TWI781450B - 複合刺激生物反應器 - Google Patents

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TWI781450B
TWI781450B TW109133086A TW109133086A TWI781450B TW I781450 B TWI781450 B TW I781450B TW 109133086 A TW109133086 A TW 109133086A TW 109133086 A TW109133086 A TW 109133086A TW I781450 B TWI781450 B TW I781450B
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Abstract

本發明關於一種複合刺激生物反應器，其包含：流道層，其包含產生負壓吸力或正壓作用力的一組流道；導電彈性層，其配置有一對電極，並配置在該流道層上，且接受該負壓吸力或該正壓作用力之驅動而沿形變方向產生形變，以及經由該對電極接收電壓差而沿電場方向形成電場；以及培養層，其配置在該導電彈性層上，並提供組織在該導電彈性層上進行體外培養。

Description

複合刺激生物反應器
本發明係關於一種能夠分開或同時對所體外培養之組織細胞進行電刺激或機械刺激，且能選擇性因應溫度改變培養區之親疏水性的複合刺激生物反應器。
組織工程學(tissue engineering)是指利用生物活性物質，使用體外培養或構建方法，在體外培養出細胞組織以供研究、用於再造或修復器官及組織的一門技術。
在生物體內，以肌肉細胞為例，神經細胞對於骨骼肌的電刺激，是導致骨骼肌發育及成熟的重要因素，但在體外培養中，機械應力刺激才是對肌肉細胞的生長、分化、蛋白質表現以及功能化則扮演著重要的角色，機械刺激也已經被證明能夠誘導細胞順向排列，且能促進肌管分化的平行排列以及提升肌管的成熟。
在習用技術中，能對體外培養之細胞進行刺激的裝置，大致區分為兩大類，各有不同的結構與設計原理，其中一類是利用微流道(microchannel)進行靜水壓、剪應力的仿生模型，另一類是利用機械載台直接對生物薄膜或是模具進行拉伸的機台。
然而以微流道為主的仿生模型，往往有生物樣本太少以至於 無法做生物分析，而機械載台的價格往往過於高昂，且其體積大、重量重，雖然可以提供充足的細胞培養空間，但卻不易置入細胞培養箱內進行無菌處理與培養組織，在空間利用上的表現非常之差，這兩類裝置都有明顯的缺點。
另外一種則是利用微系統製程，製作微流道式的微型化生物反應器，使生物反應器之尺寸縮小，但這種微型化生物反應器，雖然可以輕易置入細胞培養箱，但卻也壓縮了生物反應器的培養空間，導致生物樣本的收集困難。
一種尺寸較微型化生物反應器更大的生物反應器，其透過體積適中的流道層，以氣壓使培養細胞的生物薄膜產生形變，但這種生物反應器的培養區被限定能為圓形，一般而言，圓形之薄膜在受到力的鼓起或壓縮時，產生之拱形形變在薄膜上的分布是不一致的，造成細胞所受到的刺激量皆不一致，進而影響實驗結果。
而Hosseini團隊使用液壓使PDMS薄膜膨脹藉此給予細胞機械刺激，然後利用一對稱形狀之奈米銀摻雜於PDMS薄膜中作為導電體，而在通電的時候給予細胞電場刺激，這樣的裝置雖然可以同時施加電與機械刺激，只能針對在電極上的細胞進行形態分係，且膨脹所造成的拱形形變無法使細胞得到一致的拉伸。
但是上述這些習用裝置，多數都是設計用來對體外培養組織提供機械刺激，只有少數裝置能對組織進行結合機械刺激與電刺激的複合式刺激，但是明顯的這類複合刺激裝置的開發，仍在起步階段且存在許多問題有待克服。
另一方面，這些少數的研究都指出，結合電刺激與機械刺激，組織產生的各種反應都有加乘的效果，加上對於體外培養之組織，施加複合性物理刺激，對於組織的熟成均扮演著相當重要的角色，也是非常重要的研究主題。
鑑於複合刺激的重要性，但目前在組織工程的領域中，能結合拉伸刺激並透過基材對細胞通電的裝置不但數量非常少，且存在許多缺點，職是之故，發明人經過悉心嘗試與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「複合刺激生物反應器」，能夠克服上述缺點，以下為本發明之簡要說明。
有鑑於習用技術的缺點，本發明提出能夠對培養與附著在培養薄膜上的組織，分開或同時進行電刺激或者機械刺激，以及能夠因應溫度改變培養薄膜之親疏水性的一種複合式生物反應器，整組生物反應器是以全生物相容為基礎進行開發設計，不僅設計簡單且符合空間及成本效益，培養區還能提供大培養空間，且培養薄膜拉伸狀況相當均勻，同時還提供複合次記，能夠給予組織均勻的複合刺激，且具有低成本且方便製作、可自動化且易於操作、以及高度整合性等優點。
本發明裝置在結構上包含多組大面積且相互分開獨立的培養區，可供操作者在完全相同的條件下進行多組生物實驗、縮小實驗誤差及足夠生物樣本等優點，並提供效果均勻且穩定的拉伸或電刺激，還能根據需求對電刺激或拉伸刺激參數進行改變，實現拉伸/電雙重刺激，並且如果有需要，在分化後期還能夠選擇性的透過降溫方式輕鬆獲取細胞片。
