CN110121552A - 细胞培养基材 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种细胞培养基材，其特征在于，所述细胞培养基材含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该细胞培养基材中还具有粘附基质，该粘附基质为细胞外基质和/或粘附性合成基质。另外，上述细胞外基质为选自层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙粘着蛋白和它们的片段中的至少一种，和/或，粘附性合成基质为聚[2‑(甲基丙烯酰氧基)乙基二甲基‑(3‑磺丙基)氢氧化铵]或负载有寡肽的聚合物。

Description

细胞培养基材
技术领域
本发明涉及细胞培养用的基材。
背景技术
人iPS细胞、ES细胞之类的人多能性干细胞由于在病理阐明、新药开发以及再生医疗中的应用可能性而受到关注。在人多能性干细胞的利用中，需要稳定且安全地培养、进而将培养的细胞回收后应用于药物研发、医疗。
一直以来，人多能性干细胞的低培养率日益成为问题。作为解决方法之一，尝试了利用饲养细胞的培养方法，但存在所使用的饲养细胞污染这样的问题，因此不能称之为安全。
作为该问题的解决对策，专利文献1报道了下述方案：在细胞培养基材上涂布作为细胞外基质的层粘连蛋白和层粘连蛋白片段，从而即使无饲养细胞也能培养人多能性干细胞。
另一方面，专利文献1虽然能够在基材上培养，但是并未言及培养细胞的回收，在培养细胞的利用方面存在问题。例如，用上述方法培养的细胞与细胞外基质的粘附强，因此通过在酶处理后用细胞刮棒(橡胶或树脂制刮刀)等物理方式归拢细胞的方法来回收细胞，操作效率低且会造成物理性刺激，因此存在对细胞的存活率造成不良影响的问题。
另一方面，在将层粘连蛋白等细胞外基质用于人多能性干细胞时，存在细胞外基质失活的问题。特别是，如果基材表面干燥则细胞外基质失活、人多能性干细胞的培养效率下降。若考虑到细胞培养基材的保存运输等，则在干燥状态下也维持培养效率这一点很重要。专利文献2公开了一种细胞培养基材，其通过涂布层粘连蛋白以外的蛋白质而能耐受干燥状态，虽然该方案也能够培养，但未解决培养细胞的回收这一问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2011/043405
专利文献2:WO2014/199754
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种即使对于人多能性干细胞也能高效率地培养、并且能够将培养后的细胞以维持高存活率的状态剥离而回收的细胞培养基材。另外，还提供一种能够进行细胞剥离、并且还能耐受干燥状态的细胞培养基材。
用于解决问题的方案
发明人们进行了深入研究，结果发现，通过提供下述细胞培养基材可以解决上述课题，所述细胞培养基材的特征在于，该细胞培养基材含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该细胞培养基材中还具有粘附基质，该粘附基质为细胞外基质和/或粘附性合成基质。
另外，提供一种细胞培养基材，其中，细胞外基质为选自层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙粘着蛋白和它们的片段中的至少一种；或者，粘附性合成基质为聚[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵]或负载有寡肽的聚合物。
另外，提供一种细胞培养基材，其中，上述具有最低临界溶解温度的链段的聚合度为400-10000。
另外，提供一种细胞培养基材，其中，上述疏水性链段为使下述式(1)所示的单体聚合而得到的。
(上述式(1)中，R1为氢原子或甲基，R2表示苯基、烷基碳数为1～8的羧基烷基、芳烷基碳数为7～8的羧基芳烷基、下述式(2)所示的基团、下述式(3)所示的基团中的任意一者。
(上述式(2)中，n表示2或3，R3表示碳数1～3的烷基。)
(上述式(2)中，R4和R5分别独立地表示氢原子或碳数1～6的烷基，R4和R5的合计碳数为4以上。))
另外，提供一种细胞培养基材，其中，上述细胞培养基材上还含有选自明胶、胶原蛋白和/或白蛋白中的至少一种蛋白质。
发明的效果
本发明的细胞培养基材能够高效率地培养人多能性干细胞，并且可以将培养后的细胞保持高存活率地从基材剥离而回收。
另外，公开了即使经历干燥状态也能够进行培养、并且能够进行细胞剥离的基材。
具体实施方式
本发明提供一种细胞培养基材，其特征在于，该细胞培养基材含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该细胞培养基材中还具有粘附基质，该粘附基质为细胞外基质和/或粘附性合成基质。
[具有最低临界溶解温度的链段]
本发明中的具有最低临界溶解温度的链段是指：嵌段聚合物中的链段，该链段由若达到某一定温度以下则溶解于水的聚合物构成。
本发明中的具有最低临界溶解温度的链段是指：如下所述的若达到某一定温度以下则溶解于水的聚合物。作为具有最低临界溶解温度的聚合物，可列举下述1)和2)。
1)使均聚物具有最低临界溶解温度的单体聚合而得到的聚合物
2)疏水化单体与亲水性单体的共聚物
1)是仅使均聚物具有最低临界溶解温度的单体聚合而得到的聚合物链段。作为均聚物具有最低临界溶解温度的单体，可例示例如：N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、N-正丙基(甲基)丙烯酰胺、N-环丙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基乙基(甲基)丙烯酰胺、N-四氢糠基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-乙基-N-甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N-甲基-N-正丙基丙烯酰胺、N-甲基-N-异丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰基哌啶和N-丙烯酰基吡咯烷。这些单体可以单独使用，也可以同时使用多种。
对于1)、即、使均聚物具有最低临界溶解温度的单体聚合而得到的链段而言，可以简便地制造具有最低临界溶解温度的聚合物。但是，这些单体存在下述问题：与塑料表面之间的粘接性低，如果与水接触则所涂布的聚合物层容易剥离，本申请的细胞培养基材含有疏水性链段，因此耐水性优异，因此培养基材可以不剥离地使用。
2)是疏水化单体与亲水性单体的共聚物。为了使疏水化单体与亲水性单体的共聚物具有最低临界溶解温度，可列举：
2-1)亲水性单体为均聚物具有最低临界溶解温度的单体的情况；和
2-2)下述式(1)所示的单体(a)与亲水性的酰胺系乙烯基单体(b)的共聚物(B1)、上述单体(a)与下述式(2)所示的单体(c)的共聚物(B2)或者单体(a)与下述式(3)所示的含有聚乙二醇链的单体(d)的共聚物(B3)。
(式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示碳原子数2～3的亚烷基，R3表示碳原子数1～2的烷基。)
