CN104830686A - 一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法 - Google Patents

一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法。本发明针对不同的细胞培养需求，采用生物性能较好的天然蛋白类物质和聚乳酸为原料制备电纺溶液，通过静电纺丝在普通盖玻片表面制成三维多孔结构的纳米纤维膜。采用本发明方法制备的细胞爬片，安全无毒、可降解、针对性强，更有利于细胞的粘附、生长、增殖和培养，可有效提高体外细胞培养的实验效果；本发明克服了现有细胞爬片制备技术单一、培养效果欠佳的缺点，具有效果显著、简便易行、成本低廉，利于推广的优点。

Description

一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法
技术领域：
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及细胞爬片的制备方法，尤其涉及一种通过静电纺丝制备细胞爬片的制备方法。
背景技术：
细胞爬片是将玻片浸入细胞培养基中，使细胞在玻片上生长，以此进行生物体外实验。利用细胞爬片进行体外细胞实验时，可以有效避免一些体内实验的干扰因素，但细胞爬片的种类、质量也同样成为体外实验中的干扰因素。因此，需要对细胞爬片进行相关处理，以减少实验干扰因素，从而获得准确的实验结果。
通过静电纺丝技术制备出的纳米纤维膜具有三维多孔结构，纤维直径在几十纳米到几微米之间，与细胞外基质在结构上存在一定的相似性，因而被经常用于模拟天然的细胞外基质。此外，因纳米纤维膜拥有较高的比表面积和孔隙率，更加有利于细胞的吸附、生长和增殖，是制备细胞培养载体、组织工程支架、伤口创伤敷料、药物控释剂的优良材料。
玉米醇溶蛋白是一种从玉米蛋白粉中提取出来的天然蛋白类物质，拥有优良的生物性能，被广泛地应用于细胞载体材料等医学卫生领域。在申请号为20120084617.7的专利文献中，公开了一种用于细胞培养的玉米醇溶蛋白纳米纤维膜的制备方法，具体通过静电纺丝制得玉米醇溶蛋白和聚乙烯醇纳米纤维膜，并作为细胞培养的载体材料。
林蛙皮胶原蛋白是一种从林蛙皮中提取出来的天然蛋白类物质，同样拥有优良的生物性能。在申请号为201410117708.5的专利文献中，公开了一种林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备方法，其中记载了以林蛙皮为原料提取胶原蛋白，再通过静电纺丝制得林蛙皮胶原蛋白纤维膜，用于制作各种医用创伤辅料。
关于细胞爬片的制备方法，在申请号为201410141763.8的专利文献中，仅记载了一种直接把消毒后的玻片浸入培养液中，再放置于培养板，注入细胞悬垂液进行后续的培养的方法。但至今未见对玻片表面进行其他处理，以提高其细胞培养效果的记载。
发明内容：
本发明目的是为了提高细胞爬片的细胞培养效果，提供一种以天然蛋白为纺丝原料，通过静电纺丝制备细胞爬片的方法。
具体而言，本发明针对不同的细胞培养需求，采用生物性能较好的天然蛋白类物质，如玉米醇溶蛋白或林蛙皮胶原蛋白，以及聚乳酸为原料，溶于六氟异丙醇配制成电纺溶液，再通过静电纺丝制备出安全、无毒、可降解、针对性强的细胞爬片，使之更有利于细胞的粘附、生长、增殖和培养，有效提高体外细胞培养效果。
本发明为解决技术问题而采用如下技术方案：
一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法，包括如下步骤：
(1)取盖玻片，用蒸馏水浸泡后冲洗，于紫外灯下照射灭菌；
(2)分别称取玉米醇溶蛋白或林蛙皮胶原蛋白与聚乳酸，使二者的质量比为1∶1至5∶1，溶于六氟异丙醇中，配制成质量百分比浓度为10％的纺丝溶液；
(3)将前述盖玻片贴附于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)按设定的纺丝电压、纺丝距离、纺丝速率，使用上述配制好的纺丝溶液进行静电纺丝；
(5)将盖玻片取下，真空干燥后，得到细胞爬片。
所述步骤(2)中所述的玉米醇溶蛋白或林蛙皮胶原蛋白与聚乳酸的质量比优选为3∶1。
所述步骤(4)中使用玉米醇蛋白与聚乳酸配制的纺丝溶液的静电纺丝条件为：所述的纺丝电压为13-17KV，纺丝距离为10-14cm，纺丝速率为0.5-0.7ml/h。
所述步骤(4)中使用林蛙皮胶原蛋白与聚乳酸配制的纺丝溶液的静电纺丝条件为：纺丝电压13-17KV，纺丝距离为10-15cm，纺丝速率为0.8-1.2ml/h。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
本发明针对不同的细胞培养需求，采用生物性能较好的天然蛋白类物质和聚乳酸为原料制备电纺溶液，通过静电纺丝在普通盖玻片表面制成三维多孔结构的纳米纤维膜。采用本发明方法制备的细胞爬片，安全无毒、可降解、针对性强，更有利于细胞的粘附、生长、增殖和培养，可有效提高体外细胞培养的实验效果；本发明克服了现有细胞爬片制备技术单一、培养效果欠佳的缺点，具有效果显著、简便易行、成本低廉，利于推广的优点。
附图说明
图1为实施例1中制备的细胞爬片实物照片；
图2为实施例1中制备的细胞爬片的微观扫描电镜照片；
图3为实施例4中制备的细胞爬片的微观扫描电镜照片；
图4为应用实施例1中细胞培养的电镜照片；
图5为应用实施例2中细胞培养的电镜照片
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进一步说明，但这些实施例仅用于解释本发明，对本发明的范围并不构成限制。
实施例1
