각각의 무게를 칭량한다(표 1).
조직 균질액의 시료 각각에 프로프라놀롤 용액의 특정 서브볼륨 중 하나가 첨가된다.
하기 표 1은 신장 균질액의 6개의 시료에 대한 구체적인 데이터를 제공한다.
신장 내 프로프라놀롤을 나타내는 희석범위를 제조하는데 사용된 신장 균질액의 시료의 제조
신장 균질액 시료의 번호 균질액 중량(g) 시료 당 첨가된 1.10-10 mol/㎕ 프로프라놀롤 용액의 프로프라노롤 부피(㎕) 시료 내 최종 프로프라놀롤 농도(㎍/g)
1 0.7 61.7 2.8
2 0.4 66.4 5.6
3 0.7 246.8 11.2
4 0.4 265.8 22.4
5 0.4 637.8 44.8
6 0.5 0.0 0
재구성된 조직의 제조
신장 균질액의 시료를 포함하는 튜브 각각이 주위온도에서 1시간 동안 볼텍스(vortex)하여, 상기 시료 내에 프로프라놀롤을 균일하게 분배하였다.
도 1a에 도시된 바와 같이, 7개 가로 파티션(101)이 제공되어 상기 몰드의 더 큰 크기로 연속적으로 연장되는 6개의 격실(102)(도 1a의 몰드에서는 3개의 격실만 형성됨)을 형성하는 알루미늄의 몰드(100)가 사용된다. 몰드는 액체 질소에 위치되어, 신장 균질액을 빠르게 동결한다. 몰드는 그 후 -80℃에서 1시간 동안 위치된다.
그 후, 재구성된 또는 컨디셔닝된 조직(즉, 신장 균질액의 동결된 시료)의 블록(200)을 몰드에서 벗겨내었다(도 1b). 재구성된 조직(201)은 -22℃로 냉각된 저온유지장치를 사용하여 20　㎛의 두께로 박편화되었다. 필요에 따라, 하나의 동일한 박편에 시리즈의 모든 조직(201)은 서로에 대해 파티션(101)에 의해 분리되거나, 원하는 재구성된 조직(들)에 대응되는 부분이 나머지 박편으로부터 분리되었다.
실시예 1: "재구성된 조직" 모델의 검증
본 실시예에서, 동결된 조직 균질액에 의해 형성된 재구성된 조직이 대응되는 전체 조직을 나타내는 모델을 형성한다는 것을 입증하는 것이다.
이를 위해, 본 발명에 따른 재구성된 신장 및 전체 신장의 밀도 및 분자 소광계수(TEC)가 측정 및 비교되었다.
재구성된 조직 6번(대조군, 표 1)의 10개의 박편이 분리되고 각각 지지체에 위치되었다(슬라이드 ITO2).
또한, 조직의 20　㎛ 박편 10개가 다른 대조 마우스로부터 적출된 전체 신장으로부터 제조되고, 주위온도에서 유지되었다. 각 박편은 지지체에 배열되었다(슬라이드 ITO3).
지지체들은 2400　dpi의 HP Scanjet G4010 스캐너에서 동시에 스캐닝되고, 이미지는 jpeg 포맷으로 저장되었다.
그 후, 하기의 표 2에 나타난 바와 같이, 재구성된 신장 박편 및 전체 신장 박편의 평균 밀도가 계산되었다. 더욱 구체적으로, 재구성된 신장의 표면, 높이, 부피 및 무게의 평균값이 재구성된 조직 대조군의 10개의 박편 각각으로부터 획득된 값으로부터 계산되었다. 유사하게, 전체 신장의 표면, 높이, 부피 및 무게가 대응되는 10개의 박편 각각에 대해 획득된 값으로부터 계산되었다.
2개의 조직의 밀도는 그 차이가 0.04 mg/mm3에 불과하여 실질적으로 동일하다는 것이 발견되었다(표 2).
재구성된 조직 및 전체 조직에 대한 TEC를 계산하기 위해, 10　pmol의 프로프라놀롤을 포함하는 MALDI DHB 매트릭스(40　mg/ml 메탄올/TFA 0.1% 1/1)가 로봇화 시스템(SunCollect)을 사용하여 밀도를 계산하기 위해 사용된 10개의 슬라이드 ITO2 및 ITO3의 두 배치(batch)에 분무되었다.
