CN101842474A - 表面柔软的多孔培养平板 - Google Patents

Abstract

在多孔平板上可以装载有大面积的柔软物质。使用可商业购得的试验方法测定细胞穿过平板的反应，平板的刚性模量是50到51200帕斯卡。细胞可以在该平板中生长，并且可以被操作和分析。可以在小孔的底部附着水凝胶。该平板可以帮助附着作用并支持不同细胞类型的生长，适用于进行96孔板试验和384孔板试验。所述水凝胶的机械性能是可再生的，并且足够稳定从而确保底物的保存期限。所述水凝胶适用于各种细胞类型的生长以及附着的各种不同的配位体的生长，并且可以与凝胶表面相耦合，所述配位体例如胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白或者RGD肽。

Description

表面柔软的多孔培养平板

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年8月30日递交的美国临时专利申请第60/969,104号的权利。

许可

政府根据合约NIH HL-82856、GM-073628享有本发明的某些权利。

背景技术

活细胞的物理环境影响了它的增殖能力、代谢能力、分化能力和改型。活细胞具有详细的表达谱系并表达不同的表现型和物理状态，对他们下面的支撑基质的硬度(即，刚性模量)具有非常灵敏的反应活性。

生物工程师和生命科学家普遍赞同的观点之一是，在很多情况下，刚性底物不适于评价细胞的生理行为。为了在三维立体重组生物成分中更加真实的模仿组织环境而进行的早期努力形成了水凝胶，例如，胶原蛋白、纤维蛋白和基质胶。最近，合成的、自组装肽凝胶(PuraMatrix公司)、藻蛋白酸盐海绵状物(AlgiMatrix公司)、和透明质酸-衍生的凝胶剂(Glycosan)成为可以商业购得的物质。但是，这些方法的价格高的惊人，工艺上来讲也并不实用，并且不适合于许多基于细胞的高处理能力试验，这些方法主要从二维系统着眼进行设计，但是通常，当需要在三维空间中进行培养时，这些系统不能支持广泛的弹性要求。进一步讲，在很多情况下，细胞在体外对药物组合物和生物学物质的反应不能够准确的预测相应的体内功能性和毒性。

发明内容

根据本发明的执行过程，可以提供一种或者更多种下列能力。同时，还可以提供一系列具有不同的刚性模量(即，硬度)的孔。在一种实施方案中，可以制造一种具有大面积柔软底物的多孔平板。可以商业购得的或者定做的试验可以用于检测细胞在平板上的反应，所述平板的硬度在50帕斯卡到150,000帕斯卡范围内。例如，可以检测肺部成纤维细胞的增殖作用和凋亡作用，这两个作用主要取决于底物的刚性模量。细胞可以在平板上生长，并且可以按照与常规的多孔平板相同的方式进行操作和分析。

在一种实施方案中，水凝胶可以附着(即，牢固的附着)在小孔的底部(例如，在24孔板、96孔板、384孔板的底部)。这种稳定的附着作用能够长期的培养细胞，并且与许多能够造成水凝胶缩小和分离的实验试剂相容。所述平板可以支持不同细胞类型的附着和生长并且适用于多种标准多孔平板试验。所述水凝胶的机械性能是可以再生的，并且足够稳定从而增加底物的保存期限。所述水凝胶适用于多种细胞类型的生长，也适用于多种附着的配位体的生长，并且可以与凝胶表面相耦合，所述配位体例如，胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白或者RGD肽。

按照一定方向发生变化的多刚性模量凝胶可以被放入或者在多孔玻璃底平板上产生。具有硬度依赖性的生物学物质可以以一种高处理方式进行评价，并且经历标准的多孔平板试验，包括，但不局限于，细胞增殖作用、细胞凋亡作用、信号发生事件和可溶因子和不可溶因子的检测。

可以对多刚性模量平板上生长的细胞进行固定和免疫染色，或者分离所述细胞进行基因表达和蛋白质分析。附着依赖型细胞可以进行可信度较高的研究，所述附着依赖型细胞包括成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、类骨质细胞和神经元细胞。所述平板可以作为一种工具知道成熟细胞或者胚胎干细胞的分化作用。

这里描述的装置和方法可以有效的应用于计划或者重新计划胚胎干细胞和/或成熟干细胞的活性，例如，后者可以从正常组织或者肿瘤衍生组织中获得。在培养室中培养细胞，所述细胞能够忍受底物硬度方面的变化。重新计划的干细胞可以通过他们的行为(例如，运动或者缺失)进行确认、通过细胞液的物理状态进行确认、通过外观进行确认、通过在基因/蛋白表达方面的变化进行确认、或者经过细胞内加工方式或者分泌的细胞因子以及其他参数进行确认。某些方法和成像系统可以被用于监测细胞特性并识别/筛选具有需要表现型的细胞，例如，处于理想的细胞分化状态的细胞，或者“干性(sternness)细胞”，例如，作为应用到一种细胞或者一群细胞上的培养底物硬度变化的反应的细胞表型。所述方法包括非侵入性方法、非扰乱性方法、可自动方法和定量方法，这些方法可以用于细胞的检测，所述细胞例如成熟干细胞或者胚胎干细胞以及所有细胞表型在分化过程各个阶段的分化细胞。在培养期间，在不同的时间点检测并确定细胞或者细胞群所处的培养环境或者机械应力条件下对应的细胞存活期、干性或者塑性，细胞可以是保藏/固定的，或者以实时方式检测。

