KR102469649B1 - 세포 배양 기재 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트와 소수성 세그먼트의 블록 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 세포 배양 기재 중에 추가로 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재를 제공하는 것이다. 또한, 세포외 매트릭스가, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트로부터 선택되는 적어도 1종이고/이거나 접착성 합성 기질이, 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드] 또는 올리고펩티드 담지 중합체인 세포 배양 기재를 제공하는 것이다.

Description

세포 배양 기재
본 발명은 세포 배양용 기재(基材)에 관한 것이다.
인간 iPS 세포나 ES 세포와 같은 인간 다능성 줄기 세포는, 병리 해명이나 신약 개발 및 재생 의료에의 응용 가능성으로부터 주목받고 있다. 인간 다능성 줄기 세포의 이용에는, 안정하면서 안전하게 배양하고, 나아가 배양한 세포를 회수한 후에, 창약이나 의료에 응용할 필요가 있다.
종래부터 인간 다능성 줄기 세포는 그의 낮은 배양율이 과제로 되어 왔다. 해결법의 하나로서, 피더 세포를 이용한 배양법이 시도되어 왔지만, 사용한 피더 세포가 오염된다는 문제가 있는 점에서, 안전하다고 할 수는 없었다.
그것에 대한 해결책으로서, 특허문헌 1에서는, 세포 배양 기재 상에 세포외 매트릭스인 라미닌 및 라미닌 프래그먼트를 도포함으로써, 피더 세포가 없어도 인간 다능성 줄기 세포가 배양 가능한 것이 보고되어 있다.
한편, 특허문헌 1에서는 기재 상에서의 배양은 가능하기는 하지만, 배양 세포의 회수에 대해서는 언급되어 있지 않고, 배양 세포를 이용한다는 점에서는 과제가 남겨져 있다. 예를 들어 상기 방법으로 배양된 세포는, 세포외 매트릭스와의 접착이 강한 점에서, 효소 처리한 후에 셀 스크래퍼(고무 또는 수지제 주걱) 등으로 물리적으로 세포를 긁어모으는 방법으로 세포를 회수하고 있어, 작업 효율이 낮을 뿐 아니라 물리적 자극을 부여하는 점에서 세포의 생존율에 악영향을 미친다는 과제가 있었다.
한편, 라미닌 등의 세포외 매트릭스를 인간 다능성 줄기 세포에 이용하는 데 있어서는, 세포외 매트릭스가 실활되기 쉽다는 과제가 있다. 특히, 기재 표면이 건조되면 세포외 매트릭스가 실활되어, 인간 다능성 줄기 세포의 배양 효율이 저하된다. 세포 배양 기재의 보존 수송 등을 생각하면, 건조 상태에서도 배양 효율을 유지하는 것이 중요하다. 특허문헌 2에서는, 라미닌 이외의 단백질을 코팅함으로써, 건조 상태를 견딜 수 있는 세포 배양 기재가 개시되어 있지만, 이것에 대해서도 배양은 가능하기는 하지만, 배양 세포의 회수라는 과제는 해결되지 않았다.
WO2011/043405 WO2014/199754
본 발명의 과제는, 인간 다능성 줄기 세포라도 고효율로 배양 가능하며, 또한 배양 후의 세포를 높은 생존율을 유지한 채 박리시켜 회수하는 것이 가능한 세포 배양 기재를 제공하는 데 있다. 또한, 나아가 세포 박리 가능하며 또한 건조 상태에도 견딜 수 있는 세포 배양 기재를 제공하는 데 있다.
발명자들은 예의 검토한 결과, 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트와 소수성 세그먼트의 블록 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 세포 배양 기재 중에 추가로 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재를 제공함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하였다.
또한, 세포외 매트릭스가 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트로부터 선택되는 적어도 1종인 세포 배양 기재, 또는 접착성 합성 기질이 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드] 또는 올리고펩티드 담지 중합체인 세포 배양 기재를 제공한다.
또한, 상기 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트의 중합도가 400 내지 10000인 세포 배양 기재를 제공한다.
또한, 상기 소수성 세그먼트가 하기 식 (1)로 표시되는 모노머를 중합하여 얻어지는 것인 세포 배양 기재를 제공한다.
Figure 112019050132555-pct00001
(상기 식 (1) 중, R1은 수소 원자 또는 메틸기이며, R2는 페닐기, 알킬 탄소수 1 내지 8의 카르복시알킬기, 아르알킬 탄소수 7 내지 8의 카르복시 아르알킬기, 하기 식 (2)로 표시되는 기, 하기 식 (3)으로 표시되는 기 중 어느 하나를 나타낸다.
Figure 112019050132555-pct00002
(상기 식 (2)에 있어서, n은 2 또는 3을 나타내고, R3은 탄소수 1 내지 3의 알킬기를 나타낸다.)
Figure 112019050132555-pct00003
(상기 식 (3)에 있어서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타내고, R4 및 R5의 합계 탄소수가 4 이상인 것을 나타낸다.))
또한, 상기 세포 배양 기재 상에, 추가로 젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질을 함유하는 것인 세포 배양 기재를 제공한다.
본 발명의 세포 배양 기재는, 인간 다능성 줄기 세포를 고효율로 배양 가능할 뿐 아니라, 배양 후의 세포를 높은 생존율인 채로 기재로부터 박리시켜 회수할 수 있다.
또한, 건조 상태를 거쳐도 배양 가능하며 또한 세포 박리 가능한 기재를 개시한다.
본 발명은, 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트와 소수성 세그먼트의 블록 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 세포 배양 기재 중에 추가로 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재를 제공하는 것이다.
[하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트]
본 발명에 있어서의 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트란, 블록 중합체에 있어서의 세그먼트이며, 해당 세그먼트는 어떤 일정 온도 이하가 되면 물에 용해되는 중합체로 구성된 세그먼트를 말한다.
본 발명에 있어서의 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트란, 이하와 같은 어떤 일정 온도 이하가 되면 물에 용해되는 중합체이다. 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체로서는, 하기 1) 및 2)를 들 수 있다.
1) 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체
2) 소수화 모노머와 친수성 모노머의 공중합체
1)은, 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머만을 중합시켜 얻어지는 중합체 세그먼트이다. 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머로서는, 예를 들어 N-이소프로필(메트)아크릴아미드, N-n-프로필(메트)아크릴아미드, N-시클로프로필(메트)아크릴아미드, N-에톡시에틸(메트)아크릴아미드, N-테트라히드로푸르푸릴(메트)아크릴아미드, N-에틸아크릴아미드, N-에틸-N-메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N-메틸-N-n-프로필아크릴아미드, N-메틸-N-이소프로필아크릴아미드, N-아크릴로일피페리딘 및 N-아크릴로일피롤리딘이 예시된다. 이들 모노머는 단독으로도 복수종을 동시에 이용해도 상관없다.
1)인 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머를 중합시켜 얻어지는 세그먼트는, 간편하게 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 제조하는 것이 가능하다. 그러나 이들 모노머는 플라스틱 표면과의 사이에 접착성이 낮아, 물에 접촉하면, 도포된 중합체층이 박리되기 쉽다는 과제가 있지만, 본원의 세포 배양 기재는, 소수성 세그먼트를 함유하는 점에서, 내수성이 우수하기 때문에, 배양 기재가 박리되지 않고 사용할 수 있다.