(式中，R4表示氢原子或甲基，R5表示碳原子数2～3的亚烷基。)
(式中，n表示2～20的整数。)
作为亲水性的酰胺系单体(b)，可例示二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙基丙烯酰胺等。
疏水化单体是指：单体时为水溶性、但若聚合则不溶于水性溶剂的单体。当共聚物中含有这样的单体时，可以制成耐水性优异、不易从支撑体剥离的细胞培养基材。
作为疏水化单体，可列举：上述式(1)所示的化合物；二丙酮丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸聚丙二醇酯、甲氧基二乙二醇丙烯酸酯、甲氧基三乙二醇丙烯酸酯。这些可以单独使用，也可以同时使用多种。其中，优选丙烯酸2-甲氧基乙酯、丙烯酸2-乙氧基乙酯、丙烯酸3-甲氧基丙酯，特别优选丙烯酸2-甲氧基乙酯、丙烯酸2-乙氧基乙酯。
在为2-2)中公开的共聚物链段时，可通过单体的种类、比率将得到的共聚物链段的最低临界溶解温度控制在较宽范围内，进而可以根据细胞的种类适当改变单体的种类、比率，可以以更良好的细胞粘附性和增殖性来培养细胞，因此优选。例如，随着单体(b或c、或d)相对于单体(a)的比率的增加，所得到的共聚物的最低临界溶解温度向高温侧移动。该比率与最低临界溶解温度几乎呈直线关系。细胞培养温度通常为37℃，因此优选按照所得到的共聚物的最低临界溶解温度在20～32℃附近的方式进行制备。
另外，本发明中的具有最低临界溶解温度的链段可以在具有最低临界溶解温度的范围内含有不包含于由均聚物具有最低临界溶解温度的单体、亲水性单体和疏水化单体组成的组中的单体。
本发明的嵌段聚合物中，上述具有最低临界溶解温度的链段的聚合度优选为400-10000。这是由于，当为400以上时，细胞剥离性变得更良好，当小于10000时，嵌段聚合物的合成上更为容易。
作为优选的聚合度，为1000-8000，如果为该范围，则细胞剥离性和培养效率的均衡性优异。特别优选为3000-6000。
[疏水性链段]
本发明的嵌段聚合物的特征在于，具有疏水性链段。需要说明的是，本说明书中，嵌段聚合物的链段中的“疏水性”是指：对于由链段构成的聚合物而言，水中的25℃下的溶解度小于0.5g/100mL。疏水性链段至少包含疏水性单体的单体单元。
本发明的嵌段聚合物由于具有疏水性链段，因此即使具有耐水性差且具有最低临界溶解温度的链段，该嵌段聚合物也耐水性优异、与支撑体的密合性优异。
作为疏水性单体，只要是聚合后实现了疏水化的单体则没有特别限制，优选列举下述式(1)～(3)所示的单体。需要说明的是，这些疏水性单体可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。
(上述式(1)中，R1为氢原子或甲基，R2表示苯基、烷基碳数为1～8的羧基烷基、芳烷基碳数为7～8的羧基芳烷基、下述式(2)所示的基团、下述式(3)所示的基团中的任意一者。
(上述式(2)中，n表示2或3，R3表示碳数1～3的烷基。)
[化9]
(上述式(2)中，R4和R5分别独立地表示氢原子或碳数1～6的烷基，R4和R5的合计碳数为5以上。))
其中，如果为上述式(1)所示的单体，则得到的聚合物链段为疏水性，细胞培养基材的耐水性和支撑体密合性优异，因此是优选的。
其中优选为丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、苯乙烯，特别优选丙烯酸丁酯。
本发明的嵌段聚合物中，上述疏水性链段的聚合度优选为50-1000。这是由于，聚合度为50以上时，耐水性变得更良好，聚合度小于1000时，细胞剥离性变得更良好。
[嵌段聚合物]
本发明的嵌段聚合物是含有上述具有最低临界溶解温度的链段、和疏水性链段的聚合物。在将具有最低临界溶解温度的链段设为A、将疏水性链段设为B时，本发明的嵌段聚合物可以是AB的二嵌段型，也可以是ABA或BAB的三嵌段型，还可以是具有三以上的链段数的聚合物。优选为二嵌段型或三嵌段型，特别优选为二嵌段型。
[嵌段聚合物的分子量]
关于嵌段聚合物的分子量，以重均分子量(Mw)计，优选为50000～1000000，更优选为70000～900000，进一步优选为400000～800000。如果重均分子量为50000以上，则由于细胞剥离性高而优选，如果为1000000以下，则由于容易处理而优选。
[嵌段聚合物的制造方法]
嵌段聚合物的制造方法没有特别限制，可以采用公知的方法。其中，优选精密自由基聚合，更优选可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)、氮氧化物介导的聚合(NMP)，进一步优选RAFT聚合。
〔嵌段聚合物的成型方法〕
作为形成本发明的细胞培养基材的优选方法，可列举将包含本发明的嵌段聚合物的涂层剂涂布在上述支撑体上的方法。
＜涂层剂＞
上述涂层剂包含嵌段聚合物和溶剂。此外可根据需要包含添加剂等。
[嵌段聚合物]
作为嵌段聚合物，使用上述嵌段聚合物，因此这里省略说明。
需要说明的是，嵌段聚合物可以仅包含1种，也可以包含具有不同构成的2种以上嵌段聚合物。
嵌段聚合物的含量相对于涂层剂的总质量优选为0.01～90质量％，更优选为0.1～50质量％。当嵌段聚合物的含量为0.01质量％以上时，所得到的涂膜容易表现表面亲水性，因此是优选的。另一方面，当嵌段聚合物的含量为90质量％以下时，由于粘度低因而涂覆适应性提高，因此是优选的。
[溶剂]
作为涂层剂中可含有的溶剂，没有特别限定，可使用公知的溶剂。
作为溶剂的具体例子，可列举水或有机溶剂。
作为上述有机溶剂，可列举：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇等醇系溶剂；四氢呋喃、1,4-二噁烷等醚系溶剂；环己酮、甲基异丁基酮等酮系溶剂；乙腈等腈系溶剂；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等酰胺系溶剂；二甲基亚砜；二氧杂环丙烷；吡咯烷酮等。这些中，优选使用醇系溶剂作为有机溶剂，更优选使用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇。
上述中，溶剂优选为水、醇系溶剂，更优选为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇。
上述溶剂可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。
涂层剂中的溶剂的含量相对于涂层剂的总质量优选为10～99.99质量％，更优选为50～99.9质量％，进一步优选为80～99.5质量％。当溶剂的含量为10质量％以上时，涂层剂溶液的粘度降低，因而涂覆适应性优异，因此是优选的。另一方面，当溶剂的含量为99.99质量％以下时，涂布后的涂膜厚度不会过度变薄，因此是优选的。
[添加剂]
涂层剂可以根据使用目的而含有添加剂。
作为该添加剂，没有特别限定，可使用公知的添加剂。具体而言，可列举赋形剂、表面活性剂、增塑剂、消泡剂、颜料、抗氧化剂、抗生素、紫外线吸收剂、结晶成核剂、结晶促进剂、稳定剂、抗菌剂等。这些添加剂可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。