通常，在一个方面，本发明提供了一种用于制造具有的弹性性质覆盖生理学范围的水凝胶的方法，该方法包括向一个小孔中放入一种第一聚合溶液，用平板覆盖第一聚合溶液，平板的面积小于孔的面积，将第一聚合溶液与一种配位体相结合，向所述小孔中放入一种第二聚合溶液，空气中存在的氧气基本上抑制空气液体接触面上的聚合作用；和对小孔除去污染。

实施本发明可以包括一种或者一种以上下列的特点。通过抗-配位体和抗-免疫球蛋白G包覆的荧光颗粒评价配位体结合的均一性。第二聚合溶液可以通过敲打小孔的方式分配均匀。第二聚合溶液基本上可以覆盖第一聚合溶液边缘和小孔之间定义出的环形区域。第二聚合溶液还可以将第一聚合溶液附着在小孔上。

通常，在另一个方面，本发明提供了一种仪器，该仪器包括一个小孔；一种分配系统，该分配系统被设置来向小孔中传递一种聚合溶液；一种固定物，设置用于插入小孔中；和一种放置在固定物末端的玻璃平板，其中，玻璃平板的面积小于小孔的面积，并被设置为与位于孔中的聚合溶液相接触。本发明的实施可以包括一种或者一种以上的下列特点。

所述小孔可以是多孔平板中的一个孔，所述固定物可以是一个以上的固定物，因此每个固定物可以被设置为插入多孔平板的相应的孔中。固定物插入系统可以被设置为将固定物移入和移出小孔。一种第二分配系统可以被设置为向小孔中传递第二聚合溶液，该分配系统可以被设置成向小孔中传递第二聚合溶液。所述小孔可以是96孔板或者384孔板的小孔。在一个阶段，孔板可以被设置为将小孔在至少一个轴线中移动。一种小孔轻敲器可以被设置为轻敲所述小孔。

通常，在另一个方面，本发明提供了一种仪器，这种仪器包括一种多孔平板，附着在至少平板中第一小孔中的第一凝胶，和至少附着在平板中第二小孔中的第二凝胶，其中第一凝胶和第二凝胶的刚性模量是不同的。

本发明的实施过程可以包括一种或一种以上的下列特点。一种第三凝胶可以被放置在所述平板的至少第三小孔中，其中，第一凝胶、第二凝胶和第三凝胶的刚性模量是不同的。平板上的小孔可以以行为单位进行处理，在每一行孔中的凝胶的刚性模量基本上可以是一样的。所述多孔平板可以是96孔板，并且可以包括12行小孔，其中1行小孔是空的，另外11行小孔中包含凝胶，在其中一行的小孔中的凝胶与同行小孔中的凝胶基本上具有相似的刚性模量。

通常，在另一个方面，本发明提供了一种仪器，该仪器包括一种多孔平板，至少附着在平板第一小孔中的凝胶，其中，所述凝胶的厚度小于1毫米。

本发明的实施过程可以包括一种或一种以上的下列特点。所述凝胶的厚度可以小于100微米。第二凝胶可以被放置在平板的至少第二小孔中，因此，第二凝胶的厚度小于1毫米，并且，第一凝胶和第二凝胶的刚性模量是不同的。第二凝胶的厚度可以小于100微米。所述凝胶可以是一种异(基)双功能交联剂和一种配位体衍生而来的。

本发明还包括一种通过将已知细胞与本发明所述装置或者仪器相接触来模拟生理学生长情况的方法。例如，所述细胞可以是心血管细胞、肠胃细胞、肾脏细胞、泌尿生殖器细胞、肌骨骼细胞、神经系统细胞、口腔细胞、乳房细胞、牙齿外周细胞、或者皮肤细胞或者这些细胞的前体细胞。所述装置上细胞培养底物的刚性模量在被评价的组织类型适应的范围内。此外，通过与具有不同硬度的底物相接触来诱导细胞的表现行为或者反应。例如，根据用于培养细胞的底物的刚性模量，干细胞或者前体细胞的分化途径向着某一表现型变化。

