CN110777116B

CN110777116B - 肿瘤样本前处理方法

Info

Publication number: CN110777116B
Application number: CN201910962182.3A
Authority: CN
Inventors: 曹志鹏; 卓朗; 陈璞
Original assignee: Naptide Qingdao Biomedical Co ltd
Current assignee: Napeptide Co ltd
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2039-10-11
Also published as: CN110777116A

Abstract

本发明提出了一种肿瘤样本前处理方法。该方法包括：将新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第一清洗处理；将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质质量分数大于18～22％的的组织；以及将剔除处理后组织进行第二清洗处理。该方法有效降低了肿瘤样本培养后的微生物污染的概率，提高了肿瘤样本的培养成功率，且方法中选择剔除脂肪、血液、坏死以及间质质量分数大于18～22％的组织，对剔除标准进行了严格限定，一方面可以去除部分污染，另一方面使得第二清洗更加彻底有效，也大大提高了获得肿瘤细胞含量较多的组织部位，提高了后续酶解效率以及增加了后续肿瘤细胞培养成功的克隆数。

Description

肿瘤样本前处理方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及肿瘤样本的前处理方法。

背景技术

现有的肿瘤类器官培养方法中，主要关注样本酶解以及培养基配方等环节，极少有关于样本前处理的详细方案，但样本的前处理过程却是导致培养失败的主要原因之一。

例如，现有的肿瘤类器官培养技术中，样本在转运过程中容易造成活性降低，活细胞数量减少会导致培养失败；同时，消化道肿瘤样本在培养后容易发生微生物污染，也是肿瘤类器官培养中导致失败的主要原因之一；在获得样本之后，现有技术缺少选择性剔除的标准，往往使用肿瘤细胞含量较少的组织部位进行培养，导致培养成功的克隆数较少。

以上原因是肿瘤类器官培养前处理过程中导致失败的主要原因，并且这会大大增加肿瘤类器官培养的时间和价格成本。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种肿瘤样本前处理方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第一清洗处理；将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质质量分数大于18～22％的组织；以及将剔除处理后组织进行第二清洗处理。根据本发明实施例的方法有效降低了肿瘤样本培养后的微生物污染的概率，提高了肿瘤样本的培养成功率，且方法中选择剔除脂肪、血液、坏死以及间质质量分数大于18～22％的组织，例如质量分数大于20％的组织，对剔除标准进行了严格限定，一方面可以去除部分污染，另一方面使得第二清洗更加彻底有效，也大大提高了获得肿瘤细胞含量较多的组织部位的概率，提高了后续酶解效率以及增加了后续肿瘤细胞培养成功的克隆数。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述第一清洗处理和第二清洗处理是在HBSS缓冲溶液中进行的。

根据本发明的实施例，所述第一清洗处理是在清洗缓冲液2～4中进行的，其中，所述清洗缓冲液2包含体积分数为75％的无水乙醇，所述清洗缓冲液3包含体积分数为3％的乙酸，所述清洗缓冲液4包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B。

根据本发明的实施例，所述第一清洗处理是通过如下方式进行的：将所述新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液4中清洗2或3遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液4清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟。

发明人发现，使用清洗缓冲液4清洗新鲜肿瘤样本，可以有效去除和抑制肿瘤样本表面携带的各种细菌和真菌，现有技术中使用的添加了100单位/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的双抗的细胞清洗液，用在类器官的培养中，真菌污染导致失败的概率很高，而本申请的方法采用的清洗缓冲液4，增加了两性霉素B来进行抗真菌的处理，同时使用10倍浓度的青霉素以及链霉素，对存在的细菌真菌污染进行冲击法处理，在保证组织细胞活性的前提下，最大限度地降低了类器官的污染概率。

本申请的方法中，发明人创造性的采用了含有乙醇体积分数为75％的HBSS缓冲液2进行组织样本的清洗，有效杀灭了样本携带的细菌真菌，本领域技术人员常规所了解的是，75％乙醇会对细胞的产生伤害作用，因此75％乙醇不会用来处理原代组织，而本申请的发明人发现，采用清洗缓冲液2短时间(2～4分钟)处理肿瘤样本，不仅可以有效的杀灭样本表面的细菌和真菌，同时仍可以保留细胞活性，实现后续的培养。

含有乙酸体积分数为3％的HBSS缓冲溶液3现有技术中主要用于尖锐湿疣、尖锐湿疣亚临床表现或HPV潜伏感染的试验方法。而本申请的发明人发现，使用清洗缓冲液3处理原代肿瘤样本，可以一定程度地抑制真菌的生长，降低样本后续培养发生真菌污染的概率。

