CN103068963B - 用于制造仿生结构的设备、工具包和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过使用可以是多孔隙的柱塞在孔中塑性地压缩诸如胶原凝胶的凝胶来制造仿生结构的设备、工具包和方法。该设备、工具包和方法允许以受控的且可再生的方式制造仿生结构，并且适于制造多层结构。

Description

用于制造仿生结构的设备、工具包和方法
技术领域
本发明涉及用于制造仿生结构的设备、工具包和方法。
背景技术
传统地，组织工程学旨在将初始的细胞-骨架结构转换成具有仿生功能的组织状构造。此转换过程通常包括在培养物中进行基于细胞的重建（重组，remodelling）。然而，在大多数情况中，基于细胞的重建已经证明较慢（通常需要花费数周的时间）、难以控制且昂贵、仅具有有限的组织生物人造材料或“组织”的能力（M.Eastwood等人，Cel.Motil.Cytoskel.，19984013；D.Huang等人，Ann.Biomed.Eng.，199321289）。这可部分地归因于与组织密度（例如，韧带、真皮和肌肉中的组织密度）相关的灌注/缺氧的限制。通过细胞实际上如何产生特别天然的微结构（即，3D细胞基质组织）的有限理解来复合。材料成分以及更特别地生物人造的工程结构的3D纳米微型（中位）尺度的结构对于其成功来说是关键的（R.A.Brown，in Future Strategies for Tissue and Organ Replacement（编辑：J.M.Polak，L.L.Hench，P.Kemp），World Scientific Publishing，新加坡（2002）48；R.A.Brown等人，WoundRep.Reg.（1997）5212）。
已经用压缩胶原凝胶来制造组织等同植入物。然而，已知的压缩方法是不可再生产的或者不容易自动化。用于精确且可再生产地制造压缩胶原凝胶的方法和设备对于制造用于治疗和构建目的的人造组织来说是重要的。
本发明涉及用于受控地可再生产地制造仿生结构的方法和设备的改进。这些仿生结构可用作人造组织，例如，在治疗方法中以及在体外构建和筛选方法中可用作人造组织。
本发明的一个方面提供了一种制造仿生结构的方法，包括：
（i）将凝胶溶液引入具有开口的孔（井状件，well），
（ii）培育凝胶溶液以形成凝胶，
（iii）将柱塞引入孔，
（iv）用柱塞压缩凝胶，使得液体从凝胶排出，以及
（v）移除柱塞，以在孔中留下仿生结构。
凝胶可包括一种或多种胶凝聚合物。适当的胶凝聚合物包括天然胶凝聚合物（例如诸如胶原的蛋白质、层粘连蛋白、丝（silk）、纤维蛋白或弹性蛋白、诸如纤连蛋白的糖蛋白、例如甲壳质的多糖、或纤维素）、以及合成胶凝聚合物（例如有机聚合物（诸如聚内酯、聚甘氨酸（polyglycone）、聚己内酯和合成多肽）、以及无机聚合物（例如磷酸盐玻璃））。
在一些实施方式中，凝胶可包括两种、三种或更多种胶凝聚合物。例如，凝胶可包括胶原和一种或多种如上所述的非胶原胶凝聚合物。
在优选实施方式中，凝胶是胶原凝胶。一种制造仿生结构的方法可包括：
（i）将胶原溶液引入孔，
（ii）培育胶原溶液以形成胶原凝胶，
（iii）将柱塞引入孔，
（iv）用柱塞压缩凝胶，使得液体从凝胶排出，以及
（v）移除柱塞，以在孔中留下仿生结构。
胶原是一种在间隙液体中包括胶原微纤维的水凝胶。胶原凝胶通常是各向同性的，并且胶原纤维随机地定向。在包括胶原类型的胶原凝胶中可优选的形成天然微纤维的胶原类型是，I、II、III、V、VI、IX和XI以及这些的组合（例如，I、III、V或II、IX、XI）。优选地，使用天然的I型胶原。
胶原凝胶可包括胶原，并且另一种非胶原胶凝聚合物包括天然的和合成的胶凝聚合物，如上所述。
用来制造一层紧实凝胶结构的凝胶溶液（例如，胶原溶液或非胶原凝胶溶液）的初始体积将取决于制造方法以及压缩结构的设计和预期用途。例如，凝胶溶液可具有0.1至10ml的体积，例如，1、2、3、4或5ml。在一些优选实施方式中，可用2至3.5ml的凝胶溶液来制造大约100至150μm厚的压缩结构。所使用的凝胶溶液的量取决于将制造的凝胶的高度和横截面面积。例如，为了在6mm直径的孔（28mm2）中制造具有3mm至10mm的高度的凝胶，可使用0.08ml至0.28ml的凝胶溶液。为了在110mm×75mm的孔中制造具有3mm至16mm的高度的凝胶，可使用24ml至132ml的凝胶溶液。
在一些实施方式中，在允许胶原溶液或非胶原凝胶溶液固化成凝胶之前，可用细胞种植该胶原溶液或非胶原凝胶溶液。种植可出现在引入孔之前或之后。优选地，在凝胶形成之前，在适当的温度、pH、离子强度和完全保持存活力的条件下执行凝胶溶液的种植。
适当的细胞包括真核细胞，特别是高级真核细胞，例如植物细胞和动物细胞。
在一些实施方式中，该细胞可以是哺乳动物细胞，例如，具有组织功能以及提供替换或便于修复内生组织的结构的细胞。例如，凝胶可包括一种或多种提供可收缩结构的肌肉细胞、提供导电元件的脉管和/或神经细胞、提供分泌结构的主动代谢分泌细胞（例如肝细胞、激素合成细胞、脂肪细胞、胰岛细胞或肾上腺皮质细胞）、干细胞（例如骨髓源的细胞或胚胎干细胞、真皮成纤维细胞、皮肤角化细胞、（以及真皮成纤维细胞和皮肤角化细胞的组合层））、用于神经植入的施万细胞、用于膀胱/尿道结构的尿道上皮和平滑肌细胞、以及用于骨骼和肌腱结构的骨细胞、软骨细胞和腱细胞。在一些实施方式中，在凝胶中种植的细胞可包括成纤维细胞，例如鼠或人真皮成纤维细胞（包括新生真皮成纤维细胞）、以及人血管成纤维细胞。
可在凝胶溶液中种植细胞，其可以是胶原或非胶原凝胶溶液，密度是1×103或1×104至1×106个细胞/ml，优选地，大约1×105个细胞/ml。
可以任何布置方式在凝胶内分布细胞。例如，可在凝胶中均匀地分布细胞，或可在凝胶内的限定区域、范围或层中分布细胞。
可用标准液体处理技术将凝胶溶液引导至孔中。
然后，可将凝胶溶液（其可以是胶原溶液或非胶原凝胶溶液，并可以可选地包含细胞）固化成凝胶。例如，将凝胶溶液（例如胶原溶液）固化成凝胶在本领域中是众所周知的，典型地包括，例如加热至36°C至38°C。例如，可通过在中性pH下、在大约37°下培育来引导胶原溶液聚合（聚集）成凝胶。
种植的凝胶的平均密度（例如，种植的胶原凝胶的平均胶原密度）在压缩之前可以是0.5至5mg/ml，优选地1.5至4mg/ml。
在一些优选方法中，柱塞是多孔隙（porous）的。用多孔隙柱塞吸收在压缩过程中从凝胶排出的液体。例如，柱塞可包括烧结的或非烧结的材料，例如塑料、纤维素（例如醋酸纤维素）、石膏、纤维网、金属、或陶瓷。优选地，柱塞适于在其被引入时密封孔的开口，使得液体进入柱塞并且不会由于压缩而从孔排出。
在一些实施方式中，胶原或非胶原凝胶可具有单个FLS，FLS是与多孔隙柱塞接触的表面，即，所有从凝胶排出的液体被引导通过与多孔隙柱塞接触的凝胶表面，FLS。
在凝固（setting，硬化，沉积，筛分）之后，利用柱塞使孔中的凝胶受到塑性压缩。
凝胶的塑性压缩导致其变形并减小其体积，使得甚至在移除压缩之后凝胶也能保持或基本上保持其新的体积。在WO2006/03442（Brown RA等人（2005）Adv.Funct.Mat.15:176-177）中以及其它文献中更详细地描述了塑性压缩。