그 후, 조직 박편 각각은 Autoflex speed LRF(Bruker, Daltonics)를 사용하여 MALDI 이미징에 의해 분석되었다.
박편의 배치 각각의 프로프라놀롤(m/z 260.2)의 강도는 조직의 박편 및 지지체 상에서 평균을 내었다.
그 후, TEC는 하기의 식에 따라, 각각 슬라이드 및 조직 상의 프로프라놀롤에 의해 방출된 신호의 강도값을 사용함으로써 계산될 수 있다:
Figure 112013121263081-pct00001
표 2에 나타난 바와 같이, 재구성된 신장 및 전체 신장에 대해 획득된 TEC의 평균값은 동일하다는 것이 발견되었다.
따라서, 재구성된 신장은 전체 신장과 동일한 밀도 및 동일한 조직 소광계수를 갖는다.
재구성된 신장 및 전체 신장의 밀도 및 TEC의 비교
재구성된 신장 박편 전체 신장 박편
픽셀 121637 229374.2
표면(mm2) 12.1637 22.93742
높이(mm) 0.02 0.02
부피(mm3) 0.243274 0.4587484
중량(mg)/박편 0.17 0.305
밀도(mg/mm3) 0.7 0.66
TEC 1.9361 1.922125
표준편차 0.162580886 0.408923827
TEC 오차% 8.4 21.3
따라서, 프로프라놀롤은 재구성된 신장 및 전체 신장에서 동일하게 행동한다. 따라서, 본 발명에 따른 분자의 희석범위의 제조를 위한 재구성된 조직의 사용은 그 후 대응되는 전체 조직 내 상기 분자를 확실하게 정량할 수 있게 한다.
실시예 2: 신장에 대한 프로프라놀롤의 희석범위의 제조
연속된 신장 균질액의 시료를 포함하여, 프로프라놀롤의 6개의 연속되는 농도(표 1에 나타난 순서에 따라)를 갖는 박편이 지지체에 위치되었다(슬라이드 ITO1).
MALDI DHB 매트릭스(40　mg/ml 메탄올/TFA 0.1% 1/1)가 로봇화 시스템(SunCollect)을 사용하여 조직의 박편 상에 분무되었다.
그 후, 신장 균질액의 시료를 나타내는 박편의 각 부분이 Autoflex speed LRF(Bruker, Daltonics)를 사용하여 질량분석 이미징에 의해 분석되었다.
그 후, 동일한 크기의 다수의 관심영역(regions of interest: ROI)의 범위를 조직 균질액의 시료 가각에 대한 질량분석에 의해 획득된 이미지상에 지정하였다.
질량 스펙트럼의 피크의 강도가 기준신호로서 사용하기 위해 선택되었다. 조직 균질액의 시료 각각에 대해, 프로프라놀롤 질량 스펙트럼의 피크의 강도가 ROI 각각에 대해 회수되었다. 또한, 조직 균질액의 시료 각각에 대해, 평균 강도(평균 ROI)가 대응되는 모든 ROI에 대해 획득된 강도로부터 계산되었다.
희석범위의 각 지점에 대한, 즉 조직 균질액의 시료 각각에 대한 프로프라놀롤 질량 스펙트럼의 피크의 평균 강도가 표 3에 나열되었다.
재구성된 신장에서 프로프라놀롤(m/z 260.2)의 희석범위 각 지점에 대해 MALDI 이미징에 의해 획득된 평균 강도
신장 균질액 시료의 번호 재구성된 조직 내 최종 프로프라놀롤 농도(㎍/g) 강도
1 2.8 9273.9
2 5.6 18223.0
3 11.2 37269.0
4 22.4 74191.0
5 44.8 145396.6
6 0.0 500.3
그 후, 검량선을 도시할 수 있다. 상기 검량선은 그 후에 신장 내 프로프라놀롤을 정량하는 방법에 사용될 수 있다. 분석된 신장 내 프로프라놀롤에 대해 획득된 질량 스펙트럼의 피크의 강도를 상기 검량성 상의 농도와 연관시키는 것으로 충분하다.
