CN103649305A - 温敏细胞培养支持物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞培养支持物，其包含：基质和与温敏聚合共混物层，其中所述聚合共混物层包含至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂。本发明还涉及一种生产细胞培养复合物的方法，其包含：提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；固化基质上的所述聚合共混物层以提供细胞培养支持物；以及将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞还可任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物。

Description

温敏细胞培养支持物
相关申请
本申请要求于2011年4月8日提交的美国临时申请序列号61/473,318的优先权。
技术领域
本发明涉及细胞培养支持物和生产细胞培养支持物的方法。更具体地,本发明涉及温敏性聚合物细胞培养支持物，其易接受细胞附着和随后的快速细胞片脱离。这些支持物适用于，例如，生物医学应用中，如组织工程学。
发明背景
以前制备温敏细胞培养支持物的方法使用了两种主要途径，即电子束辐射或等离子体聚合，以共价接枝聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)链到组织培养聚苯乙烯板上。这些方法中所需的复杂程序和装置妨碍具有成本效益地采用这种技术用于具体的应用。此外，以前的方法一般需要使用来自其他个体或其他物种的添加的粘着蛋白以促进细胞附着，并且这种外源添加会在移植后引起细胞片产物的免疫原性反应。不采用温敏性聚合物(TRP)从细胞培养支持物脱离和收集细胞片的其他方法采用了蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)或机械搅拌，其导致了对细胞及其分泌细胞外基质(ECM)的损伤，因此负面影响其生物机能。
Nagase等人，如在J.R.Soc.Interface(2009)6，S293-S309中所公开的并且该内容以引用的方式全部并入本文，教导了使用电子束聚合技术的温敏微观结构表面允许，例如，大鼠原代肝细胞和牛动脉内皮细胞的选择性粘着和生长。美国公开第2010/0216242号公开了一种细胞培养支持物，其包括展示温敏性的聚合物层和通过用反应气体等离子处理其表面层部分所获得的细胞培养区，同时限制细胞粘着蛋白（如胶原）的添加。然而，广泛使用这些方法仍然是非常昂贵的。
Fujita等人，正如在Biotechnology and Bioengineering,Vol.103,No.2,June1,2009所公开的并且该内容以引用的方式全部并入本文，教导了制造细胞片-聚合物膜涉及温敏性聚合物，其中细胞附着到与层粘连蛋白和胶原IV混合的温敏聚-N-异丙基丙烯酰胺膜。如上所述，添加的粘着蛋白是不理想的，因为它们可引起有害的免疫原性反应。
在本领域中，需要没有这些各种缺点的细胞培养支持物和从其中培养和脱离细胞片的方法。此外，该方法应当是简单的并且具有成本效益的以使其在一般生物医学应用中经济可行。
发明内容
本发明提供一种简单和具有成本效益的途径以使用市售材料来产生温敏细胞培养支持物。这可有益地实现而无需使用昂贵的电子束辐射或等离子体聚合技术。另外，有利地，本方法不含添加的粘着蛋白而且还不含机械搅拌或酶促辅助脱离方法。本发明的细胞培养支持物使用一种包含温敏性聚合物和网构粘合促进剂的聚合共混物，其中网构粘合促进剂增强细胞在细胞培养支持物上的附着和生长。已经发现本发明的细胞培养支持物支持细胞附着和增殖以及快速细胞片脱离。
在一个实施方案中，本发明提供温敏细胞培养支持物，其可以通过旋涂随后热退火处理来容易地产生，得到的支持物允许细胞和和融合细胞片的加速脱离。可再次使用得到的支持物(如果需要)最多三次用于细胞附着/生长和脱离；可以通过定制共混物中的温敏性聚合物和网构粘合促进剂的比例来控制脱离时间。术语退火和固化在本文中可互换使用。
在一个或多个实施方案中，本发明提供一种细胞培养支持物，其包含：基质和与所述基质结合的聚合共混物层，其中所述聚合共混物层包含至少一个温敏性聚合物和至少一个网构粘合促进剂。
在一个或多个实施方案，本发明提供一种细胞培养复合物，其包含：基质聚合共混物层，其中聚合共混物层包含至少一个温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂；以及培养的细胞层，其中培养的细胞层是可快速脱离的。
在一个或多个实施方案中，本发明提供一种产生细胞培养支持物的方法，其包含：提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；以及固化基质上的所述聚合共混物层以提供细胞培养支持物。
在一个或多个实施方案中，本发明提供一种产生细胞培养复合物的方法，其包含：提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；固化基质上的聚合共混物层以提供一种细胞培养支持物；以及将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞还可任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物。
在一个或多个实施方案中，本发明提供一种制造细胞片的方法，其包括：提供基质；将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；将所述聚合共混物的薄膜涂覆到基质上以提供基质上的聚合共混物层；固化基质上的聚合共混物层以提供细胞培养支持物；将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞还可任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物；降低细胞培养复合物的温度到低于LCST以快速地脱离培养的细胞层；以及收集培养的细胞层以提供细胞片。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-13段中的任何一段，其中基质选自由聚合物材料、玻璃、陶瓷、金属、金属氧化物、水合金属氧化物，及其组合组成的组。
在一个或多个实施方案，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-14段中的任何一段，其中至少一种温敏性聚合物选自由聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)。聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)、聚(N-乙烯基己内酰胺)(PVCL)、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯)(PDMAEMA)和聚(环氧乙烷)(PEO)及其组合组成的组。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9–15段落中的任何一段，其中至少一种温敏性聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其由下式表示；
Figure BDA0000392299770000041
在一个或多个实施方案，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9–16段中的任何一段，其中至少一种网构粘合促进剂的特征在于具有官能氨基或羧酸基团。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9–17段中的任何一段，其中所述至少一个网构粘合促进剂是氨基硅烷。
