CN103926121A

CN103926121A - 一种细胞爬片的制备方法

Info

Publication number: CN103926121A
Application number: CN201410141763.8A
Authority: CN
Inventors: 周显青; 徐英; 郭芳子; 李艳博; 孙志伟
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2034-04-10
Also published as: CN103926121B

Abstract

一种细胞爬片的制备方法：根据需要剪裁爬片并消毒；将消毒后的爬片完全浸入培养液内，然后放入培养板内；用移液枪吸取细胞悬液，于培养板正上方处垂直地将细胞悬液一次完全打出，使细胞在冲力的作用下均匀分布在爬片上；培养板中加入固定液进行固定；免疫细胞化学染色。本发明为细胞爬片的制备及后续细胞免疫化学提供了一套良好、可靠的具体操作流程及关键技术改进方案。

Description

一种细胞爬片的制备方法

技术领域

本发明涉及一种细胞爬片的制备方法。

背景技术

细胞爬片技术是利用贴壁细胞在一定的固相表面（如盖玻片）上贴壁生长的习性来进行体外实验操作的一种技术。利用细胞爬片进行体外实验时，可以排除体内诸多干扰因素的影响，方便地对细胞进行各种干预处理。因此，制备细胞爬片是体外细胞培养的一种重要技术。同时，细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测等的第一步，也是能否成功获得实验结果的关键步骤。目前，随着“3Rs”【即替代(replacement）、减少（reduction）和优化(refinement）实验动物的使用】原则的倡导和实施以及研究工作的深入，体外细胞研究和检测指标日益丰富，对细胞爬片的需求和质量要求越来越高。

目前文献报导的细胞爬片制备方法，通常是把多个小盖玻片直接置于培养皿底，加入细胞悬液进行培养。但关于制备细胞爬片的具体良好的操作流程及关键技术未见报导，致使科研人员在实际操作中需要对这一技术进行反复地摸索，质量难以控制。由于缺乏规范的流程参照，在制备细胞爬片时，常常出现接种细胞密度过大或过小的问题，导致细胞堆积重叠而无法在爬片上正常生长或密度太低无法进行后续检测，甚至出现爬片上的细胞在后续处理中容易脱片等现象。这无疑极大地浪费了科研人员的精力和时间，同时也对科研资源造成浪费，极大地影响了细胞爬片在细胞免疫化学实验中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞爬片的制备方法，以改进公知技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供的细胞爬片的制备方法，其步骤为：

1）根据需要剪裁爬片，清洗和消毒后取出烤干备用；

2）将消毒后的爬片完全浸入培养液内，然后放入培养板内；

3）将细胞重悬于培养液中，细胞浓度为1.25～2×10⁵个/ml；

4）用移液枪吸取细胞悬液，于培养板正上方处垂直地将细胞悬液一次完全打出，使细胞在冲力的作用下均匀分布在爬片上；

5）待细胞种板后，细胞贴壁牢固时去掉上清液，加培养液继续培养；

6）将培养板取出，弃去上清液，吸取磷酸盐缓冲液(PBS)对细胞进行清洗，该清洗步骤可以重复进行；

7）培养板中加入固定液进行固定，固定条件是室温30～50min，每隔10min轻轻摇晃培养板，使固定液与贴壁细胞充分接触；

8）重复用PBS洗净固定液后，加入PBS浸泡爬片并经常更换PBS，以避免环境因素对样本的影响；

9）免疫细胞化学染色。

所述细胞爬片的制备方法中，步骤1中爬片的清洗和消毒是：置于浓硫酸中浸泡，用水冲洗，再置于无水酒清中浸泡，之后用三蒸水冲洗，放在铺有脱脂纱布的玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