예를 들어, 질량 스펙트럼 피크의 강도의 함수로서 조직 내 프로프라놀롤 농도(㎍/g)를 나타내며, 검량선이 도시된다(도 2). 희석범위의 모든 지점 또는 지점의 집합의 추이 곡선의 방정식이 예를 들어 엑셀과 같은 그래픽 재처리 소프트웨어를 사용하여 y　=　ax　+　b의 포맷에서 계산된다.
기재된 실시예에서, 추이 곡선(trend curve)에 대한 방정식은 y　=　3244.7x　+　534.92이다. 상기 방정식은 그 후 분자의 정량을 가능하게 한다.
유사하게, 선형 단일 또는 다중 회귀의 질을 판단할 수 있는 지표인 결정계수(여기서, R2 =　0.9999)가 계산된다. 상기 계수가 1에 가까울수록, 추이 곡선은 더욱 선형이 된다.
실시예 3: 처리된 마우스 신장 내 프로프라놀롤의 정량
7.5　mg/kg의 프로프라놀롤에 의해 처리되고, 투여 후 20분에 희생된 마우스의 신장이 적출된다.
3개의 20　㎛ 두께의 조직 박편이 신장으로부터 제조되고, 각각 지지체(슬라이드 ITO)에 위치된다.
MALDI DHB 매트릭스(40　mg/ml 메탄올/TFA 0.1% 1/1)가 로봇화 시스템(SunCollect)을 사용하여 박편상에 분무된다.
각 박편이 Autoflex speed LRF(Bruker, Daltonics)를 사용하여 질량분석 이미징에 의해 분석된다. 프로프라놀롤(m/z 260.2)의 질량 스펙트럼 피크의 평균 강도가 모든 크기가 동일한 각 박편 상의 다수의 ROI를 사용하여 다시 한번 계산된다.
획득된 평균 강도값은 19633.3이다.
신장 내 프로프라놀롤 농도는 검량선 방정식을 사용하여, 상기 직선 상에 획득된 평균 강도 값을 포함함으로써 정량된다(도 2). 여기서, 프로프라놀롤의 농도는 조직의 5.9　㎍/g이다.
실시예 4: 신장 내 프로프라놀롤의 검출한계의 평가
본 용법에 있어서, 재구성된 조직 내 하나 이상의 관심분자의 희석범위 또는 희석점은 선택된 분석방법을 사용한 분자 또는 분자들의 검출을 평가하기 위해 사용된다.
본 실시예에서, 희석범위는 0, 0.3, 0.7, 1.4, 2.8, 5.6, 11.2, 22.4 및 44.8　㎍/g의 시료 내 농도를 획득하도록 신장 균질액의 시료에 각각 첨가되는 프로프라놀롤 용액의 9개의 다른 정밀 서브볼륨으로부터 제조된다.
신장 균질액의 연속된 시료를 포함하고, 이에 따라 프로프라놀롤의 9개의 연속된 농도를 갖는(표 4에 나타난 순서로) 박편이 지지체(슬라이드 ITO) 상에 위치된다.
MALDI-TOF 이미징에 의한 슬라이드의 분석에 있어서, 본 발명에 의해 예비단계에서 분석될 조직을 제조하기 위한 프로토콜을 미세조정할 수 있다. 실제로, 제조된 시리즈를 사용하여 예를 들어 박편의 두께 또는 매트릭스의 및/또는 획득된 신호 상에 증착시키는 이의 방법의 선택의 영향을 평가하기 위한 다수의 제조시험을 수행하는 것이 가능하다.
본 실시예에서, 최적 두께는 20　㎛로 지정되고, 가장 효율적인 MALDI 매트릭스는 40　mg/ml 메탄올/TFA 0.1% 1/1에서의 DHB이다.
그 후, 신장 균질액의 시료를 나타내는 박편의 각 부분은 Autoflex speed LRF(Bruker, Daltonics)을 사용한 질량분석 이미징 또는 직접 분석에 의해 분석된다.
이미징 모드에서의 획득에 있어서, 조직 균질액의 시료 각각에 대해 질량분석에 의해 획득된 이미지상에 동일한 크기의 다수의 관심영역(ROI)의 경계가 지어진다.