據此本發明提出一種複合刺激生物反應器，其包含：流道層，其包含產生負壓吸力或正壓作用力的一組流道；導電彈性層，其配置有一對電極，並配置在該流道層上，且接受該負壓吸力或該正壓作用力之驅動而沿形變方向產生形變，以及經由該對電極接收電壓差而沿電場方向形成電場；以及培養層，其配置在該導電彈性層上，並提供組織在該導電彈性層上進行體外培養。
較佳的，該有機導電薄膜之成分包含聚吡咯(polypyrrole、PPy)、聚噻吩(polythiophene、PT)、聚苯胺(polyaniline、PANi)、聚苯硫醚(polyphenylene sulfide、PPS)或者其組合，該有機導電薄膜透過氧化聚合程序而沉積在該生物彈性基材上，該流道層、該生物彈性基材以及該培養層之成分包含聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane、PDMS)材料。
本發明進一步提出一種複合刺激生物反應器，其包含：流道層，其包含產生負壓吸力或正壓作用力的一組流道；導電彈性層，其配置有一對電極，並配置在該流道層上，且接受該負壓吸力或該正壓作用力之驅動而沿形變方向產生形變、經由該對電極接收電壓差而沿電場方向形成電場以及因應溫度變化而改變表面之親疏水性；以及培養層，其配置在該導電彈性層上，並提供細胞在該導電彈性層上進行體外培養。
較佳的，該導電彈性層還包含生物彈性基材、以及沉積在該生物彈性基材上的溫敏導電薄膜。
較佳的，該溫敏導電薄膜之成分包含聚吡咯(polypyrrole、PPy)、聚噻吩(polythiophene、PT)、聚苯胺(polyaniline、PANi)、聚苯硫醚(polyphenylene sulfide、PPS)、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)或者其組合。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解，此發明內容並非揭露本發明的完整描述，且用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
100:生物反應器
110:基座
111:定位槽
112:組裝孔
120:流道層
121a:微流道
121b:微流道
122:腔室
123:實驗與觀察平台
124:流體介質
130:導電彈性層
131:周邊區域
140:培養層
141:邊框結構
142:垂直腔壁
143:培養井
144:組織
151a:第一電極對
151b:第一電極對
152a:第二電極對
152b:第二電極對
160:壓板
161:裝配孔
162:夾槽
163:保護蓋定位部
171:螺栓
172:螺帽
181:夾鉗
190:保護蓋
200:生物相容反應模組
301:空氣泵浦
302:針筒
310:成像設備
SS’:剖面線
SD:形變方向
EF:表面電場
ED1:第一電場方向
ED2:第二電場方向
第1圖到第9圖揭示本發明複合刺激生物反應器第一實施例之組裝過程示意圖；
第10圖揭示本發明生物相容反應模組第二實施例之構造大部分解示意圖；
第11圖揭示本發明生物相容反應模組第二實施例之構造總成示意圖；
第12圖揭示本發明生物相容反應模組第三實施例之構造大部分解示意圖；
第13圖揭示本發明生物相容反應模組第三實施例之構造總成示意圖；
第14圖揭示本發明生物反應器與外部流體驅動設備連結與連通之示意圖；
第15圖到第17圖係揭示本發明生物反應器生物相容反應模組沿第13圖所揭示之剖面線SS’所呈現之作動過程之一系列剖面示意圖；
第18圖揭示經由使用倒立式顯微鏡4倍物鏡觀察培養在本發明複合刺激生物反應器導電彈性層上的組織細胞的影像圖；
第19圖揭示經由使用倒立式顯微鏡10倍物鏡觀察培養在本發明複合刺激生物反應器導電彈性層上的組織細胞的影像圖；
第20圖揭示本發明生物相容反應模組所產生之電場方向平行於形變 方向之複合刺激之示意圖；
第21圖揭示本發明生物相容反應模組所產生之電場方向垂直於形變方向之複合刺激之示意圖；
第22圖揭示本發明印有螢光標記陣列的導電彈性層在拉伸前螢光標記陣列的排列形式之顯微鏡影像；以及
第23圖揭示本發明印有螢光標記陣列的導電彈性層在拉伸後螢光標記陣列的排列形式變化之顯微鏡影像。
本發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然本發明之實施並非可由下列實施案例而被限制其實施型態；本發明之圖式並不包含對大小、尺寸與比例尺的限定，本發明實際實施時其大小、尺寸與比例尺並非可經由本發明之圖式而被限制。
本文中用語“較佳”是非排他性的，應理解成“較佳為但不限於”，任何說明書或請求項中所描述或者記載的任何步驟可按任何順序執行，而不限於請求項中所述的順序，本發明的範圍應僅由所附請求項及其均等方案確定，不應由實施方式示例的實施例確定；本文中用語“包含”及其變化出現在說明書和請求項中時，是一個開放式的用語，不具有限制性含義，並不排除其他特徵或步驟。
第1圖到第9圖揭示本發明複合刺激生物反應器第一實施例之組裝過程示意圖；在本實施例，本發明生物反應器包含預先製作的多件基本元件，這些基本元件經過設計包含各式定位槽、組裝孔以及培養井等 結構，按照操作者的操作經驗與組裝熟練程度，操作者一般可在大約介於5到15分鐘的時間裡，將這些基本元件組裝成本發明複合式刺激的生物反應器100。