在一个或多个实施方案，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9–18段中任何一段，其中至少一个网构粘合促进剂选自由3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷(APDEMS)和3-氨基丙基甲氧基硅烷(APTMS)、及其组合组成的组。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9–19段中的任何一段，其中所述至少一个网构粘合促进剂是3-氨基丙基甲氧基硅烷(APTES)，其由下式表示：
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物复合物或方法，如在9-20段中的任何一段，其中聚合共混物的特征在于具有从约90:10至约40:60的温敏性聚合物和网构粘合促进剂比(TRP：NFAP)。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-21段中的任何一段，其中培养的细胞层包含特征还在于为锚定依赖性细胞的细胞。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-22段中的任何一段，其中培养的细胞层包含特征还在于为粘着细胞的细胞。
在一个或多个实施方案，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-23段中的任何一段，其中培养的细胞层包含细胞，该细胞选自由成纤维细胞、成肌细胞、肌管细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、表皮细胞、粘膜上皮细胞、间充质干细胞、ES细胞、iPS细胞、成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞、毛根细胞、牙髓干细胞、β-细胞、肝细胞、及其组合组成的组。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-24段中的任何一段，其中培养的细胞层包含细胞和培养基。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9–25段中的任何一段，其中所述聚合共混物的薄膜被旋转涂布在基质上。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-26段中的任何一段，其中所述聚合共聚物层基本上不含黏着蛋白。
在一个或多个实施方案中，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-27段中的任何一段，其中所述聚合共聚物层基本上不含等离子体或电子束处理。
在一个或多个实施方案，本发明提供了支持物、复合物、或方法，如在9-28段中的任何一段，其中培养的细胞层的脱离基本上不含蛋白水解酶或机械搅拌。
附图简述
图1a示出了细胞培养支持物的实例。
图1b示出了细胞培养复合物的实例。
图2a示意性地表示将APTES分子/pNIPAAm链的聚合共混物施用到基质上。
图2b示意性地表示图2a的聚合共混物的热退火以交联APTES网/pNIPAAm链并且在表面暴露-NH2基团（来自APTES）以促进随后的细胞粘着。
图2c示意性地表示细胞附着和生长。
图2d示意性地表示在温度降低到LCST以下时在APTES网中的含水pNIPAAm链；扩展链因此“掩埋”允许快速细胞脱离的-NH2基团。
图3a-c包括光学显微镜(OM)相位衬比图象，其显示细胞分离的行为。
图4示出了具有各种pNIPAAm/APTES比的表面的不同细胞脱离时间。
具体实施方案
本发明的实施方案是基于对包含聚合共混物层的细胞培养支持物的发现，该聚合共混物层包括温敏性聚合物(TRP)，以及网构粘合促进剂，其分子可以使用任何类型的退火/固化工艺形成交联网络。聚合共混物层设置在适宜的基质上，并且基质和聚合共混物可提供为具体产物，用于培养和收集细胞。有利的是，某些实施方案的细胞培养支持物为增强的细胞附着(以产生在本文中所称的“细胞片”)和随后的快速细胞片脱离提供了帮助，即使细胞培养支持物基本上不含之前采用的蛋白质和酶以分别促进细胞生长和收集。已经发现本发明的实施在生物医学应用，如组织工程学中特别有用，但是还可以考虑，本发明的实施可以扩展到其他应用，其中细胞培养支持物是理想的，如在基于细胞的制药研究和临床药物治疗中。
参考图1a，细胞培养支持物根据本发明示出并标识为数字10。细胞培养支持物10包括基质12和聚合共混物层14。通过形成适当的共价键将聚合共混物层14化学地结合到基质上。例如，当有机硅烷，例如氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，被用作网构粘合促进剂时，通过形成硅氧烷键将该有机硅烷结合到含有羟基的基质。由于APTES分子也通过退火形成网，温敏性聚合物的聚合物链可以被锁定到网中，从而保持温敏性聚合物以及基质上的共价结合的网构粘合促进剂。
该基质12可以任何有用的形式提供，其包括（但不限于）薄膜、片、膜、滤网、非织造或织造纤维、中空或实心珠、瓶、板、管、杆、圆管、或晶片。该基质可以是多孔或无孔的、刚性的或柔性的、透明或不透明的、无色或有色的和反射性或非反射性的。合适的基质材料选自由聚合物材料、玻璃、陶瓷、金属、金属氧化物、水合金属氧化物，及其组合组成的组。
合适的玻璃和陶瓷基质材料包括，例如，钠、硅、铝、铅、硼、磷、锆、镁、钙、砷、镓、钛、铜、及其组合。玻璃典型地包括各种类型的含硅酸盐材料。
在一个或多个实施方案中，可市售的载玻片(Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)或P(100)测试类型硅晶片(Silicon Quest International，Santa Clara，CA)可用于实施本发明。在本文中，硅晶片（Silicon wafer）也可称为硅晶片（Si-wafer）。
在本发明的一个或多个实施方案中，根据具体应用的要求，基质可以被定制为任何合适的尺寸和形状。例如，基质尺寸可以被定制到所需最终细胞片尺寸。通常，出于描述本文中实例的目的，载玻片和硅晶片被切割成表面积约1cm2的正方形；然而，考虑的基质尺寸可以几乎为任何尺寸，并且通常范围从约0.01至100cm2。
改性该基质，如果需要的话，以在其表面提供官能团,其适合共价结合到网构粘合促进剂和/或聚合共混物层14的温敏性聚合物，。在本发明的特定实施方案的实施中，所用基质含有羟基(-OH)，以允许APTES分子共价结合到基质上。含有氨基（-NH2）或羧酸（-COOH）基团的基质也是可行的。
再次参考图1a中，本发明的细胞培养支持物10由基底12和聚合共混物层14构成。聚合共混物层14包含至少一种温敏性聚合物(TRP)和至少一种网构粘合促进剂。TRP是理想的，因为通过简单的温度变化可以收集TRP上形成的细胞片(即，容易从细胞培养支持物脱离)，该温度由于聚合物链从疏水到亲水性质的变化而引起细胞片的自发脱离。TRP能够响应温度的变化，并可分为两大类：具有下临界溶液温度(LCST)的TRP和具有上临界溶液温度(UCST)的TRP。
如将在本文中更详细地描述的，TRP对温度变化的反应被有利地用于安全地收集细胞培养支持物10的聚合共混物层上生长的细胞片。在TRP的疏水状态下，因为暴露的网构粘合促进剂，细胞支持物一般会变得更有利于细胞附着和生长。相比于使用蛋白酶(例如胰蛋白酶)或机械搅拌收集细胞片，使用TRP收集汇合融合细胞片最小化对细胞及其分泌细胞外基质(ECM)的损伤，从而保持其生物学功能。根据本发明的基于收集的细胞片的组织工程学产物允许提高的细胞-细胞相互作用，并且去除免疫原性材料存在于支架中的风险，组织工程学中所使用的天然或合成生物材料模拟ECM作为3D细胞培养环境。此外，从TRP收集的细胞片可以构图和装配在一起以模仿天然组织的微体系结构，其是官能组织再生的关键。