涂层剂的涂布方法没有特别限制，可列举喷涂法、流涂法、浸渍法等。
另外，在基材为管状时，可列举使涂层剂通入的方法等。此时，通入后通常会通入溶剂，从而将管内部的多余的涂层剂除去。
对干燥条件也没有特别限定，可以是自然干燥，也可以是加热干燥。在加热干燥的情况下，干燥温度根据所使用的涂层剂而不同，优选为30～70℃，更优选为40～60℃。需要说明的是，通过控制干燥，可以得到残留有部分溶剂的涂膜。
〔粘附基质〕
本发明的细胞培养基材在基材中具有粘附基质，从而人多能性干细胞的培养性提高。作为粘附基质，可列举细胞外基质和粘附性合成基质。
作为细胞外基质，具体可列举层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙粘着蛋白和它们的片段。可优选列举层粘连蛋白和玻连蛋白、以及它们的片段。作为细胞外基质，只要来自动物就可使用，优选来自人和小鼠的细胞外基质。进一步优选以重组蛋白形式制造的细胞外基质。作为市售品，可利用基质胶(Corning公司制)、Geltrex(Thermo FisherScientific公司制)、iMatrix-511(Nippi公司制)、Laminin521(BioLamina公司)等。
可以与细胞外基质同时使用ROCK(Rho-associated coiled-coil kinase，Rho相关卷曲螺旋的蛋白激酶)抑制剂。通过使用ROCK抑制剂，从而分散在单一细胞中的人多能性干细胞的培养变得更加容易。可列举Y-27632(和光纯药工业)、法舒地尔盐酸盐(东京化成工业株式会社制)。
作为粘附性合成基质，可列举聚[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵](后文简记为PMEDSAH)或负载有寡肽的聚合物。负载有寡肽的聚合物是在聚合物上共价结合有具有细胞粘附活性的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的寡肽的基质。作为市售品，可列举Synthemax(Corning公司制)。
可以通过任意方法对基材供给粘附基质。例如，可以将粘附基质混合到基材中，也可以涂布于基材。另外，可以使细胞培养用的培养基中含有粘附基质，从而以与培养基同时接触基材的方式供给。
该粘附基质在基材中可以均匀存在，也可以不均匀地存在。优选存在于基材表面的情况。在通过涂布来进行粘附剂基质的供给时，作为涂布方法，将粘附基质的溶液用公知惯用的方法进行涂布即可，可以通过喷涂、旋涂、喷墨等进行涂布，也可以使用版来压印。也可以是将溶液浇注在基材上、静置一定时间后将溶液除去的方法，根据使用方法适当选择即可。
在将粘附基质涂布到细胞培养基材表面的情况下，作为涂布量，相对于细胞培养基材的面积优选为0.01～5μg/cm2，进一步优选为0.2～2μg/cm2，特别优选为0.5～1μg/cm2。
〔明胶、胶原蛋白或白蛋白〕
进而，为了维持粘附基质的活性、提高细胞培养效率，可以使细胞培养基材上存在明胶、胶原蛋白或白蛋白。明胶、胶原蛋白或白蛋白与上述粘附基质同样可以混合到细胞培养基材中，也可以涂布于基材。涂布的情况下，从维持粘附基质的活性、提高细胞培养效率出发，优选先涂布明胶、胶原蛋白或白蛋白，然后涂布粘附基质的方式。另外，关于明胶、胶原蛋白或白蛋白，可以使用1种也可以同时使用多种。
作为明胶、胶原蛋白或白蛋白的涂布量，优选为0.5～500μg/cm2。进一步优选为5～200μg/cm2，特别优选为20～100μg/cm2。
本发明的细胞培养基材可以单独使用，从运输、保管等的便利性方面出发，优选形成在支撑体上。特别优选在支撑体上层叠细胞培养基材从而制成层叠体的方法。
[其它配混物]
本发明的细胞培养基材除了嵌段聚合物、细胞外基质、明胶或胶原蛋白以外，还可以具有配混物。可以包含例如防腐剂、抗菌剂、着色料、香料、酶、糖类、蛋白质、肽类、氨基酸类、细胞、DNA类、盐类、水溶性有机溶剂类、表面活性剂、高分子化合物、流平剂等。
[细胞培养基材]
本发明的细胞培养基材的形状只要是可以进行细胞培养、可以通过低温处理容易地剥离培养细胞的形状则没有特别限定。可列举例如：薄膜状、皿状、瓶(bin)状、管状、粗细为5nm～5mm的线状或棒状、袋(bag)状、多孔板状、微流路状、多孔膜状或网状(例如Transwell、细胞过滤器)以及粒径优选为10～2000μm、更优选为100～500μm的球状等。
本发明的细胞培养基材可以单独使用，优选以在支撑体上形成有基材的细胞培养器材形式使用。这是由于，在制成细胞培养器材的情况下，除了运输、保管等的便利性优异以外，还可以直接作为培养容器、培养用载体使用。
本发明中使用的支撑体的材质只要培养基材能充分粘接、且可以在所粘接的培养基材上进行细胞培养、可以通过低温处理容易地剥离培养细胞，则没有特别限定。优选使用例如：聚苯乙烯之类的苯乙烯系树脂；聚丙烯之类的聚烯烃系树脂；聚氨酯系树脂；聚碳酸酯；聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)；聚砜系树脂；氟系树脂；纤维素之类的多糖类天然高分子；玻璃、陶瓷之类的无机材料；不锈钢、钛之类的金属类材料。
支撑体的形状没有特别限定，为可成为本发明的细胞培养基材的支撑体的形状即可。可列举例如：薄膜状、膜状、板状、球状、多边形、棒状、皿状、瓶(bin)状、管状、针/线状、纤维状、袋(bag)状、多孔板状、微流路状、多孔膜状或网状(例如Transwell、细胞过滤器)等。可以是将这些组合而成的形状，也可以是不具有特定的形状的无定形的支撑体。
另外，本发明的细胞培养基材可与支撑体一体化而以细胞培养器材形式使用，这是不言而喻的，也可以从支撑体剥下后单独使用。
〔培养细胞〕
本发明的细胞培养基材可适宜培养各种细胞，特别是动物细胞。作为动物细胞，只要来源为动物即可，可列举人、小鼠、猴子等，也可以是人工细胞。作为细胞种类，没有特别限定，可列举上皮细胞(角膜上皮细胞等)、内皮细胞(人脐带静脉内皮细胞等)、成纤维细胞(人皮肤成纤维细胞、小鼠成纤维细胞等)、血细胞、收缩性细胞(骨骼肌细胞、心肌细胞等)、血液与免疫细胞(红细胞、巨噬细胞等)、神经细胞(神经元、神经胶质细胞等)、色素细胞(视网膜色素细胞等)、肝细胞、软骨细胞、成骨细胞、干细胞(ES细胞、iPS细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、生殖干细胞、EC细胞、EG细胞、神经干细胞)等。其中，可优选对培养困难的干细胞、特别是ES细胞、iPS细胞应用本发明的细胞培养基材。
〔干燥细胞培养基材〕
本发明的细胞培养基材即使经历干燥状态也能够进行人多能性干细胞的培养。因此能够耐受长期保存、运输，因而产业上的可利用性非常高。
作为干燥方法，没有特别限定，将细胞培养基材层叠到后述的支撑体上之后进行干燥即可。可列举例如：室温干燥(18～30℃、湿度20％～60％RH)、加热干燥(30～37℃)、利用恒温干燥机或干燥器的干燥等。从防止蛋白质变性的观点出发，优选室温干燥。
干燥时的细胞培养基材的膜厚优选为1000nm以下，进一步优选为500nm以下。这是由于，如果为1000nm以下，则细胞培养性良好。