首先提供如第1圖揭示的基座110，基座110的構造較佳包含一個可供流道層嵌合的定位槽111、以及多個組裝孔112，定位槽111構造之一部分結構與流道層在結構形式上相互對應，流道層120經由嵌入定位槽111而安裝到基座110上，如第2圖所揭示，流道層120的構造包含相互連通的微流道(microchannel)121a與121b、腔室122以及實驗與觀察平台123，微流道121a與121b透過腔室122連通外部流體驅動設備，例如：空氣泵浦、液體泵浦、針筒推進器(syringe)、液壓控制器、注射泵或者蠕動泵等。
接著如第3圖所揭示，在流道層120上接合可透光的一層導電彈性層130，導電彈性層130與流道層120之間較佳是透過電漿接合(plasma bonding)方法而接合，接合範圍包含微流道121a與121b外側與到邊緣的周邊區域131，但不包含位在實驗與觀察平台123上的導電彈性層130，位在實驗與觀察平台123上的導電彈性層130相對於流道層120必須保持可滑動的狀態，以產生拉伸應變(strain)，在實驗與觀察平台123與導電彈性層130之間可塗佈少許矽油作為潤滑劑，拉伸應變的形變方向垂直於微流道121a或121b。
導電彈性層130還包含作為基材的一片生物彈性基材，以及透過高分子聚合製程將導電高分子材料沉積在生物彈性基材表層上的一層有機導電薄膜，舉例來說，生物彈性基材較佳是選擇使用聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane、PDMS)薄膜製作，導電高分子材料較佳是聚吡咯(polypyrrole、PPy)、聚噻吩(polythiophene、PT)、聚苯胺(polyaniline、PANi)、 聚苯硫醚(polyphenylene sulfide、PPS)或者其組合，上述導電高分子材料不但具有生物相容性且性質穩定，還具備導電的特性，作為體外培養薄膜基材時，有助於細胞之貼附、遷移、增生以及促進分化。導電彈性層130基本上是一片具有導電性、延展性且可透光的複合高分子薄膜
接著如第4圖所揭示，在導電彈性層130上黏著一層培養層140，導電彈性層130與培養層140之間較佳是使用生物相容材料例如：PDMS作為接著劑而黏合，培養層140之構造包含多個邊框結構141，以及由邊框結構141上的多面垂直腔壁142組成的多組井狀結構，培養層140與導電彈性層130黏合後，垂直腔壁142與導電彈性層130共同構成多組培養井143或稱培養區，每一組培養井143的導電彈性層130上可供體外培養生物細胞或組織，每一組培養井143之間透過邊框結構141互相隔離，形成一個獨立的培養區。
第5圖揭示搭接在導電彈性層130四周邊緣的二組電極對(a pair of electrodes)，包含第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b，第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b與外部的電子控制器電性連接，電子控制器包含電源供應器模組與電子控制模組等，可向第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b供應並施加例如但不限於：0.1V/cm、0.33V/cm或者1V/cm的直流電與對應之電壓差，經由在第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b之間施加電壓差，第一電極對151a與151b可以在導電彈性層130上產生平行於形變方向的電場，第二電極對152a與152b可以在導電彈性層130上產生垂直於形變方向的電場，以便對所培養之組織提供電刺激，或模擬體內細胞間電訊號的傳遞。
流道層120與培養層140較佳是使用生物相容材料，例如但不限於：PDMS，透過實施成型(molding)或模鑄(casting)方法所製作，培養層140較佳是使用生物相容材料，例如但不限於：PDMS，透過實施成型(molding)或模鑄(casting)方法所製作，以上所述之流道層120、導電彈性層130、培養層140以及第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b等，共同構成一組配置在生物反應器100內部的核心生物相容反應模組200。
第6圖揭示組裝在生物相容反應模組200上的壓板160，壓板160在對應於基座110多個組裝孔112的位置上，也相應開設有多個裝配孔161，壓板160四周邊緣還設置有多個夾槽162，中央處設置有一個保護蓋定位部163，壓板160整體結構可包覆住一部分或全部的邊框結構141，並定位培養層140，如第7圖所揭示，基座110與壓板160之間可以使用多組螺栓171與螺帽172，鎖入基座110多個組裝孔112以及壓板160多個裝配孔161而將兩者鎖固，經鎖固後的基座110與壓板160，可以固定生物相容反應模組200包含的流道層120、導電彈性層130以及培養層140等元件。