(1)取盖玻片15个，使用蒸馏水浸泡冲洗后，放入紫外灯光下照射2h；
(2)分别称取玉米醇溶蛋白0.601g，以及聚乳酸0.198g，溶于4.5ml的六氟异丙醇(25℃，密度1.596g/ml)中，磁力搅拌2h；
(3)将盖玻片粘贴于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)调节静电纺丝条件中的电压为15kv，纺丝距离12cm，纺丝速率0.6ml/h进行静电纺丝；
(5)将接收装置上贴附的盖玻片取下，在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱中恒温干燥24h，得到细胞爬片(见图1和图2)。
实施例2
(1)取盖玻片15个，使用蒸馏水浸泡冲洗后，放入紫外灯光下照射2h；
(2)分别称取玉米醇溶蛋白0.666g，以及聚乳酸0.133g，溶于4.5ml的六氟异丙醇(25℃，密度1.596g/ml)中，磁力搅拌2h；
(3)将盖玻片粘贴于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)调节静电纺丝条件中的电压为13kv，纺丝距离10cm，纺丝速率0.5ml/h，进行静电纺丝；
(5)将接收装置上贴附的盖玻片取下，在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱中恒温干燥24h，得到细胞爬片。
实施例3
(1)取盖玻片15个，使用蒸馏水浸泡冲洗后，放入紫外灯光下照射2h；
(2)分别称取玉米醇溶蛋白1.066g，以及聚乳酸0.532g，溶于9.0ml的六氟异丙醇(25℃，密度1.596g/ml)中，磁力搅拌2h；
(3)将盖玻片粘贴于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)调节静电纺丝条件中的电压为17kv，纺丝距离14cm，纺丝速率0.7ml/h，进行静电纺丝；
(5)将接收装置上贴附的盖玻片取下，在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱中恒温干燥24h，得到细胞爬片。
实施例4
(1)取盖玻片15个，使用蒸馏水浸泡冲洗后，放入紫外灯光下照射2h；
(2)分别称取林蛙皮胶原蛋白0.601g，以及聚乳酸0.198g，溶于4.5ml的六氟异丙醇(25℃，密度1.596g/ml)中，磁力搅拌2h；
(3)将盖玻片粘贴于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)调节静电纺丝条件中的电压为15kv，纺丝距离12.5cm，纺丝速率1ml/h，进行静电纺丝；
(5)将接收装置上贴附的盖玻片取下，在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱中恒温干燥24h，得到细胞爬片(见图3)。
实施例5
(1)取盖玻片15个，使用蒸馏水浸泡冲洗后，放入紫外灯光下照射2h；
(2)分别称取林蛙皮胶原蛋白1.278g，以及聚乳酸0.320g，溶于9.0ml的六氟异丙醇(25℃，密度1.596g/ml)中，磁力搅拌2h；
(3)将盖玻片粘贴于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)调节静电纺丝条件中的电压为13kv，纺丝距离10cm，纺丝速率0.8ml/h，进行静电纺丝；
(5)将接收装置上贴附的盖玻片取下，在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱中恒温干燥24h，得到细胞爬片。
实施例6
(1)取盖玻片15个，使用蒸馏水浸泡冲洗后，放入紫外灯光下照射2h；
(2)分别称取林蛙皮胶原蛋白0.799g，以及聚乳酸0.799g，溶于9.0ml的六氟异丙醇(25℃，密度1.596g/ml)中，磁力搅拌2h；
(3)将盖玻片粘贴于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)调节静电纺丝条件中的电压为17kv，纺丝距离15cm，纺丝速率1.2ml/h，进行静电纺丝；
(5)将接收装置上贴附的盖玻片取下，在温度为37℃，真空度为0.09MPa的真空干燥箱中恒温干燥24h，得到细胞爬片。
应用实施例
1、人骨髓间充质干细胞在细胞爬片上的培养
1.1.原料：实施例1准备的细胞爬片、人骨髓间充质干细胞
1.2.方法：将实施例1准备的细胞爬片在紫外光照射2h进行灭菌消毒处理，然后在无菌条件下放置于24孔细胞培养板内，悬垂滴入1ml细胞培养液，将细胞密度2×104个/ml的人骨髓间充质干细胞植入培养板中进行细胞培养。经过5天细胞培养后，将细胞爬片进行脱水、喷金处理，使用扫描电子显微镜观察细胞爬片上细胞生长形态。
1.3.结果：图4显示为实施例1制备的细胞爬片上人骨髓间充质干细胞的生长形态，可见细胞粘附在细胞爬片的纤维膜上，呈梭性，有较多明显突起伸出，细胞长势良好，证明其细胞培养效果优良。
2、人表皮成纤维细胞在细胞爬片上的培养
2.1.原料：实施例4制备的细胞爬片、人表皮成纤维细胞
2.2.方法：将实施例4制备的细胞爬片在紫外光照射2h进行灭菌消毒处理，然后在无菌条件下放置于24孔细胞培养板内，悬垂滴入1ml细胞培养液，将细胞密度2×104个/ml的人表皮成纤维细胞植入培养板中进行细胞培养。经过7天细胞培养后，将细胞爬片进行脱水、喷金处理，使用扫描电子显微镜观察细胞爬片上细胞生长形态。
2.3.结果：图5显示为实施例4制备的细胞爬片上人表皮成纤维细胞的生长形态，可见细胞粘附在细胞爬片上的纤维膜上，呈极性排列，较多明显突起伸出，细胞长势良好，证明其细胞培养效果优良。