当对凝胶施加压缩时通过其排出液体的凝胶的表面通常叫做流体离开表面（FLS）。可用通过FLS排出的液体的量、用FLS的每个单位表面积的塑性压缩（即，V排出mm3/AFLSmm2）来测量压缩的程度。这可以是高度减小（以单位mm表示）。通过FLS排出的液体的适当的体积（用每个FLS单位表面积的塑性压缩）可以是2至16.5mm，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16mm，优选地，是2至14mm、2.5至13mm、或5至10mm。
塑性压缩可将凝胶的体积减小80%至99.5%。例如，压缩的凝胶可具有其原始体积的1%、2%、3%、4%或5%。在一些优选实施方式中，可排出凝胶中的液体的至少95%、96%、97%、98%或99%w/w。
在一些实施方式中，在压缩之后，可用细胞种植压缩的凝胶结构（例如，压缩的胶原或非胶原结构）的表面。
在压缩和可选的种植之后，可在孔中的培养基中培育包含细胞的凝胶结构。适当的条件在本领域中是众所周知的。培育的时长和条件将取决于预期用途。典型地，在结构的表面已经被种植的情况下，可一直培育该结构，直到在表面上形成汇合层为止，例如，培育1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天。
在一些实施方式中，可重复该方法，以制造多层结构。例如，一种方法可进一步包括：
（vi）将另一凝胶溶液引至孔中的压缩凝胶层上，
（vii）培育所述另一凝胶溶液，以形成另一凝胶，
（viii）将多孔隙柱塞引入孔中，
（ix）用柱塞压缩所述另一凝胶，使得将液体从凝胶排出至柱塞中，
（x）移除柱塞，以在孔中留下包括多层压缩凝胶的结构。优选地，凝胶是胶原。一种方法可进一步包括：
（vi）将另一胶原溶液引至孔中的压缩胶原层上，
（vii）培育该另一胶原溶液，以形成另一胶原凝胶，
（viii）将多孔隙柱塞引入孔中，
（ix）用柱塞压缩该另一胶原凝胶，使得将液体从胶原凝胶排出至柱塞中，
（x）移除柱塞，以在孔中留下包括多层压缩胶原的胶原结构。
可用细胞种植所述另一凝胶溶液（例如该另一胶原溶液），该细胞可以是与原始凝胶溶液相同或不同的细胞。
在一些实施方式中，多孔隙柱塞可以是与在第一压缩步骤中使用的相同的柱塞。在其他实施方式中，可对每个压缩步骤使用不同的多孔隙柱塞。
可将步骤（vi）至（x）重复一次或多次，以制造包括多层压缩凝胶的仿生结构，例如，多层压缩胶原。
可根据需求来制造非细胞种植和细胞种植的层的任何组合，例如，非细胞种植和细胞种植的胶原层。可在不同的层中种植不同的细胞类型。例如，可用相同或不同类型的细胞来种植两层或多层压缩凝胶。
凝胶引入和压缩的重复循环允许制造仿生多层组织。
在一些实施方式中，柱塞可包括一个或多个凸起，其在压缩凝胶的表面中压印凹入部、凹袋（pocket，凹陷）或隐窝。适当的凸起可位于柱塞的接触凝胶的表面（即，底面）上。这些压印的微结构可用作支持特定细胞类型（例如干细胞）的生态位。该凸起可以与柱塞整体形成，并且该凸起可用与柱塞相同的材料或不同的材料制造，取决于应用场合，该材料可以是能渗透的或不能渗透的。可替换地，可在柱塞与凝胶之间插入包括一个或多个凸起的分离压印部（stamp），以压印凹入部或隐窝。取决于应用场合，该分离压印部可以是能渗透的或不能渗透的。
在一些实施方式中，柱塞或该单独的压印部可包括在压缩凝胶的表面中压印凹槽的一个或多个凸起。
对于期望的应用，该一个或多个凹槽可具有任何适当的宽度、深度或长度。优选地，凹槽从压缩凝胶的边缘延伸，并且更优选地，凹槽在压缩凝胶的2个或更多个边缘之间延伸。在其他实施方式中，凹槽可以不延伸至压缩凝胶的任何边缘。
该凹槽的宽度可以是至少1μm、至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、或至少50μm、并且，宽度可高达500μm、高达400μm、高达300μm、高达200μm、或高达100μm。本文所述的凹槽的适当宽度的范围可具有这些最小值中的任一个与这些最大值中的任一个的组合。例如，适当的凹槽的宽度可以是1至500μm，优选地，1至300μm。
该凹槽的深度可以是至少1μm、至少5μm、或至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、或至少50μm，并且，深度可高达500μm、高达400μm、高达300μm、高达200μm或高达100μm。本文所述的凹槽的适当深度的范围可具有这些最小值中的任一个与这些最大值中的任一个的组合。例如，适当的凹槽的深度可以是1至500μm，优选地，1至300μm。
该凹槽的长度可高达110mm、高达80mm、高达75mm、高达50mm、高达30mm、高达20mm、高达10mm、或高达6mm，例如长度高达22mm。在一些优选实施方式中，凹槽可在压缩凝胶上从一个边缘延伸至另一个边缘，从而可具有与压缩凝胶的宽度、长度或直径相对应的长度。在其他实施方式中，凹槽可以不延伸至压缩凝胶的边缘，或者可以延伸至压缩凝胶的单个边缘。
该凹槽的长度可以是至少10μm、至少20μm、或至少50μm。本文所述的凹槽的适当长度的范围可具有这些最小值中的任一个与这些最大值中的任一个的组合。例如，适当的凹槽的长度可以是10μm至110mm。
压缩凝胶的表面上的不同凹槽可具有相同或不同的尺寸。
凹槽的深度和/或宽度可沿着其长度变化。这在制造封闭（enclosed）管道时可以是有用的，所述封闭管道的横向横截面面积（即，管道的宽度和/或高度）沿着其长度变化，例如，增加或减小。例如，管道可在多层结构的一部分中更窄和/或更浅，并在多层结构的其他部分中更宽和/或更深。
通过柱塞或压印部上的凸起的尺寸和布置来确定凹槽的尺寸和布置。例如，凹槽深度可以是凸起深度的25%至100%，并且凹槽宽度可以是凸起宽度的75%至100%，优选地是100%。
在一些实施方式中，可将压缩凝胶的表面中的凹槽分成或分为多个单独的凹槽。压缩凝胶的表面中的多个单独的凹槽可合并或连接在一起而形单个凹槽。
可用另一层压缩凝胶（例如，另一层压缩胶原）覆盖所述一个或多个压印凹槽，以制造一个或多个封闭管道（即，有顶（roofed）的通道或微通道）。例如，可将另一凝胶溶液（例如另一胶原溶液）引导至具有一个或多个压印凹槽的压缩凝胶层的表面上。可培育该表面上的所述另一凝胶溶液，以形成另一凝胶，然后将其压缩，例如，使用如上所述的多孔隙柱塞进行压缩，以将液体从所述另一凝胶排出至柱塞中。该另一压缩凝胶覆盖所述一个或多个压印凹槽，以产生包含一个或多个封闭的（或有顶的）管道或微通道的多层结构。该封闭的（或有顶的）管道或微通道可在多层结构的表面处包括至少一个开口。
如上所述，可对该另一压缩凝胶增加更多层的压缩胶原或更多层的压缩非胶原凝胶，以产生多层压缩凝胶结构。该结构中的一层、两层、三层、四层或更多层压缩凝胶可包含压印凹槽。
例如，如本文所述地制造的仿生结构可在该结构中的压缩胶原或非胶原凝胶的层中的10%或更多、25%或更多、50%或更多、75%或更多或100%中包括有顶通道。在一些实施方式中，多层仿生结构可包括一层、两层、三层、四层或更多层无顶的通道。
可通过根据仿生结构的期望特性改变柱塞或压印部上的凸起的尺寸、数量、几何形状和布置来控制有顶通道的尺寸、数量、几何形状和布置。
在一些实施方式中，柱塞或单独的压印部可包括一个或多个细长的凸起，该一个或多个细长的凸起压印将多层仿生结构的不同层中的有顶通道连接的通道。