第8圖揭示鎖定在壓板160夾槽162上的多個夾鉗181，以便針對導電彈性層130以及搭接在導電彈性層130邊緣的第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b提供更多夾持力，避免導電彈性層130的拉伸應變造成第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b的滑脫或位移，導致電性接觸不良，並增強導電彈性層130的拉伸效率，以利產生足夠的拉伸量(應變量)，較佳也可以改用C形環或者C形扣環鎖定在夾槽162上，以固定基座110與壓板160；最後如第9圖所揭示，在保護蓋定位部163上放置一個透光或不透光的保護蓋190，避免環境雜質汙染培養井143內正在體外培養 的組織，完成本發明複合式生物反應器100。
第10圖揭示本發明生物相容反應模組第二實施例之構造大部分解示意圖；第11圖揭示本發明生物相容反應模組第二實施例之構造總成示意圖；第12圖揭示本發明生物相容反應模組第三實施例之構造大部分解示意圖；第13圖揭示本發明生物相容反應模組第三實施例之構造總成示意圖；本發明生物相容反應模組200的培養層140經過設計可以形成數量不限的培養井143，如第10圖與第11圖揭示的三組培養井143的生物相容反應模組200、或者第12圖與第13圖揭示的單一組培養井143的生物相容反應模組200。
本發明之生物相容反應模組200，包含以PDMS為主材料而製作的流道層120、導電彈性層130以及培養層140，流道層120與導電彈性層130之間是透過電漿接合而接合，導電彈性層130與培養層140之間較佳是使用生物相容材料例如：PDMS作為接著劑而黏合，上述PDMS材料、PDMS接著劑與氧電漿等材料皆具備高度的生物相容性，不會對培養井143中體外培養的細胞組織產生毒性，即使所培養的組織與這些材料產生接觸，也不會對組織造成傷害。
流道層以及培養層的製作方式，大致是先利用電腦輔助設計與製造(CAD/CAM)系統例如但不限於SolidWorks軟體等，設計出流道層以及培養層對應的成型模具的設計圖，然後輸入電腦數值控制(CNC)加工機，銑削壓克力(PMMA)塊材，形成流道層以及培養層的成型模具粗胚，然後拋光與加工粗胚，完成成型模具的製作，再將液態的PDMS的A劑與B劑，依特定比例混合與攪拌一定時間後，澆注灌入成型模具，靜置一段時間並脫 泡，然後將成型模具連同液態PDMS，放入加熱器在特定溫度下烘烤一段時間，以進行PDMS的熱固化，完成後待PDMS冷卻後即可從成型模具中脫模，完成流道層以及培養層的製作。
導電彈性層包含的生物彈性基材較佳是依照以下步驟製作：(1)提供一片具有光滑且平整表面的PMMA基材，並置於旋轉機台上；(2)將液態的PDMS的A劑與B劑，依特定比例混合與攪拌一定時間後，澆淋在PMMA基材上並啟動旋轉機台進行抹平；(3)將PMMA基材與塗佈在PMMA上的PDMS材料，放入加熱器在特定溫度下烘烤一段時間；以及(4)將PMMA基材從加熱器中取出，並從PMMA上將PDMS薄膜取下。
接著對所製備的PDMS薄膜進一步進行化學表面修飾(chemical modification to surface)，可經由實施以下步驟而達成：(1)使用例如但不限於：以特定莫耳濃度的氫氧化鈉(NaOH)水溶液浸泡PDMS薄膜，並於室溫下靜置約5到7小時較佳是6小時；以及(2)以去離子水(DI water)清洗處理後的PDMS薄膜，以去除殘留的氫氧化鈉水溶液；PDMS薄膜表層經由化學表面修飾產生之蝕刻作用，會形成複數凹凸結構或細微孔洞，可以增加表面粗糙度，並有利後續PDMS薄膜的伸展，產生更大的拉伸應變量，且這些凹凸結構是以大致均勻的方式分布，使得通過PDMS薄膜的光線能大致規則的反射與折射，有助後續之成像，並賦予PDMS薄膜極佳光學特性。
接著在修飾後的PDMS薄膜單側表面上沉積一層有機導電薄膜，可經由實施以下步驟而達成：(1)將修飾後的PDMS薄膜平貼在例如但不限於培養皿(petri dish)底部；(2)調配特定莫耳濃度的過硫酸銨(ammonium persulfate、APS)水溶液以及吡咯(pyrrole、Py)水溶液，並置入冷卻器加以冷 卻至特定溫度；(3)將冷卻後APS水溶液與Py水溶液等體積混合，並注入培養皿，讓培養皿保持在特定溫度下一段時間，進行氧化聚合反應，以在PDMS薄膜上形成一層PPy有機導電薄膜，以形成PPy/PDMS薄膜；(4)從培養皿中移除APS水溶液與Py水溶液，並以去離子水清洗PPy/PDMS薄膜；以及(5)進一步利用超音波震盪機清洗PPy/PDMS薄膜表面上殘留的PPy粉末，完成導電彈性層之製作；完成後導電彈性層外觀大致呈現黑色，但由於PDMS薄膜已經預先以化學表面修飾處理過，因此PPy/PDMS薄膜或導電彈性層將具有介於30%~80%不等之透光度。
將PPy/PDMS薄膜上沒有沉積PPy有機導電薄膜的背面與流道層的正面接合，對PPy/PDMS薄膜的背面與流道層的正面實施電漿激活(plasma activation)，可經由將PPy/PDMS薄膜與流道層置入例如但不限於：常見的圓腔式氧電漿機施行氧電漿激活，以便緊密接合流道層與PPy/PDMS薄膜，使得微流道與腔室在實際操作過程能承受相當之正壓或負壓，然後在PPy/PDMS薄膜的表面上、以及培養層的底部，分別塗佈PDMS接著劑，然後整組置入加熱器在特定溫度下烘烤一段時間，使PDMS接著劑熱固化，並進一步增強電漿接合接面之接合強度。
