CN104774895A - 制备林蛙皮胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了制备林蛙皮胶原蛋白的方法，包括：获得林蛙皮粉；预处理；加入至醋酸溶液中，微波下辐照，搅拌，离心，获得沉淀和含有酸溶性胶原蛋白的溶液；将沉淀分散于含有胃蛋白酶的醋酸溶液中，离心获得上清液，上清液进行透析，离心以便获得沉淀，将沉淀溶于醋酸溶液中，以便获得含有酶溶性胶原蛋白的溶液；向含有酸溶性胶原蛋白的溶液和含有酶溶性胶原蛋白的溶液中添加NaCl，搅拌，静置，再加入NaCl和三羟甲基氨基甲烷，以便获得溶液；调节溶液pH值，以便获得沉淀，将沉淀溶解于醋酸溶液中，以便获得溶液，将溶液进行透析直至pH为中性，以便获得溶液；将溶液预冻后，干燥，以便获得林蛙皮胶原蛋白。利用该方法能够提高胶原蛋白提取率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及制备胶原蛋白的方法，更具体地，本发明涉及制备林蛙皮胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的三螺旋纤维蛋白质，其分子结构十分稳定，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌键、韧带和血管中，约占哺乳动物体内蛋白质总量的25％～30％，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的作用。有资料报道，胶原蛋白能有效增强人体皮肤组织细胞的储水能力，改善皮肤的弹性，舒缓皱纹；可促进骨的形成，增强低钙水平下的骨胶原结构，从而提高骨强度，预防骨质疏松症；可吸附肠道中的毒素和重金属，降低血清甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)；可用于制备手术缝合线、止血纤维或海绵、代血浆、人工血管、心脏瓣膜和人工皮肤等。此外，胶原含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸等中性和酸性氨基酸，生物可降解，具有优良的生物相容性与加工适应性、低免疫原性，这些均使得其在食品领域、化妆品领域、生物医学领域得到了广泛的应用。
目前，胶原蛋白制品主要是从一些陆生脊椎动物，如牛、猪、鸡等的皮肤、软骨、肌腱中提取。然而，近年来，由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等动物传染性疾病全球肆虐，再加上部分国家与民族的宗教和习俗限制，人们开始寻求从低等脊椎动物和无脊椎动物中提取胶原蛋白。研究表明，蛙皮中含有丰富的胶原蛋白，可作为胶原蛋白的一种潜在替代来源。
中国林蛙(Rana Chensinensis)又称哈什蟆，属两栖纲，无尾目，蛙科，蛙属，为我国特有的国家二级保护动物，主要生长在东北、华北及西部地区，是集药用、食补、美容于一体的珍贵蛙种，在我国具有悠久的药用历史，其干燥的输卵管是我国特产的1种具有滋补强壮作用的珍贵动物性中药材—蛤蟆油。近年来，随着人工养殖技术的成熟和完善，林蛙养殖量和商品量逐年增加，其资源十分丰富。据不完全统计，东北地区年产林蛙10亿余只，蛙油产量约200t，蛙油年产值10亿元左右。然而，蛙油仅占整蛙的15％。如将其它部位(脑、皮、肉和骨)作为废弃物或饲料处理，不仅会造成严重的资源浪费、而且会产生严重的环境污染。林蛙皮中含有丰富的蛋白质、氨基酸、胶原蛋白、抗菌肽和透明质酸等生物活性物质。近年来活体取蛙油技术的应用不仅能够获取良好品质的林蛙油，还能最大限度地保持林蛙活体各部位的生物活性。因此利用废弃的林蛙皮提取胶原蛋白可以在充分利用废弃生物资源的同时开发出高附加值的产品，具有重要的环境效益和经济效益。
至今为止国内外关于中国林蛙深加工的研究报道多集中于林蛙油、蛙体的制药及蛙肉的食用，有关林蛙皮的研究报道很少，袁德云等从林蛙皮中分离出了抗菌肽，王战勇等进一步探讨了林蛙皮抗菌肽对革兰氏阳性、阴性细菌和真菌的抗菌作用；吕玲玲等研究了林蛙皮的抗氧化性；邱芳萍等采用柱前衍生RP-HPLC法测定了林蛙皮胶原蛋白肽中18种氨基酸的含量。也有部分研究者对林蛙皮中胶原蛋白进行了提取，如吕玲玲等应用木瓜蛋白酶在室温下提取了林蛙皮胶原蛋白；王长周等应用碱性蛋白酶法在50℃下提取了林蛙皮胶原蛋白肽；张根生利用碱性蛋白酶等在50℃下提取了林蛙残体胶原蛋白；李琳琳等应用胃蛋白酶在37℃的条件下提取了林蛙皮胶原蛋白。