2)는, 소수화 모노머와 친수성 모노머의 공중합체이다. 소수화 모노머와 친수성 모노머의 공중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖기 위해서는,
2-1) 친수성 모노머가, 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머인 경우와,
2-2) 하기 식 (1)로 표시되는 모노머 (a)와 친수성의 아미드계 비닐 모노머 (b)의 공중합체 (B1), 또는 상기 모노머 (a)와 하기 식 (2)로 표시되는 모노머 (c)의 공중합체 (B2), 또는 모노머 (a)와 하기 식 (3)으로 표시되는 폴리에틸렌글리콜쇄 함유 모노머 (d)의 공중합체 (B3)을 들 수 있다.
Figure 112019050132555-pct00004
(식 중, R1은 수소 원자 또는 메틸기, R2는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기, R3은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기를 나타낸다.)
Figure 112019050132555-pct00005
(식 중, R4는 수소 원자 또는 메틸기, R5는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기를 나타낸다.)
Figure 112019050132555-pct00006
(식 중, n은 2 내지 20의 정수를 나타낸다.)
친수성의 아미드계 모노머 (b)로서는, 디메틸아크릴아미드, 아크릴아미드, 메틸아크릴아미드, 에틸아크릴아미드 등이 예시된다.
소수화 모노머란, 모노머 시에는 수용성이지만 중합하면 수성 용매에 불용화되는 모노머이다. 이러한 모노머가 공중합체에 함유되어 있는 경우, 내수성이 우수하며 지지체로부터 박리되기 어려운 세포 배양 기재로 할 수 있다.
소수화 모노머로서는, 상기 식 (1)로 표시되는 화합물이나, 소수화 모노머로서는, 상기 식 (1)로 표시되는 화합물이나, 디아세톤아크릴아미드, (메트)아크릴산폴리프로필렌글리콜, 메톡시디에틸렌글리콜아크릴레이트, 메톡시트리에틸렌글리콜아크릴레이트를 들 수 있다. 이들은 단독으로도 복수종을 동시에 사용해도 상관없다. 그 중에서도 아크릴산2메톡시에틸, 아크릴산2에톡시에틸, 아크릴산3메톡시프로필이 바람직하고, 아크릴산2메톡시에틸, 아크릴산2에톡시에틸이 특히 바람직하다.
2-2)에서 개시되는 공중합체 세그먼트의 경우, 얻어지는 공중합체 세그먼트의 하한 임계 용해 온도를, 모노머의 종류나 비율에 의해 폭넓게 제어할 수 있고, 또한 세포의 종류에 따라서 적절히 모노머의 종류나 비율을 바꾸어, 보다 양호한 세포 접착성과 증식성을 가지고 세포를 배양할 수 있는 점에서 바람직하다. 예를 들어, 모노머 (a)에 대하여 모노머 (b 또는 c 또는 d)의 비율을 증가시킴에 따라서, 얻어지는 공중합체의 하한 임계 용해 온도가 고온측으로 시프트된다. 이 비율과 하한 임계 용해 온도가 거의 직선 관계에 있다. 세포 배양 온도는 통상 37℃이기 때문에, 얻어지는 공중합체의 하한 임계 용해 온도는 20 내지 32℃ 부근이 되도록 조제하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서의 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트는, 하한 임계 용해 온도를 갖는 범위 내에서, 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머, 친수성 모노머 및 소수화 모노머로 이루어지는 군에 포함되지 않는 모노머를 함유할 수 있다.
본 발명의 블록 중합체에 있어서, 상기 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는 400 내지 10000이면 바람직하다. 400 이상인 경우, 세포 박리성이 보다 양호해지고, 10000보다 작은 경우에는, 블록 중합체의 합성 상, 보다 용이하기 때문이다.
바람직한 중합으로서는 1000 내지 8000이며, 이 범위라면 세포 박리성과 배양 효율의 밸런스가 우수하다. 특히 바람직하게는 3000 내지 6000이다.
[소수성 세그먼트]
본 발명의 블록 중합체는, 소수성 세그먼트를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 명세서에 있어서 블록 중합체의 세그먼트에 있어서의 「소수성」이란, 세그먼트를 포함하는 중합체에 대하여, 물 중에 있어서의 25℃에서의 용해도가 0.5g/100mL 미만인 것을 의미한다. 소수성 세그먼트는 적어도 소수성 모노머의 모노머 단위를 포함한다.
본 발명의 블록 중합체는, 소수성 세그먼트를 갖는 점에서, 내수성이 떨어지는 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트를 갖고 있어도, 내수성이 우수하며 지지체와의 밀착성이 우수하다.
소수성 모노머로서는, 중합 후에 소수화되는 모노머라면 특별히 제한은 되지 않지만, 바람직하게는 하기 식 (1) 내지 (3)으로 표시되는 모노머를 들 수 있다. 또한, 이들 소수성 모노머는 단독으로 사용해도, 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
Figure 112019050132555-pct00007
(상기 식 (1) 중, R1은 수소 원자 또는 메틸기이며, R2는 페닐기, 알킬 탄소수 1 내지 8의 카르복시알킬기, 아르알킬 탄소수 7 내지 8의 카르복시아르알킬기, 하기 식 (2)로 표시되는 기, 하기 식 (3)으로 표시되는 기 중 어느 하나를 나타낸다.
Figure 112019050132555-pct00008
(상기 식 (2)에 있어서, n은 2 또는 3을 나타내고, R3은 탄소수 1 내지 3의 알킬기를 나타낸다.)
Figure 112019050132555-pct00009
(상기 식 (3)에 있어서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타내고, R4 및 R5의 합계 탄소수가 5 이상인 것을 나타낸다.))
이 중에서도, 상기 식 (1)로 표시되는 모노머라면, 얻어지는 중합체 세그먼트가 소수성이 되고, 세포 배양 기재의 내수성과 지지체 밀착성이 우수하기 때문에 바람직하다.
그 중에서도 바람직하게는, 에틸아크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 스티렌이며, 특히 바람직하게는 부틸아크릴레이트이다.
본 발명의 블록 중합체에 있어서, 상기 소수성 세그먼트의 중합도는 50 내지 1000이면 바람직하다. 50 이상인 경우, 내수성이 보다 양호해지고, 1000보다 작은 경우에는, 세포 박리성이 보다 양호해지기 때문이다.
[블록 중합체]
본 발명의 블록 중합체는, 상기 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트와, 소수성 세그먼트를 갖는 중합체이다. 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트를 A, 소수성 세그먼트를 B라 했을 때, 본 발명의 블록 중합체는 AB의 디블록 타입이어도 되고, ABA 또는 BAB의 트리블록 타입이어도, 그 이상의 세그먼트수를 갖는 중합체이어도 상관없다. 바람직하게는 디블록 타입 또는 트리블록 타입이며, 특히 바람직하게는 디블록 타입이다.
[블록 중합체의 분자량]
블록 중합체의 분자량은, 중량 평균 분자량(Mw)으로 50000 내지 1000000이 바람직하고, 70000 내지 900000이 보다 바람직하고, 400000 내지 800000이 더욱 바람직하다. 중량 평균 분자량이 50000 이상이면, 세포 박리성이 높기 때문에 바람직하고, 1000000 이하이면 취급이 용이하기 때문에 바람직하다.