该温敏性聚合物不特别限制于本文中，各种公知的聚合物或共聚物可用作温敏性聚合物。这些聚合物可以按需交联，但是仅到不会失去温敏特性的程度。在一个或多个实施方案中，选择TRP以具有大于其缠结长度的分子链长度。
在一些实施方案中，TRP可以选自几乎任何TRP，这些TPR在升高的温度下变成疏水的并且发生链塌陷，该升高的温度一般高于室温并且优选地接近用于生长所需的细胞的培养温度，并且随后在降低的温度下变成亲水的，该降低的温度一般低于升高的温度。在一个或多个实施方案中，升高的温度优选地高于室温。在一个或多个实施方案中，所述降低的温度优选地接近或低于室温。通常认为室温或环境温度在约18℃至约25℃的范围中，更通常地为20℃至23℃。在一个或多个实施方案中，降低的温度约为室温。
在一个或多个各种实施方案中，温敏性聚合物包括各种聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺衍生物及其共聚物。
在一个或多个实施方案中，本发明的温敏性聚合物选自由聚-N-异丙基丙烯酰胺(LCST＝32℃)、聚-N-正丙基丙烯酰胺(LCST＝21℃)、聚-N-正丙基甲基丙烯酰胺(LCST＝32℃)、聚-N-乙氧基乙基丙烯酰胺(LCST＝约35℃)。聚-N-四氢化糠基丙烯酰胺(LCST＝28℃)，聚-N-四氢化糠基甲基丙烯酰胺(LCST＝35℃)、聚-N,N-二乙基丙烯酰胺(LCST＝32℃)、聚(C-异丙基丙烯酰胺)(LCST＝32℃)及其组合(临界温度提供于括号中)组成的组。
在一个或多个其他实施方案中，本发明的温敏性聚合物选自由聚-N-乙基丙烯酰胺、聚-N-异丙基甲基丙烯酰胺、聚-N-环丙基丙烯酰胺、聚-N-环丙基甲基丙烯酰胺、聚-N-丙烯酰基吡咯烷。聚-N-丙烯酰基哌啶；聚甲基乙烯基醚；烷基取代的纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素和羟丙基纤维素；聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物代表的聚氧化烯嵌段共聚物；及其混合物组成的组。
在本发明的一个或多个实施方案中，有温敏特性的合适的聚合物选自由聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)、聚(N-乙烯基己内酰胺)(PVCL)、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯)(PDMAEMA)、聚(环氧乙烷)(PEO)及其组合组成的组。聚(N-异丙基丙烯酰胺)（一种常用的TRP，其呈现引人注目的下临界溶液温度(LCST)）在本文中也可以可互换地称为聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、PNIPAAm、pNIPA、pNIPAA、pNIPAm或pNIPAAm。
PNIPAAm可由下式表示。
Figure BDA0000392299770000101
同时具有疏水和亲水基团，其中pNIPAAm链取决于温度而塌陷（失去氢键与亲水基团的H2O）或延长（形成氢键与亲水基团的H2O）。
在本发明的一个或多个实施方案中，pNIPAAm(Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)用作温敏性聚合物。pNIPAAm在生物工程应用中特别引人关注，这是因为发生在生理相关温度范围内的相位变化。其在水中具有32℃的下临界溶液温度(LCST)。聚合物链处于高于LCST的塌陷疏水状态和低于LCST的扩展亲水状态。
聚合共混物层14还包括网构粘合促进剂，其分子可形成交联网络以在TRP链中锁定。该网形成应该使用一种简单的途径（例如在不会改变TRP性能的温度下进行热退火）来实现。通过互锁TRP链到网中，去除使用设施集约途径（例如电子束或等离子体）对TRP所造成的化学接枝。此外，这些分子的粘合促进特性将增强细胞附着和生长，避免了使用粘着蛋白的污染问题。本发明的网构粘合促进剂是非蛋白质的粘合促进剂。
在一个或多个实施方案中，本发明的网构粘合促进剂结合或附着到基质。不受理论的束缚，网构粘合促进剂到基质的附着是通过共价键、氢键合、或其他相互作用完成的，包括但不限于范德华力，并且也可提供本领域已知的其他附着/结合手段。网构粘合促进剂也可用来缠结或互锁TRP链，并且网构粘合促进剂提供用于随后的细胞附着的突出末端基团。
在一个或多个实施方案中，网构粘合促进剂的特征可在于具有官能氨基或羧酸基团。实例包括但不限于氨基硅烷与伯胺或仲胺官能团。
在一个或多个实施方案中，合适的网构粘合促进剂选自由3-氨基丙基乙氧基硅烷(APTES)、3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷(APDEMS)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、3-氨基丙基三(甲氧基乙氧基乙氧基)硅烷(APTMEES)、4-氨基丁基三乙氧基硅烷(ABTES)、N-(2-氨基乙基)-3-氨基异丁基甲基二甲氧基硅烷(AEAIBMDMS)、N-(2-氨基乙基)-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMDMS)、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三羟基硅烷(AEAPS)、(氨基乙基氨基甲基)苯乙基三甲氧基硅烷(AEAMPTMS)、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(AEAPTES)、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPTMS)、N-(6-氨基己基)氨基甲基三甲氧基硅烷(AHAMTMS)、N-(6-氨基己基)氨丙基三甲氧基硅烷(AHAPTMS)、N-(2-氨基乙基)-11-氨基十一烷基三甲氧基硅烷(AEAUDTMS)、3-(间氨基苯氧基)丙基三甲氧基硅烷(APPTMS)、间氨基苯基三甲氧基硅烷(mAPTMS)、对氨基苯基三甲氧基硅烷(pAPTMS)，氨基苯基三甲氧基硅烷(APTMS)、N-[氨基(聚亚丙基氧基)]氨基丙基三甲氧基硅烷(APEAPTMS)，11-氨基十一烷基三乙氧基硅烷(AUDTS)及其组合组成的组。网构粘合促进剂也可选自由羧乙基三羟基硅烷（carboxyethlsilanetriol），2(甲氧羰基)乙基三氯硅烷、和2-(甲氧羰基)甲基乙基二氯硅烷及其组合的组。在本发明中所使用的网构粘合促进剂一般包括至少两个头基和氨基或羧酸官能端基。
在一个或多个实施方案中，网构粘合促进剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)。APTES也同义地称为3-三乙氧基甲硅烷基丙胺。APTES可以用下式表示：
Figure BDA0000392299770000121
在一个或多个实施方案中，本发明有利地不含蛋白质粘合促进剂，其一般是更复杂的聚合物且不会形成所需网以捕获TRP链。如现有技术中所教导的蛋白质涂覆在TRP层的的顶部上，且大部分物理地吸收到层中，因此它们最有可能从TRP层脱离并且在收集期间用细胞/细胞片保持。因此，这些蛋白质粘合剂将成为不需要的外源材料，其在得到的细胞片中引起污染问题。不同的是，本发明中所使用的网构粘合促进剂将形成网，并且被化学地固定到下面的基质。不需要的蛋白质的实例，其中本发明有利地不含该不需要的蛋白质，除了RGD肽、RGDS肽、GRGD肽和GRGDS肽外，还包括胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖(透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角蛋白等)、纤连蛋白、层粘连蛋白、含水粘连蛋白、明胶等。