직접 분석 모드에서의 획득에 있어서, 시리즈의 각 지점을 나타내는 평균 스펙트럼이 획득된다.
질량 스펙트럼 피크의 강도는 기준신호로서의 용도를 위해 선택된다. 프로프라놀롤의 질량 스펙트럼 피크의 강도는 조직 균질액의 시료 각각에 대해 회수된다. 또한, 조직 균질액의 시료 각각에 대해, 평균 강도가 이에 따라 획득된다.
희석범위의 각 지점, 즉 조질 균질액의 각 시료에 대한 프로프라놀롤의 질량 스펙트럼 피크의 평균강도는 표 4에 나열된다.
재구성된 신장 내 프로프라놀롤(m/z 260.2)의 희석범위의 각 지점에 대해 MALDI 이미징에 의해 획득된 평균 강도
신장 균질액 시료의 번호 재구성된 조직 내 프로프라놀롤의 최종 농도(㎍/g) 강도
1 0.0 500.3
2 0.3 520.6
3 0.7 2806.2
4 1.4 5077.5
5 2.8 9273.9
6 5.6 18223.0
7 11.2 37269.0
8 22.4 74191.0
9 44.8 145396.6
이때, 선택된 매질 내 화합물의 검출한계를 평가할 수 있고, 여기서 이는 0.7　㎍/g이다. 본 실시예에서 검출한계는 화합물이 3 초과의 신호/잡음비에 의해 검출되는 최저 농도가 되도록 설정된다. 정량한계를 측정하는 것도 가능하다는 점에 주목하여야 한다.
또한, 처리된 조직에서 화합물의 정량이 수행되어야 한다면, 본 발명에서 분석방법은 3 log에 선형인 것으로 평가될 수 있다.
더욱 일반적으로, 본 발명은 예를 들어 하기와 같은 다수의 파라미터를 시험 시스템의 제조 전에 생체내(in vivo)에서 평가할 수 있게 한다:
- 조직 박편의 두께
- 화합물의 탈착(desorption) 및 이온화에 가장 적합한 MALDI 매트릭스
- 매트릭스 증착(deposition) 방법
- 기준매질 내 화합물 또는 화합물들의 검출한계 및 정량한계
- 화합물 또는 화합물들의 정량을 수행하기 위한 분석방법의 선형성(linearity)의 범위 등.
실시예 5: MALDI 질량분석 이미징에서 분석의 품질 및 재현성의 제어
본 실시예의 목적은 MALDI 이미징에서 분석의 품질 및 재현성을 평가하는 것이다.
알려진 농도의 프로프라놀롤(5.6　㎍/g)을 포함하는 신장 균질액의 박편이 관심시료로서 하나의 동일한 지지체(슬라이드 ITO)에 위치된다. 상기 재구성된 신장 균질액이 재현성이 평가되는 모든 분석에서 사용된다는 것을 주의하여야 한다.
동일한 제조방법 및 동일한 분석방법이 사용되는 관심시료의 각 분석 동안, 품질제어의 박편이 MALDI 이미징에서 동일한 시간에 분석된다.
따라서, 프로프라놀롤의 평균강도값은 각 분석에 대해 획득되고, 이에 따라 분석의 재현성을 관찰하는 것이 가능하다. 따라서, 관심조직의 10번의 분석에 있어서, 5.6　㎍/g의 프로프라놀롤에 의해 도핑된 재구성된 신장의 박편이 첨가되었다. 도 3은 하나의 동일한 연구에서 10번의 구성요소 분석에 있어서 획득된 가변성을 나타낸다.
따라서, 다른 분석간의 관심 화합물(들)을 상대적으로 정량하기 위해, 실험적 가변성을 관찰하거나, 상기 품질 제어에 상대적으로 각 분석에 대해 획득된 값을 정규화할 수 있다.
조직의 제조(특히, MALDI 매트릭스의 증착)의 품질 및 사용된 기기의 분석 수행 수준의 품질을 판단하는 것도 가능하다. 상기 품질 제어의 결과의 함수로서 유지가 결정될 수 있다는 점에 주목하여야 한다.