提供有顶通道在提供包含可控尺寸、几何形状和方向的微通道的仿生结构时可以是有用的。微通道可改进仿生结构的特性（例如，通过增加仿生结构内的氧化来改进）和/或可在植入之后促进血管和神经元的向内生长。
本发明的方法特别适合于同时在孔阵列中制造仿生结构。这在例如筛选时可以是有用的。
下面描述用于制造包含仿生结构的孔阵列的适当的工具包和设备。
在一些实施方式中，孔的底部可以是能渗透的。例如，诸如培养基的液体可通过该能渗透的底部进入孔。方便地，可通过膜限定孔的底部。例如，当需要将该结构的表面上的细胞暴露于空气以引起仿生表型时，这可以是有用的。
可将孔安装在不能渗透的支撑部上，使得所述能渗透的孔底部不接触支撑部。可将孔容纳在支撑部的凹袋或凹入部中。这允许支撑部的凹袋或凹入部中的培养基接触该结构，同时使该结构的上表面暴露于空气。
优选地，将孔弹性地安装在支撑部上，使得，能渗透的孔的底部可在压缩之前被驱动得抵靠所述不能渗透的支撑部，以防止将液体从凝胶通过所述能渗透的孔的底部排出。
例如，可将孔保持在弹性地安装于支撑部上的安装板中。安装板可保持孔阵列，孔阵列可以是例如位于多孔（multi-well，具有多个孔的）板中的多个单独的孔或多个连接在一起的孔。可通过支撑部中的相对应的凹袋或凹入部的阵列来容纳被保持在安装板中的孔阵列。
在压缩凝胶之后，可移除柱塞以将压缩凝胶留在孔中。在一些实施方式中，可使柱塞旋转和/或倾斜，以帮助与压缩凝胶的表面分离。
在一些实施方式中，可在压缩凝胶中引入密度梯度。例如，一种制造本文所述的仿生结构的方法可包括：
（i）将胶原溶液或非胶原凝胶溶液引导至孔，
（ii）培育胶原或非胶原凝胶溶液以形成凝胶，其中，凝胶在第一区域的高度或深度比在第二区域的高度或深度大，
（iii）将柱塞引导至孔，
（iv）用柱塞压缩凝胶，使得液体从凝胶排出，并且减小或消除凝胶在第一和第二区域处的高度或深度的差异，并且
（v）移除柱塞以将所述仿生结构留在孔中，
其中，相对于第二区域，仿生结构在第一区域中具有增加的硬度或密度。
在WO2009/004351中描述了适当的用于引入密度梯度的方法。
本发明的另一方面提供了一种用于制造仿生结构的工具包，包括：
柱塞，以及
孔，具有开口，
其中，柱塞包括多孔隙材料，并且柱塞适于在引导至孔时密封或部分地密封开口。
柱塞和孔形成为适于使得当引入柱塞时密封或部分地密封孔的开口。在一些实施方式中，不通过用柱塞压缩孔中的胶原或非胶原凝胶来将液体从孔排出。柱塞的多孔隙本体允许从胶原或非胶原凝胶排出的液体进入柱塞。多孔隙本体可以是刚性的或非刚性的，例如，其可表现出一些柔性或弹性。多孔隙本体由非烧结或烧结材料制成，例如，塑料材料、纤维素、石膏、金属、密集纤维或陶瓷。
柱塞可进一步包括支持多孔隙材料的不能渗透的支撑部。
柱塞可包括连接器（例如销钉或栓钉），连接器附接至多孔隙本体并允许可释放地附接至柱塞头部。优选地，用不能渗透的材料制造连接器，例如用塑料材料（例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、或聚丙烯）或金属制造，以防止柱塞的多孔隙部分中的液体进入柱塞支架。
柱塞可适于压缩包含于孔中的凝胶，并通过压缩吸收从凝胶排出的液体。
柱塞的在压缩过程中接触孔中的凝胶的表面可包括一个或多个凸起，该一个或多个凸起在孔中的胶原或非胶原凝胶的表面中压印一个或多个凹入部、凹袋或凹槽。可替换地，工具包可进一步包括单独的压印部，该压印部在其表面上包括一个或多个凸起或其他微结构。压印部可插入在柱塞和凝胶之间，使得在用柱塞压缩时通过压印部在凝胶的表面上压印一个或多个凹入部、隐窝、凹袋或凹槽。
凸起可位于柱塞或压印部的底面（即，当将柱塞引导至孔中时面向孔底部的表面）上，并且，其可以是可吸收的或不可吸收的。
在一些实施方式中，柱塞可包括从柱塞的顶面中的孔口朝着柱塞的底面延伸的一个或多个通道。通道可完全延伸至底面或在朝向底面的路径中的一部分中延伸。例如，通道可在朝向柱塞的底面的距离的70%、80%、90%或100%延伸。在一些实施方式中，通道可延伸至柱塞的底面中的孔口。当液体已从凝胶排出时，空气或其他气体或液体可通过一个或多个通道进入柱塞与压缩凝胶的表面（即，流体离开表面）之间的界面。在一个或多个通道的末端处，流体可通过柱塞的底面中的孔口直接在凝胶上离开，或者，流体可进入通道末端附近的柱塞的底部并移动通过柱塞，以便在其底面离开。
可迫使空气或其他流体通过该一个或多个通道，以便于将柱塞与压缩凝胶分离。工具包可包括驱动器（例如活塞），驱动器驱动或迫使流体通过该一个或多个通道。驱动器可与柱塞分离或与柱塞整体形成。在一些实施方式中，可将从凝胶吸收的空气和/或液体驱动得通过通道，并将其传送至压缩凝胶的表面。例如，在用柱塞吸收液体之后，可迫使空气通过该一个或多个通道。可将此空气通过柱塞的底面中的孔口直接传送至压缩凝胶的表面；或者，空气可将在柱塞底部吸收的液体驱动回至压缩凝胶的表面上；或者，可将空气之后的吸收液体的组合传送至压缩凝胶的表面。
柱塞可包括其他便于与压缩凝胶分离的一个或多个特征。
例如，柱塞沿着其外部可包括一个或多个缝隙（slot，狭槽），所述一个或多个缝隙从柱塞的顶面延伸至底面，使得在引导至孔时，缝隙和孔限定从柱塞的顶部延伸至压缩凝胶的表面的通道。这些通道允许空气进入柱塞/凝胶界面并便于分离。
柱塞可在其底面上包括纸或合成网的能渗透的外层。此层可宽松地或部分地附接至柱塞，并可便于空气进入柱塞/凝胶界面。
可通过将柱塞从外层移除或部分地移除、然后将外层从压缩凝胶的表面移除，而将柱塞从孔移除。可通过一开始将外层在压缩凝胶的边缘或角部处与凝胶分离、然后从凝胶的剩余部分移除（例如，将其从边缘或角部剥离），而方便地移除外层。
工具包可包括多个柱塞。例如，可在托盘中设置柱塞阵列。托盘可以是一次性的，并可使柱塞在最上面具有连接器，以便于装载。可将柱塞阵列快速且方便地从托盘装入胶原或非胶原凝胶压缩设备中的相应的柱塞阵列支架，以制造仿生结构。下面描述了适当的设备。
孔可以是任何可容纳柱塞的容器、凹袋或凹入部。孔可由任何适当的材料制成，例如，聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃、聚丙烯、金属、或陶瓷。
在一些实施方式中，该一个或多个孔可以是不能渗透的。在其他实施方式中，该一个或多个孔可以是能渗透的。例如，该一个或多个孔可具有能渗透的底部，例如膜。能渗透的孔可具有特殊的应用，例如，在空运（airlifting）中在孔中培养细胞时。
在一些实施方式中，可将多个孔连接在一起。例如，工具包可包括连接孔的阵列。在一些实施方式中，工具包可包括多孔板。
工具包可包括用于阵列中的每个孔的柱塞。如上所述，可在托盘中设置柱塞阵列，使得托盘中的每个柱塞与孔阵列中的孔相应。
工具包可进一步包括导板。这在将孔与支撑部（例如，多孔板中的）整体形成的实施方式中可以是有用的。导板在压缩过程中定位在支撑部上，并且导板包含与支撑部中的孔相应的孔口。例如，导板可包含与支撑部中的孔阵列相应的孔口阵列。导板中的孔口从顶部向底部向内逐渐变细，即，孔口在上表面处的内径大于在下表面处的内径，并且，直径从上表面向下表面逐渐减小。在导板的下表面处，孔口优选地具有相对于支撑部中的孔相同或减小的内径。在压缩过程中，柱塞在上表面处进入导板的孔口，在该处，孔口的直径最大。当柱塞移动通过孔口时，孔口的逐渐减小的直径将柱塞引导至位于每个孔口下方的孔中。