[블록 중합체의 제조 방법]
블록 중합체의 제조 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법을 채용할 수 있다. 이 중, 정밀 라디칼 중합인 것이 바람직하고, 가역적 부가-개열 연쇄 이동(RAFT) 중합, 원자 이동 라디칼 중합(ATRP), 니트록시드 매개 중합(NMP)인 것이 보다 바람직하고, RAFT 중합인 것이 더욱 바람직하다.
[블록 중합체의 성형 방법]
본 발명의 세포 배양 기재를 형성시키는 바람직한 방법으로서, 본 발명의 블록 중합체를 포함하는 코팅제를 상술한 지지체 상에 도포하는 방법을 들 수 있다.
<코팅제>
상기 코팅제는 블록 중합체와 용매를 포함한다. 그 밖에, 필요에 따라서 첨가제 등을 포함하고 있어도 된다.
[블록 중합체]
블록 중합체로서는, 상술한 것이 사용되는 점에서 여기에서는 설명을 생략한다.
또한, 블록 중합체는 1종만을 포함하고 있어도 되고, 다른 구성을 갖는 2종 이상의 블록 중합체를 포함하고 있어도 된다.
블록 중합체의 함유량은, 코팅제의 전체 질량에 대하여 0.01 내지 90질량％인 것이 바람직하고, 0.1 내지 50질량％인 것이 보다 바람직하다. 블록 중합체의 함유량이 0.01질량％ 이상이면, 얻어지는 도막이 표면 친수성을 발현하기 쉬운 점에서 바람직하다. 한편, 블록 중합체의 함유량이 90질량％ 이하이면, 점도가 낮은 점에서 도공 적성이 높아지므로 바람직하다.
[용매]
코팅제에 함유될 수 있는 용매로서는, 특별히 제한되지 않고 공지된 것이 사용될 수 있다.
용매의 구체예로서는 물 또는 유기 용매를 들 수 있다.
상기 유기 용매로서는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 부탄올, sec-부탄올, iso-부탄올, tert-부탄올 등의 알코올계 용매; 테트라히드로푸란, 1,4-디옥산 등의 에테르계 용매; 시클로헥사논, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤계 용매; 아세토니트릴 등의 니트릴계 용매; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드계 용매; 디메틸술폭시드; 디옥실란; 피롤리돈 등을 들 수 있다. 이들 중, 유기 용매로서는 알코올계 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로필알코올, tert-부탄올을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상술한 중에서 용매는, 물, 알코올계 용매인 것이 바람직하고, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로필알코올, tert-부탄올인 것이 보다 바람직하다.
상술한 용매는 단독으로 사용해도, 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
코팅제 중의 용매의 함유량은, 코팅제의 전체 질량에 대하여 10 내지 99.99질량％인 것이 바람직하고, 50 내지 99.9질량％인 것이 보다 바람직하고, 80 내지 99.5질량％인 것이 더욱 바람직하다. 용매의 함유량이 10질량％ 이상이면 코팅제 용액의 점도가 낮아지기 때문에, 도공 적정이 우수한 점에서 바람직하다. 한편, 용매의 함유량이 99.99질량％ 이하이면, 코팅 후의 도막의 두께가 지나치게 얇아지지 않아 바람직하다.
[첨가제]
코팅제는 사용 목적에 따라서 첨가제를 함유해도 된다.
당해 첨가제로서는 특별히 제한되지 않고, 공지된 것이 사용될 수 있다. 구체적으로는, 부형제, 계면 활성제, 가소제, 소포제, 안료, 항산화제, 항생 물질, 자외선 흡수제, 결정 핵제, 결정화 촉진제, 안정화제, 항균제 등을 들 수 있다. 이들 첨가제는 단독으로 사용해도, 2종 이상을 혼합하여 사용해도 된다.
코팅제의 도포 방법은 특별히 제한은 없고, 스프레이 코팅법, 플로우 코팅법, 침지법 등을 들 수 있다.
또한, 기재가 튜브 형상인 경우에는, 코팅제를 통액시키는 방법 등을 들 수 있다. 이 때, 통액 후에는 통상, 용매를 통액시켜 튜브 내부의 여분의 코팅제를 제거한다.
건조 조건에 대해서도 특별히 제한되지 않고, 자연 건조여도 가열 건조여도 된다. 가열 건조인 경우의 건조 온도는, 사용하는 코팅제에 따라서도 상이하지만, 30 내지 70℃인 것이 바람직하고, 40 내지 60℃인 것이 보다 바람직하다. 또한, 건조를 제어함으로써, 일부 용매를 잔존시킨 도막을 얻을 수 있다.
[접착 기질]
본 발명의 세포 배양 기재는, 접착 기질을 기재 중에 가짐으로써, 인간 다능성 줄기 세포의 배양성이 향상된다. 접착 기질로서는, 세포외 매트릭스와 접착성 합성 기질을 들 수 있다.
세포외 매트릭스로서는, 구체적으로는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트를 들 수 있다. 바람직하게는 라미닌 및 비트로넥틴 및 그러한 프래그먼트를 들 수 있다. 세포외 매트릭스로서는 동물 유래라면 이용할 수 있지만, 바람직하게는 인간 및 마우스 유래의 세포외 매트릭스이다. 더욱 바람직하게는 재조합 단백질로서 제조된 것이다. 시판품으로서, 마트리겔(코닝사제), 겔트렉스(서모 피셔 사이언티픽사제), iMatrix-511(닛삐사제), Laminin521(BioLamina사) 등이 이용 가능하다.
세포외 매트릭스와 동시에, ROCK(Rho-associated coiled-coil kinase) 저해제를 사용해도 된다. ROCK 저해제를 사용함으로써, 단일 세포에 분산된 인간 다능성 줄기 세포의 배양이 더욱 용이해진다. Y-27632(와코 쥰야꾸 고교)나 파수딜 히드로클로라이드(Fasudil hydrochloride)(도꾜 가세이 고교 가부시키가이샤제)를 들 수 있다.
접착성 합성 기질로서는, 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드](이후 PMEDSAH라 약칭) 또는 올리고펩티드 담지 중합체를 들 수 있다. 올리고펩티드 담지 중합체는, 세포 접착 활성을 갖는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 서열을 갖는 올리고펩티드를 중합체에 공유 결합시킨 기질이다. 시판품으로서 Synthemax(코닝사제)를 들 수 있다.
접착 기질은, 기재에 대하여 어떤 방법으로 제공해도 상관없다. 예를 들어 접착 기질을 기재 중에 혼합해도 되고, 도포해도 상관없다. 또한, 세포 배양용 배지에 접착제 기질을 함유시켜, 배지와 동시에 기재와 접촉시키는 형태로 제공해도 된다.