在上述吡咯的聚合過程中，較佳的還可以進一步加入溫敏性高分子，例如但不限於：N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)之單體，與吡咯進行共聚，最終得到聚合在PDMS薄膜上的一層P(PPy-co-NIPAm)溫敏導電薄膜，此溫敏導電薄膜具有生物相容性，並同時具有可拉伸性、導電性及溫敏性(thermosensitivity)，溫敏導電薄膜本身的分子鏈型態能響應溫度之變化，改變表層之親水性(hydrophilic)與疏水性(hydrophobic)，當溫度增加時，溫敏 導電薄膜分子鏈傾向於組成疏水纏繞扁平狀構形，較適於細胞貼附，當溫度降低時，溫敏導電薄膜分子鏈傾向於組成親水舒展直鏈狀構形，此時細胞外基質會被推開，進而細胞就能脫離表面，過程不會損傷細胞結構，稱為降溫脫附，可以使得培養與附著在溫敏導電薄膜上的組織，完整無損傷的從溫敏導電薄膜上取下。
P(PPy-co-NIPAm)溫敏導電薄膜較佳可經由實施以下步驟而沉積到作為基材的PDMS薄膜表層上：(1)將修飾後的PDMS薄膜平貼在例如但不限於培養皿(petri dish)底部；(2)調配特定莫耳濃度的APS水溶液、PPy水溶液以及NIPAm水溶液；(3)將PPy水溶液以及NIPAm水溶液混合後加入特定量四甲基乙二胺(Temed)溶液並倒入培養皿，利用試管震盪器均勻震盪混合；(4)加入APS水溶液，混和均勻後置於室溫反應一段時間，以在PDMS薄膜上形成一層P(PPy-co-NIPAm)溫敏導電薄膜；(5)從培養皿中移除水溶液，並以去離子水清洗P(PPy-co-NIPAm)/PDMS薄膜；以及(6)將P(PPy-co-NIPAm)/PDMS薄膜放入加熱器以特定溫度加熱一段時間，完成導電彈性層之製作。
第14圖揭示本發明生物反應器與外部流體驅動設備連結與連通之示意圖；本發明生物反應器100在流道層120中包含微流道121a與121b與腔室122等，微流道121a與121b與腔室122內部較佳可填充氣體或液體等適當之流體介質，腔室122會與外部的流體驅動設備，例如但不限於空氣泵浦301或者針筒302連通，透過流體驅動設備對填充在流道層內部的流體介質進行之抽出或注入等作動，就能使上方的導電彈性層130產生相應的拉伸(stretch)或收縮(contraction)的機械作動，形變方向垂直於微流道121a或 121b。
第15圖到第17圖係揭示本發明生物反應器生物相容反應模組沿第13圖所揭示之剖面線SS’所呈現之作動過程之一系列剖面示意圖；如第15圖之揭示，當本發明生物相容反應模組200還未作動時，導電彈性層130是在中立狀態(neutral status)，而流道層120與導電彈性層130皆以可透光材質所製作，因此透過架設在生物相容反應模組200下方的成像設備310，例如：顯微鏡、倒立式顯微鏡、電子顯微鏡(SEM)等，就能到觀察在培養層140培養井143內與導電彈性層130上體外培養的組織144、其組織結構與細胞型態。
如第16圖所揭示，當流體驅動設備開始將流道層120內部的流體介質124移出時，流體介質124被抽出微流道121a與121b的過程，在連續體原理作用下，導電彈性層130被向下吸入微流道121a與121b，進一步造成實驗與觀察平台123上的導電彈性層130往垂直腔壁142拉伸而產生形變，培養與附著在導電彈性層130上的組織144也將一起被拉伸，透過位在下方的成像設備310，就能到觀察組織144受到拉伸這類機械刺激後，其組織結構的變化與反應；如第17圖所揭示，當流體驅動設備對流道層120內部的流體介質124執行注入作動時，流體介質124重新移入微流道121a與121b，使得被拉伸而緊繃的導電彈性層130失去張力而開始收縮，附著在導電彈性層130上的組織144同步從受機械刺激的狀態回復到初始狀態。
微流道121a與121b的寬度與深度較佳係經配置為可調整，透過調整寬度與深度，即可調控導電彈性層130以及其所包含的生物彈性基材的拉伸應變量；舉例來說，當微流道121a與121b的深度或溝深經調整為 0.5mm、1mm或1.5mm時，可以分別對導電彈性層130造成6.5%、9%或13%的拉伸量，連帶驅動培養與附著在導電彈性層130上的組織144被拉伸，拉伸過程可透過例如：第二電極對152a與152b對導電彈性層130上的組織144，在導電彈性層130上施加方向大致與形變方向平行於的表面電場EF，而對組織144形成結合機械刺激與電刺激的複合刺激。
本發明生物相容反應模組200是採用流體驅動，填充在微流道121a與121b中的流體介質124較佳是氣體或者流體，由於流體內部壓力波是高速傳導，故流體介質124對流體驅動設備產生的正壓或負壓可以產生快速回應，導電彈性層130能在極短時間內被拉伸到極限，產生類似脈衝的快速拉伸，透過電子控制器或電控系統的介入，可產生循環快速拉伸，還可控制拉伸速度，忠實模擬組織在生物體內的實際作動。