在其他实施方式中，工具包可包括多个单孔。优选地，使单孔逐渐变细，使得孔在开口处的内径大于孔在底部处的内径。这可将柱塞引导至孔的底部，并避免需要单独的导板。
孔可在其开口处包括凸缘，该凸缘允许孔搁置于安装板上并防止其通过安装板落下。
工具包可进一步包括适于保持多个孔（例如，孔阵列）的安装板或盒子，安装板或盒子可以是连接的或单独的。安装板可包括孔口，每个孔口可容纳一个孔。
优选地，安装板适于弹性地安装在不能渗透的支撑部上，例如，使用可弹性变形的构件来安装。安装板可形成为适于使得，当定位在支撑部上时，安装板可压靠在支撑部上以驱动被保持在安装板中的孔的底部抵靠支撑部。
工具包可进一步包括不能渗透的支撑部，该支撑部适于支撑安装板，使得被保持在安装板中的孔（特别是能渗透的孔）不会接触支撑部。
该不能渗透的支撑部可包括容纳被保持在安装板中的孔的凹袋或凹入部。例如，支撑部可方便地是多孔板。
工具包可进一步包括用于覆盖被容纳在安装板中或与支撑部整体形成的孔的盖。
工具包可进一步包括用于制造本文所述的仿生结构的试剂。试剂可包括胶原、非胶原胶凝聚合物、缓冲剂、营养混合物和培养基。
可根据标准实验室惯例，在适当包装中的无菌条件下，供应工具包的柱塞、孔和其他部件。
本发明的其他方面提供了用于制造本文所述的仿生结构的工具包，该工具包包括2个、3个、4个、5个或更多个从包括以下部件构成的组中选择的部件：柱塞（可选地位于一次性托盘中）、孔、安装板（可选地具有盖）、导板、不能渗透的支撑部（可选地具有盖）、以及试剂。适当的部件如上所述。
工具包可适于在制造如上所述的仿生结构的方法中使用，并可在下述凝胶压缩设备中使用。
本发明的另一方面提供了一种用于制造仿生结构的凝胶压缩设备，包括：
用于孔的底座，所述孔用于包含胶原凝胶，以及
柱塞支架，用于接合柱塞，
柱塞支架和底座可相对于彼此移动，使得将与支架接合的柱塞被驱动至底座中的孔中。
该设备可用于压缩胶原或非胶原凝胶。
可与柱塞支架接合的柱塞可包括多孔隙本体和能渗透的支撑部。多孔隙本体可以是刚性的或非刚性的，并可能够吸收在凝胶的压缩过程中排出的液体，如上所述。该能渗透的支撑部可包括连接器（例如销钉或栓钉），连接器附接至多孔隙本体并可释放地附接至柱塞支架。优选地，用不能渗透的材料（例如塑料材料（例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、或聚丙烯），或金属）制造连接器，以防止柱塞的多孔隙部分中的液体进入柱塞支架。
适当的孔可以是任何开口容器，其容纳柱塞，使得当引入柱塞时孔的开口被密封。
柱塞和孔如以上更详细地描述的。
柱塞支架可适于可释放地保持柱塞。例如，柱塞支架可包括容纳柱塞的连接器的孔口，并使得柱塞通过支架中的摩擦而被保持。
柱塞支架可进一步包括用于分离柱塞的释放装置。例如，柱塞支架可进一步包括探针，探针可移动通过孔，并将连接器从孔口移除，且将柱塞从支架释放。
柱塞支架可能够朝着底座以及远离底座移动，使得与支架接合的柱塞可进入和离开定位在底座中的孔。换句话说，柱塞支架可在第一位置和第二位置之间移动，在第一位置中，与支架接合的柱塞被容纳在底座中的孔中，在第二位置中，柱塞不被容纳在孔中。
在一些实施方式中，柱塞支架可能够在压缩位置和装载位置之间移动（例如可旋转或可枢转），压缩位置用于使被保持于柱塞支架中的柱塞与底座中的孔接合，装载位置用于装载和/或卸载由柱塞支架可释放地保持的柱塞。
柱塞支架可适于与柱塞阵列接合，或者更优选地，该设备可包括柱塞支架的阵列，每个柱塞支架与柱塞阵列中的一个柱塞接合。
柱塞支架可对柱塞施加足够的力，以在底座中的孔中压缩胶原或非胶原凝胶。例如，柱塞支架可具有足够的质量，以施加压缩凝胶的重力。例如，为了在10mm至22mm直径的孔中压缩胶原或非胶原凝胶，柱塞支架可具有5至100g的质量。
在一些实施方式中，该设备可包括驱动器，驱动器对柱塞支架施加力，以将柱塞驱动至底座中的孔中。可使用一系列不同的驱动器。例如，驱动器可包括以下部件中的一个或多个：能够连接于柱塞支架的一个或多个重物；弹性件，例如，与柱塞支架接合的或能够与柱塞支架接合的弹簧或弹性带；电机，例如电动机；液压系统，用于对柱塞施加流体压力。
驱动器施加至柱塞支架的力可以是可调节的。例如，可通过改变与柱塞支架接合的重物的数量、或通过调节弹性件的张力来调节压机施加至柱塞支架的力。
柱塞支架可与引导件相连，引导件便于将保持于支架中的柱塞与容纳于底座中或与支撑部整体形成的孔接合。
柱塞支架可被包含在柱塞头部中，柱塞头部适于可释放地保持柱塞阵列。
可将柱塞支架布置在柱塞头部中，使得可通过位于底座中的孔来容纳被接合在柱塞头部中的支架中的每个柱塞。例如，底座可适于容纳孔阵列，该孔阵列与由柱塞头部中的柱塞支架可释放地保持的柱塞阵列相对应。
可在可释放地附接至柱塞头部之前将柱塞阵列保持在托盘或板中。该设备可包括装载站，装载站适于容纳柱塞的托盘或板。装载站还可适于容纳废料托盘，以在使用之后收集湿柱塞。
柱塞头部可能够在压缩位置、卸载位置以及可选的装载位置之间移动（例如，可旋转或可枢转），压缩位置用于将接合在柱塞头部中的柱塞驱动至底座中的孔中，卸载位置用于从柱塞头部中的柱塞支架卸载使用过的柱塞，装载位置用于将柱塞装载到柱塞头部中的柱塞支架中。例如，柱塞头部可能够移动至装载位置，以将装载站中的柱塞阵列可释放地附接在头部中的柱塞支架中。然后，柱塞头部可能够移动至压缩位置，在该压缩位置中，所附接的柱塞能够与位于底座中的孔接合。然后，柱塞头部可能够回到卸载位置，以释放使用过的柱塞，该柱塞现在包含从凝胶排出的液体并可将其丢弃。可选地，可装载一组新的柱塞。
在一些实施方式中，柱塞头部可安装在立柱上，并且，其可围绕立柱在装载位置与压缩位置之间枢转。
柱塞头部可包括外引导件（例如弹性腿部），当使用这些部件时，弹性腿部适于将安装板驱动得抵靠支撑部。现在，外引导件还可以有利于允许在压缩之前将柱塞头部精确地定位在底座的上方。
底座可适于容纳孔阵列，每个孔容纳柱塞阵列中的一个柱塞。
底座可包括包含一个或多个凹入部的块，孔或支撑部可如上所述地插入该一个或多个凹入部中。该块可以是平坦的、或可包括适于容纳孔阵列的凹入部阵列。方便地，该块可容纳多孔板，例如，12孔板或24孔板。安装于该块上的多孔板可本身用作支撑部，以将孔（例如各个孔）容纳在如上所述的安装板中。例如，当孔是能渗透的时，这可以是有用的。可替换地，安装于该块上的多孔板的孔可直接用来包含胶原或非胶原结构，如本文所述的。
底座可进一步包括一个或多个加热元件。这允许在用户定义的温度下（典型地大约37°C在底座中培育孔。这可有利于在压缩之前固定胶原或非胶原凝胶，并且，必要时，可有利于在孔中执行后续的细胞种植步骤。这允许该结构保持在底座中的孔中的原处（in situ），直到完成生产中的所有所需步骤为止。
该设备的压缩站可进一步包括盖，以覆盖底座和容纳于底座上的孔。该盖可由任何刚性的、不能渗透的材料制成，并且，优选地是透明的。该盖可用于在底座中保持适当的培育条件。
该设备还可包括定时器。这可有利于对孔中的胶原或非胶原凝胶施加压缩的持续时间的定时，或对培育和种植步骤的时间长度的定时。
该设备可包括一个或多个显示器，用于显示施加至柱塞支架的力的持续时间和量、底座的温度、以及培育和/或种植的持续时间。
该设备可包括一个或多个警报器（例如，可视或声音警报器），其在凝固胶原或非胶原凝胶的培育周期或压缩凝胶的压缩周期已经过去时提供指示。
如上所述的设备可包括与柱塞支架接合的柱塞和定位于底座上的孔。在一些实施方式中，该设备可包括柱塞阵列和孔阵列。该设备还可包括支撑部、安装板和其他如上所述的消耗物。