당해 접착 기질은, 기재 중에 균일하게 존재하고 있어도, 불균일하게 존재하고 있어도 상관없다. 바람직하게는 기재 표면에 존재하는 경우이다. 도포에 의한 접착제 기질의 공급을 행하는 경우, 도포 방법으로서는 접착 기질의 용액을 공지 관용의 방법을 사용하여 도포하면 되고, 스프레이 코팅, 스핀 코팅, 잉크젯 등으로 도포해도 되고, 판을 사용하여 스탬프해도 상관없다. 용액을 기재 상에 주입하고, 일정 기간 정치한 후에 용액을 제거하는 방법이어도 되고, 사용 방법에 따라서 적절히 선택하면 된다.
접착 기질을 세포 배양 기재 표면에 도포하는 경우, 도포량으로서는, 세포 배양 기재의 면적당 0.01 내지 5μg/cm2가 바람직하고, 0.2 내지 2μg/cm2가 더욱 바람직하고, 0.5 내지 1μg/cm2가 특히 바람직하다.
[젤라틴, 콜라겐 또는 알부민]
또한 접착 기질의 활성 유지나 세포 배양 효율을 높이기 위해서, 세포 배양 기재 상에 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민을 존재시켜도 상관없다. 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민은, 상기 접착 기질과 동일하게, 세포 배양 기재 중에 혼합해도 되고, 도포해도 상관없다. 도포하는 경우에는, 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민을 먼저 도포한 후에 접착 기질을 도포하는 쪽이, 접착 기질의 활성 유지나 세포 배양 효율에 있어서는 바람직하다. 또한, 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민은 1종이어도 되고 복수종을 동시에 사용해도 상관없다.
젤라틴, 콜라겐 또는 알부민의 도포량으로서는, 0.5 내지 500μg/cm2가 바람직하고, 5 내지 200μg/cm2가 더욱 바람직하고, 20 내지 100μg/cm2가 특히 바람직하다.
본 발명의 세포 배양 기재는 단체로 사용해도 되지만, 수송이나 보관 등의 편리성의 면에서 지지체 상에 형성되는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는, 지지체에 세포 배양 기재를 적층하여 적층체로 하는 방법이다.
[기타 배합물]
본 발명의 세포 배양 기재는, 블록 중합체나 세포외 매트릭스, 젤라틴 또는 콜라겐 외에도, 배합물을 갖고 있어도 된다. 예를 들어 방부제나 항균제, 착색료, 향료, 효소, 당류, 단백질, 펩티드류, 아미노산류, 세포, DNA류, 염류, 수용성 유기 용제류, 계면 활성제, 고분자 화합물, 레벨링제 등을 포함해도 상관없다.
[세포 배양 기재]
본 발명의 세포 배양 기재의 형상은 세포 배양할 수 있고, 저온 처리에 의해 배양 세포를 용이하게 박리할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 필름 형상의 것, 접시 형상의 것, 보틀(병) 형상의 것, 튜브 형상의 것, 굵기 5nm 내지 5mm의 실 형상 또는 막대 형상의 것, 가방(주머니) 형상의 것, 멀티웰 플레이트 형상의 것, 마이크로유로 형상의 것, 다공질막 형상 또는 망 형상의 것(예를 들어 트랜스 웰, 셀 스트레이너), 입경이 바람직하게는 10 내지 2000㎛, 보다 바람직하게는 100 내지 500㎛인 구 형상의 것 등을 들 수 있다.
본 발명의 세포 배양 기재는 단체로 사용해도 되지만, 지지체 상에 기재를 형성한 세포 배양 기재(器材)로서 사용하는 것이 바람직하다. 세포 배양 기재(器材)로 한 경우, 수송이나 보관 등의 편리성이 우수한 것 이외에도, 그대로 배양 용기나 배양용 담체로서 사용할 수도 있기 때문이다.
본 발명에서 사용되는 지지체의 재질은, 배양 기재가 충분히 접착될 수 있고, 또한 접착된 배양 기재 상에서 세포 배양을 할 수 있으며, 저온 처리에 의해 배양 세포를 용이하게 박리할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 폴리스티렌과 같은 스티렌계 수지, 폴리프로필렌과 같은 폴리올레핀계 수지, 폴리우레탄계 수지, 폴리카르보네이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리술폰계 수지, 불소계 수지, 셀룰로오스와 같은 다당류 천연 고분자, 유리나 세라믹스와 같은 무기 재료, 스테인리스, 티타늄과 같은 금속류 재료가 적합하게 사용된다.
지지체의 형상에는 특별히 한정은 없고, 본 발명의 세포 배양 기재의 지지체가 될 수 있는 형상이면 된다. 예를 들어 필름 형상의 것, 막 형상의 것, 판 형상의 것, 구 형상의 것, 다각 형상의 것, 막대 형상의 것, 접시 형상의 것, 보틀(병) 형상의 것, 튜브 형상의 것, 바늘·실 형상의 것, 섬유 형상의 것, 가방(주머니) 형상의 것, 멀티웰 플레이트 형상의 것, 마이크로유로 형상의 것, 다공질막 형상 또는 망 형상의 것(예를 들어 트랜스 웰, 셀 스트레이너) 등을 들 수 있다. 이들을 조합한 형상이어도 되고, 특정한 형상을 갖지 않는 부정 형상의 지지체여도 된다.
또한, 본 발명의 세포 배양 기재가, 지지체와 일체화되어 세포 배양 기재(器材)로서 사용되는 것은 물론, 지지체로부터 박리하여 단독으로 사용해도 된다.
[배양 세포]
본 발명의 세포 배양 기재는 각종 세포, 특히 동물 세포를 적합하게 배양하는 것이 가능하다. 동물 세포로서는, 유래는 동물이면 되고, 인간, 마우스, 원숭이 등을 들 수 있고, 인공 세포여도 상관없다. 세포종으로서는 특별히 한정은 없지만, 상피 세포(각막 상피 세포 등), 내피 세포(인간 탯줄 정맥 내피 세포 등), 섬유아세포(인간 피부 섬유아세포, 마우스 섬유아세포 등), 혈구 세포, 수축성 세포(골격근 세포, 심근 세포 등), 혈액과 면역 세포(적혈구, 마크로파지 등), 신경 세포(뉴런, 신경교세포 등), 색소 세포(망막 색소 세포 등), 간세포, 연골 세포, 골아세포, 줄기 세포(ES 세포, iPS 세포, 조혈 간세포, 피부 줄기 세포, 생식 줄기 세포, EC 세포, EG 세포, 신경 줄기 세포) 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 본 발명의 세포 배양 기재는, 배양이 어려운 줄기 세포, 특히 ES 세포나 iPS 세포에 대하여 적합하게 이용 가능하다.
[건조 세포 배양 기재]
본 발명의 세포 배양 기재는, 건조 상태를 거쳐도 인간 다능성 줄기 세포의 배양이 가능하다. 따라서, 장기간 보존이나 수송에 견딜 수 있는 점에서 산업상 이용 가능성이 매우 높다.
건조 방법으로서는 특별히 한정은 없고, 후술하는 지지체 상에 세포 배양 기재를 적층한 후, 건조시키면 된다. 예를 들어 실온 건조(18 내지 30℃, 습도 20％ 내지 60％RH), 가열 건조(30 내지 37℃), 항온 건조기나 데시케이터에 의한 건조 등을 들 수 있다. 단백의 변성을 방지하는 관점에서, 실온 건조가 바람직하다.