然而，目前制备林蛙皮胶原蛋白的技术仍有待改进。
发明内容
现有制备林蛙皮胶原蛋白的方法采用的温度较高，制备条件剧烈，制备的胶原蛋白提取产物多为明胶和水解胶原蛋白，对于具有生物活性的天然胶原的提取报道很少。虽然天然胶原、明胶及水解胶原蛋白具有同源性，但它们在结构和性能上却有很大的差异：(1)天然胶原保持了其本身的三股螺旋结构，相对分子质量为30万，而明胶已不具有三股螺旋结构，其相对分子质量分布从几万到10万，水解胶原蛋白则是多肽的混合物，其相对分子质量分布从几千到几万；(2)结构上的不同造成了它们性能上的差异，其中最为显著的差异是天然胶原能促进细胞粘附和生长，具有显著生物活性，而明胶和水解胶原蛋白因不具有促进细胞生长的能力，故它们不具有生物活性。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
根据提取介质的不同，提取胶原蛋白的传统方法主要划分为5种：酶法提取、酸法提取、盐法提取、碱法提取和热水法提取。传统的提取方法虽然有些已经很成熟，但是提取率低、提取温度高且提取时间较长，易造成胶原蛋白的水解、结构的破坏和生物活性的降低。1986年，Ganzler等报道了利用微波能从土壤、种子、食品、饲料中萃取分离各种类型化合物的样品制备新方法－微波萃取法。微波萃取法问世以来，由于其选择性高、萃取效率高、节约能源等优点而深受重视，应用范围从环境分析一直扩展到食品、化工、农业等领域，近年来，微波提取技术在蛋白质的提取中也有诸多应用，利用微波处理缩短提取时间，提高蛋白质得率的优越性已在许多研究结果中得到支持。故本发明采用酸酶法与微波萃取法相结合在低温条件下制备林蛙皮胶原蛋白，提出了一种制备林蛙皮胶原蛋白的方法，利用该方法，能够提高胶原蛋白提取率，缩短提取时间，并且由于提取条件温和，所以不会破坏蛋白的活性，制得的胶原蛋白的生物活性好。
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种制备林蛙皮胶原蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；(2)称取所述林蛙皮粉10g，进行脱色和脱脂处理，以便获得预处理的林蛙皮样品；(3)将所述预处理的林蛙皮样品加入至100～500mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有林蛙皮样品的醋酸溶液，将所述含有林蛙皮样品的醋酸溶液置于200～800W功率的微波下，辐照1～10min后，将经过微波处理的含有林蛙皮样品的醋酸溶液持续搅拌24～48h，离心，以便获得第一沉淀和含有酸溶性胶原蛋白的溶液和；(4)将所述第一沉淀分散于100～500mL含有0.01重量％～2重量％胃蛋白酶的1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得第一溶液，将所述第一溶液进行离心以便获得第一上清液，将所述第一上清液进行透析后，以便获得第一透析液，将所述第一透析液进行离心以便获得第二沉淀，将所述第二沉淀溶于100～300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有酶溶性胶原蛋白的溶液；(5)向所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液和所述含有酶溶性胶原蛋白的至少之一中添加NaCl，直至NaCl终浓度为0.7mol/L，以便获得第二溶液，搅拌6～12h后，静置12～24h后，再加入NaCl和三羟甲基氨基甲烷，直至NaCl终浓度为2.4～3mol/L，三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.1mol/L，以便获得第三溶液；(6)将所述第三溶液的pH值调节至7.0～7.5，搅拌6～12h，静置12h，离心，以便获得第三沉淀，将所述第三沉淀溶解于50～300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得第四溶液，将所述第四溶液进行透析直至pH为中性，以便获得第五溶液；(7)将所述第五溶液经-20℃过夜预冻后，真空冷冻干燥，以便获得林蛙皮胶原蛋白。利用该方法，能够提高胶原蛋白提取率，缩短提取时间，并且由于提取条件温和，所以不会破坏蛋白的活性，制得的胶原蛋白的生物活性好。