适当的柱塞和孔如上所述，并且，该设备可包括如上所述的工具包。
在一些优选实施方式中，设备可包括单个站，底座在该单个站中保持固定，同时在定位于底座上的孔中制造仿生结构。
可替换地，该设备可包括多个站，并且，包含孔（仿生结构在该孔中制造）的底座可能够在这些站之间移动。每个站可在孔中的胶原或非胶原凝胶上执行不同的操作。对于高度自动化或批量生产的应用来说，这些生产线过程可以是优选的。用于操作多孔板中的试剂的自动装置在本领域中是众所周知的。
底座可能够在该设备中的第一站、第二站、以及可选的第三、第四、第五或更多个站之间移动。例如，底座可在分配站、培育站、和/或压缩站之间移动，其中分配站用于对包含于底座中的孔添加试剂（例如，胶原溶液、非胶原凝胶聚合物溶液、细胞悬浮液、以及培养基）；培育站用于以固定温度在孔中培育胶原或非胶原凝胶，例如，用于凝固胶原或非胶原凝胶聚合物溶液和/或培养细胞；压缩站用于在孔中压缩胶原或非胶原凝胶。
底座可在这些站之间以直线的方式移动、或者可围绕同一组站进行重复循环，例如，底座可可以在沿着旋转分度系统定位的站之间移动。可使底座自动地在不同的站之间移动。多站系统的设计和控制在本领域中是众所周知的。
该设备在制造如上所述的仿生结构的方法中可以是有用的。在一些实施方式中，该设备可与在所述方法中如上所述的工具包一起使用。
一设备可在制造如上所述的仿生结构的方法中使用。
本发明的其他方面提供了在制造仿生结构的方法中使用如上所述的工具包和/或设备。适当的方法也如上所述。
本发明的其他方面提供了制造包含有顶微通道的仿生结构的方法。
一种制造包括有顶通道的仿生结构的方法，该方法可包括：
（i）提供压缩凝胶，在所述压缩凝胶的表面上具有一个或多个凹槽，
（ii）将另一胶凝聚合物溶液引导至该压缩凝胶的表面上，
（iii）固定该另一胶凝聚合物溶液，以形成另一胶原凝胶，以及；
（iv）压缩所述另一凝胶，使得从凝胶排出液体。
在其他实施方式中，一种制造包括有顶通道的仿生结构的方法可包括：
（i）提供压缩凝胶，在所述压缩凝胶的表面上具有一个或多个凹槽，
（ii）提供另一凝胶；并且执行以下任何一项操作；
（a）压缩所述另一凝胶，使得液体排出；以及
（b）将压缩的所述另一凝胶引导至压缩凝胶的表面上，或者；
（c）将所述另一凝胶引导至压缩凝胶的表面上，以及
（d）在压缩凝胶的表面上压缩所述另一凝胶。
压缩的所述另一凝胶形成封闭该一个或多个凹槽以形成管道或微通道的顶部。
可用细胞种植压缩凝胶和/或该另一胶凝聚合物溶液。
在一些实施方式中，可通过用固体表面（例如，如上所述的柱塞或压印部的表面，其包括一个或多个凸起）压缩凝胶来提供压缩凝胶，使得液体从凝胶排出，并且凸起在凝胶的表面中压印一个或多个槽。固体表面可以是能渗透的或不能渗透的。适当的凸起和槽如上面所更详细地描述的。
可用任何传统的方法来压缩该凝胶和另一凝胶。例如，可使用上述方法，或在WO2006/003442或Brown RA等人(2005)Adv.Funct.Mat.15:176-177中描述的方法。
可将步骤（i）至（iv）重复一次或多次，以制造包括多层压缩凝胶的仿生结构，其包含一个或多个微通道。
在优选实施方式中，该凝胶和另一凝胶是胶原凝胶，并且胶凝聚合物溶液是胶原溶液。
如上所述，本发明的方法可有利于制造包括多层压缩胶原的仿生结构，该结构包含可控尺寸、几何形状和方向的一个或多个微通道或管道，例如，用于再生药用途。压缩凝胶和仿生结构的尺寸取决于特定的用途。在一些实施方式中，可在压缩之后模制、轧制、折叠或用其他方法成形该仿生结构。
微通道或管道可例如增加仿生结构的中心氧化和灌注，并在植入之后促进血管和神经元的向内生长。
如上所述的方法、工具包和设备还可用来使用非胶原凝胶制造非胶原仿生结构。例如，本发明的一个方面提供了一种制造仿生结构的方法，包括：
（i）将非胶原凝胶溶液引导至孔，
（ii）培育非胶原凝胶溶液，以形成凝胶，
（iii）将柱塞引导至孔，
（iv）用柱塞压缩凝胶，使得液体从凝胶排出，以及
（v）移除柱塞，以将所述仿生结构留在孔中。
凝胶溶液是包括胶凝聚合物的溶液。适当的非胶原胶凝聚合物如上所述。可通过改变条件（例如温度）来引起凝胶溶液固化或凝固成凝胶。
非胶原凝胶可包括一种或多种生物兼容的非胶原胶凝聚合物。适当的非胶原胶凝聚合物包括天然的胶凝聚合物，例如蛋白质（例如昆布氨酸、丝、纤维蛋白、纤连蛋白或弹性蛋白）、糖蛋白（例如纤连蛋白）、多聚糖（例如甲壳质或纤维素）、或合成胶凝聚合物（例如有机聚合物（诸如聚内酯、聚乙二醇、聚己内酯和合成多肽）、以及无机聚合物（例如磷酸盐玻璃））。
可以与胶原凝胶相同的方式使用非胶原凝胶来制造仿生结构，并且，已作必要的修正以将以上对胶原凝胶描述的方法和结构的所有特征和方面应用于非胶原凝胶。
本发明的其他方面提供了一种基本上如本文所述的以及参考附图的方法、工具包或设备。
对于本领域的技术人员来说，根据本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方式将是显而易见的。
在本说明书中提到的所有文献通过引用整体结合于此。
这里使用的“和/或（并且/或者）”将作为两个特定特征或部件中的每一个的特定公开，或者具有另一个特征或部件或没有另一个特征或部件。例如，“A和/或B”将作为（i）A、（ii）B和（iii）A和B中的每一个的特定公开内容，就如它们在本文中单独地进行了阐述一样。
除非上下文另外指出，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特殊方面或实施方式，并同样可应用于所述所有方面和实施方式。
除非上下文另外指出，否则术语“包括”表示包括特定特征且可选地包括其他特征。因此，该术语包含：a)“包括但不限于”和b)“由…组成”或“包括并限于”。例如，“包括A的产品”将应视为特定公开了以下两种：（i）包括A的产品和（ii）仅由A组成的产品，就好像本文对这两种情况下中的任一种进行了分别阐述一样。
现在将参考下述图表，通过实例说明本发明的某些方面和实施方式。
图1示出了本发明的方法的一个实例的示意图。
图2示出了本发明的方法的另一实例的示意图。
图3示出了一次性托盘中的可在本发明的工具包中使用的柱塞阵列。
图4示出了包含可在本发明的工具包中使用的整体孔的支撑部、以及用于覆盖支撑部的孔的盖和用于将柱塞引导至孔的导板。
图5示出了插入具有盖的安装板中的各个孔，该盖可在本发明的工具包中使用。
图6a和6g示出了执行本发明的方法的设备的示意图。
图7示出了根据本发明的一个实施方式的设备的柱塞头部的横截面。
图8示出了根据本发明的一个实施方式的设备，其包括一线性组的处理站。站1是对系统提供新的多孔板的板堆叠站。站2是对板中的孔添加液体试剂的分配站。例如，该站可对孔分配胶原溶液、缓冲剂、营养物和细胞，或分配细胞悬浮液，例如以便在孔中结构的表面进行种植（接种，seed）。站3是培育（incubation）站，其将板中的孔保持在升高的温度下（例如37°C），以便使胶原溶液凝固在孔中或者以便培育该结构之中或之上的细胞。站4是柱塞装载站，在该站处，将新的柱塞装在设备的柱塞支架上以进行压缩。站5是压缩站，在该站处，用在站4装载的柱塞来压缩在站3处凝固在板的孔中的凝胶。站6是柱塞移除站，在该站处，卸载使用过的柱塞。