所述细胞爬片的制备方法中，步骤2中的培养液是含血清的达尔伯克必需基本培养液（DMEM培养液）。

所述细胞爬片的制备方法中，步骤5中是指细胞贴壁牢固，生长面积达到培养孔的85%时去掉上清液，加不含血清的DMEM培养液继续培养。

所述细胞爬片的制备方法中，步骤7中的固定液是4%多聚甲醛固定液。

所述细胞爬片的制备方法中，PBS的pH值为7.4。

本发明为细胞爬片的制备及后续细胞免疫化学提供了一套良好、可靠的具体操作流程及关键技术改进方案。

附图说明

图1A和图1B是对按照公知技术制备的小鼠精原细胞GC-1spg爬片进行免疫化学染色，检测细胞内FasL蛋白表达（1A，100×；1B，400×）。

图2A和图2B是对依照实施例2制备的小鼠精原细胞GC-1spg爬片进行免疫化学染色，检测细胞内FasL蛋白表达（2A，100×；2B，400×）。具体实施方式

本发明的步骤包括：

一、爬片的准备

1、爬片可用一般的盖玻片和专用爬片。

2、使用一般的盖玻片时，根据自己的需要先将盖玻片用小沙轮剪裁成直径为20mm的圆形盖玻片，以备置于12孔板。

3、将专用爬片或剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗15-20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，然后用三蒸水冲洗3遍，放在底部铺有一层脱脂纱布的玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。其中，清洗爬片时需要避免爬片因水流张力而重叠，可用眼科小镊子轻轻夹住爬片的边缘单独冲洗干净，这一环节对细胞牢固贴壁至关重要。

4、高压消毒后取出爬片放入烤箱中烤干，放入超净台中备用。

二、细胞爬片

1、先将无菌爬片完全浸入培养液内，然后用无菌小镊子夹着放入12孔培养板内。由于浸过培养液的爬片依靠液体表面的张力可以使爬片与培养板孔底贴和紧密，防止添加细胞悬液时玻片漂起，利于细胞长到爬片上，避免了大部分细胞在爬片与培养板之间的空隙内生长而爬片上的细胞却很稀少的现象。

2、用胰酶将细胞从培养瓶中消化下来，离心后将细胞重悬于2ml培养液中，计数细胞浓度。种板时细胞合适的浓度约为1.25～2×10⁵个/ml左右，既能避免细胞增殖受限，使单个细胞在爬片上充分展开，又能保证细胞在种板24小时后完全贴壁且生长面积达到85%以上，有效防止了在后期操作中细胞从爬片上脱落。根据实际操作经验，12孔板每孔接种的细胞悬液量为1ml。

3、用1ml移液枪吸取细胞悬液，于距离培养板底部约3～5cm正上方处垂直、快速地将细胞悬液一次完全打出，使细胞在冲力的作用下均匀分布在爬片上。按照传统细胞种板方法，枪头靠近孔底后再将细胞悬液打出，致使细胞密度不均一，大量细胞堆积。在实际操作中，即使采用十字交叉法摇匀，细胞仍然出现严重分布不均地现象，可能与孔径较小有关。

4、待细胞种板24h后，细胞贴壁牢固，生长面积达到培养孔的85%时去掉上清液，加不含血清的DMEM培养液继续培养。

三、细胞爬片的固定

1、提前一天配制4%多聚甲醛固定液：称取4g多聚甲醛加入100ml0.01M PBS中溶解，65℃水浴磁力搅拌3h，待溶液完全澄清后放入4℃冷藏备用。

2、将培养板从培养箱取出后，用移液枪将上清液吸弃后，另吸取1ml预冷的PBS沿着孔壁缓慢打入，轻轻摇晃培养板10次后将PBS吸出，完成对细胞的第一次清洗，并重复2次，尽量将细胞碎片和细胞代谢产物洗净，以免在后续的实验中得到假阳性结果。

3、每孔加入1ml4%多聚甲醛进行固定，室温下孵育30～50min，每隔10min轻轻摇晃培养板，使固定液与贴壁细胞充分接触。

4、同步骤2，用PBS将固定液洗净，重复3次。洗净后，加入2ml PBS浸泡已被固定的细胞，并每周换一次PBS，于4℃环境可保存半年。这种保存方法避免了环境因素对样本的影响。

四、免疫细胞化学染色

1、取出爬片，37℃复温。

2、0.01M PBS（pH=7.4）浸泡洗5min/次，共洗3次。

3、每张爬片加50μl的细胞通透剂曲拉通100，室温下孵育15～35min。

4、0.01M PBS（pH7.4）浸泡洗5min/次，共洗3次。

5、每张爬片加50μl正常非免疫血清，37℃孵育20min，吸去多余液体。

6、每张爬片加50μl的第一抗体，4℃孵育过夜或37℃1h。

7、0.01M PBS浸泡洗5min/次，共洗3次。

8、每张爬片加50μl生物素标记的第二抗体，37℃孵育40～60min。

9、0.01M PBS浸泡洗5min/次，共洗3次。

10、每张爬片加50μl辣根过氧化酶标记链亲和素溶液（1:400倍稀释），37℃孵育40min。

11、0.01M PBS浸泡洗5min/次，共洗3次。

12、每张爬片加100μl新鲜配制的二氨基苯联胺（DAB）工作液，显微镜下观察随时终止反应。

13、自来水浸泡洗5min，苏木素复染3-10min，自来水浸泡洗5min，晾干，中性树胶封固。

14、采集图片。

除了上面做的12孔细胞板外，本发明还做了6孔板和24孔板的试验，都收到了同样的效果。6孔板和24孔板每孔接种的细胞悬液量分别为2ml和0.5ml，使其每孔中的细胞密度基本一致。

