CN110938323A - 温敏细胞培养表面及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种温敏细胞培养表面及其制备方法。该温敏细胞培养表面的制备方法包括以下步骤：1)将温敏单体、交联剂加入溶剂中，混合均匀即得所述温敏液；2)将细胞培养装置放入等离子发生器内进行等离子处理，处理时间为15s～30s；3)将所述温敏液均匀的涂布在表面预处理后的所述细胞培养装置的培养面上；4)将涂布处理后的所述细胞培养装置置于高能电子发射器中进行高能电子束辐射接枝处理；5)对辐照处理后的所述细胞培养装置进行清洗。本发明的温敏细胞培养表面的制备方法能够让温敏液均匀涂布在细胞培养表面，确保温敏细胞培养表面各处的温敏功能平衡。

Description

温敏细胞培养表面及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种温敏细胞培养表面及其制备方法。
背景技术
体外动物细胞培养是生物医药产业及其相关研究领域的一种常用技术。随着人们对生物制药产业和相关研究领域需求的日益增加，细胞培养相关领域的发展也日渐繁荣。细胞培养相关的耗材、装置和设备是细胞培养过程中必需的物品，目前用于细胞培养的产品主要包括小规模的细胞培养装置，例如细胞培养皿、细胞培养瓶、细胞培养板；以及大规模的细胞培养类产品主要包括细胞工厂(例如Thermofisher和Corning公司的细胞工厂高达40层的细胞培养表面)、粉末微载体颗粒(例如GE生命科学的Cytopore、Cytoline、Cytodex类产品的细胞培养面积可达2000cm2/g)等。
传统的细胞培养装置在细胞培养完成后，大多采用以下两种方式收获细胞：一是机械方式，例如直接采用细胞刮刀刮下细胞培养表面的细胞；二是生物方式，采用添加蛋白酶类消化液(例如胰蛋白酶)对细胞的贴壁层蛋白进行消化以使细胞贴壁层膜蛋白遭到破坏，从而使细胞从细胞培养表面上脱落下来，最后添加一定量的血清终止多余的蛋白酶的消化作用。但上述细胞收获方式中，机械方式在收获时容易刮伤细胞，造成细胞形态及活性的破坏；而生物方式在收获时，蛋白酶的消化一方面会破坏细胞外基质使细胞的结构和功能遭受一定程度的破坏，另一方面蛋白酶消化后会残留一些消化生成的化学物质而降低了细胞培养类产品的纯度，且成本较高。
为了克服传统细胞培养表面在收获细胞时存在的缺陷，温度响应性细胞培养表面的研究越来越受到人们的关注。温度响应性细胞培养表面在完成细胞培养后，只需要将培养环境的温度降低到最低临界温度以下即可实现细胞的收获。温度响应性细胞培养表面收获细胞时既不会损害细胞外基质，也不会残留胰酶消化时生成的化学物质。温度响应性细胞培养表面在制备时，需要将温敏液均匀地涂布到细胞培养表面上，但在实际操作中，温敏液往往会发生回缩，聚集堆积在细胞培养表面，温敏液聚集区域在温度达到最低临界温度后，细胞仍不能脱落；而温敏液稀疏区域在温度还未达到最低临界温度前，就已经有细胞开始脱落，导致细胞培养表面各处温敏功能的不平衡。
发明内容
基于此，有必要针对现有温度响应性细胞培养表面存在的温敏单体涂布不均匀的问题，提供一种温敏单体涂布均匀的温敏细胞培养表面及其制备方法。
具体的技术方案如下：
一种温敏细胞培养表面的制备方法，包括以下步骤：
1)温敏液的制备：将温敏性单体、交联剂加入极性溶剂中，混合均匀即得所述温敏液；
2)表面预处理：将细胞培养装置放入等离子发生器内进行等离子处理，处理时间为15s～30s；
3)涂布处理：将所述温敏液均匀的涂布在表面预处理后的细胞培养装置的培养面上；
4)辐照处理：将涂布处理后的细胞培养装置置于高能电子发射器中进行高能电子束辐射接枝处理；
5)清洗处理：对辐照处理后的所述细胞培养装置进行清洗。
在其中一个实施例中，所述表面预处理的处理时间为20s～30s。