Claims (4)

1.一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取盖玻片，用蒸馏水浸泡后冲洗，于紫外灯下照射灭菌；
(2)分别称取玉米醇溶蛋白或林蛙皮胶原蛋白与聚乳酸，使二者的质量比为1:1至5:1，溶于六氟异丙醇中，配制成质量百分比浓度为10％的纺丝溶液；
(3)将前述盖玻片贴附于静电纺丝装置中的接收装置表面；
(4)按设定的纺丝电压、纺丝距离、纺丝速率，使用上述配制好的纺丝溶液进行静电纺丝；
(5)将盖玻片取下，真空干燥后，得到细胞爬片。
2.根据权利要求1所述一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的玉米醇溶蛋白或林蛙皮胶原蛋白与聚乳酸的质量比为3:1。
3.根据权利要求1或2所述一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法，其特征在于，步骤(4)中使用玉米醇蛋白与聚乳酸配制的纺丝溶液的静电纺丝条件为：纺丝电压为13-17KV，纺丝距离为10-14cm，纺丝速率为0.5-0.7ml/h。
4.根据权利要求1或2所述一种通过静电纺丝制备细胞爬片的方法，其特征在于，步骤(4)中使用林蛙皮胶原蛋白与聚乳酸配制的纺丝溶液的静电纺丝条件为：纺丝电压为13-17KV，纺丝距离为10-15cm，纺丝速率为0.8-1.2ml/h。
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