附图说明

图1是用于制造水凝胶的部件的侧视图。

图2是一种流程图，示意性的表现了用于制造具有两种聚合溶液的柔软底物的方法和仪器。

图3是聚合物表面边缘效应的照片。

图4是一种流程图，示意性的表现了用于制造具有单一聚合溶液的柔软底物的方法和一起。

图5是一种示范性的96-孔平板，所述96孔平板装配有大量凝胶。

图6是一种示范性的384-孔平板，所述384-孔平板装配有大量凝胶。

图7是一张图表，显示了在384-孔平板上生长的人肺部成纤维细胞，所述384-孔平板包括具有大范围刚性模量值的水凝胶。

图8是一张图表，显示了在384-孔平板上生长的人肺部成纤维细胞的凋亡，所述384-孔平板包括具有大范围刚性模量值的水凝胶。

图9包括一系列图表，这些图表比较了在培养细胞的水凝胶的刚性模量值不同的情况下，不同类型细胞的细胞生长。

具体实施方式

在坚硬的塑料上生长的细胞与在柔软的组织上生长的相同的细胞具有不同的表现。例如，通常，坚硬的底物不但可以支持高速率的增殖作用，而且可以减少细胞分化作用，细胞分化作用会改变细胞在天然环境中的正常功能。因此，这里描述的发明提供了在模仿软组织伸长弹性的底物上使细胞生长的方法，同时提供了一种方法，在此方法中能够获得组织环境的基本方面通式维持体外系统的简单性。

这里所述发明的实施方案提供了用于制造具有弹性的水凝胶的技术，所述水凝胶的弹性范围较宽，在生理学相关的范围内。在此技术中使用了玻璃底多孔平板。在适当的具有弹性的环境中研究细胞。在多孔平板上可以使用合成的包覆有基质的水凝胶，从而实现生理学范围内的刚性模量值跨度。例如，可以使用96-孔平板，96-孔平板是一种经常用于生物检测试验的规格形式。该系统还可以延伸至其他规格形式，从而适用于高处理能力的筛选(384-孔平板)或者细胞培养(佩特里培养皿)。通常，为了重现软组织的弹性，通过聚合作用聚合薄而光学上透明的聚丙烯酰胺水凝胶，将此薄并且光学上透明的聚丙烯酰胺水凝胶附着在每个小孔的底部。通过控制相互连接的水凝胶网络的交联数目，水凝胶的弹性可以在典型软组织(心脏组织、肺组织、肾脏组织、肝脏组织、肌肉组织、神经组织等等)允许的范围内变化，弹性模量从-20帕斯卡(脂肪)变化到-100,000帕斯卡(骨骼肌)。比较起来，现有技术中由聚苯乙烯塑料制成的细胞培养皿具有的硬度为-3,000,000,000帕斯卡。

关于图1，显示了一种用于制造水凝胶10的部件。部件10包括至少一个固定物12、小孔14、聚合溶液16、玻璃小孔底部18、和玻璃平板20。所述小孔14可以是一种多孔构形，例如，是一种96孔板部件，该96孔板的平板中包括12x8个矩形排列孔(例如，矩形的96-孔部件)。所述小孔14还可以是一种6孔构形、24孔构形、384孔构形。通常，所述小孔14还可以包括在不同的试验条件下惯常用于研究各种生物学端点的标准多孔平板。小孔底部18可以是玻璃的，从而允许观测放置在小孔14内部的细胞。所述小孔底部18还可以是其他材料制成的，从而抑制氧气流入所述聚合溶液16。在一个实施方案中，所述聚合溶液16可以由不同比例的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺组成，并且可以通过一种传递系统(例如，吸量管、自动的液态分配系统)被传递到小孔中。所述聚合溶液16可以是聚合水凝胶，例如聚脘基胺水凝胶(polyalkylimide)、聚(N-乙烯基甲酰胺)、聚乙烯醇、聚(乙二醇)。还可以是聚二甲硅氧烷、有机硅树脂、氨基多糖、透明质酸、硫酸软骨素、多聚糖、自组装肽、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、甲基纤维素、琼脂糖。对于384-孔部件，每个小孔通常可以承受1-2微升聚合溶液16。96孔部件通常可以承受大约5微升的聚合溶液16。根据所得凝胶需要的厚度不同，加入的聚合溶液的量可以是变化的。所述传递系统可以是一种吸量管或者类似的液体分配系统(例如，百特(BioTek)微孔板液体分配系统)。玻璃平板20可以使疏水玻璃的，并可以放置在固定物12的顶部。例如，但不局限于，一种环状的小孔14，玻璃平板20的直径小于小孔14的直径。所述小孔14、固定物12、小孔底部18、和玻璃平板20也可以是其他形状的。

在操作过程中，所述固定物12可以在小孔内部下降或者上升，从而将所述玻璃平板20与聚合溶液16相接触。例如，玻璃平板20可以放置在50微升的小孔底部18之内，从而所述聚合溶液16通过小孔14的直径被挤压到一种均一厚度。但是玻璃平板20不需要具有统一的表面，所述平板20可以包括正面和反面的设计(例如，凸缘、凹槽、小洞)，从而在所述聚合溶液16的表面产生褶皱及其他不规则的形状。小孔14和固定物12可以与线性或者旋转式马达相连，从而他们可以相互独立的移动，例如，将小孔14呈递到一种分配系统中，从而将小孔14放置在固定物12的下方，从而使小孔底部18和玻璃平板20相互靠近。

