CN103835066A - 一种林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以林蛙皮为原料制备无毒且透明的胶原蛋白纤维膜的制备方法。该方法以林蛙皮为原料提取胶原蛋白,将其溶解于醋酸中进行电纺,制备出具有生物相容性、生物降解性、安全无毒、材质透明的林蛙皮胶原蛋白纤维膜。由此克服了现有技术制备的胶原蛋白纤维膜材质不透明、有残余溶剂毒性等缺点。采用本发明制备的林蛙皮胶原蛋白纤维膜安全无毒,可用于制作各种医用创伤敷料,且易于观察创伤修复状态,使治疗过程安全可控。
Description
技术领域:本发明涉及胶原蛋白的制备方法,尤其是涉及一种林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备方法。
背景技术:
胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质,是腱软骨皮肤和血管的主要成分,占蛋白质总量的25%~30%。胶原蛋白具有独特的三重螺旋结构,分子结构非常稳定,并且具有低免疫原性和良好的生物相容性。胶原蛋白在水、弱酸和弱碱中不降解,且在煮沸后变为可溶的单链结构的明胶,但由于胶原蛋白的分子量比明胶大,具有更高的生物活性,因此,胶原蛋白更适合生物组织利用,更易促进受损组织再生,缩短愈合过程。
由于疯牛病和口蹄疫等动物传染性疾病全球肆虐,目前亟待寻找更高质量和更高安全性的未变性天然胶原蛋白的提取原材料。众所周知,水产动物比陆生动物在安全性上具有更大的优势,因此水产动物已经成为未变性天然胶原蛋白的优选原材料,其中,林蛙因其天然安全性成为优中之选。
胶原蛋白膜作为一种医用创伤敷料,可用于创面愈合,细胞增殖等一系列皮肤组织修复。目前,以胶原蛋白复合高聚物为原料制备纤维膜的制备工艺研究已取得一定进展,其主要工艺方法是以哺乳动物,如鼠、猪、牛的皮肤或肌腱中分离提取胶原蛋白,再将胶原蛋白与高聚物共混后进行电纺,以制备胶原蛋白纤维膜。
例如由Bin Dong等人发表在Macromolecular Journals(2009,30,539-542)的文章Electrospinning of Collagen Nanofiber Scaffolds from Benign Solvents中记载,将以牛皮为原料提取的胶原蛋白溶于水、酒精、盐的混合溶液中进行电纺制备纤维膜。但由此制备的胶原蛋白纤维膜作为创伤敷料使用时,存在材质不透明、有残余溶剂毒性等缺点。
发明内容:本发明的目的是为克服现有技术的缺点,旨在公开一种以林蛙皮为原料,制备出安全无毒、材质透明的林蛙皮胶原蛋白纤维膜的方法。
本发明为解决技术问题而采用如下技术方案:
1、一种林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备方法,其步骤如下:
(1)林蛙皮胶原蛋白肽的制备
①脱色:称取干燥林蛙皮,用水浸泡至舒展变软后,加入到 0.05mol/L的NaOH水溶液和1%w/vH2O2水溶液的混合溶液中浸没静置,其中NaOH水溶液与H2O2水溶液的体积比为1~3:1,搅拌,每2~4h更换一次混合溶液,直至溶液中无可见色素产生,将林蛙皮用蒸馏水清洗,于25~45℃烘干;
②脱脂:将烘干后的林蛙皮放入丙酮中浸没静置,恒温25±10℃,搅拌2~3d,期间每3-4h更换一次丙酮,以蒸馏水洗去林蛙皮上的残余脂肪;
③酸酶提取:将脱脂、脱色处理后的林蛙皮放入0.5~1mol/L乙酸水溶液中,林蛙皮与乙酸水溶液的质量体积比为1:100g/ml,并加入规格为3.000-3.500NFU/mg的胃蛋白酶,林蛙皮与胃蛋白酶的质量比为20~100:1,置于35±10℃恒温水浴中,搅拌24~96h,得林蛙皮的酸酶提取液;
④乙二胺四乙酸灭酶活:向林蛙皮的酸酶提取液中加入乙二胺四乙酸,其中林蛙皮与乙二胺四乙酸质量比为33~167:1,静置1~10h;
⑤离心:将静置后的林蛙皮酸酶提取液离心10~30min,转数为4000~10000r/min,合并收集上清液;