〔细胞的培养方法〕
作为培养方法，可以使用公知惯用的方法，例如可以对在皿状容器的底面形成的培养基材加入规定量的培养基、培养试剂，播种细胞并在规定温度、CO2浓度条件下进行培养；也可以将形成线状、球状的培养基材放入装有培养基的市售聚苯乙烯容器中，播种细胞并进行培养。在后者的情况下，细胞不粘附于聚苯乙烯容器而是粘附于线状、球状培养基材的表面而增殖。例如在使用粗细为50μm的线状培养基材时，细胞会沿着线的长度方向增殖，因此还可以以细胞形状受控的形式进行培养。另外，与通常的皿状容器相比，使用球状培养基材时表面积大，具有可以培养更多的细胞的优点。
〔细胞的剥离方法(调温法)〕
作为从基材剥离所培养的细胞的方法，没有特别限定，例如，可以在培养结束后用规定温度(6℃～30℃)的培养基置换37℃的培养基，在规定温度(6℃～30℃)下静置而等待细胞自然剥离；也可以轻轻摇动培养容器或通过用吸液管吸入/吐出培养基的“吹吸”操作以平稳的水流对细胞提供物理性刺激而将细胞剥离。
〔细胞的剥离方法(酶法)〕
在欲切断细胞彼此的结合、制成单个细胞的情况下，可以使用利用酶处理的剥离法。所使用的蛋白水解酶的种类可根据细胞的种类适当选择。可列举例如：胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司)。处理温度、时间可根据细胞的种类、与基材的粘附强度适当调整。可列举例如下述方法：在培养结束后，除去培养基，用缓冲液等洗涤细胞，加入酶溶液，在37℃下静置一定时间后除去酶溶液，加入规定温度(6℃～37℃)的缓冲液或培养基，静置或通过“吹吸”操作剥离细胞。当然，也可以将低温处理和酶使用组合来剥离细胞。
实施例
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明的范围并非仅限于这些实施例。
＜GPC＞
GPC的测定方法如下所述。
装置：HLC-8220GPC(东曹株式会社制)
溶剂：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液(含有10mmol/L LiBr)
色谱柱：2根TSK-gelα-M柱(东曹株式会社制)连接而成
标准物质：PMMA标准(Shodex M-75)
(NMR的测定方法)
1H-NMR：JEOL制JNM-ECZ400S
磁场强度：400MHz
累计次数：16次
溶剂：氘代甲醇
试样浓度：10质量％
(AFM的测定方法)
原子力显微镜：Bruker AXS制NanoScope(R)IIIa
测定模式：DFM、样品的2个测定位置的平均
[合成例1]嵌段聚合物1的合成
对丙烯酸丁酯(和光纯药株式会社制)0.475g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.013g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.006g、叔丁醇9.0g、水1.0g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的丙烯酸丁酯的转化率为82％。
接着，在对N-异丙基丙烯酰胺(以下记作NIPAM、株式会社KJ Chemical制)1.68g、叔丁醇10.8g、水1.2g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇22.9g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果丙烯酸丁酯的转化率为100％，NIPAM的转化率为100％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝41000、Mw＝74000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例2]嵌段聚合物2的合成
对丙烯酸丁酯1.19g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.013g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.002g、叔丁醇8.0g、水1.0g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的丙烯酸丁酯的转化率为84％。
接着，对NIPAM 6.3g、叔丁醇20.8g、水2.2g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果丙烯酸丁酯的转化率为100％，NIPAM的转化率为97％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝137000、Mw＝277000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例3]嵌段聚合物3的合成
对丙烯酸丁酯0.474g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.013g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.006g、叔丁醇8.0g、水1.0g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的丙烯酸丁酯的转化率为87％。
接着，对NIPAM 10.5g、叔丁醇30.5g、水3.4g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果丙烯酸丁酯的转化率为100％，NIPAM的转化率为99％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝274000、Mw＝489000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例4]嵌段聚合物4的合成
对丙烯酸丁酯0.71g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0078g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0024g、叔丁醇5.4g、水0.6g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的丙烯酸丁酯的转化率为97％。
接着，对NIPAM 7.55g、叔丁醇24.3g、水2.7g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果丙烯酸丁酯的转化率为100％，NIPAM的转化率为99％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝200000、Mw＝440000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例5]嵌段聚合物5的合成