关于图2，进一步参照图1，表现了用于制造柔软底物100的方法和仪器。但是所述方法100仅仅起到示范性作用，并不作为对本发明的限制。方法100是可以改变的，例如，所述方法的步骤可以增加，减少或者重新排列。

在步骤102，一种聚合溶液16被放入小孔中，举例来说但并不作为对本发明的限制，384孔托盘的每个小孔包括大致1-2微升的聚合水凝胶。例如，可以使用丙烯酰胺/双-丙烯酰胺混合物。可以使用不同浓度的丙烯酰胺/双-丙烯酰胺混合物来生产具有不同刚性模量的凝胶剂，例如，刚性模量在20到100,000帕斯卡范围内的凝胶剂。也可以使用其他的聚合物水凝胶，例如，聚脘基胺水凝胶(polyalkylimide)、聚(N-乙烯基甲酰胺)、聚乙烯醇、聚(乙二醇)、聚二甲硅氧烷、硅氧烷、氨基多糖、透明质酸、硫酸软骨素、多聚糖、自组装肽、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、甲基纤维素、和琼脂糖。在每个小孔14中凝胶剂的刚性模量不需要覆盖任意范围。在一个实施方案中，多孔托盘在每个小孔中可以包括具有标准刚性模量的凝胶剂(例如，5000帕斯卡、10,000帕斯卡、17,000帕斯卡)。

在步骤104中，固定物12和小孔14之间的相对位置发生改变，因此玻璃平板20与聚合溶液16相接触。举例来说但不作为限制，聚合溶液16被压缩到厚度小于50微米。将玻璃平板20继续与聚合溶液16保持接触大约5-10分钟。较厚的凝胶剂可能需要更长时间的制备。

在步骤106中，由于氧气抑制作用，聚合溶液16不能完全的聚合在小孔14的墙壁上。通常，聚合作用的发生依赖于自由基发生系统，因此，对于其他因素敏感。例如，氧气是一种自由基捕获剂，因此，可以吸收氧气或者氧气可以透过的表面会抑制聚合作用的发生，从而导致局部凝胶变形或者未聚合成凝胶。因此，当在步骤108中除去固定物12和玻璃板20时，可能会存在未聚合的区域16a。关于图3中的照片A显示了聚合溶液16的不均匀边缘，这与缺口16a和小孔墙壁14有关。

在步骤110中，通过与一种配位体结合将聚合溶液16(即，凝胶)功能化。通过加入表面配位体22来改善凝胶16的细胞粘附性。例如，用一种异(基)双功能交联剂(例如，硫代SANPAH)处理凝胶16的表面，所述异(基)双功能交联剂能够将需要的配位体与凝胶共价连接在一起。还可以使用其他的异(基)双功能交联剂例如胺-反应性光反应性试剂(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/硝基苯叠氮化物交联剂；ANB-NOS)、硫代-SBED)、胺-羧基反应性试剂、胺基-巯基反应性试剂和丙烯酸酯。示例性的配位体包括细胞外基质(ECM)蛋白，例如，胶原蛋白(I型胶原蛋白)、层粘连蛋白、f纤维连接蛋白或者他们的结合物。还可以使用其他的细胞附着配位体/启动子例如胶原蛋白(III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白)、玻璃粘连蛋白、聚-d-赖氨酸、环状的RGD肽和线性RGD肽、肽序列和带负电荷的基团或者带正电荷的基团。举例来说，但是不作为限制，可以通过加入一种溶液来活化凝胶16，所述溶液包括溶解于200毫摩N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)中的1毫摩的磺基琥珀酰亚胺-6-(4-叠氮基-2-硝基苯基氨)己酸。将平板暴露于紫外光下5分钟，用0.1摩的N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)溶液洗涤两次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次、用I型胶原蛋白溶液(0.1毫克/毫升)包覆并在40℃条件下储存整夜。在第二天，洗涤所述凝胶16，用不含有血清的媒介物溶液水合凝胶，并在37℃条件下在5％的二氧化碳中储存在培养器中。例如，一种96孔板在不同的小孔中可以装载有大量的聚合溶液16。这些小孔可以被一排固定物14和平板20所覆盖同时放置以产生均一厚度且具有不同刚性模量(例如，100帕斯卡、200帕斯卡、400帕斯卡、800帕斯卡、1600帕斯卡、3200帕斯卡、6400帕斯卡、12800帕斯卡、25600帕斯卡和51200帕斯卡)的凝胶剂16。

在步骤112中，通过传递系统24可以加入一种第二聚合溶液26。所述传递系统24可以是一种吸量管或者类似的液体分配系统。第二聚合溶液26可被用于克服由于氧气抑制作用引起的边缘效应(即，16a)。通常，第二聚合溶液26是一种柔软的聚丙烯酰胺(即，一种相对富有弹性的聚合物)，这种柔软的聚丙烯酰胺可以附着在小孔上。