⑥盐析:向上述上清液中加入NaCl,使NaCl浓度为4~5mol/L,搅拌12~24h后,静置12~24h,以转数5000~10000r/min离心20~40min,除去上清液,取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,其中每1L缓冲溶液含有NaCl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol,并加入HCl调节PH值至7.2~7.6,且林蛙皮与缓冲溶液的质量体积比1:20~50g/mL,向上述缓冲溶液加入NaCl,使NaCl的浓度为1.7~2.4mol/L,静置12h,以转数5000~10000r/min,离心30~60min,得沉淀;
⑦透析:将上述沉淀溶于1%w/v乙酸水溶液中,且林蛙皮与乙酸水溶液的质量体积比为1:10~50g/mL,将乙酸水溶液装入透析袋中,再将透析袋浸入蒸馏水中透析3~7d,更换蒸馏水至其中无氯离子产生;
⑧聚乙二醇20000浓缩:将上述透析袋埋到固体聚乙二醇20000中,更换浸湿的聚乙二醇20000,至透析袋中的溶液浓缩至原体积的1/2;
⑨冷冻干燥:将上述浓缩后的溶液经预冻后,放入冻干机中真空冷冻干燥,制得林蛙皮胶原蛋白肽;
(2)林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备
①取林蛙皮胶原蛋白肽制成浓度为0.05~0.10g/ml的醋酸溶液,搅拌12h;
②调节静电纺丝条件中的电压至10~15V、纺丝距离10~15cm、纺丝速度0.5~1ml/h,电纺得林蛙皮胶原蛋白纤维膜。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果:
本发明公开的制备方法是以林蛙皮为原料,提取出胶原蛋白后,使用温和溶剂,不添加任何高聚物,将其溶解于醋酸中进行电纺,制备出安全无毒、材质透明的林蛙皮胶原蛋白纤维膜。由此克服了现有技术制备的胶原蛋白纤维膜材质不透明、有残余溶剂毒性等缺点。采用本发明制备的林蛙皮胶原蛋白纤维膜安全无毒,可用于制作各种医用创伤敷料,且易于观察创伤修复状态,使治疗过程安全可控。
附图说明:
图1是采用本申请实施例1制备的林蛙皮胶原蛋白纤维膜照片
具体实施方式
下面结合附图给出的实施例,对本发明作进一步的描述;但这些实施例仅用于解释本发明,对本发明的范围并不构成限制。
实施例1:
(1)林蛙皮胶原蛋白肽的制备
①脱色:称取干燥林蛙皮10g,,用蒸馏水浸泡至舒展变软后,加入到0.05mol/L的NaOH水溶液和1%w/vH2O2水溶液的混合溶液中浸没静置其中NaOH水溶液与H2O2水溶液的体积比为1:1,搅拌,每3h更换一次溶液,直至溶液中无可见色素产生,将林蛙皮用蒸馏水清洗,于40℃烘干;
②脱脂:将烘干后的林蛙皮在丙酮中浸没静置,恒温25℃,用搅拌器持续搅拌2d,每3h更换一次丙酮,以蒸馏水洗去残余脂肪。
③酸酶提取:将脱脂、脱色处理后的林蛙皮放入1L0.5mol/L乙酸水溶液中,并加入规格为3.000-3.500NFU/mg的胃蛋白酶0.20g,置于37℃恒温水浴中,搅拌72h,得林蛙皮的酸酶提取液620ml;
④乙二胺四乙酸灭酶活:向林蛙皮的酸酶提取液620ml中加入乙二胺四乙酸0.12g,静置5h;
⑤离心:将静止后的林蛙皮的酸酶提取液620ml,离心20min,转数8000r/min,合并收集得上清液605ml;
⑥盐析:向上述605ml上清液中加入NaCl141.42g,使NaCl浓度为 4mol/L,持续搅拌12h后静置12h,以转数7000r/min离心20min,除去上清液,取沉淀溶于300mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,其中每1L该缓冲溶液含有NaCl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol,并加入HCl调节PH值至7.4,向上述缓冲溶液中加入NaCl16.36g,使NaCl的浓度为2.4mol/L,静置12h,以转数7000r/min离心50min,得沉淀;
⑦透析:将上述沉淀溶于300mL1%w/v乙酸水溶液后装入透析袋中,将透析袋浸入蒸馏水中透析5d,更换蒸馏水,使用AgNO3检测透析中的氯离子,至蒸馏水中无氯离子产生;
⑧聚乙二醇20000浓缩:将上述透析袋埋到固体聚乙二醇20000中,更换浸湿的聚乙二醇20000,至透析袋中的溶液浓缩至150mL;
⑨冷冻干燥:将上述浓缩后的溶液经预冻后,放入冻干机中真空冷冻干燥,制得胶原蛋白肽1.9601g;