图9示出了如本文描述地用图6和7所示的设备制造的仿生结构（横截面）的苏木精-伊红（H&E）组织染色的结果。示出了用该设备同时在两个单独的孔中制造的仿生结构的横截面。
图10示出了用不同尺寸的凸起压印的双层PC胶原结构中的有顶微通道的示意图。比例尺20μm。箭头示出了通道的开口。
在图1中示出了根据本发明的一个实施方式的制造仿生结构的方法。描述了在单个孔中制造结构，但是，可以相同的方式同时在孔阵列中制造该结构。
在能够保持24个柱塞的展示托盘（托盘，presentation tray）3中设置在顶部上具有不能渗透的连接器2的多孔隙（porous）柱塞1（图1a#1）。
将托盘放在胶原压缩设备（未示出）上，并迫使柱塞支架5的孔口4与柱塞连接器2接触（图1a#2）。
然后，升高包含保持柱塞的整个机构的柱塞头部6，将保持在柱塞支架5中的柱塞1从托盘3升起（图1a#3）。然后，丢弃托盘3。
将孔7（其也可叫做插入物）放在安装板8上的位置中。孔7的底部可以是多孔隙的。孔具有搁置于安装板8的顶部上的凸缘10。将安装板放在支撑部9上。支撑部9可以是多孔板。在图1a#4中用交叉剖面线示出支撑部9；安装板8具有垂直剖面线；孔7具有实线轮廓。
然后，在图1a#5中，用胶原溶液11填充孔7。可选地，可在将胶原溶液引导至孔7之前或之后，可用细胞对胶原溶液11进行种植。
然后，用盖12覆盖包含孔7的安装板8，并培育胶原溶液11以形成凝胶（图1a#6）。在图1a#6中以密集虚线示出了盖12。
然后，移除盖12，并使柱塞头部6在安装板8上移动（图1b#7）。降低头部6，使得用外弹性引导件13将安装板8固定就位。将柱塞1在孔7中的胶原凝胶14的上方保持在柱塞支架5中。
然后，用将孔压在支撑部9的底部的内弹性引导件15将孔7固定就位，从而，当使用具有能渗透的底部的孔7时，防止从孔7的底部排出液体。通过释放柱塞支架5，使柱塞1朝着孔7的底部移动，柱塞支架5将柱塞1夹紧在其孔口（aperture）4中。用止挡件18将柱塞支架5可移动地保持在柱塞头部6内，止挡件限制柱塞支架5的移动（图1b#7），直到其被释放为止（图1b#8）。
柱塞支架5的向下移动将柱塞1朝着其孔7的底部移动，在孔7中压缩胶原凝胶14，并吸收从其排出的液体（图1b#9）。
在压缩之后，升高柱塞头部6，以使保持在柱塞支架5中的柱塞1升高到孔7之外。释放安装板8，并使头部6远离包含压缩后的凝胶16的孔7移动（图1b#10）。
然后，将盖12放回到孔7上，以保持压缩后的胶原16清洁并便于培育。
然后，用穿过柱塞支架5的孔口4的探针17从柱塞头部6释放柱塞1，并移出柱塞1的连接器2。
然后，丢弃柱塞1，柱塞包含在压缩过程中从凝胶14排出的液体。
在图2a和2b中示出了用于制造仿生结构的方法的另一实施方式。除了将孔7与支撑部9制成一体以外，该方法与图1a和1b中示出的方法相似（图2a#4）。与图1a和1b不同，不需要单独的孔和安装板。可选地，可用导板来便于将柱塞适当地定位在其各自的孔中。在此实施方式中，柱塞1向下直接进入支撑部9中的孔7，并从而可表现出比与单独的插入孔一起使用的直径稍大的直径。
将胶原溶液11直接分配至支撑部9中的孔7中（图2a#5）
将盖12直接放在支撑部9上，以在孔7中培育胶原溶液11，并导致其凝固以产生胶原凝胶（图2a#6）。
然后，移除盖12，并使柱塞头部6在支撑部9上移动（图2b#7）。将柱塞1在孔7中的胶原凝胶14的上方保持在柱塞头部5中。
然后，用与柱塞止挡件18连接的内弹性引导件15将孔7固定就位。内弹性引导件15与支撑部9之间的接触使柱塞支架5与柱塞止挡件18分离，并导致柱塞1朝着孔7的底部移动。通过止挡件18将柱塞支架5可移动地保持在柱塞头部6内，所述止挡件限定柱塞支架5的向上和向下移动的程度（图2b#8）。
柱塞支架5的向下移动使柱塞1朝着孔7的底部移动，在孔7中压缩胶原凝胶14并吸收从其排出的液体（图2b#9）。
在压缩之后，升高柱塞头部6，以使保持在柱塞支架5中的柱塞1升高到孔7之外。释放支撑部9，并使头部6远离包含压缩后的凝胶16的孔7移动（图2b#10）。
然后，用盖12覆盖孔7，以保持压缩凝胶16清洁并便于培育（图2b#11）。
然后，用穿过柱塞支架5的孔口4的探针17从柱塞头部6释放柱塞1，并移出柱塞1的连接器2（图2b#12）。
然后，丢弃柱塞1，柱塞包含之前在压缩过程中从凝胶排出的液体（图2b#13）。
在图3中示出了用于压缩孔阵列中的凝胶的柱塞1的阵列。通过柱塞1最上部的连接器2将柱塞安装在一次性托盘3中，托盘定位柱塞1以用于装载到胶原压缩设备的柱塞支架上。
在图2中示出了不能渗透的支撑部9。将孔7的阵列与支撑部9制成一体。在培育和储存过程中，用盖12覆盖孔7。在压缩过程中，可用导板28覆盖孔7。导板28包含孔口阵列，该孔口阵列与支撑部9中的孔7对应。使孔口29逐渐变细，即，孔口在导板的上表面30处的内径比在导板的下表面处的内径大。在导板的下表面处，孔口29具有与支撑部9中的孔7相同的内径。当柱塞向下进入支撑部9的孔7中时，导板28引导柱塞。
在图5中示出了各个孔7的阵列。孔7逐渐变细，使得开口32处的内径比孔33的底部处的内径大。将孔7安装在安装板8中的孔口31中。孔7的凸缘10搁置于安装板8上，并防止孔7穿过孔口31掉下。在培育和储存过程中，用盖12覆盖安装板中的孔7。
在图6中示出了一种用于在孔阵列中同时制造仿生结构的设备的操作。
一开始，设备19处于静止状态中，其中柱塞头部被升高，并且未装载消耗物（诸如柱塞或孔）（图6a）。设备19包括柱塞头部6，柱塞头部枢转地安装在立柱25上，并可在压缩站26与卸载站21之间移动。头部6包含柱塞支架阵列（未示出）、以及弹性内引导件15和弹性外引导件13。压缩站26包括底座20，其用于容纳可由盖12覆盖的孔。底座20搁置于未示出的加热板上，以对容纳于底座20中的孔进行培育。该设备包含显示器22以及控制器23，显示器指示定位于底座中的孔的培育的温度和持续时间，控制器允许调节这些参数。将可移除的废料托盘21定位在卸载站21中。
在第一阶段中，对柱塞头部6内的柱塞支架5装载柱塞1。将容纳柱塞1的阵列的托盘3定位在底座20上，并且将柱塞1的连接器2引入安装在柱塞头部6中的柱塞支架阵列（未示出）的孔口。连接器2与孔口的接合将每个柱塞1保持在其相应的柱塞支架5中，使得可通过柱塞头部6将柱塞1的阵列从托盘3升高（图6b）。在图1和2的步骤1和2中也示意性地示出了此阶段。
然后，通过将柱塞头部6围绕立柱25枢转以定位在废料托盘21上，而将装载有柱塞1的阵列的柱塞头部6移到旁边。将孔7定位在24孔阵列中的支撑部9上的安装板8中，然后将孔引导至底座20。通过将柱塞头部6定位在废料托盘21上，使孔7可以用于引入胶原溶液；细胞的悬浮液；和/或其他试剂（图6c）。在图1和2的步骤3、4和5中也示意性地示出了此阶段。
在将装载的柱塞头部6定位在废料托盘21上的同时，用胶原溶液（未示出）填充安装托盘8中的孔7（可选地，所述溶液种植有细胞），并用盖12覆盖孔。然后，用加热器（未示出）加热被覆盖的底座20中的孔，并在37℃下进行培育，以使得胶原溶液凝固成凝胶（图6d）。在图1和2的步骤6中也示意性地示出了此阶段。
然后，从底座20移除盖（未示出），并使柱塞头部6围绕立柱25枢转至孔7上的位置中，使得附接至柱塞支架（未示出）的柱塞1就绪，以用于插入板的孔7中（图6e）。在图1和2的步骤7中也示意性地示出了此阶段。