在步骤114中，通过轻轻敲打所述小孔14从而使第二聚合溶液平坦的分布，从而形成凹液面。轻轻敲打的过程可以通过一种机械敲打器进行或者手动进行。在步骤116中，空气中存在的氧气会抑制空气和第二聚合溶液26的接触面上发生聚合反应。说得更精确些，聚合反应只发生在凝胶/小孔的边缘处，在这里，液面的深度是最大的。在步骤118中，在小孔14周围可以形成均一的环状边界。在小孔中，环形的第二聚合溶液26协助附着(即，固定在)功能化的凝胶16上。同样，第二聚合溶液26也可以是未被功能化的(和柔软的)，从而最大程度上减小附着上的细胞在环26上的生长。关于图3的照片B，显示了第二聚合溶液26勾勒出的第一聚合溶液16的均匀的边缘。

丙烯酰胺、及其他聚合物溶液对细胞具有较高的毒性，因此通常需要包括一种解毒过程。在步骤120中，谷胱甘肽32可以被加入，从而对游离的、未被聚合的丙烯酰胺解毒。例如，谷胱甘肽32的溶液可以被分装到小孔14中，随后再向小孔14中接种细胞之前先培养几个小时。

在另一个实施方案中，在方法100中，试验可以包括对第二聚合溶液特别敏感的细胞，在步骤120中的清洁过程可能不足以对小孔14解毒已达到要求的程度。对于图4，进一步参照图1和图2，图4显示了用于制造柔软的底物的方法和仪器200，在底物200中含有单一的聚合物溶液。但是，方法200只是示范性的，不起到限制作用。方法200可以被改变，例如，向其中加入一些步骤、去掉一些步骤或者将各个步骤重新排列。方法和仪器200能够包括一种的多孔接口模块201，该接口模块包括一系列接口部件210，能够可操作的连接到玻璃板20上。每个玻璃板的尺寸都比多孔平板上的每一个小孔14的尺寸小一点，因此，玻璃平板20能够放置在小孔14的内部。在一个实施方案中，所述多孔平板可以是一种96孔板，购自Matrical股份有限公司，该96平板使用非细胞毒素粘合剂将玻璃底部18粘合在小孔中。通常，玻璃的厚度与基于荧光的试验、以及大功率同焦点的显微镜检验法相一致(即，厚度为大约170微米)。

在步骤220，多孔接口模块201可以被装载并且清洁。接口模块玻璃20可以被疏水化试剂(例如，Surfasil、Pierce)处理，并在凝胶覆盖之前用甲醇进行彻底的清洁。在一种实施方案中，可以通过在平板20之间放入一种间隔物来控制凝胶的厚度。

在步骤222，多孔平板上的每个小孔14都可以用50微升的硅烷水溶液进行处理，从而确保随后加入的聚合物溶液附着在小孔上。通常，可以用一种试剂处理小孔14，所述试剂例如如下式所示的一种取代的丙基三甲氧基硅烷：

其中

R是NR¹R²或者OR³；R¹或者R²分别独立的是氢或者C₁-C₆烷基

R³是烷基、烯基或者炔基(例如，C(O)R⁴，其中R⁴是氢、烷基、烯基、炔基)；

具体化合物包括：

3-氨基丙基三甲氧基硅烷和3-甲基乙酰基氧基丙基三甲氧基硅烷

例如，对于聚丙烯酰胺水凝胶，可以向小孔14中放置浓度大约为0.004-0.4％的3-甲基乙酰基氧基丙基三甲氧基硅烷，放置时间大约为10分钟。在步骤224中，在蒸馏水中冲洗每个小孔14，随后干燥(例如，可以将整个多孔平板放入蒸馏水中然后放在空气中干燥或者吹干)。经过处理的玻璃表面18与随后加入的聚丙烯酰胺发生反应，从而形成一种共价的、持久的化学键，将聚丙烯酰胺与小孔相附着。

在一种实施方案中，在步骤222，可以用3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理多孔平板上的每个小孔。例如，对于聚丙烯酰胺水凝胶，可以使用浓度大约为97％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液覆盖小孔大约10分钟。在步骤224中，在蒸馏水中冲洗每个小孔并干燥(例如，可以将整个多孔平板放入蒸馏水中然后放在空气中干燥或者吹干)，然后用在水中浓度为0.5％的戊二醛包覆处理后的玻璃表面30分钟，随后冲洗并干燥。将功能化的玻璃与随后加入的聚丙烯酰胺发生反应，从而形成一种共价的、持久的化学键，将聚丙烯酰胺与小孔相附着。

在步骤226中，向每个小孔14的底部加入少量(例如，向每个96孔托盘的小孔中加入大约5微升)的聚合溶液16.举例来讲但是并不作为限制，聚合溶液16可以使丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物。还可以使用上面在讨论方法100时论述过的其他的聚合溶液。根据完成的水凝胶所需要的硬度不同，丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例是变化的。所述混合物还可以包括0.15％的四甲基乙二胺、0.075％的过硫酸铵和1毫摩的亚硫酸氢钠(所述亚硫酸氢钠用作除氧剂)。