对丙烯酸丁酯0.59g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0065g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0036g、叔丁醇9.0g、水1.0g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的丙烯酸丁酯的转化率为81％。
接着，对N-异丙基丙烯酰胺(以下记作NIPAM、株式会社KJ Chemical制)10.53g、叔丁醇49.86g、水5.54g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇66.7g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果丙烯酸丁酯的转化率为100％，NIPAM的转化率为99％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝220000、Mw＝760000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例6]嵌段聚合物6的合成
对丙烯酸甲氧基乙酯(以下记作MEA、大阪有机化学株式会社制)1.21g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0129g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0054g、叔丁醇9.0g、水1.0g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的MEA的转化率为98％。
接着，对NIPAM 6.29g、叔丁醇18.0g、水2.0g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇37.5g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果MEA的转化率为100％，NIPAM的转化率为98％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝114000、Mw＝338000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例7]嵌段聚合物7的合成
对MEA 0.97g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0104g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0032g、叔丁醇7.2g、水0.8g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的MEA的转化率为92％。
接着，对NIPAM 8.39g、叔丁醇26.5g、水2.9g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇46.8g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果MEA的转化率为100％，NIPAM的转化率为90％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝152000、Mw＝430000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例8]嵌段聚合物8的合成
对MEA 1.45g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0156g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.008g、叔丁醇10.8g、水1.2g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的MEA的转化率为98％。
接着，对NIPAM 15.1g、叔丁醇48.8g、水5.4g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇82.8g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果MEA的转化率为100％，NIPAM的转化率为96％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝205000、Mw＝576000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例9]嵌段聚合物9的合成
对MEA 1.46g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0156g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0077g、叔丁醇10.8g、水1.2g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的MEA的转化率为98％。
接着，对NIPAM 18.8g、叔丁醇58.8g、水6.4g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇72.8g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果MEA的转化率为100％，NIPAM的转化率为97％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝234000、Mw＝737000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例10]嵌段聚合物10的合成
对MEA 0.96g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.0105g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0049g、叔丁醇9g、水1g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的MEA的转化率为97％。
接着，对NIPAM 16.9g、叔丁醇54.7g、水6.3g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇89g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果MEA的转化率为100％，NIPAM的转化率为98％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝192000、Mw＝772000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例11]嵌段聚合物11的合成