在本发明的一个或多个实施方案中，聚合共混物层14中的温敏性聚合物与网构粘合促进剂的比为从约99:1至约40:60，在其他实施方案中，从约95:5至约75:25，在其他实施方案中，从约95:5至约85:15，在另外其他实施方案中，从约88:12至约92:8，并且在此外其他实施方案中约89:11-约91:9。在特定实施方案中，温敏性聚合物与网构粘合促进剂的比为90:10。在一个或多个实施方案中，包含TRP和网构粘合促进剂的聚合共混物中的TRP的百分比（其中TRP和网构粘合促进剂的总数构成100重量％(wt％)）为至少为75重量％。在其它实施方案中至少80%，在其它实施方案中至少85%，在其它实施方案中至少86%，在其它实施方案至少87%，在其它实施方案中为至少88%，在其它实施方案至少89%，并且在另外其他实施方案中至少90%。在一个或多个实施方案中，聚合共混物层14中的TRP的百分比（其中TRP和网构粘合促进剂的总数为100%）最多为99重量%，在其它实施方案中最多98%，在其它实施方案中最多95%，在其它实施方案中最多94%，在其它实施方案中最多93%，在其它实施方案中最多92%，在其它实施方案最多91%，并且在另外其他实施方案中最多90%。
在采用pNIPAAm作为TRP并且采用APTES作为网构粘合促进剂的特定实施方案中，上述比如下。在特定实施方案中，聚合共混物层14为pNIPPAAm和APTES的混合物，pNIPPAAm：APTES的比从40:60至90:10。
对于基于二氧化硅的基质(例如玻璃、硅晶片)，将首先适当地清洁该基质。这可以通过应用新制备的piranha溶液(即，70/30(v/v)浓硫酸/30%工业级过氧化氢)30–60分钟，然后用去离子水彻底漂洗，并且然后使用UV/臭氧或等离子体(氧气或空气)中的任一者氧化5–10分钟，以产生所需表面上的-OH基团来实现。将去除有机污染物的其他清洁方法也是可行的。将依次使用水不混溶有机溶剂(例如，甲苯、己烷)、然后用水混溶性有机溶剂(例如，丙酮、乙醇)、并且最后用水超声处理每一个金属基质5-10分钟，以除去杂质。然后也可使用UV/臭氧或等离子体(氧气或空气)中的任一者氧化它们5–10分钟以产生例如–OH基团。也考虑到了除了–OH基团之外提供将聚合共混物结合到基质上的其它键，包括但不限于例如酯键。在一个或多个实施方案中，聚合物基质可以用合适的溶剂洗涤，并进行超声处理，然后经由溶胶-凝胶方法涂布基于二氧化硅薄层的材料，来提供可以改性的二氧化硅表面以提供–OH基团。在这些实施方案中，促进硅氧烷键合，由此头基被水解，并转化为-OH基团，提供稳定键合到基质上。
在一个或多个实施方案中，通过首先形成TRP和网构粘合促进剂的聚合共混物，并且然后旋涂、浸涂和散布该共混物来将聚合共混物层涂覆到基质上。可以定制溶液的浓度以实现不同的膜厚度。在一个或多个实施方案中，共混溶液可以包含约0.5至约10重量％的总溶质；在其它实施方案中从约1至约5重量％的总溶质；并且在另一实施方案中从约2至5重量％的总溶质。在另一实施方案中，溶质的浓度为约3重量％。在一个或多个实施方案中，旋涂聚合共混物以形成基质12上的聚合共混物层14。除了旋涂（包括浸涂和刮涂）外，也可以使用如本领域所知的其它技术。
聚合共混物层的厚度可以是可变的而且对于细胞培养支持物的成功而言并不是重要的参数。额外厚度的区域不是有害的，并且将在制备过程中被简单地洗掉。在一个或多个实施方案中，聚合物层的厚度为从约15纳米至约500纳米，在其它实施方案中从约30纳米至约400纳米，并且在另外其它实施方案中从约100纳米到约200纳米。一般来讲，聚合物层的厚度大于最薄层(例如，8-10纳米)，这可以通过旋涂所关注的聚合物溶液来产生。在一个或多个实施方案种，聚合共混物层的厚度为至少15纳米，在其它实施例中至少18纳米，在另外其他实施方案中至少25纳米，并且在此外其它实施方案中至少30纳米。
在一个或多个实施方案中，在将图1a的聚合共混物涂覆到基质12，并且由此形成聚合共混物层14后，聚合共混物层14进行热退火，以允许网的形成和聚合共混物层14固定到基质上。尽管热退火是最简单的途径以获得所需的粘合/网形成，但是也可应用其它方法，如UV辐射。退火用于将粘合网构粘合促进剂粘合到基质并且形成网，以将温敏性聚合物的链锁定在网内，紧密地向基质12保持聚合共混物层14。本领域的技术人员将容易地选择合适的退火温度和时间用于给定的聚合共混物层14和基质12。取决于特定聚合共混物类型和比例，退火的条件（温度，时间）可变化，但是在约24小时至约72小时的时间中通常范围从约80℃至约210℃或更高。在一个或多个实施方案中，聚合共混物在从约115℃至约205℃的温度下退火约24小时至约72小的时间。在另一个实施方案中，聚合共混物在约160℃下退火约48小时。
在采用pNIPAAm和APTES的特定实施方案中，APTES通过加热来固化，从而引起形成硅氧烷键。形成网时，pNIPAAm链在APTES网中互锁。
在退火聚合共混物层14的步骤后，将基质12和退火的聚合共混物层14置于细胞培养盘中，并且使温度升高高于温敏性聚合物的LCST。这将使温敏性聚合物链塌陷，从而暴露网构粘合促进剂的细胞附着官能团(例如，氨基)。细胞附着官能团的暴露促进了随后的细胞附着和细胞片的生长，并且这种暴露可通过降低温度来逆转以允许细胞片的快速脱离。这将在后文中更详细地公开。
在采用pNIPAAm和APTES的特定实施方案中，当pNIPAAm链在高于其LCST的温度下塌陷时，驻留在pNIPAAm/APTES网的表面的APTES分子的氨基暴露于周围环境。暴露的氨基促进细胞附着和增殖。
如图1a所示，本发明的细胞培养支持物10可用于培养锚定依赖性细胞。在一个或多个实施方案中，如图1b所示，培养的细胞生长到细胞片中以提供具有培养的细胞片16的细胞培养复合物20，该培养的细胞片16可以随后通过温度引起的(即，降低温度)脱离从细胞培养支持物收集。有利地，脱离快速地发生。本发明的一个优点是细胞培养支持物10可以被构图并组装在一起，以模拟天然组织的微体系结构，其是官能组织再生的关键。因此，培养的细胞层16可以具有各种应用所需要的任何尺寸和形状。将在细胞培养复合物20中培养的细胞在本文中并无特别限制，只要它们是锚定依赖性细胞。
如在本文所使用的“锚定依赖性细胞”应被理解为仅当附着于表面时生长、存活或保持功能的细胞。
锚定依赖性细胞（或者涉及作为粘着细胞）的实例选自由成纤维细胞、成肌细胞、肌管细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、表皮细胞、粘膜细胞、上皮细胞、间充质干细胞、ES细胞、iPS细胞、成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞、毛根细胞、牙髓干细胞、β-细胞、肝细胞、及其组合组成的组。在本文描述中，术语“细胞”不仅是指单个细胞，也包括从身体组织收集的细胞构成组织。
当考虑在再生医学中的人等中使用这些细胞时，优选地，将使用自体细胞。可以使用异种动物源的细胞，只要它们提供可接受的免疫相容性，并且在同种异体细胞中，可以使用异源或自体细胞中的任一种。
在本发明的一个或多个实施方案中，使用了人类充质干细胞(hMSCs)(Lonza，Walkersville，MD)。基于本发明的细胞片的组织工程学产物允许提高的细胞-细胞相互作用的风险，并且去除免疫原性材料存在于支架中的风险。
在产生细胞培养支持物10和暴露网构粘合促进剂的细胞附着功能后，细胞沉积在固化的聚合共混物层14上并且允许生长。在一个或多个实施方案中，正如本领域已知的，生长可发生在恒温箱中和/或在营养溶液中。通过根据标准技术规范在热(即高于LCST)培养基中培养，并且然后接种到有暴露的细胞附着官能团的聚合共混物层14上来培养细胞。在接种后，细胞在37℃(>LCST)下在恒温箱中生长至融合以形成培养的细胞片16并且提供细胞培养复合物20。