第18圖揭示經由使用倒立式顯微鏡4倍物鏡觀察培養在本發明複合刺激生物反應器導電彈性層上的組織細胞的影像圖；第19圖揭示經由使用倒立式顯微鏡10倍物鏡觀察培養在本發明複合刺激生物反應器導電彈性層上的組織細胞的影像圖；如前所述，本發明導電彈性層(PPy/PDMS薄膜、P(PPy-co-NIPAm)/PDMS薄膜)130預先經過化學表面修飾，使得通過導電彈性層130的光線能夠大致規則的反射與折射，因此當使用成像設備310，例如使用倒立式顯微鏡4倍物鏡與10倍物鏡，觀察培養在導電彈性層130上的組織144時，在成像設備310上將形成清晰可辨之影像，分別如第18圖與第19圖所揭示。
第20圖揭示本發明生物相容反應模組所產生之電場方向平行於形變方向之複合刺激之示意圖；第21圖揭示本發明生物相容反應模組 所產生之電場方向垂直於形變方向之複合刺激之示意圖；本發明生物相容反應模組200中，導電彈性層130會沿著形變方向拉伸或鬆弛，在本實施例，形變方向是指例如但不限於，大致垂直於微流道121a或121b的方向，而搭接在導電彈性層130四周邊緣的第一電極對151a與151b以及第二電極對152a與152b，經施加電壓差後，可以分別在導電彈性層130上產生不同方向的電場。
如第20圖揭示，第一電極對151a與151b經通電後將在導電彈性層130上沿著第一電場方向ED1產生第一電場，而電場方向ED平行於形變方向SD，另如第21圖揭示，第二電極對152a與152b經通電後將在導電彈性層130上沿著的二電場方向ED2產生第二電場，而電場方向ED垂直於形變方向SD，透過在生物相容反應模組200下方架設成像設備310，就能觀察組織144同時受到合併機械刺激與電刺激之複合刺激，或是分別受到機械刺激或電刺激後，其組織結構產生的不同變化與反應。
經由使用本發明複合刺激生物反應器，操作者可以自由組合包含例如但不限於：拉伸速度、拉伸頻率、拉伸週期、應變量大小、拉伸模式、脈衝拉伸、循環拉伸、強制拉伸、自然收縮、電壓大小、電流大小、交錯刺激、循環刺激、複合刺激、刺激模式等等，操作者可以自由規劃、組合與應用，在實際實驗後觀察組織受到刺激後的變化與反應。
第22圖揭示本發明印有螢光標記陣列的導電彈性層在拉伸前螢光標記陣列的排列形式之顯微鏡影像；第23圖揭示本發明印有螢光標記陣列的導電彈性層在拉伸後螢光標記陣列的排列形式變化之顯微鏡影像；為了測量導電彈性層130的拉伸量，本發明進一步應用微接觸印刷(micro contact printing)技術，將一組螢光標記陣列印刷到導電彈性層130上，經由分析螢光標記在拉伸前後的位置變化或間隔變化，可有效計算出導電彈性層130的拉伸量，較佳的一般希望將拉伸量控制或設定在10%，這是因為肌肉組織能夠承受的拉伸量程度大約以10%為極限，設定超過10%的拉伸量反而對肌肉組織造成傷害。
微接觸印刷(micro contact printing)是屬於軟光刻技術的一種應用，其製程大致包含模板製備、上墨、油墨轉移等三大階段，首先使用微顯影製程(lithography)製作出一個包含微印章形式的模板，再使用這個模板製作一組微印章，微印章上以凹凸結構的方式攜帶要印刷的圖樣，在微印章上沾附螢光油墨後，直接接觸導電彈性層130，就可以將要印刷的螢光標記陣列圖樣，轉移到導電彈性層130上，如同奈米轉移印刷。本發明使用混有羅丹明B的BSA標準品作為螢光染劑；如第22圖所揭示，導電彈性層在拉伸前螢光標記之間的間隔距離經測量為160μm，如第23圖所揭示，拉伸後螢光標記之間的間隔距離改變為176μm，經計算後可知導電彈性層的拉伸量是10%。
導電彈性層130在經過電性質可靠度的測試後，經測量出其在一定的拉伸量以內，例如介於30%~40%範圍的拉伸量時，仍可將電阻抗值保持在小於20kΩ的低且穩定的狀態，因此只要拉伸量不超過40%，導電彈性層130大致可以維持在提供小於20kΩ的電阻抗值的狀態，尤其經過6小時左右的化學表面修飾所製作出的導電彈性層130(PPy/PDMS薄膜、P(PPy-co-NIPAm)/PDMS薄膜)，能表現出最穩定的電阻抗值以及生物適合性，且化學表面修飾所形成之表面微孔洞，能改善導電彈性層130的光學特 性，以利使用成像設備觀察所培養之組織或細胞，再者，經實際將小鼠肌肉纖維母細胞(C2C12)培養於導電彈性層130上，並使用細胞存活率試驗(MTT assay)測試，證明導電彈性層130有助於表面細胞之生物活性。
本發明提出的複合刺激生物反應器採用生物相容材料為基礎進行設計，應用流體驅動的方式，以負壓將培養組織之導電彈性層拖曳進微流道，透過拉伸導電彈性層以完成對組織之拉伸刺激，並透過在導電彈性層邊緣配置多對電極對以對組織進行電刺激，可對組織提供複合刺激。本發明的裝置不僅設計簡單且符合空間及成本效益，培養區還能提供大培養空間，更重要的是其培養區的拉伸狀況相當均勻，能夠給予組織均勻刺激，並可結合電刺激，整體而言是個良好設計，能提供大培養空間、低成本且方便製作以及易攜帶、不佔空間等優點。
本發明基於簡單的設計，合理的成本，搭建一組能夠有效對細胞進行電刺激以及拉伸刺激的複合刺激生物反應器，能對組織提供多種刺激形式的組合，操作者可自行規劃與嘗試不同的複合刺激組合，對人體組織進行更多、更廣泛、更深入、更複雜、更細緻的研究，且可供應用在例如但不限於：組織工程、再生醫學、細胞療法、生醫技術、臨床應用、細胞生物學、生命醫學、材料工程、仿生技術、病理模型建構等領域，對於各領域的研究與發展，都能產生實質貢獻。