Claims (21)

  1. 하기 단계를 포함하는, 식물 또는 동물의 하나 이상의 조직에서 질량분석 이미징(mass spectrometry imaging)에 의해 하나 이상의 표적 분자의 분포를 검출하거나 또는 하나 이상의 표적 분자를 정량하는 방법:
    (a) 상기 식물 또는 동물로부터 조직 시료를 획득하고, 상기 조직을 조직 박편으로 박편화하고, 조직 박편 상에 질량분석 이미징 분석을 수행하고, 상기 조직 박편 내 상기 하나 이상의 표적 분자를 나타내는 질량 스펙트럼 신호를 검출하는 단계; 및
    (b) 조직 균질액의 고체 시료의 박편 내 하나 이상의 표적 분자의 농도를 나타내는 검량선(callibration curve) 내 질량 스펙트럼 신호와 상기 조직 박편 내 검출되는 상기 하나 이상의 표적 분자의 질량 스펙트럼 신호를 연관시킴으로써 조직 시료 내 상기 하나 이상의 표적 분자의 양 및 분포를 측정하기 위하여 하나 이상의 표적 분자의 질량 스펙트럼 신호를 사용하는 단계로, 상기 검량선은 하기의 단계에 따라 획득되는, 단계:
    (i) 단계 (a)의 조직과 동일한 조직의 조직 균질액을 제공하는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 제공된 조직 균질액의 제1 시료에 알려진 제1농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 첨가하는 단계;
    (iii) 단계 (i)에서 제공된 조직 균질액의 제2 시료에 알려진 제2농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 첨가하는 단계로, 하나 이상의 표적 분자의 상기 알려진 제2농도는 하나 이상의 표적 분자의 상기 알려진 제1농도와는 상이한 것인, 단계;
    (iv) 임의로, 단계 (i)의 조직 균질액의 하나 이상의 추가의 시료와 표적 분자의 상기 제1농도 및 제2농도와는 상이한 추가의 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 이용하여 단계 (ii) 및 단계 (iii)을 반복하는 단계;
    (v) 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 시료들을 고체화하는 단계;
    (vi) 상이한 알려진 농도의 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 상기 고체 시료들을 실질적으로 동일한 두께로 박편화하는 단계; 및
    (vii) 상기 하나 이상의 표적 분자에 대한 조직 균질액의 상기 박편화된 고체 시료들에 대해 질량 분석 분석법을 수행하고, 조직 균질액의 고체 시료의 각 박편 내 상기 하나 이상의 표적 분자의 각각의 농도를 나타내는 신호를 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조직 균질액의 시료들을 고체화하는 단계는 조직 균질액의 상기 시료를 동결 및/또는 코팅하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 알려진 농도의 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액이, 상기 조직 균질액 내 상기 하나 이상의 표적 분자가 균일하게 분포되도록 혼합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    둘 이상의 상이한 표적 분자가 상기 조직 박편 및 상기 조직 균질액 박편에서 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분자는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 아미노산, 핵산, 지질, 약물, 약학적으로 또는 생물학적으로 활성인 분자 또는 대사물질인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    표적 분자의 질량 스펙트럼과 관련된 신호는 표적 분자의 질량 스펙트럼의 피크의 강도, 피크의 넓이 또는 신호/잡음비(signal/noise ratio)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    표적 분자가 동위원소적으로 표지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    표적 분자가 전체 동물(whole animal)의 박편 상에서 직접적으로 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 하기 단계를 포함하는, 조직 내 하나 이상의 표적 분자를 상기 조직의 박편으로부터 검출하는 방법을 검증(validating)하는 방법:
    (a) 하기를 포함하는, 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액을 제공하는 단계:
    (i) 조직의 조직 균질액을 제공하는 단계;
    (ii) 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 단계 (i)에서 제공된 상기 조직 균질액의 2개 이상의 시료에 첨가하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액을 혼합하는 단계;
    (iv) 알려진 농도들의 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 시료들을 고체화하는 단계; 및
    (v) 단계 (iv)의 조직 균질액의 고체 시료들을 실질적으로 동일한 두께로 박편화하는 단계, 및
    (b) 조직 균질액의 박편화된 고체 시료들에 대해 질량 분석 분석법을 수행하고 각각의 조직 균질액 박편 내 하나 이상의 표적 분자의 각각의 농도에 대한 신호를 검출하는 단계.