根据本发明的一个实施例，所述方法中步骤(2)中的所述脱色脱脂包括以下步骤：(2-1)将所述林蛙皮粉10g加入至100～500mL 0.3mol/L的NaOH溶液中，持续慢速搅拌24～120h，每4～8h更换新鲜的所述NaOH溶液，离心，以便获得经过NaOH溶液处理的林蛙皮样品，任选地，所述NaOH溶液中含有0％～3％过氧化氢；(2-2)将所述NaOH溶液处理的林蛙皮样品用10倍体积的4℃蒸馏水洗涤样品至中性，以便获得水洗至中性的林蛙皮样品；(2-3)将所述水洗至中性的林蛙皮样品加入至100～500mL 20％的正丁醇溶液中，持续搅拌24～72h，每4～8h更换新鲜的所述正丁醇溶液，离心，以便获得经过正丁醇溶液处理的林蛙皮样品；(2-4)将所述经过正丁醇溶液处理的林蛙皮样品用10倍体积4℃的蒸馏水洗涤三次，以便获得所述预处理的林蛙皮样品。利用该方法，能够进一步提高胶原蛋白提取率并且保证胶原蛋白的生物活性。
根据本发明的一个实施例，所述方法在步骤(4)之前，步骤(3)之后，进一步包括：将所述第一沉淀的至少一部分加入到100～500mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，并将所得到的混合物置于200～800W功率的微波下，辐照1～10min后，将经过辐照处理的混合物持续搅拌24～48h，离心，以便获得第四沉淀和含有酸溶性胶原蛋白的溶液，其中，将所述第四沉淀和所述第一沉淀其余部分的至少之一用于步骤(4)的处理。利用该方法，能够进一步提高胶原蛋白提取率并且保证胶原蛋白的生物活性。
根据本发明的一个实施例，所述方法中步骤(3)和步骤(4)中的离心分别独立地为在10000～30000g离心30～70min。利用该方法，能够进一步提高胶原蛋白提取率并且保证胶原蛋白的生物活性。
根据本发明的一个实施例，所述方法中步骤(4)中的所述透析是按照下列条件进行的：利用10～50倍体积pH 7.20.05mol/L Na2HPO4溶液对所述第一上清液进行透析3d，每12h更换一次新鲜的pH 7.20.05mol/L Na2HPO4溶液。利用该方法，能够进一步提高胶原蛋白提取率并且保证胶原蛋白的生物活性。
根据本发明的一个实施例，所述方法步骤(6)中，利用HCl或NaOH将所述第三溶液的pH值调节至7.0～7.5。利用该方法，能够进一步提高胶原蛋白提取率并且保证胶原蛋白的生物活性。
根据本发明的一个实施例，所述方法步骤(6)中所述透析包括以下步骤：利用10～50倍体积的0.1mol/L醋酸溶液为透析介质，进行透析24h，再以10～50倍体积的蒸馏水为透析介质进行透析直至pH为中性，透析过程中每12h更换一次新鲜的透析介质。利用该方法，能够进一步提高胶原蛋白提取率并且保证胶原蛋白的生物活性。
根据本发明的实施例，在制备胶原蛋白的过程中所有的提取步骤均是在低温下，最优选4摄氏度下进行的。换句话说，步骤(2)～(6)是在低温下，最优选4摄氏度下进行的。由此，可以显著地提高所得到胶原蛋白的生物活性和提取效率。温度过低或者过高都会使得提取效率或所得到产物的活性劣化。
根据本发明的另一方面，本发明又提出了一种制备林蛙皮胶原蛋白的方法，所述方法包括：(1)预处理：(1-1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，自来水洗净，室温自然干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；(1-2)将10g所述林蛙皮粉加入至含有1.5％过氧化氢的300mL 0.3mol/L的NaOH溶液中，持续搅拌96h，每6h更换一次新鲜的含有1.5％过氧化氢的0.3mol/L的NaOH溶液，以便获得第一林蛙皮样品，利用4℃10倍体积的蒸馏水将所述第一林蛙皮样品洗涤至中性，以便获得第二林蛙皮样品；(1-3)将所述第二林蛙皮样品加入至300mL 