在其中一个实施例中，所述温敏性单体为N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-丙基丙烯酰胺以及N-丙基-2-甲基丙烯酰胺中的至少一种；
所述交联剂为偶氮二异丁腈或亚甲基双丙烯酰胺。
在其中一个实施例中，所述温敏液的制备包括以下步骤：先将所述交联剂以及所述温敏性单体加入所述极性溶剂中，搅拌均匀，得到所述温敏性单体的质量浓度为3％～7％的预聚液；再向所述预聚液中继续添加所述温敏性单体至其终质量浓度为75％～85％，搅拌均匀，即得所述温敏液。先制备预聚液，由于预聚液中温敏性单体质量浓度较低，不易结晶析出，便于保存。当需要制备高质量浓度温敏液时，直接在预聚液中加入温敏性单体即可，操作简单方便。
在其中一个实施例中，所述温敏液的制备包括以下步骤：先将所述温敏性单体加入所述溶剂中，再将所述交联剂加入所述溶剂中，搅拌均匀，获得所述温敏性单体质量浓度为60％～70％的温敏液。
在其中一个实施例中，所述涂布处理的温敏液的用量为1.5μl/cm2～4μl/cm2。
在其中一个实施例中，所述辐照处理的辐射剂量为200KGy～500KGy。
在其中一个实施例中，所述极性溶剂选自水、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、丁醇、异丁醇、乙二醇单甲醚以及丙二醇单甲醚中的至少一种。
本发明还提供了一种温敏细胞培养表面。
具体的技术方案如下：
一种上述的温敏细胞培养表面的制备方法制备得到的温敏细胞培养表面。
本发明还提供了一种温敏细胞培养装置。
具体的技术方案如下：
具有上述的温敏细胞培养表面的温敏细胞培养装置。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本申请发明人发现，在现有的温敏响应性细胞培养表面的制备方法中，通常直接在未经任何处理的细胞培养表面涂布制备好的温敏液，此时，由于细胞培养表面不具有亲水性，温敏液在涂布后会回缩聚集在一起，造成温敏液涂布不均匀的问题，影响产品性能。但若采用常规的亲水处理方法处理细胞培养表面后再进行涂布，会因为细胞培养表面亲水性过强，导致温度响应性不灵敏，达到最低临界温度细胞仍不能够自动脱落。
基于此，发明人通过大量创造性的实验得到本发明的温敏细胞培养表面的制备方法，将细胞培养装置在涂布温敏液前，先经表面预处理并严格控制处理时间，让细胞培养表面的亲水性与温度响应性达到平衡，既能够保证在涂布时温敏液不会回缩聚集在一起，又能够实现在最低临界温度时细胞全部自动脱落。本发明的温敏细胞培养表面的制备方法能够让温敏液均匀涂布在细胞培养表面，确保温敏细胞培养表面各处的温敏功能平衡。
进一步地，本发明在温敏液均匀涂布在细胞培养表面的基础上，结合特定种类的温敏性单体以及交联剂，确保温敏细胞培养表面的温敏性能稳定。
本发明还限定了温敏液中温敏性单体的质量浓度以及对应不同温敏性单体质量浓度的温敏液的不同制备方法，在温敏性单体在温敏液中的质量浓度为75％～85％时，制备得到的温敏细胞培养表面适用于贴壁型较强的细胞的低温无损脱落。在温敏性单体在温敏液中的质量浓度为60％～70％时，制备得到的温敏细胞培养表面适用于贴壁型较弱的细胞的低温无损脱落。
此外，本发明的温敏细胞培养表面的制备方法中还进一步具体的限定了温敏单体的质量浓度以及温敏液的用量，能够减少多余的温敏液在细胞培养表面回缩聚集造成的浪费。
附图说明
图1为3T3细胞在实施例1的温敏细胞培养皿上培养48小时后的细胞贴附显微镜照片；
图2为3T3细胞在实施例1的温敏细胞培养皿上培养48小时后，再在20℃处理30分钟后，3T3细胞成片自动脱附的显微镜照片；
图3为3T3细胞在对比例1的温敏细胞培养皿上培养48小时后的细胞贴附显微镜照片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例提供一种温敏细胞培养表面及其制备方法。该制备方法包括：