  10. 조직 내 검출 가능한 표적 분자의 최소량을 검출하는 방법으로, 상기 최소량은 3 이상의 신호/잡음값(signal/noise value)을 가지고, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 하나 이상의 표적 분자의 희석 범위를 제공하는 단계로, 상기 희석 범위를 제공하는 것이 하기의 단계들을 포함하는, 단계:
    (i) 상기 조직의 조직 균질액을 제공하는 단계;
    (ii) 알려진 제1농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 단계 (i)에서 제공된 조직 균질액의 제1 시료에 첨가하고, 상기 조직 균질액과 상기 하나 이상의 표적 분자를 혼합하는 단계;
    (iii) 하나 이상의 표적 분자의 알려진 제1농도와는 상이한 알려진 제2농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 단계 (i)에서 제공된 상기 조직 균질액의 제2 시료에 첨가하고, 상기 조직 균질액과 상기 제2농도의 하나 이상의 표적 분자를 혼합하는 단계;
    (iv) 임의로, 단계 (i)의 조직 균질액의 하나 이상의 추가 시료와 상기 표적 분자의 제1농도 및 제2농도와는 상이한 하나 이상의 추가의 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 사용하여 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하는 단계;
    (v) 상기 하나 이상의 표적 분자의 알려진 농도를 포함하는 조직 균질액의 시료들을 고체화하는 단계; 및
    (vi) 상이한 농도의 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 상기 고체 시료들을 실질적으로 동일한 두께로 박편화하는 단계, 및
    (b) 조직 균질액의 상기 박편화된 고체 시료들에 대해 질량분석 분석법을 수행하고 각각의 조직 균질액 박편 내 상기 하나 이상의 표적 분자의 각 농도에 대한신호를 검출하는 단계.
  11. 하기를 포함하는, 표적 분자의 희석 범위로부터, 조직 내 표적 분자의 정량 한계 (Limit of quantification:LOQ)를 검출하는 방법으로, 검출가능한 최소 신호의 신호/잡음값의 3배이상 큰 신호/잡음값을 나타내고 10보다 큰 값을 가지는 최소 신호가 LOQ인, 방법:
    (a) 상기 하나 이상의 표적 분자의 희석 범위를 제공하는 단계로, 상기 희석 범위를 제공하는 것은 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    (i) 조직의 조직 균질액을 제공하는 단계;
    (ii) 알려진 제1농도의 하나 이상의 표적 분자를 단계 (i)에서 제공된 상기 조직 균질액의 제1 시료에 첨가하고, 상기 조직 균질액과 상기 하나 이상의 표적 분자를 혼합하는 단계;
    (iii) 상기 하나 이상의 표적 분자의 알려진 제1농도와는 상이한 알려진 제2농도의 하나 이상의 표적 분자를 단계 (i)에서 제공된 상기 조직 균질액의 제2 시료에 첨가하고, 상기 조직 균질액과 상기 제2농도의 하나 이상의 표적 분자를 혼합하는 단계;
    (iv) 임의로, 상기 표적 분자의 제1농도 및 제2농도와는 상이한 추가의 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자와 단계 (i)로부터의 조직 균질액의 하나 이상의 추가의 시료를 사용하여 단계 (ii) 및 단계 (iii)을 반복하는 단계;
    (v) 상기 알려진 농도의 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 시료들을 고체화하는 단계;
    (vi) 상이한 알려진 농도의 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 상기 고체 시료들을 실질적으로 동일한 두께로 박편화하는 단계; 및
    (vii) 조직 균질액의 상기 박편화된 고체 시료에 대해 질량분석 분석법을 수행하고 각각의 조직 균질액 박편 내 및 상기 조직 박편 내 하나 이상의 표적 분자를 검출하는 단계.