根据本发明的实施例，所述第二清洗处理是在清洗缓冲液1～5中进行的，其中，所述清洗缓冲液1包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B，所述清洗缓冲液5包含体积分数为1％的FBS。

根据本发明的实施例，所述第二清洗处理是通过如下方式进行的：将剔除处理后组织在清洗缓冲液1中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液1清洗的组织在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的组织在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液3清洗的组织在清洗缓冲液4中、在4℃的条件下浸泡28～32分钟；以及将经过清洗缓冲液4浸泡的组织在清洗缓冲液5中清洗5或6遍，每遍4～6分钟。发明人发现，将剔除处理后组织首先在含有青霉素浓度为100单位/mL，链霉素浓度为100μg/mL以及0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液1中进行清洗，可以进一步清洗并抑制样本携带的细菌和真菌，进而陆续在清洗缓冲液2、3、4进行清洗，最后在含有1％FBS的HBSS缓冲液5中进行清洗，可通过多次清洗，降低污染概率，维持细胞活性。

根据本发明的实施例，所述新鲜肿瘤样本预先保存在转移缓冲液中，所述转移缓冲液为Advanced DMEM/F-12K培养基，所述培养基中包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μML-丙氨酸，100μM L-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸。根据本发明实施例的转移缓冲液采用了高浓度HEPEs，在保证细胞活性的前提下，有效提高了转移缓冲液的缓冲能力。

根据本发明实施例的转移缓冲液可有效维持肿瘤样本的活性，活性可长达4天。

根据本发明的实施例，所述新鲜肿瘤样本预先保存在4～8℃的条件下。进而进一步有效维持肿瘤样本的活性。

根据本发明实施例的方法具有如下优势：

1、该样本前处理办法中，转运缓冲液以及流程能有效维持样本长时间存放以及转运过程中的活性，为一些远距离样本经过运输后，再进行类器官培养提供了可能。

2、该样本前处理办法中，清洗缓冲液以及相关流程可以有效降低样本培养后的微生物污染概率，提高培养成功率。

3、该样本前处理办法中，选择性剔除的标准会获得肿瘤细胞含量较多的组织部位，提高后续酶解效率以及增加培养成功的克隆数。

附图说明

图1是根据本发明实施例的采用普通前处理方法和本发明提出的样本前处理方法样本污染比例的统计结果；以及

图2是根据本发明实施例的对肺鳞癌样本使用本发明提出的transfer Buffer 4℃存放4天后，进行培养5天后结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了一种肿瘤样本前处理方法，在肿瘤类器官培养过程中，该方法可以维持样本转运过程中的细胞活性，降低肿瘤样本培养的污染概率，提高酶解效率，提高肿瘤类器官培养成功测克隆数，降低整个培养过程中的时间和价格成本。

根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：

1、将肿瘤样本(该肿瘤样本可来自病人手术或者穿刺之后取下的肿瘤样本，属于医疗废弃物)十分钟内转移至含有转移缓冲液(transfer Buffer)的离心管中，放入含有冰盒的生物样本转运箱中(保持温度4～8℃)，同时样本转运箱中的冰盒可长时间维持在4～8℃，在此条件下可以维持样本的生物活性长达4天。

其中，transfer Buffer为包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μM L-丙氨酸，100μML-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸的Advanced DMEM/F-12K培养基。

2、进行以下5步处理，(1)清洗缓冲液(Wash Buffer)4，清洗2遍，每遍5分钟。(2)Wash Buffer 2清洗3分钟。(3)Wash Buffer 3清洗3分钟。(4)眼科剪剔除脂肪，血液，坏死以及间质质量分数大于20％的组织的部位(5)Wash Buffer1～5分别清洗。

其中，Wash Buffer 1为包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 2为包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 3为包含体积分数为3％的乙酸的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 4为包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 5为包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲溶液。

以上样本处理过程中采用的5种Wash Buffer分别通过不同的原理去除微生物，降低样本培养污染的概率，同时通过剪刀剔除相关组织部位，一方面可以去除部分污染，使清洗过程更加彻底有效，另一方面剔除间质较多的部位可以缩短酶解时间，提高酶解效率，以获得活性更高的肿瘤细胞。