在步骤228中，多接口排列模块201排列在多孔平板上，从而每个小孔14都收到一个接口和玻璃部件210，20。在一个实施方案中，多接口排列模块可以与一种第二多孔托盘相结合，在第二多孔托盘上，每个小孔中都附着有一种竿和玻璃平板部件210，20。在与玻璃平板相附着的竿的末端从第二多孔托盘中伸出。在操作中，第二多孔托盘可以发生转动并与包含聚合溶液16的多孔平板对齐，从而玻璃平板能够从上面落到小孔14中。

在步骤230中，玻璃平板20被牢固的压在聚合溶液16和玻璃底部18上。举例来讲，但不作为限制，压缩之后聚合溶液16(即，凝胶)的厚度可以小于100微米(例如，可以是10微米、25微米、50微米、70微米、80微米)。根据实验不同，所述凝胶16的厚度可以更大(例如，0.3毫米、0.5毫米、.75毫米、1.0毫米)。加入的聚合溶液的体积可以影响所得凝胶的厚度。保持玻璃平板20在固定的位置直到所述聚合溶液16完全聚合(例如，大约10-15分钟，但是对于较厚的凝胶剂，可能需要更长的时间)。在一个实施方案中，多孔托盘和接口排列部件可以放置于一种缺氧的空间中。例如，放置在氮气条件下。

在步骤232中，从小孔14中除去玻璃平板20。通常，通过提拉除去玻璃平板20，同时施加一种横向力将玻璃平板20与凝胶16相剥离。一旦平板20从每个小孔中被除去，向小孔中加入100微升的蒸馏水212，从而使凝胶16水合。

在步骤234中，去掉蒸馏水212并用一种异(基)双功能交联剂衍生凝胶16，然后用一种配位体与之发生反应。在一个实施方案中，向每个小孔14(即，向96-孔板托盘的每个小孔)中加入35微升的0.5毫克/毫升的硫代SANPAH(N-磺基琥珀酰亚胺-6-[4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨]己酸)在50毫摩N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES缓冲液)中的溶液。然后将小孔14暴露于紫外灯下大约5分钟。在向紫外灯下暴露之后，除去所述硫代SANPAH(N-磺基琥珀酰亚胺-6-[4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨]己酸)溶液，用100微升50毫摩的N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES缓冲液)冲洗凝胶16。然后向每个小孔中加入100微升在磷酸盐缓冲盐水中浓度为100微克/毫升的胶原蛋白I(经过胃蛋白酶增溶的胶原蛋白I)，在室温条件下培养大约4小时。然后从小孔中去掉所述I型胶原蛋白溶液。在上面关于过程100的讨论中提到的其他交联剂和配位体可以被使用。在一种实施方案中，在进行衍生之前，先将聚合溶液加入到小孔14中。

在步骤236中，将小孔14和凝胶16灭菌。在一种实施方案中，向每个小孔14中加入200微升的磷酸盐缓冲盐水。然后在紫外灯216下对每个小孔14进行大约2小时的灭菌。去掉磷酸盐缓冲盐水，在大约200微升的培养基中接种细胞。

对于图5，进一步参照图2、4，在一个实施方案中，96孔板可以被设置成小孔14之间中弹性凝胶16的刚性模量是按列变化的。例如，每列小孔中装载的凝胶16的刚性模量是按列递增的(即，分别为50帕斯卡、100帕斯卡、200帕斯卡、400帕斯卡、800帕斯卡、1600帕斯卡、3200帕斯卡、6400帕斯卡、12800帕斯卡、25600帕斯卡和51200帕斯卡)。

进一步的，非衍生凝胶剂可以作为每种刚性模量值的背景参照。根据不同试验方案的要求，每排平板包括不同的测试细胞和空白参照。在一种实施方案中，整个多孔平板上凝胶剂的刚性模量值基本上是相似的。例如，在一种实验中，每个小孔中凝胶的刚性模量是一致的，但接种的细胞类型发生变化。

对于图6，进一步参照图2，图4。在一种实施方案中，一种384孔平板可以被设置成小孔14之间中弹性凝胶16的刚性模量是按列变化的。例如，每列小孔中装载的凝胶16的刚性模量是150帕斯卡、300帕斯卡、600帕斯卡、1200帕斯卡、2400帕斯卡、4800帕斯卡、9600帕斯卡、19200帕斯卡、38400帕斯卡、76800帕斯卡、和153600帕斯卡，或者是50帕斯卡、100帕斯卡、200帕斯卡、400帕斯卡、800帕斯卡、1600帕斯卡、3200帕斯卡、6400帕斯卡、12800帕斯卡、25600帕斯卡和51200帕斯卡。