依据上述细胞爬片的制备方法，对爬片的小鼠生精细胞进行免疫化学染色，观测生精细胞凋亡相关膜蛋白（Ⅱ型跨膜糖蛋白，FasL）的表达，进一步说明本发明，但本发明的权利要求不仅限于实施例。

实施例1：

首先将湿润的12个无菌爬片用镊子分别轻轻放入12孔培养板底部。然后取对数生长期的细胞，用预热的0.25%的胰酶进行消化，将细胞吹打成单细胞悬液，将细胞密度调整为1.25×10⁵/ml左右，用1ml移液枪吸取1ml细胞悬液，于距离12孔板底部约3cm左右正上方垂直、快速地将细胞悬液一次完全打出，在37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。次日细胞贴壁后，吸弃培养液，用PBS洗细胞一次，加入不含血清的DMEM培养液，每孔1ml。将12孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养24h后，将其从培养箱中拿出，弃去上清液，用预冷的PBS洗细胞3次后加入1ml4%多聚甲醛固定30min，弃去固定液后再用预冷的PBS洗3次。

取出经过固定的爬片，37℃复温。用0.01M PBS（pH=7.4）浸泡洗5min/次，重复三次。每张爬片加50μl的细胞通透剂曲拉通100，室温下孵育15min，0.01M PBS（pH7.4）浸泡洗5min/次，重复3次。然后每张爬片加50μl正常非免疫血清，37℃孵育20min，吸去多余液体。每张爬片加50μl第一抗体（FasL，1:25稀释），37℃孵育1h，用PBS洗三次，每张爬片加50μl生物素标记的第二抗体（1:200稀释），37℃孵育40min。PBS洗三次，每张爬片加50μl辣根过氧化酶标记链亲和素溶液（1：400倍稀释），37℃孵育40min后用PBS洗三次，每张爬片加100μl新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察随时终止反应。自来水浸泡洗5min，2%苏木素复染3-10min，自来水浸泡洗5min，晾干，中性树胶封固，在倒置显微镜下采集图片。

结果显示：细胞爬片紧贴在培养板底部，接种的细胞90%以上都在爬片上生长，且细胞均匀分布于爬片上，未出现细胞之间相互重叠的现象。在对细胞爬片进行免疫细胞化学染色处理时，细胞未出现脱片现象，细胞染色均匀、阳性结果明显。

实施例2：

将湿润的无菌爬片用镊子轻放入12孔板底部，然后取对数生长期的细胞，用预热的0.25%的胰酶进行消化，将细胞吹打成单细胞悬液，将细胞密度调整为1.5×10⁵/ml左右，用1ml移液枪吸取1ml细胞悬液，于距离12孔板底部约4cm左右正上方垂直、快速地将细胞悬液一次完全打出，在37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。次日细胞贴壁后，吸弃培养液，用PBS缓冲液冲洗细胞一次，加入不含血清的DMEM培养液，每孔1ml。将12孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养24h后，将其从培养箱中拿出，弃去上清液，用预冷的PBS洗细胞3次后加入1ml4%多聚甲醛固定40min，弃去固定液后再用预冷的PBS洗3次。

取出经过固定的爬片，37℃复温。用0.01M PBS（pH=7.4）浸泡洗5min/次，重复三次。每张爬片加50μl的细胞通透剂曲拉通100，室温下孵育25min，0.01M PBS（pH7.4）浸泡洗5min/次，重复三次。然后每张爬片加50μl正常非免疫血清，37℃孵育20min，吸去多余液体。每张爬片加50μl第一抗体（FasL，1:25稀释），4℃孵育过夜。第二天，用PBS洗三次，每张爬片加50μl生物素标记的第二抗体（1:200稀释），37℃孵育50min。PBS洗三次，每张爬片加50μl辣根过氧化酶标记链亲和素溶液（1:400倍稀释），37℃孵育40min后用PBS洗三次，每张爬片加100μl新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察随时终止反应。自来水浸泡洗5min，2%苏木素复染3-10min，再用自来水浸泡洗5min，晾干，中性树胶封固，在倒置显微镜下采集图片如图2A和图2B所示。