(2)林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备
①称取林蛙皮胶原蛋白肽0.0766g溶于1ml醋酸中,搅拌12h;
②调节静电纺丝条件中的电压至17V、纺丝距离12cm、纺丝速度1ml/h,电纺得林蛙皮胶原蛋白纤维膜,称重为0.0753g,如图1所示。
实施例2:
(1)林蛙皮胶原蛋白肽的制备
①脱色:称取干燥林蛙皮10g,,用蒸馏水浸泡至舒展变软后,加入到0.05mol/L NaOH水溶液和1%w/vH2O2水溶液的混合溶液中浸没静置,其中NaOH水溶液与H2O2水溶液的体积比为1:1,搅拌,每2h更换一次溶液,直至溶液中无可见色素产生,将蛙皮用蒸馏水清洗,于25℃烘干;
②脱脂:将烘干后的林蛙皮在丙酮中浸没静置,恒温15℃,用搅拌器持续搅拌2d,每3h更换一次丙酮,以蒸馏水洗去林蛙皮上的残余脂肪;
③酸酶提取:将脱脂、脱色处理后的林蛙皮放入1L0.5mol/L乙酸水溶液中,并加入规格为3.000-3.500NFU/mg的胃蛋白酶0.10g,置于25℃恒温水浴中,搅拌24h,得林蛙皮的酸酶提取液800ml;
④乙二胺四乙酸灭酶活:向林蛙皮的酸酶提取液800ml中加入乙二胺四乙酸0.06g,静置1h;
⑤离心:将静止后的林蛙皮的酸酶提取液800ml,离心10min,转数为4000r/min,合并收集得上清液780ml;
⑥盐析:向上述780ml上清液中加入182.33gNaCl,使NaCl浓度为4mol/L,持续搅拌12h后,静置12h,以转数5000r/min离心20min,除去上清液,取沉淀溶于200mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,每1L缓冲溶液含有NaCl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol,并加入数滴HCl调节溶液PH值至7.2,向上述缓冲溶液中加入NaCl8.18g,使NaCl的浓度为1.7mol/L,静置12h,以转数5000r/min离心30min,得沉淀;
⑦透析:将上述沉淀溶于100mL1%w/v乙酸水溶液后装入透析袋中,将透析袋浸入蒸馏水中透析3d,更换蒸馏水,使用AgNO3检测透析中的氯离子,至蒸馏水中无氯离子产生;
⑧聚乙二醇20000浓缩:将上述透析袋埋到固体聚乙二醇20000中,更换浸湿的聚乙二醇20000,至透析袋中的溶液浓缩至50mL;
⑨冷冻干燥:将上述浓缩后的溶液经预冻后,放入冻干机中真空冷冻干燥,制得胶原蛋白肽1.406g;
(2)林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备
①称取林蛙皮胶原蛋白肽0.0501g溶于1ml醋酸中,搅拌12h;
②调节静电纺丝条件中的电压至15V、纺丝距离10cm、纺丝速度1ml/h,电纺得林蛙皮胶原蛋白纤维膜,称重为0.0408g。
实施例3:
(1)林蛙皮胶原蛋白肽的制备
①脱色:称取干燥林蛙皮10g,,用蒸馏水浸泡至舒展变软后,加入到事先配制的0.05mol/L NaOH水溶液和1%w/vH2O2水溶液的混合溶液中浸没静置,其中NaOH水溶液与H2O2水溶液的体积比为3:1,搅拌,每4h更换一次溶液,直至溶液中无可见色素产生,将林蛙皮用蒸馏水清洗,于45℃烘干;
②脱脂:将烘干后的林蛙皮在丙酮中浸没静置,恒温35℃,用搅拌器持续搅拌3d,每4h更换一次丙酮,以蒸馏水洗去林蛙皮上的残余脂肪;
③酸酶提取:将脱脂、脱色处理后的林蛙皮放入1L1mol/L乙酸水溶液中,并加入规格为3.000-3.500NFU/mg的胃蛋白酶0.50g,置于45℃恒温水 浴中,搅拌96h,得林蛙皮的酸酶提取液550ml;
④乙二胺四乙酸灭酶活:向林蛙皮的酸酶提取液550ml中加入乙二胺四乙酸0.30g,静置10h;
⑤离心:将静止后的林蛙皮的酸酶提取液550ml,离心30min,转数10000r/min,合并收集得上清液540ml;