1)温敏液制备：
称取异丙醇50g，N-异丙基丙烯酰胺2.5g，偶氮二异丁腈0.02g，将三者混合后进行磁力搅拌溶解，在70℃恒温搅拌4h，冷却到室温，得预聚液；
称取预聚液7.5g、N-异丙基丙烯酰胺22.5g，在60℃～65℃下，搅拌溶解40min～60min，得到N-异丙基丙烯酰胺质量浓度为80％的温敏液，于30℃保温放置。
2)表面预处理：将表面积为60cm2的细胞培养皿放入等离子发生器内进行等离子处理，处理时间为30s。
3)涂布处理：将0.2ml所述温敏液均匀的涂布在表面预处理后的所述细胞培养皿表面。
4)辐照处理：将涂布处理后的所述细胞培养皿置于高能电子发射器中进行高能电子束辐射接枝处理，辐射剂量为450KGy。
5)清洗处理：将辐照处理后的所述细胞培养皿浸泡在超纯水中20h，然后用机械刷轻轻刷洗一遍，再用超纯水冲洗后烘干，最后用纯氩气等离子清洗机清洗，所述等离子清洗机清洗的功率为200W，时间为60s，流速为80ml/min，即得温敏细胞培养表面。
本实施例制备的温敏细胞培养表面适用于培养贴壁性较强的细胞。
实施例2
本实施例提供一种温敏细胞培养表面及其制备方法。该制备方法包括：
1)称取丙醇17.5g，N-异丙基丙烯酰胺32.5g，亚甲基双丙烯酰胺0.15g，将三者混合，搅拌溶解，得到N-异丙基丙烯酰胺质量浓度为65％的温敏液，于25℃保温放置。
2)表面预处理：将表面积为60cm2的细胞培养皿放入等离子发生器内进行等离子处理，处理时间为15s。
3)涂布处理：将0.2ml所述温敏液均匀的涂布在表面预处理后的所述细胞培养皿表面。
4)辐照处理：将涂布处理后的所述细胞培养皿置于高能电子发射器中进行高能电子束辐射接枝处理，辐射剂量为200KGy。
5)清洗处理：将辐照处理后的所述细胞培养皿浸泡在超纯水中30h，然后用机械刷轻轻刷洗一遍，再用超纯水冲洗后烘干，最后用纯氩气等离子清洗机清洗，所述等离子清洗机清洗的功率为300W，时间为90s，流速为100ml/min，即得温敏细胞培养表面。
本实施例制备的温敏细胞培养表面适用于培养贴壁性较弱的细胞。
实施例3
本实施例提供一种温敏细胞培养表面及其制备方法。该制备方法包括：
1)称取丙二醇17.5g，N-丙基丙烯酰胺32.5g，亚甲基双丙烯酰胺0.15g，将三者混合，搅拌溶解，得到N-异丙基甲基丙烯酰胺质量浓度为65％的温敏液，于25℃保温放置。
2)表面预处理：将表面积为60cm2的细胞培养皿放入等离子发生器内进行等离子处理，处理时间为30s。
3)涂布处理：将0.1ml所述温敏液均匀的涂布在表面预处理后的所述细胞培养皿表面。
4)辐照处理：将涂布处理后的所述细胞培养皿置于高能电子发射器中进行高能电子束辐射接枝处理，辐射剂量为500KGy。
5)清洗处理：将辐照处理后的所述细胞培养皿浸泡在超纯水中10h；然后用超声机进行超声清洗，超声机功率为500W；再用超纯水冲洗后烘干；最后用纯氩气等离子清洗机清洗，所述等离子清洗机清洗的功率为300W，时间为30s，流速为100ml/min，即得温敏细胞培养表面。
本实施例制备的温敏细胞培养表面适用于培养贴壁性较弱的细胞。
对比例1
本对比例的温敏细胞培养表面的制备，类似于实施例1的温敏细胞培养表面及其制备方法，主要区别在于：本对比例的制备方法不包含步骤2)表面预处理。
对比例2
本对比例的温敏细胞培养表面的制备，类似于实施例1的温敏细胞培养表面及其制备方法，主要区别在于：步骤2)表面预处理中，等离子处理的时间为60s。
对比例3
本对比例的温敏细胞培养表面的制备，类似于实施例1的温敏细胞培养表面的制备方法，主要区别在于：温敏性单体及交联剂的种类不同。本对比例的温敏性单体为N-异丙基-2-甲基丙烯酰胺，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯。
试验例1