건조 시의 세포 배양 기재의 평균 막 두께는 1000nm 이하인 것이 바람직하고, 500nm 이하이면 더욱 바람직하다. 1000nm 이하이면 세포 배양성이 양호하기 때문이다.
[세포의 배양 방법]
배양 방법으로서는 공지 관용의 방법을 사용하면 되고, 예를 들어 접시 형상 용기의 저면에 형성시킨 배양 기재에, 소정량의 배지나 배양 시약을 넣고, 세포를 파종하여 소정 온도, CO2 농도 조건에서 배양해도 되고, 실 형상이나 구 형상으로 형성시킨 배양 기재를, 배지가 들어간 시판 폴리스티렌 용기에 넣고, 세포를 파종하여 배양해도 상관없다. 후자의 경우, 세포는 폴리스티렌 용기에 접착되지 않고, 실 형상이나 구 형상 배양 기재의 표면에 접착되어 증식한다. 예를 들어 굵기 50㎛의 실 형상 배양 기재를 사용한 경우, 세포는 실의 길이 방향으로 증식하기 때문에, 세포 형상을 제어한 형태로 배양할 수도 있다. 또한, 구 형상 배양 기재를 사용한 경우, 통상적인 접시 형상 용기에 비해, 표면적이 크고, 보다 많은 세포를 배양할 수 있는 이점이 있다.
[세포의 박리 방법(온도 조절법)]
배양된 세포를 기재로부터 박리하는 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 배양 종료 후, 소정 온도(6℃ 내지 30℃)의 배지로 37℃의 배지를 치환하여, 소정 온도(6℃ 내지 30℃)에서 정치하고, 세포의 자연 박리를 기다려도 되며, 배양 용기를 가볍게 흔들거나, 피펫으로 배지를 빨아들이거나 내거나 하는 「피펫팅」 조작으로, 온화한 수류로 세포에 물리적 자극을 주어, 세포를 박리해도 된다.
[세포의 박리 방법(효소법)]
세포끼리의 결합을 잘라내어, 단일 세포로 하고자 하는 경우에는, 효소 처리에 의한 박리법을 사용해도 된다. 사용하는 단백 분해 효소의 종류는 세포의 종류에 의해 적절히 선택하면 된다. 예를 들어, 트립신, 트립신/EDTA, TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific사)를 들 수 있다. 처리 온도나 시간은 세포의 종류나 기재와의 접착 강도에 의해 적절히 조정하면 된다. 예를 들어, 배양 종료 후, 배양을 제거하고, 완충액 등으로 세포를 세정하고, 효소 용액을 첨가하여, 37℃ 일정 시간 정치한 후, 효소 용액을 제거하고, 소정 온도(6℃ 내지 37℃)의 완충액 또는 배지를 첨가하고, 정치 또는 「피펫팅」 조작에 의해 세포를 박리하는 방법을 들 수 있다. 물론, 저온 처리와 효소 사용을 합쳐서 세포를 박리해도 된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
<GPC>
GPC의 측정 방법은 이하와 같음.
장치: HLC-8220GPC(도소 가부시키가이샤제)
용매: N,N-디메틸포름아미드(DMF) 용액(10mmol/L LiBr 함유)
칼럼: TSK-gel α-M 칼럼(도소 가부시키가이샤제) 2개 연결
표준 물질: PMMA 표준(Shodex M-75)
(NMR의 측정 방법)
1H-NMR: JEOL제 JNM-ECZ400S
자장 강도: 400MHz
적산 횟수: 16회
용매: 중(重)메탄올
시료 농도: 10질량％
(AFM의 측정 방법)
원자간력 현미경: Bruker AXS제 NanoScope(R) IIIa
측정 모드: DFM, 샘플 측정 2군데의 평균
[합성예 1] 블록 중합체 1의 합성
부틸아크릴레이트(와코 쥰야쿠 가부시키가이샤제) 0.475g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.013g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.006g, t부탄올 9.0g, 물 1.0g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 부틸아크릴레이트의 전환은 82％였다.
이어서, N-이소프로필아크릴아미드(이하 NIPAM, 가부시키가이샤 KJ 케미컬제) 1.68g, t부탄올 10.8g, 물 1.2g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 22.9g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, 부틸아크릴레이트의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 100％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=41000, Mw=74000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 2] 블록 중합체 2의 합성
부틸아크릴레이트 1.19g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.013g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.002g, t부탄올 8.0g, 물 1.0g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 부틸아크릴레이트의 전환은 84％였다.
이어서, NIPAM 6.3g, t부탄올 20.8g, 물 2.2g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, 부틸아크릴레이트의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 97％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=137000, Mw=277000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 3] 블록 중합체 3의 합성
부틸아크릴레이트 0.474g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.013g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.006g, t부탄올 8.0g, 물 1.0g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 부틸아크릴레이트의 전환은 87％였다.
이어서, NIPAM 10.5g, t부탄올 30.5g, 물 3.4g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, 부틸아크릴레이트의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 99％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=274000, Mw=489000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 4] 블록 중합체 4의 합성
부틸아크릴레이트 0.71g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.0078g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0024g, t부탄올 5.4g, 물 0.6g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 부틸아크릴레이트의 전환은 97％였다.
이어서, NIPAM 7.55g, t부탄올 24.3g, 물 2.7g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, 부틸아크릴레이트의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 99％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=200000, Mw=440000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 5] 블록 중합체 5의 합성
부틸아크릴레이트 0.59g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.0065g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0036g, t부탄올 9.0g, 물 1.0g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 부틸아크릴레이트의 전환은 81％였다.
이어서, N-이소프로필아크릴아미드(이하 NIPAM, 가부시키가이샤 KJ 케미컬제) 10.53g, t부탄올 49.86g, 물 5.54g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 66.7g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, 부틸아크릴레이트의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 99％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=220000, Mw=760000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 6] 블록 중합체 6의 합성
메톡시에틸아크릴레이트(이하 MEA, 오사까 유끼 가가꾸 가부시키가이샤제) 1.21g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.0129g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0054g, t부탄올 9.0g, 물 1.0g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 MEA의 전환은 98％였다.
이어서, NIPAM 6.29g, t부탄올 18.0g, 물 2.0g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 37.5g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, MEA의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 98％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=114000, Mw=338000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 7] 블록 중합체 7의 합성
MEA 0.97g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.0104g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0032g, t부탄올 7.2g, 물 0.8g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 MEA의 전환은 92％였다.
이어서, NIPAM 8.39g, t부탄올 26.5g, 물 2.9g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 46.8g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, MEA의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 90％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=152000, Mw=430000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 8] 블록 중합체 8의 합성
MEA 1.45g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.0156g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.008g, t부탄올 10.8g, 물 1.2g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 MEA의 전환은 98％였다.
이어서, NIPAM 15.1g, t부탄올 48.8g, 물 5.4g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 82.8g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, MEA의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 96％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=205000, Mw=576000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 9] 블록 중합체 9의 합성
MEA 1.46g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.0156g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0077g, t부탄올 10.8g, 물 1.2g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 MEA의 전환은 98％였다.
이어서, NIPAM 18.8g, t부탄올 58.8g, 물 6.4g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 72.8g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, MEA의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 97％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=234000, Mw=737000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 10] 블록 중합체 10의 합성
MEA 0.96g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.0105g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0049g, t부탄올 9g, 물 1g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 MEA의 전환은 97％였다.