⑥盐析:向上述540ml上清液中加入157.95gNaCl,使NaCl浓度为5mol/L,持续搅拌24h后静置24h,以转数10000r/min离心40min,除去上清液,取沉淀溶于500mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,其中每1L缓冲溶液中含有NaCl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol,并加入数滴HCl调节PH值至7.6,向上述缓冲溶液中加入NaCl16.36g,使NaCl的浓度为2.4mol/L,静置12h,以转数10000r/min离心60min,得沉淀;
⑦透析:将上述沉淀溶于500mL1%w/v乙酸水溶液后装入透析袋中,将透析袋浸入蒸馏水中透析7d,更换蒸馏水,使用AgNO3检测透析中的氯离子,至蒸馏水中无氯离子产生;
⑧聚乙二醇20000浓缩:将上述透析袋埋到固体聚乙二醇20000中,更换浸湿的聚乙二醇20000,至透析袋中的溶液浓缩至250mL;
⑨冷冻干燥:将上述浓缩后的溶液经预冻后,放入冻干机中真空冷冻干燥,制得胶原蛋白肽1.638g;
(2)林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备
①称取前述林蛙皮胶原蛋白肽0.1021g溶于1ml醋酸中,搅拌12h;
②调节静电纺丝条件中的电压至20V、纺丝距离15cm、纺丝速度2ml/h,电纺得林蛙皮胶原蛋白纤维膜,称重为0.1004g。
Claims (1)
1.一种林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备方法,其特征为步骤如下:
(1)林蛙皮胶原蛋白肽的制备
①脱色:称取干燥林蛙皮,用水浸泡至舒展变软后,加入到0.05mol/L的NaOH水溶液和1%w/vH2O2水溶液的混合溶液中浸没静置,其中NaOH水溶液与H2O2水溶液的体积比为1~3:1,搅拌,每2~4h更换一次混合溶液,直至溶液中无可见色素产生,将林蛙皮用蒸馏水清洗,于25~45℃烘干;
②脱脂:将烘干后的林蛙皮放入丙酮中浸没静置,恒温25±10℃,搅拌2~3d,期间每3-4h更换一次丙酮,以蒸馏水洗去林蛙皮上的残余脂肪;
③酸酶提取:将脱脂、脱色处理后的林蛙皮放入0.5~1mol/L乙酸水溶液中,林蛙皮与乙酸水溶液的质量体积比为1:100g/ml,并加入规格为3.000-3.500NFU/mg的胃蛋白酶,林蛙皮与胃蛋白酶的质量比为20~100:1,置于35±10℃恒温水浴中,搅拌24~96h,得林蛙皮的酸酶提取液;
④乙二胺四乙酸灭酶活:向林蛙皮的酸酶提取液中加入乙二胺四乙酸,其中林蛙皮与乙二胺四乙酸质量比为33~167:1,静置1~10h;
⑤离心:将静置后的林蛙皮酸酶提取液离心10~30min,转数为4000~10000r/min,合并收集上清液;
⑥盐析:向上述上清液中加入NaCl,使NaCl浓度为4~5mol/L,搅拌12~24h后,静置12~24h,以转数5000~10000r/min离心20~40min,除去上清液,取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,其中每1L缓冲溶液含有NaCl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol,并加入HCl调节PH值至7.2~7.6,且林蛙皮与缓冲溶液的质量体积比1:20~50g/mL,向上述缓冲溶液加入NaCl,使NaCl的浓度为1.7~2.4mol/L,静置12h,以转数5000~10000r/min,离心30~60min,得沉淀;
⑦透析:将上述沉淀溶于1%w/v乙酸水溶液中,且林蛙皮与乙酸水溶液的质量体积比为1:10~50g/mL,将乙酸水溶液装入透析袋中,再将透析袋浸入蒸馏水中透析3~7d,更换蒸馏水至其中无氯离子产生;
⑧聚乙二醇20000浓缩:将上述透析袋埋到固体聚乙二醇20000中,更换浸湿的聚乙二醇20000,至透析袋中的溶液浓缩至原体积的1/2;
⑨冷冻干燥:将上述浓缩后的溶液经预冻后,放入冻干机中真空冷冻干燥,制得林蛙皮胶原蛋白肽;
(2)林蛙皮胶原蛋白纤维膜的制备
①取林蛙皮胶原蛋白肽制成浓度为0.05~0.10g/ml的醋酸溶液,搅拌12h;
②调节静电纺丝条件中的电压至10~15V、纺丝距离10~15cm、纺丝速度0.5~1ml/h,电纺得林蛙皮胶原蛋白纤维膜。
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