培养条件（温度，时间）取决于将培养的具体细胞，但是在约6小时至约30天的时间中通常范围从约33℃至约38℃。有利地，本发明使用简单的技术，并且不含使用刷子或蛋白的技术。
随后，当细胞生长至融合并且形成细胞片16时，降低细胞培养复合物20的温度（并且特别是聚合共混物层的温敏性聚合物的温度）至低于温敏性聚合物的LCST，使温敏性聚合物的链膨胀并且覆盖网构粘合促进剂的附着基团，从而防止细胞片16和网构粘合促进剂之间的相互作用，并且允许细胞片16的快速和容易的脱离。
不旨在受到具体理论的限制，图2a、b、c和d中示出特定实施方案，其涉及细胞培养支持物110，该细胞培养支持物110具有玻璃基质112和pNIPAAm(TRP)和APTES(网构粘合促进剂)的聚合混合物层114。在图2a中，聚合物共混物114被涂覆到基质112，其还包括基质官能团118，其可以是–OH基团。
在图2b中，在聚合共混物的热退火后，聚合共混物官能团122在表面处是明显的。在通过固化形成硅氧烷键时，互渗透的pNIPAAm链锁定在APTES网中，并且在T>LCST时，pNIPAAm链塌陷以暴露APTES的-NH2基团，从而促进细胞附着。
图2c中，电池116被应用和连接到细胞培养复合物120的聚合共混物官能团122。在细胞脱离和生长（至融合）后，降低温度至T<LCST导致pNIPAAm链扩展，并且掩埋APTES的-NH2基团，从而允许细胞片116脱离，如图2d所示。
降低细胞培养基的温度，或代之以新鲜冷却基、水合pNIPAAm链并且改变其形态至扩展形式。这个阶段改变用于掩埋APTES表面氨基并且将细胞片从表面上分离，从而允许细胞的融合片的脱离。此外，操纵混入pNIPAAm/APTES膜的APTES的量将控制细胞片脱离速率，这可能在未来的组织工程学应用中起重要作用。
可以定制本发明的温敏性聚合物/网构粘合促进剂共混物（或者更简单地称为聚合共混物）以提供最佳的细胞附着和随后用于收集的快速脱离。不受理论的束缚，细胞脱离有可能是由掩埋APTES的NH2基团的pNIPAAm链的扩展引起的，从而覆盖细胞附着所需的锚点。增加pNIPAAm/APTES共混物中的APTES的量导致细胞附着的锚点的量增加；但是，这导致冷却时较慢的细胞脱离。对于实际用途，小于10分钟的脱离时间是理想的。
再次参考图1a，细胞培养支持物10由基质12和聚合共混物层14组成。小心制备基质用以防止污染物，这对于细胞的成功培养是重要的。首先制备基质12以除去有机污染物。这可以通过将基质（如非限定性实例载玻片或硅晶片）浸泡在包含70体积%H2SO4和30体积%H2O2的溶液中或如现有技术中已知的其他合适的溶液中完成。将衬底随后用去离子水漂洗，并用氮气干燥，接着在UV/臭氧清洁剂清洗十分钟。
在本发明的一个或多个实施方案中，聚合共混物层14可以根据如下方式制备。单独地，制备乙醇中3重量%的pNIPAAm溶液和乙醇中10重量%的APTES溶液。然后将溶液以pNIPAAm：APTES的不同的比混合。在一个或多个实施方案中，混合的溶液可以包含约3重量％的总溶质。例如，使用PTFE膜过滤溶液以除去颗粒物。通过旋涂或其它薄膜技术（如前面所述和本领域已知的）在所制备的基质上生产聚合共混物膜。在本发明的一个或多个实施方案中，温敏性聚合物/网构粘合促进剂共混物的薄膜以2000rpm旋涂到基质上约30秒钟，以形成聚合共混物层14。聚物共混物层的厚度的范围通常从约200纳米至约400纳米。然后细胞培养支持物10被固化或退火，如上所述。在一个或多个实施方案中，在范围从约115℃至约205℃的温度下将细胞培养支持物固化在真空中约一至三天以进行聚合共混物网的热退火。固化后，根据本发明的细胞培养支持物可有利地存储和/或运输，供以后使用。
如图1b所示，细胞培养复合物20由基质12、固化的聚合共混物层14和培养的细胞层16构成。在一个或多个本发明实施方案，细胞沉积到固化的细胞培养支持物上。在一个或多个实施方案中，培养的细胞层16包括培养基，该培养基专用于根据应用和用途而选择的用于培养的特定细胞。在沉积到细胞培养支持物上后，使细胞生长至融合以形成培养的细胞层16（其也被称为细胞片）以提供细胞培养复合物20。
根据本发明的至少一个实施方案，在使细胞生长至融合以形成培养的细胞层16后，细胞片可以从细胞培养复合物20迅速地脱离以用于各种应用。本发明的细胞培养复合物有利地实现脱离，而不需要使用机械搅拌或酶促蛋白水解手段以协助脱离。在一个或多个实施方案中，通过用新鲜冷却基替代热细胞培养基来诱发培养的细胞层16的脱离，其中温度为约4℃。冷却基用于降低细胞培养复合物20的温度低于LCST以提供几分钟内的培养的细胞层16的脱离。可替代地，在缺少培养基的情况下，降低细胞培养复合物的温度低于LCST的其它手段包括冷却、浸泡在冷水中，或从热地区移至室温，以及本领域已知的其它技术。
在本发明的一个或多个实施方案中，可重复使用本发明的细胞培养支持物。通过多次(通常支持物可使用两到三次)使用支持物，进一步实现本发明的经济优点。
为了证明本发明的实施，已制备并测试了下述实施例。然而，实施例不应当被视作限制本发明的范围。权利要求书将用来界定本发明。
实例1
材料。
pNIPAAm（分子量为20-25kg/mol）和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO，USA)。载玻片和P(100)测试类型硅晶片购自Fisher Scientific(Waltham，MA，USA)和Silicon Quest International(SantaClara，CA)。所有其它化学试剂均购自Sigma Aldrich，除非另外指出。
玻璃和硅晶片(硅晶片)基质的制备。
载玻片和硅晶片被切割成表面积约为1cm2的正方形。载玻片和晶圆在100℃下浸泡在新制备的piranha溶液(70体积%浓H2SO4和30体积%H2O2)1小时以去除有机污染物。倾析piranha溶液后，用去离子水(DI)水彻底洗涤载玻片，并且用氮气(N2)气体干燥。之后，载玻片和/或晶圆在UV/臭氧清洁器(Jelight Company Inc，Irvine，CA)中氧化10分钟用于进一步清洁。
pNIPAAm/APTES溶液的制备。
3%重量pNIPAAm溶液和10%重量。分别制备乙醇(Pharmco-AAPER，Inc.，Shelbyville，KT)中的APTES溶液。pNIPAAm与APTES的比(按质量计)为90:10、80:20、60:40和40:60的溶液是通过混合适当比例的上述两种溶液和少量乙醇以制备最终含有3重量％的总溶质的溶液来制备的。然后，通过有0.45μm PTFE膜的
Figure BDA0000392299770000201
CR13mm注射器滤器(Pall Life Sciences,Co，Ann Arbor，MI)，将溶液过滤以去除微粒。
pNIPAAm/APTES膜的制备。
通过以2000rpm(p-6000旋转涂布器(Specialty Coating Systems，Inc，Indianapolis，IN)旋涂pNIPAAm/APTES混合的溶液到预先清洁的基质上30秒来生产聚合共混物膜。在以下温度下：115℃、145℃、160℃、175℃和205℃，该旋涂的样品固化在真空(<100毫托)烘箱中(VWR International，Radnor，PA)3天。
pNIPAAm/APTES薄膜的水接触角。
使用固着液滴法来测量pNIPAAm/APTES膜上的静态水接触角。使用有改性阶段的接触角测角器(Ramé-Hart Instrument Co，Netcong，NJ)记录接触角，将其加热至45℃，并且然后置于培养皿中。在加热阶段放置该样品，并且将一滴去离子水放在样品上。通过在培养皿中加入冷却水，该阶段的温度持续下降至～25℃。随着温度下降，使用金刚石VC500一触式视频获取系统(Diamond Multimedia，Chatsworth，CA)记录样品上的DI水的停滴图像，同时人工地记录相关联的经过时间。从视频剪辑中提取出静止图像并且使用ImageJ软件(National Institutes of Health，Bethesda，MD)测量接触角。