이어서, NIPAM 16.9g, t부탄올 54.7g, 물 6.3g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 89g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, MEA의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 98％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=192000, Mw=772000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 11] 블록 중합체 11의 합성
스티렌(이하 St, 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤제) 5.79g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.040g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0122g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 St의 전환은 40％이며, 계산되는 중합도는 200이었다.
계속해서, 얻어진 RAFT제 함유 폴리스티렌을 디이소프로필에테르 중에서 재침전 후, 70℃에서 진공 건조시켜, 모노머를 제거하였다. 그 후, RAFT제 함유 폴리스티렌 1g, NIPAM 8.02g, 아세트산에틸 45.2, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0122g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, NIPAM의 전환은 98％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=62000, Mw=221000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[조정예 1] 4분지 RAFT제의 합성
비특허문헌 「Macromolecules, 36, 1505(2003)」에 따라서, 하기 수순으로 RAFT제 「테트라키스(3-1S-(1-메톡시카르보닐)에틸트리티오카르보닐프로피온산)펜타에리트리톨」을 합성하였다.
디클로로메탄 10mL, 펜타에리트리톨(3-머캅토프로피오네이트) 1.22g, 이황화탄소 2.00g, 트리에틸아민 2.04g을 넣고, 1시간 교반하였다. 계속해서, 2-브로모 프로피온산메틸 1.94g을 넣고, 또한 5시간 교반한 후, 5％ KHSO4 수용액으로 세정하였다. 또한 수세 후, 포화 식염수로 건조시켰다. 황산마그네슘 처리 후, 증발기를 사용하여 디클로로메탄을 제거하였다. 얻어진 주황색 유상 생성물을, 헥산/아세톤을 용리액으로 하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 RAFT제 「테트라키스(3-1S-(1-메톡시카르보닐)에틸트리티오카르보닐프로피온산)펜타에리트리톨」을 얻었다.
[합성예 12] 블록 중합체 12의 합성
MEA 1.48g, RAFT제로서 상기 테트라키스(3-1S-(1-메톡시카르보닐)에틸트리티오카르보닐프로피온산)펜타에리트리톨 0.013g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.0042g, t부탄올 7.2g, 물 0.8g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 MEA의 전환은 97％였다.
이어서, NIPAM 12.9g, t부탄올 45.7g, 물 5g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 메탄올 60g을 첨가하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, MEA의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 98％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=250000, Mw=782000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 13] 블록 중합체 13의 합성
부틸메타크릴레이트(이하 BMA, 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤 제품) 1.92g, RAFT제로서 2-(도데실티오카르보노티오일티오)프로판산 0.060g, 디메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트) 0.012g, t부탄올 10.8g, 물 1.2g을 충분히 질소 버블링하여 산소를 제거한 후, 70℃에서 7시간 교반하여, 제1 반응액을 얻었다. 이 단계에 있어서의 BMA의 전환은 83％였다.
이어서, NIPAM 6.1g, t부탄올 18g, 물 2g의 혼합물을 충분히 질소 버블링시킨 후에, 전술한 반응액에 첨가하고, 또한 70℃에서 20시간 교반하여, AB형의 온도 응답성 블록 중합체 용액을 얻었다. 이 블록 중합체의 전환을 NMR로 측정한 결과, MEA의 전환은 100％, NIPAM의 전환은 99％였다. 또한, 이 블록 중합체의 분자량 분포를 측정한 결과, Mn=34000, Mw=51000이었다. 전환으로부터 계산한 소수 세그먼트와 하한 임계 온도를 갖는 세그먼트의 중합도는, 각각 표 1과 같이 되었다. 또한, 후술하는 시험법으로 이 블록 중합체의 물 겔분율을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
(배양 기재의 제작예)
[실시예 1]
블록 중합체 1을 메탄올로 희석하여 0.5％ 용액을 제작하고, 35mm 폴리스티렌제 샤알레(35mm/조직 배양 접시(Tissue Culture Dish), AGC 테크노글라스제)에 60ul 첨가하였다. 그 후, 80℃에서 30분간 건조시키고, 또한 순수에 10분간 침지시키는 조작을 3회 반복하여 세정하고, 40℃에서 밤새 건조시킴으로써, 세포 배양 기재를 적층한 세포 배양 용기 1을 얻었다. 얻어진 세포 배양 기재의 막 두께를 원자간력 현미경으로 측정한 결과, 50nm였다.
이 세포 배양 기재를 후술하는 방법으로 라미닌 코팅을 행하고, 후술하는 시험법으로 iPS 세포 배양성 및 세포의 온도 감각 박리성의 평가를 행한 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 2 내지 13]
실시예 1과 동일한 방법으로, 블록 중합체 2 내지 13으로부터 각각 세포 배양 기재를 적층한 세포 배양 용기 2 내지 13을 제작하였다. 이 세포 배양 기재를 후술하는 방법으로 라미닌 코팅을 행하고, 후술하는 시험법으로 iPS 세포 배양성 및 세포의 온도 감각 박리성의 평가를 행한 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 1]
시판되고 있는 온도 감각 박리 배양 용기 「UPCELL(폴리이소프로필아크릴아미드 단독 중합체 고정화 세포 배양 기재, 셀시드 가부시키가이샤 제품)」의 35mm 샤알레에, 후술하는 라미닌 코팅법을 사용하여 라미닌 코팅을 행한 후, 후술하는 시험법으로 iPS 세포 배양성 및 iPS 세포 온도 감각 박리성의 평가를 행하였다.
[비교예 2]
시판되고 있는 세포 배양 용기 35mm 폴리스티렌제 샤알레(TCPS, 35mm/조직 배양 접시, AGC 테크노글라스제)에, 후술하는 라미닌 코팅법을 사용하여 라미닌 코팅을 행한 후, 후술하는 시험법으로 iPS 세포 배양성 및 iPS 세포 온도 감각 박리성의 평가를 행하였다.
[실시예 1 내지 13, 비교예 1 내지 2의 라미닌 도공 방법]
실시예 1 내지 13, 비교예 1 내지 2의 세포 배양 용기에, 농도 10ug/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하였다. 그 후, 건조시키지 않고, 후술하는 iPS 세포 배양·온도 감각 박리 시험을 행하였다.
(물 겔분율)
상기 건조 배양 기재 0.1g을 200메쉬의 스테인리스 금속망으로 싸고, 4℃의 물 중에서 20시간 방치 전후의 샘플을 130℃의 열풍 건조기에서 2시간 건조시킨 중량을 각각 측정하고, 냉수 중에 정치한 전후의 중량 감소율을 조사하였다. 이 값이 높을수록, 배양 기재의 내수성이 높고, 배양 기재로부터의 물에 의한 용출이 일어나기 어렵다고 할 수 있다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
배양 용기 1에 ROCK 저해제 Y27632(첨가량: 0.5μg/mL 배지)를 첨가한 StemFit Ak02N 배지(아지노모또 가부시키가이샤제)를 2ml 첨가하고, 또한 인간 iPS 세포(201B7주, iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤제)를 일정량(약 1×104개/cm2) 넣고, 5％ CO2 분위기의 37℃ 항온기 내에 정치하고, 5일간 배양을 행하였다. 배지는 2일에 1회의 빈도로 교환을 행하였다. 이어서, 온도 조절 박리법으로 세포를 박리하였다. 즉, 4℃의 냉매지로 배지 교환을 행하고, 실온에서 10분간 정치한 후, 피펫으로 배지를 빨아들이거나 내거나 하는 「피펫팅 조작」을 약 10회 행하고, 세포 박리를 행하였다. 이어서, 상기 「세포의 박리율과 생존율 및 배양성의 측정」 방법에 따라서, 박리된 세포수와 박리 세포 중의 사세포수, 및 전체 배양 세포수를 계측하고, 식 (6), (7), (8)로부터 박리율, 생존율 및 배양성을 산출하였다.