关于图7，进一步的参照图2、图4、和图6，图7显示了在包括水凝胶16的384-孔平板中生长的人肺部成纤维细胞的图表，所述水凝胶16含有大范围的刚性模量值。该图表包括的X轴302代表了细胞所生长的凝胶的刚性模量。X轴302的刻度是对数制的，从10帕斯卡到1,000,000帕斯卡(Pa)范围内变化。图表的Y轴304代表了细胞数目方面的变化(即，2倍、3倍)，范围在0-6倍之间变化。在图300上绘制了4组数据，包括0％血清的306、包括0.1％血清的308、包括1％血清的310和包括10％血清的312。将成熟人肺部成纤维细胞(CCL-151)接种在包括不同刚性模量值的凝胶的384孔平板上，将其与上述指定浓度的血清相接触48小时，将所得结果在图300上绘制。结果显示，在中间刚性模量上细胞增加的数目最多，在刚性模量为800帕斯卡时，细胞增加的数目达到顶点。最右边的数值314代表了在刚性玻璃底物上生长的细胞。

关于图8，进一步参照图2、4、6，图8显示了在包括水凝胶16的384-孔平板中生长的人肺部成纤维细胞细胞凋亡的图表，所述水凝胶16含有大范围的刚性模量值。该图表包括的X轴302代表了细胞所生长的凝胶的刚性模量。X轴302的刻度是对数制的，从10帕斯卡到1,000,000帕斯卡(Pa)范围内变化。图表的Y轴322代表了每个细胞天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶3/7活性，范围在0到0.035之间变化。在图300上绘制了4组数据，包括0％血清的306、包括0.1％血清的308、包括1％血清的310和包括10％血清的312。将成熟人肺部成纤维细胞(CCL-151)接种在包括不同刚性模量值的凝胶的384孔平板上，将其与上述指定浓度的血清相接触48小时，将所得结果在图300上绘制。结果显示，在柔软的凝胶剂上生长的细胞其细胞凋亡的标志-天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶3/7活性有所提高。当细胞在不含血清的培养基上生长时，效果更为显著。最右边的数值314代表了在刚性玻璃底物上生长的细胞。

对于图9，进一步参考图2、4、6，图300、332、334、336、338、340比较了与细胞所生长的水凝胶16的硬度有关的不同细胞类型的细胞生长。该图表包括的X轴302代表了细胞所生长的凝胶的刚性模量。X轴302的刻度是对数制的，从10帕斯卡到1,000,000帕斯卡(Pa)范围内变化。图表的Y轴304代表了细胞数目方面的变化(即，2倍、3倍)，范围在0-10倍之间变化。在384孔平板上以100个细胞/平方毫米的密度播种细胞，并在包含10％血清的培养基上培养48小时。所述细胞包括胎儿肺部成纤维细胞330、成熟的肺部成纤维细胞332、正常人的肺部成纤维细胞334、皮肤成纤维细胞336、成肌细胞338和狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney)340。所得结果表明在凝胶刚性模量和细胞类型的变化时细胞数量上的变化。

具有柔软表面的多孔培养平板可以认为是常规二维细胞培养物的升级。通常，具有柔软表面的多孔培养平板可以更好的满足现实中细胞培养的需要。例如，研究员已经显示了通过改变细胞外硬度可以简单的完成不同血统之间间充质干细胞的分化作用。具有柔软表面的多孔培养平板技术可以被使用来筛选适于细胞分化的硬度，并且一旦识别出来，就可以作为未来研究过程中的底物。进一步的，可以以一种结合的方式评价机械和生物化学因素，从而制备有效的新发现的基质。

生理条件的模拟

绝大多数药物筛选，尤其是针对癌症的药物筛选时将细胞接种在坚硬的多孔平板上进行的。但是，很多化学治疗药物在坚硬的平板上不能抑制细胞增值作用，但是在柔软的底物上却可以；同样也存在相反的例子。通常，对什么样的机械性能(刚性模量)能够激发需要的细胞表型这类知识的了解对组织设计非常有价值，能在组织设计过程中设计三维支架。

具有柔软表面的多孔培养平板还可以用于基于疾病的研究中。通常，在许多疾病中都会出现组织变硬(或者变软)的情况，例如，sclerodoma、动脉粥样硬化症、肺气肿、或者肺部的纤维症、肝脏纤维症和肾脏纤维症。具有柔软表面的多孔培养平板技术将依赖硬度的细胞表现评定领域提高到更高的水平，这一水平是目前所有的技术都不能达到的。例如，通过将细胞在具有脂肪相似刚性模量(大约为10帕斯卡)的表面上培养细胞能够模拟与脂肪组织相接触的细胞的生长或者表现。不同的组织类型具有不同的硬度，例如，正常的脑组织具有的刚性模量大约为200帕斯卡。根据给定的组织的疾病状态不同，细胞生长/表现行为也不相同，例如，正常乳腺组织的刚性模量大约是100帕斯卡，而乳房肿瘤组织的刚性模量是2000帕斯卡。相似的，正常肝脏组织具有的刚性模量大约为300帕斯卡，与此相比，纤维化的肝脏组织具有的刚性模量大约为800帕斯卡。由于底物硬度不同，细胞的生长、信号传导、基因或者蛋白质表达/分泌、以及其他的生理参数都会发生改变，根据与之相接触的底物不同对细胞进行评价时，底物应该具有与被模拟的不同组织类型或者疾病状态所具有的机械性能为特征。