对苯乙烯(以下记作St、和光纯药株式会社制)5.79g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.040g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0122g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的St的转化率为40％，计算出的聚合度为200。
接着，将得到的含有RAFT剂的聚苯乙烯在二异丙醚中再沉淀后，在70℃下真空干燥而除去单体。然后，对含有RAFT剂的聚苯乙烯1g、NIPAM 8.02g、乙酸乙酯45.2、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0122g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果NIPAM的转化率为98％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝62000、Mw＝221000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[制备例1]4支链RAFT剂的合成
按照非专利文献“Macromolecules、36、1505(2003)”，
通过下述的步骤合成了RAFT剂“四(3-1S-(1-甲氧基羰基)乙基三硫代羰基丙酸)季戊四醇”。
加入二氯甲烷10mL、季戊四醇(3-巯基丙酸酯)1.22g、二硫化碳2.00g、三乙胺2.04g，搅拌1小时。然后加入2-溴丙酸甲酯1.94g，再搅拌5小时，然后用5％KHSO4水溶液洗涤。再进行水洗，然后用饱和食盐水干燥。用硫酸镁处理后，用蒸发器除去二氯甲烷。将得到的橙色油状产物用以己烷/丙酮为洗脱液的硅胶柱色谱纯化，得到RAFT剂“四(3-1S-(1-甲氧基羰基)乙基三硫代羰基丙酸)季戊四醇”。
[合成例12]嵌段聚合物12的合成
对MEA 1.48g、作为RAFT剂的上述四(3-1S-(1-甲氧基羰基)乙基三硫代羰基丙酸)季戊四醇0.013g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.0042g、叔丁醇7.2g、水0.8g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的MEA的转化率为97％。
接着，对NIPAM 12.9g、叔丁醇45.7g、水5g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇60g，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果MEA的转化率为100％，NIPAM的转化率为98％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝250000、Mw＝782000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
[合成例13]嵌段聚合物13的合成
对甲基丙烯酸丁酯(以下记作BMA、和光纯药株式会社制品)1.92g、作为RAFT剂的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)丙酸0.060g、2,2’-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯0.012g、叔丁醇10.8g、水1.2g充分进行氮气鼓泡而除去氧后，在70℃下搅拌7小时，得到第1反应液。该阶段的BMA的转化率为83％。
接着，对NIPAM 6.1g、叔丁醇18g、水2g的混合物充分进行氮气鼓泡后，添加到上述反应液中，再在70℃下搅拌20小时，得到AB型的温度响应性嵌段聚合物溶液。用NMR测定该嵌段聚合物的转化率，结果MEA的转化率为100％，NIPAM的转化率为99％。另外，测定该嵌段聚合物的分子量分布的结果是Mn＝34000、Mw＝51000。由转化率计算出的疏水链段和具有最低临界温度的链段的聚合度分别如表1所示。另外，将用后述试验方法测定该嵌段聚合物的水凝胶分数的结果示于表1。
(培养基材的制作例)
[实施例1]
将嵌段聚合物1用甲醇稀释而制作0.5％溶液，将60ul添加到35mm聚苯乙烯制培养皿(35mm/Tissue Culture Dish、AGC Techno glass制)。然后，将在80℃下干燥30分钟、再在纯水中浸渍10分钟的操作重复进行三次而洗涤，在40℃干燥一晚，从而得到层叠有细胞培养基材的细胞培养容器1。用原子力显微镜对得到的细胞培养基材的膜厚进行测定，结果为50nm。
对于该细胞培养基材，用后述的方法进行层粘连蛋白涂布，用后述的试验法进行iPS细胞培养性和细胞的温感剥离性的评价，将结果示于表1。
[实施例2～13]
通过与实施例1同样的方法，由嵌段聚合物2～13分别制作层叠有细胞培养基材的细胞培养容器2～13。对于该细胞培养基材，用后述的方法进行层粘连蛋白涂布，用后述的试验方法进行iPS细胞培养性和细胞的温感剥离性的评价，将结果示于表1。
[比较例1]
在市售的温感剥离培养容器“UPCELL(聚异丙基丙烯酰胺均聚物固定化细胞培养基材、CellSeed Inc.制品)”的35mm培养皿上，用后述的层粘连蛋白涂布法进行层粘连蛋白涂布，然后用后述的试验方法评价iPS细胞培养性和iPS细胞温感剥离性。
[比较例2]
在市售的细胞培养容器35mm聚苯乙烯制培养皿(TCPS、35mm/Tissue CultureDish、AGC Techno glass制)上，用后述的层粘连蛋白涂布法进行层粘连蛋白涂布，然后用后述的试验方法评价iPS细胞培养性和iPS细胞温感剥离性。
〔实施例1～13、比较例1～2的层粘连蛋白涂覆方法〕
向实施例1～13、比较例1～2的细胞培养容器中加入浓度10ug/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.5μg/cm2)、在37℃下静置1小时。然后，不进行干燥而是直接进行后述的iPS细胞培养·温感剥离试验。
(水凝胶分数)
对于将上述干燥培养基材0.1g用200目的不锈钢网包裹并在4℃的水中放置20小时前后的样品，分别测定在130℃的热风干燥机中干燥2小时的重量，调查在冷水中静置前后的重量减少率。该值越高则培养基材的耐水性越高，可以说越不易发生培养基材的由水导致的溶出。
[iPS细胞的培养、剥离率的评价]
向培养容器1中添加加入了ROCK抑制剂Y27632(添加量：0.5μg/mL培养基)的StemFit Ak02N培养基(味之素株式会社制)2ml，再加入一定量(约1×104个/cm2)的人iPS细胞(201B7株、iPS Academia JAPAN株式会社制)，在5％CO2气氛的37℃恒温器内静置并培养5天。对于培养基，以2天1次的频率进行更换。接着，用调温剥离法剥离细胞。即，用4℃的冷介质进行培养基更换，在室温静置10分钟，然后进行用吸液管吸入/吹出培养基的“吹吸操作”约10次，从而进行细胞剥离。接着，按照上述“细胞的剥离率和存活率、以及培养性的测定”方法测量经剥离的细胞数和剥离细胞中的死细胞数、以及培养细胞总数，由式(6)、(7)、(8)计算剥离率、存活率和培养性。