  12. 하기의 단계를 포함하는 관심 조직 내 하나 이상의 표적 분자를 상기 조직의 박편으로부터 검출하는 방법의 품질 및/또는 재현성을 제어하는 방법:
    (a) 조직의 조직 균질액 시료를 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 제공된 상기 조직 균질액에 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 첨가하는 단계;
    (c) 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 시료를 고체화하는 단계;
    (d) 상기 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 상기 고체 시료를 실질적으로 동일한 두께로 박편화 하는 단계; 및
    (e) 조직 균질액의 상기 박편화된 고체 시료와 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 박편에 대하여 질량분석 분석법을 동시에 수행하고, 박편화되고 고체화된 조직 균질액 내 표적 분자를 나타내는 신호와 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 박편에 대한 표적 분자를 나타내는 신호를 검출하는 단계.
  13. 하기의 단계를 포함하는, 관심 조직 내 하나 이상의 표적 분자를 검출하는 방법:
    (a) 관심 조직의 조직 균질액을 제공하는 단계;
    (b) 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 단계 (a)에서 제공된 조직 균질액의 시료에 첨가하는 단계;
    (c) 상기 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 시료를 고체화하는 단계;
    (d) 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 상기 고체 시료를 실질적으로 동일한 두께로 박편화하는 단계; 및
    (e) 상기 조직 균질액의 박편화된 고체 시료와 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 박편에 대하여 동시에 질량분석 분석법을 수행하고 박편화된 고체 조직 균질액 내 표적 분자를 나타내는 신호 및 상기 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 박편에 대하여 표적 분자를 나타내는 신호를 검출하는 단계.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 신호가 질량 스펙트럼의 피크의 강도, 피크의 면적 또는 신호/잡음비로 구성된 군에서 선택되는 것인, 방법.
  15. 하기의 단계를 포함하는, 하나 이상의 조직 내 하나 이상의 표적 분자를 검출 및 정량화 하는 방법:
    (a) 조직 박편에 질량분석 분석법을 수행하고 상기 조직 박편 내 상기 하나 이상의 표적 분자를 나타내는 질량 스펙트럼 신호를 검출하는 단계,
    (b) 하나 이상의 표적 분자의 희석 범위를 제공하는 단계로, 상기 희석 범위를 제공하는 것이 하기의 단계를 포함하는, 단계:
    (i) 단계 (a)의 조직과 동일한 조직의 조직 균질액을 제공하는 단계;
    (ii) 알려진 제1농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 단계 (i)에서 제공된 상기 조직 균질액의 제1 시료에 첨가하는 단계;
    (iii) 상기 하나 이상의 표적 분자의 알려진 제1농도와는 상이한 알려진 제2농도의 상기 하나 이상의 표적 분자를 단계 (i)에서 제공된 상기 조직 균질액의 제2 시료에 첨가하는 단계;
    (iv) 임의로, 상기 표적 분자의 제1농도 및 제2농도와는 상이한 하나 이상의 추가의 알려진 농도의 상기 하나 이상의 표적 분자와 단계 (i)로부터의 조직 균질액의 하나 이상의 시료를 사용하여 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하는 단계;
    (v) 상기 알려진 농도의 하나 이상의 표적 분자를 포함하는 조직 균질액의 시료들을 고체화하는 단계;
    (vi) 상기 하나 이상의 표적 분자의 상이한 알려진 농도를 포함하는 조직 균질액의 상기 고체 시료들을 실질적으로 동일한 두께로 박편화하는 단계; 및
    (vii) 조직 균질액의 상기 박편화된 고체 시료에 대하여 질량분석 분석법을 수행하고 각각의 조직 균질액 박편 내 상기 하나 이상의 표적 분자의 각각의 농도를 나타내는 신호를 검출하고 상기 조직 박편 내 상기 표적 분자를 정량하는 단계, 및
    (c) 단계 (b)에서 제공된 희석 범위를 사용하여 조직 내 표적 분자의 양을 측정하는 단계.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 조직 박편 내 검출되는 하나 이상의 표적 분자를 나타내는 질량 스펙트럼 신호와 단계 (i) 내지 (v)의 조직 균질액 박편 내 상기 하나 이상의 표적 분자의 농도를 나타내는 질량 스펙트럼 신호를 연관시킴으로써 단계 (a)의 조직 박편 내 하나 이상의 표적 분자의 분포의 이미지를 재구축하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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