(세포의 박리율과 생존율 및 배양성의 측정)
배양 종료 후, 온도 조절법 또는 효소법으로 세포 박리 조작을 행하고, 박리된 세포 현탁액을 세포 계측 전용 카세트에 흡입하여 빨아들이고, 세포 계수 장치 NC-100(가부시키가이샤 엠에스 테크노시스템즈사제)을 사용하여 세포 현탁액 내 박리 세포 중의 사세포수를 계측한다. 또한, 박리된 세포를 배지마다 100μL를 1.5ml의 튜브에 옮기고, 시약(Reagent) A와 시약 B(가부시키가이샤 엠에스 테크노시스템즈사제)를 100μl씩 첨가하고, 수회 피펫팅하여 균일하게 혼동(混同)한 후, 동일하게 새로운 카세트로 액을 흡입하여 빨아들이고, 세포 계수 장치 NC-100에 세팅하여 박리된 세포수를 계측한다. 또한, 박리 조작 후의 박리 세포를 모두 제거한 샤알레에 시약 A를 적량 첨가하고, 실온(25℃)에서 10분간 정치하여 스크레이퍼(고무 주걱)를 사용하여 샤알레에 잔존한 세포 미박리 세포를 완전히 박리·용해시켜 벗겨낸 후, 시약 B를 적량 첨가하고, 수회 피펫팅하여 균일하게 혼동하여 세포 계수 장치 NC-100에 세팅하여 샤알레에 남은 미박리된 세포수를 계측한다. 세포 박리율과 생존율 및 배양성은 각각 하기 식 (6), (7), (8)로부터 산출한다.
박리율=[박리된 세포수/(박리된 세포수+미박리된 세포수)]×100···(6)
생존율=(1-박리 세포 중의 사세포수/박리된 세포수)×100···(7)
배양성=배양 기재에서 얻은 세포 총 수/TCPS(시판되는 조직 배양용 샤알레)에서 얻은 세포 총 수*···(8)
* 세포 총 수=박리된 세포수+미박리된 세포수
(알칼리 포스파타아제 염색(AP 염색)예)
미분화 iPS 세포는 높은 알칼리 포스파타아제 활성을 나타내기 때문에, 짙게 염색된다. 반대로, 분화 세포는 알칼리 포스파타아제 활성을 나타내지 않아 염색되지 않는다.
시약으로서 Sigma-Aldrich제의 「백혈구 알칼리 포스파타아제 키트(Leukocyte Alkaline Phosphatase Kit)」를 사용하였다. 조작 수순으로서는, 배양 종료 후, 샤알레 중의 배지를 제거하고 인산 완충액을 첨가하여 세포를 세정한 후 인산 완충액을 제거한다. 이어서, 고정액을 첨가하여 약 1분간 정치하고 나서 고정액을 제거하고, 물로 세정한 후, 염색액을 첨가하여 실온(25℃)에서 1시간 정치한다. 염색액을 제거하고, 물로 세정하고, 봉입제를 넣고 커버 유리로 덮어 현미경으로 관찰한다. 알칼리 포스파타아제 활성을 나타내는 경우(양성), 붉게 염색된다.
Figure 112019050132555-pct00010
<보존 안정성 시험>
실시예 14 내지 29의 배양 기재는 모두 하기 방법으로 제작하였다.
블록 중합체 12(실시예 26, 27은 블록 중합체 8, 실시예 28, 29는 블록 중합체 13)의 1질량％ 메탄올 용액을, 35mm 폴리스티렌제 샤알레(35mm/조직 배양 접시, AGC 테크노글라스 가부시키가이샤제)에 적량을 넣고, 스핀 코터를 사용하여 샤알레의 표면에 얇게 도포하고, 80℃의 항온기 중에서 20분간 건조시켰다. 이어서, 멸균수에 의해 샤알레를 세정한 후, 멸균 주머니 중에서 샤알레를 40℃, 5시간 건조시켜, 세포 배양 용기 14 내지 29를 얻었다. AFM(원자간력 현미경)을 사용하여 도막의 두께를 측정한 결과, 막 두께는 약 20nm였다.
실시예 14, 26, 28의 [라미닌 코팅]
세포 배양 용기 14, 26, 28에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 정치하여 건조시켰다.
실시예 15의 [라미닌 코팅]
세포 배양 용기 15에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 정치하여 건조시킨 후, 추가로 실온(25℃, 40％RH)에서 30일간 정치하였다.
실시예 27, 29의 [라미닌 코팅]
세포 배양 용기 27, 29에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 정치하여 건조시킨 후, 추가로 실온(25℃, 40％RH)에서 6일간 정치하였다.
실시예 16의 [라미닌/젤라틴 혼합 용액의 코팅]
세포 배양 용기 16에, 농도 0.2mg/ml의 젤라틴(니쓰타 젤라틴 가부시키가이샤제)과 농도 10μg/mL의 라미닌을 포함한 수용액을 500μL 넣고(젤라틴 코팅량 10μg/cm2 상당, 라미닌 코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃에서 1시간 정치한 후, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 건조시켰다.
실시예 17의 [라미닌/젤라틴 혼합물의 코팅]
세포 배양 용기 16에, 농도 3mg/ml의 젤라틴(니쓰타 젤라틴 가부시키가이샤제)과 농도 10μg/mL의 라미닌을 포함한 수용액을 500μL 넣고(젤라틴 코팅량 150μg/cm2 상당, 라미닌 코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃에서 1시간 정치한 후, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 건조시켰다.
실시예 18의 [라미닌/젤라틴 혼합물의 코팅]
세포 배양 용기 16에, 농도 3mg/ml의 젤라틴(니쓰타 젤라틴 가부시키가이샤제)과 농도 1μg/mL의 라미닌을 포함한 수용액을 500μL 넣고(젤라틴 코팅량 150μg/cm2 상당, 라미닌 코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃에서 1시간 정치한 후, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 건조시킨 후, 추가로 실온(25℃, 40％RH)에서 30일간 정치하였다.
실시예 19의 [콜라겐과 라미닌의 코팅]
세포 배양 용기 19에, 농도 0.1mg/ml의 콜라겐(상품명: Cellmatrix Type I-C, 니쓰타 젤라틴 가부시키가이샤제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 5μg/cm2 상당), 37℃에서 1시간 정치한 후, 해당 수용액을 버리고, 이어서 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 건조시켰다.