对实施例1以及对比例1制备得到的温敏细胞培养皿进行细胞形态测试
试验方法：将实施例1以及对比例1制备得到的温敏细胞培养皿用于细胞培养，接种3T3细胞在37℃、5％CO2培养48小时后，进行显微镜观察。之后在20℃处理30分钟后，再次进行显微镜观察。
实验结果：
3T3细胞在37℃培养48小时后，实施例1的温敏细胞培养皿上的细胞贴附显微镜照片见附图1；
20℃处理30分钟后，实施例1的温敏细胞培养皿上3T3细胞成片自动脱附的显微镜照片见附图2；
3T3细胞在37℃培养48小时后，对比例1的温敏细胞培养皿上的细胞贴附显微镜照片见附图3。
结果分析：实施例1的温敏细胞培养皿在细胞培养过程中，3T3细胞贴壁生长状态良好(参见附图1)，在将温度降至20℃处理30分钟后，细胞成片自动脱落(参见附图2)。可见，本发明的温敏细胞培养表面的亲水性与温度响应性达到平衡，既能够细胞贴壁生长的需求，又能够满足在最低临界温度时细胞全部成片自动脱落。
而对比例1的温敏细胞培养皿未经过等离子气体的表面预处理过程，温敏液在涂布时发生严重回缩，温敏液在细胞培养皿的培养面上分布严重不均，部分区域温敏液未涂布，部分区域温敏液聚集较多，两种情况均不适合细胞生长，显微镜下观察细胞状态明显皱缩且未发生增殖(参见附图3)。
试验例2：
对实施例1～3以及对比例1～3制备得到的温敏细胞培养表面分别进行细胞脱落率测试。
试验方法：将实施例1～3以及对比例1～3制备得到的温敏细胞培养表面用于细胞培养，分别接种100万的3T3细胞在37℃培养24小时后，将培养温度降至20℃处理20min，将细胞悬液全部倒出、收集、计数，即得温敏降温脱落细胞数，再用胰酶消化法收集温敏降温后未脱落细胞，即得胰酶法收获细胞数，两者相加即为总细胞收获数。按以下公式计算温敏细胞脱落率：
总细胞收获数＝温敏降温脱落细胞数+胰酶法收获细胞数
温敏细胞脱落率＝温敏降温脱落细胞数/总细胞收获数
试验结果见表1：
表1：实施例1～3以及对比例1～3各温敏细胞培养表面的细胞脱落率
温敏降温脱落细胞数 总细胞收获数 细胞脱落率
实施例1 314万 350万 89.7％
实施例2 298万 347万 85.9％
实施例3 311万 355万 87.6％
对比例1 / 70万 /
对比例2 81万 352万 23％
对比例3 225万 289万 77.9％
结果分析：由表1可见，实施例1～3的温敏细胞培养表面温敏性能良好，3T3细胞培养完成后，将培养温度降至20℃处理20min，细胞脱落率均在85％以上，且总细胞收获数较多，非常适于细胞无损脱落。而对比例1的温敏细胞培养表面，由于未经过等离子气体的表面预处理过程，温敏液在涂布时发生严重回缩，温敏液在细胞培养皿的培养面上分布严重不均，部分区域温敏液未涂布，部分区域温敏液聚集较多，两种情况均不适合细胞生长，因此对比例1的细胞培养失败，无法测得细胞脱落率。对比例2的温敏细胞培养表面由于表面预处理时间过长，在涂布处理前，细胞培养皿的培养面已获得非常强的亲水性，严重影响了涂布后温敏液的温度响应性能，细胞虽然能够在温敏涂层表面良好生长，正常增殖，但在经过降温后，细胞无法正常脱落；对比例3的温敏细胞培养表面，该条件下细胞可以进行正常生长增殖，但生长效率及降温后细胞脱落率均不及实施例1～3。
可见，本发明的温敏细胞培养表面温敏性能良好，可适用于细胞无损脱落，既可以满足细胞良好贴壁生长增殖，也可实现细胞降温后无损脱落的效果，即本发明的温敏细胞培养表面的亲水性与温度响应性达到平衡。
试验例3：
试验方法：将实施例1～3以及对比例3的温敏细胞培养表面(各50个)用于3T3细胞培养，对各个温敏细胞培养表面的最低临界温度(即细胞自动脱落温度)进行测量。
试验结果：实施例1的50个温敏细胞培养表面的最低临界温度均在20℃±0.2℃；
实施例2的50个温敏细胞培养表面的最低临界温度均在20℃±0.2℃；