本發明以上各實施例彼此之間可以任意組合或者替換，從而衍生更多之實施態樣，但皆不脫本發明所欲保護之範圍，茲進一步提供更多本發明實施例如次：
實施例1：一種複合刺激生物反應器，其包含：流道層，其 包含產生負壓吸力或正壓作用力的一組流道；導電彈性層，其配置有一對電極，並配置在該流道層上，且接受該負壓吸力或該正壓作用力之驅動而沿形變方向產生形變，以及經由該對電極接收電壓差而沿電場方向形成電場；以及培養層，其配置在該導電彈性層上，並提供組織在該導電彈性層上進行體外培養。
實施例2：如實施例1所述之複合刺激生物反應器，還包含：該流道層，其包含與該組流道連通的腔室；該組流道係包含流道或者複數流道，並填充有流體介質；該流道層所包含的該組流道之寬度或深度經配置為可調整，以透過調整該寬度與該深度而控制該生物彈性基材之拉伸應變量；該導電彈性層還包含生物彈性基材、以及沉積在該生物彈性基材之表層上的有機導電薄膜，該生物彈性基材可產生最大40%之拉伸應變；該培養層，其包含培養區，該培養區配置有複數垂直腔壁，並與該導電彈性層共同構成培養井，以提供該組織生長；基座，其包含供該流道層嵌入的定位槽以及複數組裝孔；壓板，其配置在該培養層上，並包含中央開口、配置在邊緣處的複數夾槽、配置在該中央開口附近之定位部以及在位置上對準於該等組裝通孔的複數裝配孔；保護蓋，其可放置於該定位部而覆蓋該培養井；複數緊固件，其係在該基座、該流道層、該導電彈性層、該培養層以及該壓板係依序配置後，鎖入彼此對準的該等裝配孔以及該等組裝孔，以鎖固該基座、該流道層、該導電彈性層、該培養層以及該壓板；複數夾具，其配置在該等夾槽上以鎖固該基座與該壓板，並對該導電彈性層以及該對電極提供更多的夾持力；複數樞接件，其配置在該基座與該壓板之邊緣處，以確定該基座相對於該壓板的相對位置，並透過該基座與該壓 板夾持該流道層、該導電彈性層與該培養層；流體驅動設備，其連通於該腔室，並透過該腔室抽出該組流道中的該流體，以產生該負壓吸力以產生該形變，或透過該腔室對該組流道注入該流體，以產生該正壓作用力以產生該形變；或者電子控制器，其包含電源供應器模組以及電子控制模組以對該對電極提供該電壓差而形成該電場。
實施例3：如實施例2所述之複合刺激生物反應器，其中該導電彈性層之該表層係經過化學表面修飾，該化學表面修飾係經由將該生物彈性基材在鹼溶液中浸泡5至7小時而實施，該表層經由該化學表面修飾產生之蝕刻作用而形成複數細微孔洞並增加表面粗糙度，該等細微孔洞是以大致均勻的方式分布。
實施例4：如實施例2所述之複合刺激生物反應器，其中該有機導電薄膜之成分包含聚吡咯(polypyrrole、PPy)、聚噻吩(polythiophene、PT)、聚苯胺(polyaniline、PANi)、聚苯硫醚(polyphenylene sulfide、PPS)或者其組合，該有機導電薄膜透過氧化聚合程序而沉積在該生物彈性基材上，該流道層、該生物彈性基材以及該培養層之成分包含聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane、PDMS)材料。
實施例5：如實施例2所述之複合刺激生物反應器，其中該有機導電薄膜上經由實施微接觸印刷而形成有由複數螢光標記構成的螢光標記矩陣，以測量該形變造成之應變量，該有機導電薄膜在該應變量小於40%的範圍內具有小於20kΩ的電阻抗值。
實施例6：如實施例1所述之複合刺激生物反應器，其中該流道層與該導電彈性層係為可透光，該導電彈性層具有介於30%~80%之透光 度，並可在成像設備上形成該組織之可辨識影像。
實施例7：如實施例1所述之複合刺激生物反應器，其中該導電彈性層係經由實施電漿接合程序而與該流道層接合，該導電彈性層係透過使用生物相容接著劑而與該培養層黏合，該電場方向係平行於該形變方向，該電場方向係垂直於該形變方向。
實施例8：一種複合刺激生物反應器，其包含：流道層，其包含產生負壓吸力或正壓作用力的一組流道；導電彈性層，其配置有一對電極，並配置在該流道層上，且接受該負壓吸力或該正壓作用力之驅動而沿形變方向產生形變、經由該對電極接收電壓差而沿電場方向形成電場以及因應溫度變化而改變表面之親疏水性；以及培養層，其配置在該導電彈性層上，並提供細胞在該導電彈性層上進行體外培養。
實施例9：如實施例8所述之複合刺激生物反應器，其中：該導電彈性層還包含生物彈性基材、以及沉積在該生物彈性基材上的溫敏導電薄膜。
實施例10：如實施例9所述之複合刺激生物反應器，其中該溫敏導電薄膜之成分包含聚吡咯(polypyrrole、PPy)、聚噻吩(polythiophene、PT)、聚苯胺(polyaniline、PANi)、聚苯硫醚(polyphenylene sulfide、PPS)、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)或者其組合。
本發明各實施例彼此之間可以任意組合或者替換，從而衍生更多之實施態樣，但皆不脫本發明所欲保護之範圍，本發明保護範圍之界定，悉以本發明申請專利範圍所記載者為準。
120:流道層
121a:微流道
121b:微流道
123:實驗與觀察平台
124:流體介質
130:導電彈性層