然后，闭锁柱塞头部6，使得通过柱塞头部（未示出）而被加重的柱塞1位于每个孔7中的凝胶（未示出）上。柱塞1压缩胶原凝胶（未示出），并吸收通过压缩而从凝胶排出的液体（图6f）。在图1和2的步骤8和9中也示意性地示出了此阶段。
然后，升高柱塞头部6，使得柱塞1（其现在容纳有从孔7中的压缩凝胶排出的液体）从底座20中的孔7移除。在图1和2的步骤10中也示意性地示出了此阶段。
然后，使容纳有湿柱塞1的柱塞头部6围绕立柱25枢转，并定位在卸载站24中的废料托盘21上。然后，将湿柱塞1排到废料托盘21中。压缩胶原的孔7留在底座20中的安装板8中的位置中，未用盖覆盖（图6g）。此相当于图1和2的步骤11至13。
在一些实施方式中，可移除废料托盘21，并可用新的柱塞1装载柱塞头部6中的柱塞支架1。可对孔7中的压缩胶原添加附加的胶原溶液，可选地，该附加的胶原溶液种植有细胞。然后，可重复图6c至6g中示出的步骤，以在孔7中制造多层胶原结构。
可重复该方法，直到孔中的结构具有期望数量的层的压缩胶原为止。
在图7中示出了用于制造图6的仿生结构的设备19的柱塞头部6的横截面。通过连接器2与柱塞支架5内的孔口4的摩擦接合，将柱塞1的阵列保持在柱塞支架5的阵列中。柱塞1示出为接触孔7的阵列的底部，孔7的阵列被容纳在定位于加热底板27上的支撑部9上的安装板8中。孔7未容纳胶原。
将柱塞头部在底座上对齐，并且用外引导件13固定安装板8。插锁34将头部固定就位。孔7在它们的开口处具有凸缘10，凸缘搁置于安装板8上。在压缩过程中，内引导件15将孔7固定在安装板8上，并驱动孔7的底部抵靠支撑部9。从头部6释放各个柱塞支架5，并且柱塞支架在孔7中的柱塞1上施加重力。
使探针17接合在每个柱塞支架5的孔口4中，并且可使探针17向下移动以将连接器2移出，并在使用之后从柱塞支架5排出柱塞1。
图8示出了本发明的多站设备。包含孔的板可多次通过一个或多个站。例如，在板通过每个站之后，板可第二次通过分配站以用于中间细胞层，然后再次通过分配站以用于新胶原层，然后进行培育、柱塞添加、压缩、以及柱塞移除。
用苏木精-伊红（H&E）对用图6和7所示的设备制造的仿生结构的横截面染色。在图9中示出了结果。用分配在整个该结构中的人真皮成纤维细胞（初始密度100,000个细胞/ml）观察密集胶原结构，与皮肤的真皮层的解剖结构类似。这证明，通过本文描述的设备制造的结构是高度仿生的。
通过使用多孔形式的单向流体流动的模板微模制来产生两部分微通道。在第一阶段中，在一层的表面中压印凹槽。在下一个阶段中，在这些凹槽的顶部上凝固一层新的胶原溶液，并将该层新的胶原溶液压缩在第一层上以用作微通道“顶部”。此技术（制造“有顶的μ通道”）允许简单且快速地制造具有预成形通道的可控厚度的结构。发现该通道的尺寸为用于模制的模具或模板的可预测的比例。在所使用的条件下，该比例在20%和50%之间，并且对于75μm和125μm深的压印部，将通道典型地形成为25μm和50至100μm宽、并高达30μm深（图10）。就地（in place）用活细胞形成压缩胶原基质，活细胞生长并重建基质持续几周时间，但保持通道。用在压缩过程中堆积在模具周围的紧实的、定向的胶原微纤维制造通道壁，以提供在培育中的坚固性。模板尺寸与最终产生的通道之间的关系的详细研究已经表明，模制保真度对模具形状和胶原密度敏感。这些结果证明，可用具有模制和多层的塑性压缩来产生具有良好灌注的高度可预测的μ通道的、活的3D结构。

Claims (72)

1.一种制造仿生结构的方法，包括：
(i)将凝胶溶液引入具有开口的孔，
(ii)培育所述凝胶溶液以形成凝胶，
(iii)将多孔隙柱塞引入所述孔，
(iv)用所述柱塞压缩所述凝胶，使得液体从所述凝胶排出至所述柱塞中，以及
(v)移除所述柱塞，以在所述孔中留下所述仿生结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在将所述柱塞引入所述孔时，所述柱塞密封所述孔的所述开口。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对于所述柱塞的接触所述凝胶的每单位表面积，从所述凝胶排出至所述多孔隙柱塞中的液体的量是2至14mm。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，用细胞种植所述凝胶溶液。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述压缩之后，在培养基中培育压缩凝胶层。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
(vi)将另一凝胶溶液引入到所述孔中的所述仿生结构上，
(vii)培育所述另一凝胶溶液，以形成另一凝胶，
(viii)将多孔隙柱塞引入所述孔，
(ix)用所述柱塞压缩所述另一凝胶，使得液体从所述凝胶排出，
(x)移除所述柱塞，以在所述孔中留下包括多层压缩凝胶的仿生结构。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，用细胞种植所述另一凝胶溶液。
8.根据权利要求6所述的方法，包括将步骤(vi)至(x)重复一次或多次，以制造包括多层压缩凝胶的仿生结构。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，用相同或不同类型的细胞来种植所述多层中的两层或更多层。
10.根据权利要求1或6所述的方法，其中，所述柱塞包括一个或多个凸起，所述一个或多个凸起在所述压缩凝胶的表面中压印凹入部。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述一个或多个凸起在凝胶的表面中压印凹槽。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤(iv)包括用所述柱塞压缩所述凝胶，使得在所述压缩凝胶的表面中压印一个或多个凹槽。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤(ix)包括用包括适于在凝胶的表面中压印凹槽的一个或多个凸起的柱塞压缩所述凝胶，使得在所述另一凝胶的表面中压印一个或多个凹槽。
14.根据权利要求11所述的方法，包括将步骤(vi)至(x)重复一次或多次，以制造包括多层压缩凝胶的仿生结构，
其中，步骤(ix)的所述重复中的一个或多个包括用包括适于在凝胶的表面中压印凹槽的一个或多个凸起的柱塞压缩所述凝胶，使得在所述仿生结构中的所述多层压缩凝胶中的一层或多层的表面中压印一个或多个凹槽。
15.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括用细胞种植所述压缩凝胶的表面。