pNIPAAm/APTES膜的厚度。
手动光电偏振光椭圆率测量仪(Rudolph Instruments，Inc.，Fairfield，NJ)用来以632nm的波长测量硅晶片上的不同pNIPAAm/APTES膜的厚度。pNIPAAm的1.48的折射率用于混合膜的厚度计算，其可能具有相比于纯pNIPAAm膜稍微不同的折射率。对由不同pNIPAAm/APTES比制造的和/或在不同温度下固化的膜采用厚度测量。在浸泡在冷的去离子水(在测量前通过氮气气流来干燥浸泡的样品)后测量样品。测量每一个样品和在相同条件下处理的多个样品(n＝3)的两种厚度测量值，以提供统计值。
pNIPAAm/APTES膜的漫反射红外傅立叶变换(漂移)。
从旋涂在硅晶片上的并且在相同条件下如载玻片上的膜一样固化的膜得到漂移光谱。少量样品（～6毫米×6毫米的大小）在确保红外光束正确地聚焦在样品上后，放在样品托架的中心。较小的半球形圆顶(底部直径约2厘米)覆盖样品。通过紧固螺钉来固定圆顶后，允许氩(Ar)气体流入圆顶约5分钟以替代内部空气并且最小化水含量。然后，使用2cm-1分辨率的NicoletMagna560（其使用室温下的Harrick Praying Mantis漫反射附件）来记录单个光束光谱。通过Abs得到吸光度。=-log(I/Io),其中I和Io分别为样品和氧化硅晶片（即，参考）的归一化强度.通过根据光谱的最大强度以特定波长划分强度来实现归一化。得到的所有光谱的最大强度范围从1.60至1.79，这取决于如何将红外光束聚焦在样品表面上。该归一化应用于最小化红外光束的变化，其用于扫描在不同扫描条件下的并且由不同操作员操作的样本。
细胞附着。
在含血清的MSCBM培养基(Lonza)中培养人类充质干细胞(hMSCs)(Lonza，Walkersville，MD)，根据制造商的生产规范辅以MSCGMSingleQuots(Lonza)。为了观察细胞脱离，将hMSCs(三代)接种到不同的基质：清洁的玻璃基质，pNIPAAm膜，在160℃下固化的90:10pNIPAAm/APTES膜，和密度为1.5x104细胞/cm2的聚苯乙烯(TCPS)组织培养皿。在每一个表面上使用Axiovert40CFL(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)装备有AxioCam照相机MRm显微镜(Carl Zeiss，Inc.)进行细胞接种4小时后拍摄相差照片。进行MTT细胞增殖试验(Invitrogen，Carlsbad，CA)以比较不同基质上的细胞的增殖潜力。使用Synergy H1混合微板读数仪(BioTek，Winooski，VT)以570nm的波长测量MTT溶液吸光度。对于每一组，测试了3个样品。
细胞片脱离。
在细胞生长至融合并且在pNIPAAm/APTES膜上形成细胞片后，通过用新鲜冷却基(4℃)替代热细胞培养基老诱发脱离。生长在皿中的细胞被用于比较。Observer Z1延时显微镜(Carl Zeiss，Inc.)被用于监视并且记录细胞脱离行为。通过AxioVision(Carl Zeiss，Inc.)软件控制的AxioCamMRm照相机(Carl Zeiss，Inc)每10秒拍摄细胞图像，直到细胞片完全脱离。
pNIPAAm/APTES共混物膜支持细胞附着和增殖。
将hMSC接种到不同的基质上，并且在相差显微镜下观察。在接种4小时后，在玻璃表面观察到低hMSC脱离。hMSC在160℃下固化3天的单一pNIPAAm膜上展现了圆形形态和不良附着。大多数的hMSC附着并且铺展在90:10pNIPAAm/APTES膜上，还在160℃下固化3天，且在TCPS皿上。用MTT实验测量细胞增殖。对于pNIPAAm/APTES膜上的hMSC和阳性控制(TCPS上培养皿上的hMSC)，5天后吸光度有了显著增加。pNIPAAm/APTES膜上的hMSC的增殖可与接种5天后的TCPS皿上的增殖进行对比。对于单一pNIPAAm膜观察到了吸光度中的浸渍，其可能是由第4日进行的培养基变化而引起的。单一pNIPAAm膜在培养基变化期间并非紧密结合到下衬底，且可以很容易地清洗掉。
pNIPAAm/APTES膜的一般性质。
制备的溶液都是透明的，表明pNIPAAm/APTES混合物在乙醇中的完全溶解。旋涂在硅晶片上的膜看起来在整个样品上具有均匀的颜色，除了在边缘处，其中会导致稍微更厚的膜。在固化之前和之后，每一个样品有轻微的颜色变化，主要是从紫色/金色变化成大部分为金色。在～115℃和145℃下固化的膜当在室温(～25°℃<LCST)下浸渍到去离子水浴中时看起来完全溶解掉。在较高温度(160℃至205℃)下固化的膜发生颜色变化，但仍保留在基质上。
参考表1，该椭圆偏振测量示出当在室温下浸渍到去离子水中时，厚度为约200-250nm的层从在160℃和更高温度下固化的约300–350nmpNIPAAm/APTES膜去除。还测量在室温下浸渍在细胞培养基后的膜的厚度，并且发现与浸渍在DI水后相比，没有显著不同。膜的重复浸渍不能进一步降低膜厚度。在室温水中的长时间(例如，3天)浸泡示出厚度的最小降低(约4%；数据未显示)。在145℃和以下的温度下固化的膜示出在浸渍后只有非常薄的层(<10纳米)仍保留。
表1：在不同的条件下制备的pNIPAAm/APTES膜的膜厚度和在室温下浸渍在DI水之前和之后的固化的膜的膜厚度。
对于纯pNIPAAm和pNIPAAm/APTES共混膜，观察到了pNIPAAm的红外光谱识别峰(N-H在约3300cm-1、C＝O在约1640cm-1，而对于双峰–HC(CH3)2在大约1390和约1360cm-1)。对于共混膜，很难区分游离APTES分子的峰(–OH在≡Si-OH中拉伸在3050–3700cm-1,2880–2980cm-1用于–CH2拉伸，1475cm-1用于–CH2剪切)，因为它们与pNIPAAm的-NH和-CH2的峰重叠。观察与交联APTES分子相关联的峰（≡Si-O-Si≡在1050–1150cm-1拉伸）对于在160℃或更高的温度下固化三天的膜，但是峰强度相对较弱。对于高温固化的膜，还在3442cm-1处观察到非氢键键合的N-H拉伸。在浸渍冷却DI水中后，所有峰强度下降，同时与pNIPAAm相关联的识别峰仍然明显。
水接触角证实pNIPAAm/APTES膜是温敏的。随着温度降低，水接触角也降低，从约70℃的角(于约40℃的温度下)降低至约30°(于约26℃的温度下)。一般而言，接触角变化快速地出现在31-34℃的温度范围中（对于在160℃或更高温度下固化3天的pNIPAAm/APTES膜）。
pNIPAAm-APTES膜上的细胞脱离。
在pNIPAAm/APTES膜上培养hMSC以评价个体细胞和由温度变化引起的细胞片脱离。在80%融合时，通过用新鲜冷却基(4℃)替代细胞培养基来实现细胞脱离。细胞脱离行为示于图3a-c。大多数细胞随着他们失去他们的锚点返回到圆形形态，同时已形成ECM连接的少数细胞仍如图3c所示结合在一起。在添加冷却基后(参见补充数据段中的视频剪辑)之后，所有细胞在2.5分钟内脱离。在相同条件下，需要花费约3小时以使细胞从商业温敏细胞培养表面(
Figure BDA0000392299770000251
)完全脱离。
以与评价上述个体细胞脱离相同的方式评价细胞片脱离。添加冷却基后，融合的细胞片从一端脱离并且卷起(图3a)。整个脱离过程需要大约2.5分钟，从添加冷却基的点到当所有细胞均从90:10160℃固化的pNIPAAm/APTES膜脱离时。还要使用锥虫蓝染色在脱离之前和之后检查细胞生存力。图3c示出从我们的表面脱离后极小的细胞死亡，从而揭示脱离工艺不显著地损害细胞。已发现当使用相同方案时，表面需要约11小时使细胞片完全地脱离。