干细胞的分化作用会受到培养基底物机械性能的影响。例如，在具有的刚性模量大约为300帕斯卡的底物上培养的干细胞，例如间充质干细胞会被分化成神经元表型的细胞。暴露于中等硬度的培养底物上，例如刚性模量为3000帕斯卡的底物上，干细胞会被分化为肌性组织。在另一个实施例中，在具有相对较硬的刚性模量(例如15,000帕斯卡)的底物上生长的干细胞会分化为具有成骨表型的细胞。因此，这里描述的底物硬度的变化和包含这种底物的仪器也会有效的影响或者驱使干细胞或者祖细胞向一种表型分化，根据所接触的底物的机械性能不同，干细胞或者祖细胞会分化成不同的细胞表型。

进一步地，在指定细胞表型的培养过程中，塑料的常见硬度是一种极端条件，会导致不希望的细胞表型，这种不希望的细胞表型在正常的天然环境中不会存在。具有柔软表面的多孔培养平板特别适合于神经元的培养，神经元细胞在柔软的底物上显示增加的分支和增长。

上面的描述涉及到本发明，但是这些描述可能包括一种以上的发明。

Claims (26)

1.一种用于制造具有的弹性性质覆盖生理学范围的水凝胶的方法，该方法包括向一个小孔中放入一种第一聚合溶液，用平板覆盖第一聚合溶液，平板的面积小于小孔的面积；将第一聚合溶液与一种配位体相结合；向所述小孔中放入一种第二聚合溶液，空气中存在的氧气基本上抑制空气液体接触面上的聚合作用；和对小孔除去解毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过抗-配位体和抗-免疫球蛋白G包覆的荧光颗粒评价配位体结合的均一性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，第二聚合溶液可以通过敲打小孔的方式分配均匀。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，第二聚合溶液基本上可以覆盖第一聚合溶液边缘和小孔之间定义出的环形区域。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，第二聚合溶液将第一聚合溶液附着在小孔上。

6.一种仪器，该仪器包括小孔；一种分配系统，该分配系统被设置来向小孔中传递一种聚合溶液；一种固定物，设置用于插入小孔中；和放置在固定物的末端的玻璃平板，其中，玻璃平板的面积小于小孔的面积，并被设置为与位于孔中的聚合溶液相接触。

7.根据权利要求6所述的仪器，其中，所述小孔是一种多孔平板。

8.根据权利要求7所述的仪器，其中，所述固定物是一系列的固定物，并且每个固定物都被设置为插入多孔平板的相应的孔中。

9.根据权利要求6所述的仪器，包括固定物插入系统，被设置为将固定物移入和移出小孔。

10.根据权利要求6所述的仪器，包括一种第二分配系统，被设置为向小孔中传递第二聚合溶液。

11.根据权利要求6所述的仪器，其中，所述分配系统可以被设置成向小孔中传递第二聚合溶液。

12.根据权利要求6所述的仪器，其中，所述小孔可以是96孔板的小孔。

13.根据权利要求6所述的仪器，其中，所述小孔可以是384孔板的小孔。

14.根据权利要求6所述的仪器，包括孔板步骤，在此步骤中，孔板可以被设置为将小孔在至少一个轴线中移动。

15.根据权利要求6所述的仪器，包括小孔轻敲器，可以被设置为轻敲所述小孔。

16.一种仪器，这种仪器包括一种多孔平板；

附着在至少平板中第一小孔中的第一凝胶；

和至少附着在平板中第二小孔中的第二凝胶；

其中第一凝胶和第二凝胶的刚性模量是不同的。

17.根据权利要求16所述的仪器，包括一种第三凝胶，该第三凝胶可以被放置在所述平板的至少第三小孔中，其中，第一凝胶、第二凝胶和第三凝胶的刚性模量是不同的。

18.根据权利要求16所述的仪器，其中，平板上的小孔可以以行为单位进行处理，在每一行孔中的凝胶的刚性模量基本上是一样的。

19.根据权利要求16所述的仪器，其中，所述多孔平板是96孔板。

20.根据权利要求19所述的仪器，其中，所述平板包括12行小孔，其中1行小孔是空的，另外11行小孔中包含凝胶，在其中一行的小孔中的凝胶与同行小孔中的凝胶基本上具有相似的刚性模量。

21.一种仪器，该仪器包括一种多孔平板；至少附着在平板第一小孔中的凝胶，其中，所述凝胶的厚度小于1毫米。

22.根据权利要求21所述的仪器，所述凝胶的厚度小于100微米。

23.根据权利要求21所述的仪器，包括一种第二凝胶，所述第二凝胶被放置在平板的至少第二小孔中，第二凝胶的厚度小于1毫米，并且，第一凝胶和第二凝胶的刚性模量是不同的。

24.根据权利要求23所述的仪器，第二凝胶的厚度小于100微米。

25.根据权利要求21所述的仪器，所述凝胶是由一种异(基)双功能交联剂和一种配位体衍生而来的。

26.一种模拟生理学生长情况的方法，包括将细胞与权利要求6、16或者22所述仪器相接触。

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