下面详细描述本发明的具体实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

在本次方案中，发明人共计培养了34例肿瘤样本，其中前9例使用常规样本处理方法，另外26例样本使用本发明的前处理方法。

普通前处理具体方法：样本获得后，放入transfer buffer，样本转运箱4～8℃条件下运输至实验室，然后用HBSS缓冲液+1％双抗清洗5遍，每遍5分钟，随后用剪刀剪成1～2mm大小的组织块，加入5ml酶解液处理，多次重复消化，直至组织消化完全，然后将收集到的细胞液离心，HBSS缓冲液清洗3遍，计数，种板，基质胶凝固后加入相应培养基培养。

本发明前处理方法：样本获得后，放入transfer buffer，样本转运箱4～8℃条件下运输至实验室，然后用Wash buffer 4清洗5遍，每遍5分钟，Wash buffer 2清洗3分钟，Wash buffer3清洗3分钟，将上述样本转移至培养皿中，眼科剪剔除脂肪，血液，坏死以及间质含量较高的部位，然后使用Wash Buffer 1～5进行清洗，具体如下：

Wash Buffer 1，清洗5遍，每遍5分钟；Wash buffer 2，清洗3分钟；Wash buffer3，清洗3分钟；Wash buffer 4，4℃浸泡30分钟；Wash Buffer 5清洗5遍，每遍5分钟。

分别在培养第2天进行观察是否污染，同时拍照记录。统计污染的状况和污染概率，结果如图1所示，结果表明普通前处理方法共计9例，有2例发生污染(样本3和5)，本发明前处理方法共计26例，有3例发生污染(样本19、30和34)，使用本发明的样本前处理方法，可以将污染概率由22％降低到11.5％，本发明的方法在统计样本增多的条件下可有效降低了污染概率。

实施例2

在本次方案中，采用肺鳞癌病人的样本，使用本发明提出的transfer buffer进行4℃放置4天，然后进行培养。结果如图2所示，结果显示，本发明提出的transfer buffer在4℃条件下可有效维持样本活性长达4天，并仍然可以成功培养类器官。

实施例3

在本次方案中，各选取10例样本采用不同顺序的清洗缓冲液处理办法。

对照组10例：

1)对新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第二清洗处理，即将鲜肿瘤样本在清洗缓冲液1中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液1清洗的组织在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的组织在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液3清洗的组织在清洗缓冲液4中、在4℃的条件下浸泡28～32分钟；以及将经过清洗缓冲液4浸泡的组织在清洗缓冲液5中清洗5或6遍，每遍4～6分钟。

2)将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质含量大于20％的组织；

3)将剔除处理后组织进行第一清洗处理。即将剔除处理后组织样本在清洗缓冲液4中清洗2或3遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液4清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟。

统计培养后的污染概率以及培养成功概率。

实验组10例：处理过程如实施例1所述。统计培养后的污染概率以及培养成功概率。

结果：相比于对照组，实验组的培养污染概率低，对组织的损伤更小，成功率更高。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种肿瘤样本前处理方法，其特征在于，包括：

将新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第一清洗处理；

所述第一清洗处理是在清洗缓冲液2～4中进行的，其中，

所述清洗缓冲液2包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲溶液，

所述清洗缓冲液3包含体积分数为3％的乙酸的HBSS缓冲溶液，

所述清洗缓冲液4包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲溶液；

所述第一清洗处理是通过如下方式进行的：

将所述新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液4中清洗2或3遍，每遍4～6分钟；

将经过清洗缓冲液4清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；

将经过清洗缓冲液2清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液3中清洗3分钟；

将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质质量分数大于18～22％的组织；

以及将剔除处理后组织进行第二清洗处理；

所述第二清洗处理是在清洗缓冲液1～5中进行的，其中，

所述清洗缓冲液1包含浓度为100单位/mL的青霉素、浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲溶液，

所述清洗缓冲液5包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲溶液；

所述第二清洗处理是通过如下方式进行的：

将剔除处理后组织在清洗缓冲液1中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；

将经过清洗缓冲液1清洗的组织在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；

将经过清洗缓冲液2清洗的组织在清洗缓冲液3中清洗3分钟；

将经过清洗缓冲液3清洗的组织在清洗缓冲液4中、在4℃的条件下浸泡28～32分钟；

以及将经过清洗缓冲液4浸泡的组织在清洗缓冲液5中清洗5或6遍，每遍4～6分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述新鲜肿瘤样本预先保存在转移缓冲液中，

所述转移缓冲液为Advanced DMEM/F-12K培养基，所述培养基中包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μM L-丙氨酸、100μM L-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述新鲜肿瘤样本预先保存在4～8℃的条件下。