取决于pNIPAAm-APTES比的细胞脱离。
细胞脱离的拟议机制被认为是由掩埋APTES的NH2基团的pNIPAAm链的扩展引起的，从而覆盖细胞附着所需的锚点。增加pNIPAAm/APTES共混物中的APTES的量将导致细胞锚点的量增加。这将导致冷却时较慢的细胞脱离。通过创建不同pNIPAAm/APTES比的膜，所有膜均在160℃的温度下固化3天，来设置简单的实验以测试这个假设。将细胞接种在这些膜中的每一个并且记录每一个表面的细胞脱离时间。图4示出了具有各种pNIPAAm/APTES比的表面的不同细胞脱离时间。通过增加APTES，细胞脱离时间从90:10膜的大约2.5分钟提高至40:60pNIPAAm/APTES膜的约40分钟，同时20:80pNIPAAm/APTES膜没有示出脱离。
对于可重复使用的功能，测试了90∶10pNIPAAm/APTES膜表面。脱离后，用冷媒洗涤表面，并且然后用hMSC再接种。细胞能够重新脱离并且达到融合。还有，将冷媒添加到表面上方，而细胞在2.5分钟内如细胞片一样脱离。对于重新播种/脱离，当第三次测试表面时，没有观察到适当的细胞铺展。相反，细胞附着是偶然发生的，尽管细胞的膜片仍然能在冷却时脱离。
pNIPAAm膜上的蜂窝行为。
根据本发明生产的pNIPAAm膜提供表面，其是生物相容的并且支持正常细胞功能的维持。此外，本发明的细胞培养支持物提供细胞附着，而无需考虑薄膜厚度。
本发明的细胞培养支持物还提供具有4℃培养基的快速细胞脱离，其表明pNIPAAm链的被动水化被认为是主要脱离机制，因为低温将限制细胞骨架作用和代谢过程以驱动细胞形态的变化。我们表面上的不同类型的哺乳动物细胞已经示出，细胞脱离时间是不受不同细胞类型或细胞-细胞相互作用影响的，因为脱离速率保持相同。

Claims (20)

1.细胞培养支持物，其包含：
基质和
聚合共混物层，其结合到所述基质，其中所述聚合共混物层包含至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂。
2.根据权利要求1所述的支持物，其中所述基质选自由聚合物材料、玻璃、陶瓷、金属、金属氧化物、水合金属氧化物，及其组合组成的组。
3.根据权利要求1所述的支持物，其中至少一种温敏性聚合物选自由聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)、聚(N-乙烯基己内酰胺)(PVCL)、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯)(PDMAEMA)、和聚(环氧乙烷)(PEO)及其组合组成的组。
4.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种温敏性聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其由下式表示：
5.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂的特征在于具有官能氨基或羧酸基团。
6.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂是氨基硅烷。
7.根据权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂选自由3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷(APDEMS)和3-氨基丙基甲氧基硅烷(APTMS)及其组合组成的组。
8.如权利要求1所述的支持物，其中所述至少一种网构粘合促进剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，其由下式表示：
Figure FDA0000392299760000021
9.根据权利要求1所述的支持物，其中聚合共混物的特征在于具有从约90:10至约40:60的温敏性聚合物与网构粘合促进剂比(TRP：NFAP)。
10.根据权利要求1所述的支持物，其中聚合共混物层不含粘着蛋白。
11.根据权利要求1所述的支持物，其中所述聚合共混物层不含等离子体或电子束处理。
12.一种生产细胞培养支持物的方法，其包含：
提供基质；
将至少一种温敏性聚合物和至少一种网构粘合促进剂混合以提供一种聚合共混物；
将所述聚合共混物的薄膜涂覆到所述基质上以提供所述基质上的聚合共混物层；
固化所述基质上的所述聚合共混物层以提供细胞培养支持物；以及
将细胞沉积到所述细胞培养支持物上，其中所述细胞任选地包含培养基，以提供一种细胞培养复合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含特征还在于为锚定依赖性细胞的细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含特征还在于为粘着细胞的细胞。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含细胞，所述细胞选自由成纤维细胞、成肌细胞、肌管细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、表皮细胞、粘膜上皮细胞、间充质干细胞、ES细胞、iPS细胞、成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞、毛根细胞、牙髓干细胞、β-细胞、肝细胞、及其组合组成的组。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层包含细胞和培养基。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚合共混物的所述薄膜被旋转涂布在基质上。
18.根据权利要求12所述的方法，其中聚合共混物层不含粘着蛋白。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚合共混物层不含等离子体或电子束处理。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养的细胞层的所述脱离不含蛋白水解酶或机械搅拌。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105524832A (zh) * 2016-02-26 2016-04-27 广州洁特生物过滤股份有限公司 细胞培养装置及方法
CN105566567A (zh) * 2016-01-27 2016-05-11 清华大学 硬度可调节的温敏聚合物材料及其制备方法和应用
CN108102918A (zh) * 2018-01-03 2018-06-01 京东方科技集团股份有限公司 一种培养皿装置及细胞膜片的培养方法
CN110004061A (zh) * 2019-04-16 2019-07-12 京东方科技集团股份有限公司 细胞膜片的培养装置和制备方法
CN110121552A (zh) * 2016-12-22 2019-08-13 Dic株式会社 细胞培养基材
CN110938323A (zh) * 2018-09-25 2020-03-31 广州洁特生物过滤股份有限公司 温敏细胞培养表面及其制备方法
CN111315870A (zh) * 2017-11-09 2020-06-19 牛津大学科技创新有限公司 宏载体
CN112370573A (zh) * 2020-11-04 2021-02-19 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 一种软骨膜片及其制备方法