结果显示：实施例2的结果基本同实施例1。

图1A和图1B是对按照公知技术制备的小鼠精原细胞GC-1spg爬片进行免疫化学染色，检测细胞内FasL蛋白的表达（1A，100×；1B，400×）。

图2A和图2B是对依照实施例2制备的小鼠精原细胞GC-1spg爬片进行免疫化学染色，检测细胞内FasL蛋白表达（2A，100×；2B，400×）。由图可以看出，公知技术的爬片中，细胞呈现脱片、重叠和分布不均匀的现象；而本发明的爬片中，细胞贴壁较牢固，没有出现脱片和重叠的现象，而且分布较均匀。

图中：

→指示FasL蛋白表达阳性细胞，呈棕褐色。

▲指示细胞脱片。

指示细胞密度不均匀。

指示细胞重叠。

□指示被原位放大400倍处。

实施例3：

将湿润的无菌爬片用镊子轻放入12孔板底部，然后取对数生长期的细胞，用预热的0.25%的胰酶进行消化，将细胞吹打成单细胞悬液，将细胞密度调整为2.0×10⁵/ml左右，用1ml移液枪吸取1ml细胞悬液，于距离12孔板底部约5cm左右正上方垂直、快速地将细胞悬液一次完全打出，在37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。次日细胞贴壁后，吸弃培养液，用PBS洗细胞一次，加入不含血清的DMEM培养液，每孔1ml。将12孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养24h后，将其从培养箱中拿出，弃去上清液，用预冷的PBS洗细胞3次后加入1ml4%多聚甲醛固定50min，弃去固定液后再用预冷的PBS洗3次。

取出经过固定的爬片，37℃复温。用0.01M PBS（pH=7.4）浸泡洗5min/次，重复3次。然后每张爬片加50μl的细胞通透剂曲拉通100，室温下孵育35min，0.01M PBS（pH7.4）浸泡洗5min/次，共洗3次。之后每张爬片加50μl正常非免疫血清，37℃孵育20min，吸去多余液体。每张爬片加50μl第一抗体（FasL，1:25稀释），4℃孵育过夜。第二天，用PBS洗三次，每张爬片加50μl生物素标记的第二抗体（1:200稀释），37℃孵育60min。PBS洗三次，每张爬片加50μl辣根过氧化酶标记链亲和素溶液（1:400倍稀释），37℃孵育40min后再用PBS洗三次，每张爬片加100μl新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察随时终止反应。自来水浸泡洗5min，2%苏木素复染3-10min，自来水浸泡洗5min，晾干，中性树胶封固，在倒置显微镜下采集图片。

结果显示：实施例3的结果基本同实施例1。

Claims

1.一种细胞爬片的制备方法，其步骤为：

1）根据需要剪裁爬片，清洗和消毒后取出烤干备用；

2）将消毒后的爬片完全浸入培养液内，然后放入培养板内；

3）将细胞重悬于培养基中，细胞浓度为1.25～2×10⁵个/ml；

6）将培养板取出，弃去上清液，吸取磷酸盐缓冲液对细胞进行清洗；

7）培养板中加入固定液进行固定，固定条件是室温下30～50min，每隔10min轻轻摇晃培养板，使固定液与贴壁细胞充分接触；

8）重复用磷酸盐缓冲液洗净固定液，加入磷酸盐缓冲液浸泡并经常更换磷酸盐缓冲液，以避免环境因素对样本的影响；

9）免疫细胞化学染色。

2.根据权利要求1所述细胞爬片的制备方法，其中，步骤1中爬片的清洗和消毒是：置于浓硫酸中浸泡，用水冲洗，再置于无水酒清中浸泡，之后用三蒸水冲洗多次，放在铺有脱脂纱布的玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

3.根据权利要求1所述细胞爬片的制备方法，其中，步骤2中的培养液是含血清的达尔伯克必需基本培养液。

4.根据权利要求1所述细胞爬片的制备方法，其中，步骤5中是指细胞贴壁牢固，生长面积达到培养孔的85%时去掉上清液，加不含血清的达尔伯克必需基本培养液继续培养。

5.根据权利要求1所述细胞爬片的制备方法，其中，步骤6中是重复吸取磷酸盐缓冲液对细胞进行清洗。

6.根据权利要求1所述细胞爬片的制备方法，其中，步骤7中的固定液是4%多聚甲醛固定液。

7.根据权利要求1所述细胞爬片的制备方法，其中，磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。