(细胞的剥离率和存活率、以及培养性的测定)
培养结束后，用调温法或酶法进行细胞剥离操作，将剥离下来的细胞悬浮液吸入细胞测量专用盒，用细胞计数装置NC-100(株式会社MS Technosystems公司制)测量细胞悬浮液中的剥离细胞中的死细胞数。另外，将剥离下来的细胞100μL连同培养基一起转移到1.5ml的管中，加入ReagentA和ReagentB(株式会社MS Technosystems公司制)各100μl，吹吸数次而混合均匀后，同样将液体吸入新的盒中，吸上来，设置在细胞计数装置NC-100中，测量经剥离的细胞数。再向剥离操作后的剥离细胞已被全部除去的培养皿中加入适量ReagentA，在室温(25℃)下静置10分钟，用刮棒(橡胶刮刀)将培养皿上残存的细胞、未剥离细胞完全剥离·溶解而剥离后，加入适量ReagentB，吹吸数次而混合均匀，设置于细胞计数装置NC-100，测量培养皿上残留的未剥离的细胞数。分别由下述式(6)、(7)、(8)计算细胞剥离率和存活率、培养性。
剥离率＝[经剥离的细胞数/(经剥离的细胞数+未剥离的细胞数)]×100
···(6)
存活率＝(1-剥离细胞中的死细胞数/经剥离的细胞数)×100
···(7)
培养性＝通过培养基材而得到的细胞总数/用TCPS(市售的组织培养用培养皿)得到的细胞总数*
···(8)
*细胞总数＝经剥离的细胞数+未剥离的细胞数
(碱性磷酸酶染色(AP染色)例)
未分化iPS细胞显示高碱性磷酸酶活性，因此会被染色成深色。相反，分化细胞不显示碱性磷酸酶活性，因此不会被染色。
作为试剂，使用Sigma-Aldrich制的“Leukocyte Alkaline Phosphatase Kit”。作为操作步骤，在培养结束后，除去培养皿中的培养基，加入磷酸缓冲液洗涤细胞后除去磷酸缓冲液。接着，加入固定液并静置约1分钟后，除去固定液，用水洗涤，然后加入染色液，在室温(25℃)下静置1小时。除去染色液，用水洗涤，加入封固剂，盖上盖玻片，用显微镜观察。在显示碱性磷酸酶活性的情况下(阳性)染色为红色。
[表1]
＜保存稳定性试验＞
实施例14～29的培养基材全部按照下述方法来制作。
将适量的嵌段聚合物12(实施例26、27中为嵌段聚合物8，实施例28、29中为嵌段聚合物13)的1质量％甲醇溶液加入到35mm聚苯乙烯制培养皿(35mm/Tissue Culture Dish、AGC Techno glass株式会社制)中，用旋涂器薄薄地涂布在培养皿的表面，在80℃的恒温器中干燥20分钟。接着，用灭菌水洗涤培养皿后，在灭菌袋中将培养皿在40℃下干燥5小时，得到细胞培养容器14～29。用AFM(原子力显微镜)测定涂膜的厚度，结果膜厚为约20nm。
实施例14、26、28的[层粘连蛋白涂布]
向细胞培养容器14、26、28中加入浓度10μg/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下静置1天而使其干燥。
实施例15的[层粘连蛋白涂布]
向细胞培养容器15中加入浓度10μg/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下静置1天而使其干燥后，再在室温(25℃、40％RH)下静置30天。
实施例27、29的[层粘连蛋白涂布]
向细胞培养容器27、29中加入浓度10μg/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下静置1天而使其干燥后，再在室温(25℃、40％RH)下静置6天。
实施例16的[层粘连蛋白/明胶混合溶液的涂布]
向细胞培养容器16中加入含有浓度0.2mg/ml的明胶(新田明胶株式会社制)和浓度10μg/mL的层粘连蛋白的水溶液500μL(相当于明胶涂布量10μg/cm2、相当于层粘连蛋白涂布量0.5μg/cm2、在37℃下静置1小时后，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下干燥1天。
实施例17的[层粘连蛋白/明胶混合物的涂布]
向细胞培养容器16中加入含有浓度3mg/ml的明胶(新田明胶株式会社制)和浓度10μg/mL的层粘连蛋白的水溶液500μL(相对于明胶涂布量150μg/cm2、相对于层粘连蛋白涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时后，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下干燥1天。
实施例18的[层粘连蛋白/明胶混合物的涂布]
向细胞培养容器16中加入含有浓度3mg/ml的明胶(新田明胶株式会社制)和浓度1μg/mL的层粘连蛋白的水溶液500μL(相当于明胶涂布量150μg/cm2、相当于层粘连蛋白涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时后，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下干燥1天后再在室温(25℃、40％RH)下静置30天。
实施例19的[胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布]
向细胞培养容器19中加入浓度0.1mg/ml的胶原蛋白(商品名：Cellmatrix TypeI-C、新田明胶株式会社制)水溶液500μL(相当于涂布量5μg/cm2)、在37℃下静置1小时后，弃掉该水溶液，接着，加入浓度10μg/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下干燥1天。
实施例20的[胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布]
使用浓度1mg/ml的胶原蛋白水溶液代替实施例19的浓度0.1mg/ml的胶原蛋白水溶液，除此以外与实施例19同样地进行胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布。
实施例21的[胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布]
使用浓度2mg/ml的胶原蛋白水溶液代替实施例19的浓度0.1mg/ml的胶原蛋白水溶液，除此以外与实施例19同样地进行胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布。
实施例22的[胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布]
使用浓度4mg/ml的胶原蛋白水溶液代替实施例19的浓度0.1mg/ml的胶原蛋白水溶液，除此以外与实施例19同样地进行胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布。
实施例23的[胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布]