实施例3的50个温敏细胞培养表面的最低临界温度均在20℃±0.2℃；
对比例3的50个温敏细胞培养表面中，有39个温敏细胞培养表面的最低临界温度在20℃±0.2℃，占78％；其余温敏细胞培养表面的最低临界温度不稳定。
结果分析：由上试验结果可以看出，实施例1～3的温敏细胞培养表面的温敏性能较为稳定，50个温敏细胞培养表面的最低临界温度均在20℃±0.2℃内，也即20℃±0.2℃时发生细胞的自动脱落。而对比例3的温敏细胞培养表面中，仅有78％的温敏细胞培养表面最低临界温度均在20℃±0.2℃内，其余温敏细胞培养表面的最低临界温度不稳定。可见，本发明的温敏细胞培养表面在制备时通过结合特定种类的温敏性单体以及交联剂，能够确保温敏细胞培养表面的温敏性能稳定。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)温敏液的制备：将温敏性单体、交联剂加入极性溶剂中，混合均匀即得所述温敏液；
2)表面预处理：将细胞培养装置放入等离子发生器内进行等离子处理，处理时间为15s～30s；
3)涂布处理：将所述温敏液均匀的涂布在表面预处理后的细胞培养装置的培养面上；
4)辐照处理：将涂布处理后的细胞培养装置置于高能电子发射器中进行高能电子束辐射接枝处理；
5)清洗处理：对辐照处理后的所述细胞培养装置进行清洗。
2.根据权利要求1所述的温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述表面预处理的处理时间为20s～30s。
3.根据权利要求1或2所述的温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述温敏性单体为N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-丙基丙烯酰胺以及N-丙基-2-甲基丙烯酰胺中的至少一种；
所述交联剂为偶氮二异丁腈或亚甲基双丙烯酰胺。
4.根据权利要求1或2所述的温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述温敏液的制备包括以下步骤：先将所述交联剂以及所述温敏性单体加入所述极性溶剂中，搅拌均匀，得到所述温敏性单体的质量浓度为3％～7％的预聚液；再向所述预聚液中继续添加所述温敏性单体至其终质量浓度为75％～85％，搅拌均匀，即得所述温敏液。
5.根据权利要求1或2所述的温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述温敏液的制备包括以下步骤：先将所述温敏性单体加入所述溶剂中，再将所述交联剂加入所述溶剂中，搅拌均匀，获得所述温敏性单体质量浓度为60％～70％的温敏液。
6.根据权利要求1或2所述的温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述涂布处理的温敏液的用量为1.5μl/cm2～4μl/cm2。
7.根据权利要求1或2所述的温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述辐照处理的辐射剂量为200KGy～500KGy。
8.根据权利要求1或2所述的温敏细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述极性溶剂选自水、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、丁醇、异丁醇、乙二醇单甲醚以及丙二醇单甲醚中的至少一种。
9.一种由权利要求1～8任意一项所述的温敏细胞培养表面的制备方法制备得到的温敏细胞培养表面。
10.具有权利要求9所述的温敏细胞培养表面的温敏细胞培养装置。
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