16.根据权利要求6所述的方法，进一步包括在压缩后在培养基中培育压缩凝胶层。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在孔阵列中同时制造仿生结构。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述孔的底部是能渗透的。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，用膜限定所述孔的所述底部。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，将所述孔安装在不能渗透的支撑部上，使得所述能渗透的孔底部不接触所述支撑部。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，将所述孔弹性地安装在所述支撑部上，使得所述能渗透的孔底部能够被驱动得抵靠所述不能渗透的支撑部，以防止液体通过所述能渗透的孔底部从所述凝胶排出。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述支撑部包括容纳所述孔的凹袋。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，将所述孔保持在弹性地安装于所述支撑部上的安装板中。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述安装板保持孔阵列。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述支撑部包括凹袋阵列以容纳所述孔阵列。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述孔阵列包括多个单孔。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，所述孔阵列包括多孔板。
28.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述凝胶溶液是胶原溶液，并且所述凝胶是胶原凝胶。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述胶原是I型胶原。
30.一种用于制造仿生结构的工具包，包括：
柱塞，以及
孔，具有开口，
其中，所述柱塞包括多孔隙材料并且适用于压缩被容纳在所述孔中的凝胶并吸收从所述凝胶排出的液体，并且所述柱塞进一步适于在引入至所述孔时密封所述孔的所述开口。
31.根据权利要求30所述的工具包，其中，所述柱塞适于在引入至所述孔时部分地密封所述孔的所述开口。
32.根据权利要求30所述的工具包，其中，所述多孔隙材料是刚性的。
33.根据权利要求30所述的工具包，其中，所述柱塞进一步包括保持所述多孔隙材料的不能渗透的支撑部。
34.根据权利要求30所述的工具包，其中，所述柱塞包括用于与柱塞支架可释放地连接的连接器。
35.根据权利要求30所述的工具包，其中，所述柱塞包括一个或多个凸起，所述一个或多个凸起适于在所述孔中的凝胶的表面中压印一个或多个凹入部。
36.根据权利要求35所述的工具包，其中，所述一个或多个凸起适于在所述凝胶的表面中压印一个或多个凹槽。
37.根据权利要求30所述的工具包，包括多孔板。
38.根据权利要求30所述的工具包，包括多个单孔。
39.根据权利要求30所述的工具包，包括适于保持多个孔的安装板。
40.根据权利要求30所述的工具包，其中，所述孔是不能渗透的。
41.根据权利要求30所述的工具包，其中，所述孔的底部是能渗透的。
42.根据权利要求39所述的工具包，其中，所述孔的底部是能渗透的。
43.根据权利要求42所述的工具包，其中，所述工具包包括适于支撑所述安装板的不能渗透的支撑部，使得被保持于所述安装板中的孔不接触所述不能渗透的支撑部。
44.根据权利要求43所述的工具包，其中，所述安装板适于弹性地安装于所述不能渗透的支撑部上。
45.根据权利要求44所述的工具包，其中，所述安装板安装在能够弹性变形的腿部上的所述支撑部上。
46.根据权利要求42所述的工具包，其中，所述工具包包括不能渗透的支撑部，所述不能渗透的支撑部适于支撑所述安装板，并且所述安装板适于弹性地安装在所述不能渗透的支撑部上使得当支撑于所述支撑部上时，所述安装板上的压力驱动被保持于所述安装板中的孔的底部抵靠所述支撑部。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的工具包，其中，所述不能渗透的支撑部包括适于容纳被保持于所述安装板中的所述孔的凹袋。
48.根据权利要求47所述的工具包，其中，所述支撑部是多孔板。
49.根据权利要求30所述的工具包，用于在根据权利要求1所述的制造仿生结构的方法中使用。
50.一种用于制造仿生结构的凝胶压缩设备，包括：
用于孔的底座，所述孔容纳凝胶，
柱塞支架，用于接合柱塞，以及
柱塞，与所述柱塞支架接合，
所述柱塞支架和所述底座相对于彼此能够移动，使得与所述支架接合的柱塞被驱动到所述底座中的所述孔中，其中，所述柱塞包含多孔隙材料，所述柱塞吸收在容纳于所述孔中的凝胶的压缩期间排出的液体。
51.根据权利要求50所述的设备，其中，所述凝胶是胶原凝胶。
52.根据权利要求50所述的设备，其中，所述柱塞支架适于可释放地保持柱塞。
53.根据权利要求50所述的设备，其中，所述柱塞支架能够朝着和远离所述底座移动，使得与所述支架接合的柱塞被驱动进入和离开被容纳于所述底座中的所述孔。
54.根据权利要求50所述的设备，包括柱塞阵列，每个柱塞均与所述柱塞支架接合。
55.根据权利要求54所述的设备，其中，所述柱塞阵列被容纳在能够移动的柱塞头部中。
56.根据权利要求55所述的设备，其中，所述柱塞阵列布置在所述柱塞头部中，使得能够通过被定位在所述底座中的孔容纳每个柱塞。
57.根据权利要求55所述的设备，其中，所述柱塞头部能够在压缩位置与卸载位置之间移动，所述压缩位置用于将被接合于其中的柱塞驱动至所述底座中的孔中，所述卸载位置用于从所述柱塞头部中的所述柱塞支架中卸载柱塞。
58.根据权利要求50所述的设备，其中，所述底座包括包含一个或多个凹入部的块，所述一个或多个凹入部用于容纳一个或多个孔。
59.根据权利要求58所述的设备，其中，所述块包括被布置为容纳孔阵列的凹入部阵列。
60.根据权利要求50所述的设备，其中，所述底座进一步包括用于加热所述底座中的孔的一个或多个加热元件。
61.根据权利要求50所述的设备，包括用于覆盖被容纳于所述底座中的孔的盖。
62.根据权利要求50所述的设备，包括定时器和/或显示器。
63.根据权利要求50所述的设备，其中，所述多孔隙材料是刚性的。
64.根据权利要求63所述的设备，其中，所述柱塞包括一个或多个凸起，所述一个或多个凸起适于在凝胶的表面中压印一个或多个凹入部。
65.根据权利要求64所述的设备，其中，所述一个或多个凹入部是凹槽。
66.根据权利要求50所述的设备，其中，所述设备进一步包括根据权利要求30所述的工具包。
67.根据权利要求50所述的设备，其中，所述底座在所述设备内是固定的。
68.根据权利要求50所述的设备，其中，所述底座在所述设备内是能够移动的。
69.根据权利要求50所述的设备，用于在根据权利要求1所述的制造仿生结构的方法中使用。
70.一种制造包括有顶通道的仿生结构的方法，包括：
(i)提供压缩凝胶，在所述压缩凝胶的表面上具有一个或多个凹槽，
(ii)将另一凝胶溶液引入到所述压缩凝胶的所述表面上，
(iii)使所述另一凝胶溶液凝固，以形成另一凝胶，以及；
(iv)根据权利要求1所述方法压缩所述另一凝胶，使得液体从所述凝胶排出。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述压缩凝胶是压缩胶原凝胶。
72.根据权利要求71所述的方法，其中，所述另一凝胶溶液是胶原溶液。
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