使用浓度10mg/ml的胶原蛋白水溶液代替实施例19的浓度0.1mg/ml的胶原蛋白水溶液，除此以外与实施例19同样地进行胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布。
实施例24的[胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布]
向细胞培养容器24中加入浓度1mg/ml的胶原蛋白(商品名：Cellmatrix Type I-C、新田明胶株式会社制)水溶液500μL(相当于涂布量50μg/cm2)，在37℃下静置1小时后，弃掉该水溶液，接着，加入浓度14μg/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.7μg/cm2)，在37℃下静置1小时，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下干燥1天。
实施例25的[胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布]
使用浓度20μg/mL的层粘连蛋白水溶液代替实施例24的“浓度14μg/mL的层粘连蛋白水溶液”，除此以外与实施例24同样地进行胶原蛋白和层粘连蛋白的涂布。
[比较例3]
向市售的细胞培养容器35mm聚苯乙烯制培养皿(TCPS、35mm/Tissue CultureDish、AGC Techno glass制)的35mm培养皿中，加入浓度10μg/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下静置1天而使其干燥。
[比较例4]
向市售的细胞培养容器35mm聚苯乙烯制培养皿(TCPS、35mm/Tissue CultureDish、AGC Techno glass制)中，加入浓度10μg/mL的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液500μL(相当于涂布量0.5μg/cm2)，在37℃下静置1小时，弃掉该水溶液，在室温25℃(相对湿度35～55％RH)下静置1天而使其干燥后，再在室温(25℃、40％RH)下静置6天。
[表2]
[表3]
(实施例30)
将嵌段聚合物10用甲醇稀释而制作0.12％溶液，向35mm聚苯乙烯制培养皿(35mm/Tissue Culture Dish、IWAKI制)中添加40ul，然后在室温下静置2小时而使其干燥，再用超纯水和灭菌水分别冲洗，在40℃干燥一晚，从而得到层叠有细胞培养基材的细胞培养容器30。用椭圆偏振光谱法(Spectroscopic ellipsometry)对得到的细胞培养基材的膜厚进行测定，结果为35nm。
[iPS细胞的培养、剥离率的评价]
向培养容器30中，添加加入了浓度0.5ug/ul的层粘连蛋白(商品名：iMatrix、Nippi.Inc.制)水溶液4.8ul、1.5ul浓度3.4ug/ul的ROCK抑制剂Y27632、和1.3x104个iPS细胞(201B7株、iPS Academia JAPAN株式会社制)的培养基(StemFit Ak02N、味之素株式会社制)1.5ml，在5％CO2气氛的37℃恒温器内静置并培养8天。从培养开始日的第3天起连续5天每天进行培养基更换。
接着，用4℃的冷介质进行培养基更换，在室温静置10分钟，然后进行用吸液管吸入/吹出培养基的“吹吸操作”约10次，从而进行细胞剥离。按照上述“细胞的剥离率和存活率、以及培养性的测定”方法求出的细胞培养性为1.0(与TCPS同等)，细胞剥离率为95％，回收细胞的存活率为75％。
(比较例5)
除了使用35mm聚苯乙烯制培养皿(35mm/Tissue Culture Dish、IWAKI制)以外，与实施例30同样地进行iPS细胞的培养、剥离率的评价。结果进行了iPS细胞的培养、剥离率的评价。其结果是，细胞培养性为1.0，细胞剥离率为5％，回收细胞的存活率为20％。
产业上的可利用性
本发明的细胞培养基材在于，提供一种即使对于人多能性干细胞也能以高效率进行培养、且能够以维持高存活率的状态剥离而回收培养后的细胞的细胞培养基材。另外，还提供能够进行细胞剥离、并且还能耐受干燥状态的细胞培养基材。

Claims (12)

1.一种细胞培养基材，其特征在于，所述细胞培养基材含有具有最低临界溶解温度的链段与疏水性链段的嵌段聚合物，该细胞培养基材中还具有粘附基质，该粘附基质为细胞外基质和/或粘附性合成基质。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基材，其中，细胞外基质为选自层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙粘着蛋白和它们的片段中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基材，其中，粘附性合成基质为聚[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵]或负载有寡肽的聚合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞培养基材，其中，所述具有最低临界溶解温度的链段的聚合度为400-10000。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养基材，其中，所述疏水性链段是使下述式(1)所示的单体聚合而得到的，
所述式(1)中，R1为氢原子或甲基，R2表示苯基、烷基碳数为1～8的羧基烷基、芳烷基碳数为7或8的羧基芳烷基、下述式(2)所示的基团、下述式(3)所示的基团中的任意一者，
所述式(2)中，n表示2或3，R3表示碳数1～3的烷基，
所述式(2)中，R4和R5分别独立地表示氢原子或碳数1～6的烷基，R4和R5的合计碳数为5以上。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞培养基材，其中，所述细胞培养基材上还含有选自明胶、胶原蛋白和/或白蛋白中的至少一种蛋白质。
7.根据权利要求6所述的细胞培养基材，其特征在于，按照权利要求1所述的嵌段聚合物、选自明胶、胶原蛋白和/或白蛋白中的至少一种蛋白质、权利要求1所述的粘附基质的顺序进行层叠。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞培养基材，其为干燥细胞培养基材。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞培养基材，其特征在于，其层叠在支撑体上。
10.根据权利要求9所述的细胞培养基材，其平均膜厚度为1000nm以下。
11.一种干燥细胞培养基材的制造方法，其具有下述工序：
在权利要求1所述的嵌段聚合物上涂布含有选自明胶、胶原蛋白和/或白蛋白中的至少一种蛋白质的溶液的工序；
进而涂布含有权利要求1所述的粘附基质的溶液而制成细胞培养基材的工序；和
对得到的细胞培养基材进行干燥的工序。
12.一种细胞培养器材，其具有支撑体和权利要求1～10中任一项所述的细胞培养基材。
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