WO2023103322A1 (zh) * 2021-12-07 2023-06-15 广东瑞程医学科技有限公司 一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2625577B1 (en) 2010-10-08 2019-06-26 Terumo BCT, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
JP6633522B2 (ja) 2013-11-16 2020-01-22 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド バイオリアクターにおける細胞増殖
WO2015148704A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Terumo Bct, Inc. Passive replacement of media
CN104225681B (zh) * 2014-09-19 2016-03-02 浙江大学 一种组织工程骨及其制备方法
WO2016049421A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled feed
US9819082B2 (en) * 2014-11-03 2017-11-14 Northrop Grumman Systems Corporation Hybrid electronic/mechanical scanning array antenna
US20180127700A1 (en) * 2015-05-21 2018-05-10 University Of South Florida Cell Culture Substrate for Rapid Release and Re-Plating
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US20170342375A1 (en) * 2016-05-26 2017-11-30 Abdullah Alghunaim Thermoresponsive cell culture supports
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
EP3656841A1 (en) 2017-03-31 2020-05-27 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
US20230190820A1 (en) * 2020-05-27 2023-06-22 The University Of Melbourne Cell harvest method
US12043823B2 (en) 2021-03-23 2024-07-23 Terumo Bct, Inc. Cell capture and expansion
CN113355261A (zh) * 2021-04-26 2021-09-07 天津大学 一种有机硅细胞涂层的制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100216242A1 (en) * 2009-02-26 2010-08-26 Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho Cell culture support and production method and uses thereof
WO2011024963A1 (ja) * 2009-08-27 2011-03-03 学校法人 東京女子医科大学 直鎖型温度応答性高分子が固定化された温度応答性細胞培養基材、及びその製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006105278A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 The Regents Of The University Of California Controlling stem cell destiny destiny with tunable network

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100216242A1 (en) * 2009-02-26 2010-08-26 Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho Cell culture support and production method and uses thereof
WO2011024963A1 (ja) * 2009-08-27 2011-03-03 学校法人 東京女子医科大学 直鎖型温度応答性高分子が固定化された温度応答性細胞培養基材、及びその製造方法

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105566567A (zh) * 2016-01-27 2016-05-11 清华大学 硬度可调节的温敏聚合物材料及其制备方法和应用
CN105524832A (zh) * 2016-02-26 2016-04-27 广州洁特生物过滤股份有限公司 细胞培养装置及方法
CN105524832B (zh) * 2016-02-26 2018-03-30 广州洁特生物过滤股份有限公司 细胞培养装置及方法
US11028356B2 (en) 2016-02-26 2021-06-08 Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Cell culture apparatus and method
CN110121552A (zh) * 2016-12-22 2019-08-13 Dic株式会社 细胞培养基材
CN111315870A (zh) * 2017-11-09 2020-06-19 牛津大学科技创新有限公司 宏载体
CN108102918A (zh) * 2018-01-03 2018-06-01 京东方科技集团股份有限公司 一种培养皿装置及细胞膜片的培养方法
CN110938323A (zh) * 2018-09-25 2020-03-31 广州洁特生物过滤股份有限公司 温敏细胞培养表面及其制备方法
CN110004061A (zh) * 2019-04-16 2019-07-12 京东方科技集团股份有限公司 细胞膜片的培养装置和制备方法
US11292998B2 (en) 2019-04-16 2022-04-05 Boe Technology Group Co., Ltd. Culture device and preparation method for a cell membrane
CN112370573A (zh) * 2020-11-04 2021-02-19 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 一种软骨膜片及其制备方法
WO2023103322A1 (zh) * 2021-12-07 2023-06-15 广东瑞程医学科技有限公司 一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US10550366B2 (en) 2020-02-04
EP2694639A1 (en) 2014-02-12
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US20170260497A1 (en) 2017-09-14

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