실시예 20의 [콜라겐과 라미닌의 코팅]
실시예 19의 농도 0.1mg/ml의 콜라겐 수용액 대신에 농도 1mg/ml의 콜라겐 수용액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 19와 동일하게 하여 콜라겐과 라미닌의 코팅을 행하였다.
실시예 21의 [콜라겐과 라미닌의 코팅]
실시예 19의 농도 0.1mg/ml의 콜라겐 수용액 대신에 농도 2mg/ml의 콜라겐 수용액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 19와 동일하게 하여 콜라겐과 라미닌의 코팅을 행하였다.
실시예 22의 [콜라겐과 라미닌의 코팅]
실시예 19의 농도 0.1mg/ml의 콜라겐 수용액 대신에 농도 4mg/ml의 콜라겐 수용액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 19와 동일하게 하여 콜라겐과 라미닌의 코팅을 행하였다.
실시예 23의 [콜라겐과 라미닌의 코팅]
실시예 19의 농도 0.1mg/ml의 콜라겐 수용액 대신에 농도 10mg/ml의 콜라겐 수용액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 19와 동일하게 하여 콜라겐과 라미닌의 코팅을 행하였다.
실시예 24의 [콜라겐과 라미닌의 코팅]
세포 배양 용기 24에, 농도 1mg/ml의 콜라겐(상품명: Cellmatrix Type I-C, 니쓰타 젤라틴 가부시키가이샤제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 50μg/cm2 상당), 37℃에서 1시간 정치한 후, 해당 수용액을 버리고, 이어서 농도 14μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.7μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 건조시켰다.
실시예 25의 [콜라겐과 라미닌의 코팅]
실시예 24의 「농도 14μg/mL의 라미닌 수용액」 대신에 농도 20μg/mL의 라미닌 수용액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 24와 동일하게 하여 콜라겐과 라미닌의 코팅을 행하였다.
[비교예 3]
시판되고 있는 세포 배양 용기 35mm 폴리스티렌제 샤알레(TCPS, 35mm/조직 배양 접시, AGC 테크노글라스제)의 35mm 샤알레에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 정치하여 건조시켰다.
[비교예 4]
시판되고 있는 세포 배양 용기 35mm 폴리스티렌제 샤알레(TCPS, 35mm/조직 배양 접시, AGC 테크노글라스제)에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 1일 정치하여 건조시킨 후, 추가로 실온(25℃, 40％RH)에서 6일간 정치하였다.
Figure 112019050132555-pct00011
Figure 112019050132555-pct00012
(실시예 30)
블록 중합체 10을 메탄올로 희석하여 0.12％ 용액을 제작하고, 35mm 폴리스티렌제 샤알레(35mm/조직 배양 접시, IWAKI제)에 40ul 첨가한 후, 실온에서 2시간 정치하여 건조시키고, 또한 초순수와 멸균수로 각각 린스하고, 40℃에서 밤새 건조시킴으로써, 세포 배양 기재를 적층한 세포 배양 용기 30을 얻었다. 얻어진 세포 배양 기재의 막 두께를 분광 엘립소메트리법에 의해 측정한 결과, 35nm였다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
배양 용기 30에, 농도 0.5ug/ul의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 4.8ul, 농도 3.4ug/ul의 ROCK 저해제 Y27632를 1.5ul 및 1.3x104개의 iPS 세포(201B7주, iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤제)를 첨가한 배지(StemFit Ak02N, 아지노모또 가부시키가이샤제) 1.5ml를 넣고, 5％ CO2 분위기의 37℃ 항온기 내에서 정치하여, 8일간 배양을 행하였다. 배양 개시일의 3일째부터 연속 5일간 매일 배지 교환을 행하였다.
이어서, 4℃의 냉매지로 배지 교환을 하고, 실온에서 10분간 정치한 후, 피펫으로 배지를 빨아들이거나 내거나 하는 「피펫팅 조작」을 약 10회 행하고, 세포 박리를 행하였다. 상기 「세포의 박리율과 생존율 및 배양성의 측정」 방법에 따라서 구한 세포 배양성은 1.0(TCPS 동등), 세포 박리율은 95％, 회수 세포의 생존율은 75％였다.
(비교예 5)
35mm 폴리스티렌제 샤알레(35mm/조직 배양 접시, IWAKI제)를 사용하는 것 이외에는, 실시예 30과 동일하게 하여, iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다. 그 결과, iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다. 그 결과, 세포 배양성은 1.0, 세포 박리율은 5％, 회수 세포의 생존율은 20％였다.
본 발명의 세포 배양 기재는, 인간 다능성 줄기 세포라도 고효율로 배양 가능하며, 또한 배양 후의 세포를 높은 생존율을 유지한 채 박리시켜 회수하는 것이 가능한 세포 배양 기재를 제공하는 데 있다. 또한, 나아가 세포 박리 가능하며 또한 건조 상태에도 견딜 수 있는 세포 배양 기재를 제공하는 데 있다.

Claims (12)

  1. 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트와 소수성 세그먼트의 블록 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 세포 배양 기재 중에 추가로 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질이고, 상기 하한 임계 용해 온도를 갖는 세그먼트의 중합도가 400 내지 10000 인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재(基材).
  2. 제1항에 있어서, 세포외 매트릭스가, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트로부터 선택되는 적어도 1종인 세포 배양 기재.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 접착성 합성 기질이, 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드] 또는 올리고펩티드 담지 중합체인 세포 배양 기재.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 소수성 세그먼트가, 하기 식 (1)로 표시되는 모노머를 중합하여 얻어지는 것인 세포 배양 기재.
    Figure 112020134813488-pct00013

    (상기 식 (1) 중, R1은 수소 원자 또는 메틸기이며, R2는 페닐기, 알킬 탄소수 1 내지 8의 카르복시알킬기, 아르알킬 탄소수 7 또는 8의 카르복시아르알킬기, 하기 식 (2)로 표시되는 기, 하기 식 (3)으로 표시되는 기 중 어느 하나를 나타낸다.
    Figure 112020134813488-pct00014

    (상기 식 (2)에 있어서, n은 2 또는 3을 나타내고, R3은 탄소수 1 내지 3의 알킬기를 나타낸다.)
    Figure 112020134813488-pct00015

    (상기 식 (3)에 있어서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타내고, R4 및 R5의 합계 탄소수가 5 이상인 것을 나타낸다.))
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포 배양 기재 상에, 추가로 젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질을 함유하는 것인 세포 배양 기재.
  7. 제6항에 있어서, 블록 중합체, 젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질, 접착 기질의 순서대로 적층되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 건조 세포 배양 기재인 세포 배양 기재.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 지지체 상에 적층된 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
  10. 제9항에 있어서, 평균 막 두께가 1000nm 이하인 세포 배양 기재.
  11. 제1항에 기재된 블록 중합체 상에,
    젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질을 함유하는 용액을 도포하는 공정과,
    추가로 제1항에 기재된 접착 기질을 함유하는 용액을 도포하여 세포 배양 기재로 하는 공정과,
    얻어진 세포 배양 기재를 건조시키는 공정을 갖는, 건조 세포 배양 기재의 제조 방법.
  12. 지지체와 제1항 또는 제2항에 기재된 세포 배양 기재를 갖는 세포 배양 기재(器材).
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