140:培養層
142:垂直腔壁
144:組織
152a:第二電極對
152b:第二電極對
200:生物相容反應模組
310:成像設備
SS’:剖面線

Claims (10)

  1. 一種複合刺激生物反應器，其包含：一流道層，其包含產生一負壓吸力或一正壓作用力的一組流道；一導電彈性層，其配置有一對電極，並配置在該流道層上，且接受該負壓吸力或該正壓作用力之驅動而沿一形變方向產生一形變，以及經由該對電極接收一電壓差而沿一電場方向形成一電場；以及一培養層，其配置在該導電彈性層上，並提供一組織在該導電彈性層上進行體外培養。
  2. 如請求項1所述之複合刺激生物反應器，還包含以下其中之一：該流道層，其包含與該組流道連通的一腔室；該組流道係包含一流道或者複數流道，並填充有一流體介質；該導電彈性層還包含一生物彈性基材、以及沉積在該生物彈性基材之一表層上的一有機導電薄膜，該生物彈性基材可產生40%之拉伸應變；該流道層所包含的該組流道之一寬度或一深度經配置為可調整，以透過調整該寬度與該深度而控制該生物彈性基材之拉伸應變量；該培養層，其包含一培養區，該培養區配置有複數垂直腔壁，並與該導電彈性層共同構成一培養井，以提供該組織生長；一基座，其包含供該流道層嵌入的一定位槽以及複數組裝孔；一壓板，其配置在該培養層上，並包含一中央開口、配置在邊緣處的複數夾槽、配置在該中央開口附近之一定位部以及在位置上對準於該等組裝通孔的複數裝配孔；一保護蓋，其可放置於該定位部而覆蓋該培養井； 複數緊固件，其係在該基座、該流道層、該導電彈性層、該培養層以及該壓板係依序配置後，鎖入彼此對準的該等裝配孔以及該等組裝孔，以鎖固該基座、該流道層、該導電彈性層、該培養層以及該壓板；複數夾具，其配置在該等夾槽上以鎖固該基座與該壓板，並對該導電彈性層以及該對電極提供更多的夾持力；複數樞接件，其配置在該基座與該壓板之邊緣處，以確定該基座相對於該壓板的相對位置，並使得該壓板能相對於該基座進行樞轉，且透過該基座與該壓板夾持該流道層、該導電彈性層與該培養層；一流體驅動設備，其連通於該腔室，並透過該腔室抽出該組流道中的該流體介質，以產生該負壓吸力以產生該形變，或透過該腔室對該組流道注入該流體介質，以產生該正壓作用力以產生該形變；以及一電子控制器，其包含一電源供應器模組以及一電子控制模組以對該對電極提供該電壓差而形成該電場。
  3. 如請求項2所述之複合刺激生物反應器，其中該導電彈性層之該表層係經過一化學表面修飾，該化學表面修飾係經由將該生物彈性基材在鹼溶液中浸泡5至7小時而實施，該表層經由該化學表面修飾產生之蝕刻作用而形成複數細微孔洞並增加表面粗糙度，該等細微孔洞是以大致均勻的方式分布。
  4. 如請求項2所述之複合刺激生物反應器，其中該有機導電薄膜之成分包含一聚吡咯(polypyrrole、PPy)、一聚噻吩(polythiophene、PT)、一聚苯胺(polyaniline、PANi)、一聚苯硫醚(polyphenylene sulfide、PPS)及其組合其中之一，該有機導電薄膜透過一氧化聚合程序而沉積在該生物彈性基材 上，該流道層、該生物彈性基材以及該培養層之成分包含一聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane、PDMS)材料。
  5. 如請求項2所述之複合刺激生物反應器，其中該有機導電薄膜上經由實施微接觸印刷而形成有由複數螢光標記構成的螢光標記矩陣，以測量該形變造成之該拉伸應變量，該有機導電薄膜在該應變量小於40%的範圍內具有小於20kΩ的電阻抗值。
  6. 如請求項1所述之複合刺激生物反應器，其中該流道層與該導電彈性層係為可透光，該導電彈性層具有介於30%~80%之透光度，並可在成像設備上形成該組織之可辨識影像。
  7. 如請求項1所述之複合刺激生物反應器，其中該導電彈性層係經由實施一電漿接合程序而與該流道層接合，該導電彈性層係透過使用一生物相容接著劑而與該培養層黏合，其中該電場方向係平行於該形變方向或者垂直於該形變方向。
  8. 一種複合刺激生物反應器，其包含：一流道層，其包含產生一負壓吸力或一正壓作用力的一組流道；一導電彈性層，其配置有一對電極，並配置在該流道層上，且接受該負壓吸力或該正壓作用力之驅動而沿一形變方向產生一形變、經由該對電極接收一電壓差而沿一電場方向形成一電場以及因應溫度變化而改變表面之親疏水性；以及一培養層，其配置在該導電彈性層上，並提供一細胞在該導電彈性層 上進行體外培養。
  9. 如請求項8所述之複合刺激生物反應器，其中：該導電彈性層還包含一生物彈性基材、以及沉積在該生物彈性基材上的一溫敏導電薄膜。
  10. 如請求項9所述之複合刺激生物反應器，其中該溫敏導電薄膜之成分包含一聚吡咯(polypyrrole、PPy)、一聚噻吩(polythiophene、PT)、一聚苯胺(polyaniline、PANi)、一聚苯硫醚(polyphenylene sulfide、PPS)、一N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)及其組合其中之一。
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