20％的正丁醇溶液中进行脱脂处理，持续慢速搅拌48h，每6h更换一次新鲜的20％的正丁醇溶液，以便获得第三林蛙皮样品；(1-4)利用4℃10倍体积的蒸馏水将所述第三林蛙皮样品洗涤三次，以便获得预处理的林蛙皮样品；(2)制备含有酸溶性胶原蛋白的溶液：(2-1)将所述预处理的林蛙皮样品加入至300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有林蛙皮样品的醋酸溶液，将所述含有林蛙皮样品的醋酸溶液置于500W的功率的微波下，辐照4min后，将经过微波处理的含有林蛙皮样品的醋酸溶液持续搅拌24～48h后在20000g离心45min，以便获得第一沉淀和所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液，将所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液置于4℃；(2-2)将所述第一沉淀重复两次步骤(2-1)，以便获得第二沉淀和所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液，将所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液置于4℃；(3)制备含有酶溶性胶原蛋白的溶液：(3-1)将所述第二沉淀分散于含有1重量％胃蛋白酶300mL1.0mol/L的醋酸溶液中，持续搅拌72h后，在20000g进行离心45min，以便获得第一上清液；(3-2)利用30倍体积的pH7.20.05mol/L Na2HPO4溶液对所述第一上清液进行透析处理3d，每12h更换一次新鲜的pH7.20.05mol/LNa2HPO4溶液后，以便获得第一透析液；(3-3)将所述第一透析液在20000g离心45min，以便获得第三沉淀；(3-4)将所述第三沉淀溶于200mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有酶溶性胶原蛋白的溶液，并将所述酶溶性胶原蛋白的溶液置于4℃；(4)纯化：(4-1)将所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液和所述酶溶性胶原蛋白的溶液合并后加入NaCl，直至NaCl终浓度为0.7mol/L，以便获得第一溶液；(4-2)将第一溶液搅拌9h后并静置12h后，加入NaCl直至NaCl终浓度为2.4mol/L，加入三羟甲基氨基甲烷直至三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.1mol/L，调节pH值至7.3，以便获得第二溶液，将所述第二溶液搅拌9h并静置12h后，在20000g离心45min，以便获得第四沉淀；(4-3)将所述第四沉淀溶解于150mL 1.0mol/L的醋酸溶液后，以便获得第二溶液；(4-4)先后利用30倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液与30倍体积的蒸馏水对第二溶液进行透析处理，直至pH为中性，以便获得第二透析液；(5)冷冻干燥：将所述第二透析液经-20℃过夜预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得林蛙皮胶原蛋白。利用该方法，能够提高胶原蛋白提取率，缩短提取时间，并且由于提取条件温和，所以不会破坏蛋白的活性，制得的胶原蛋白的生物活性好。
根据本发明的实施例，在制备胶原蛋白的过程中所有的提取步骤均是在低温下，最优选4摄氏度下进行的。换句话说，步骤(1-2)～(4-4)是在低温下，最优选4摄氏度下进行的。由此，可以显著地提高所得到胶原蛋白的生物活性和提取效率。温度过低或者过高都会使得提取效率或所得到产物的活性劣化。
附图说明
图1显示了利用本发明的实施例所述的方法制备的冻干后的胶原蛋白提取物。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
(1)预处理：
取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，自来水洗净，室温自然干燥，粉碎。所有提取操作均在4℃条件下进行。
称取粉碎后的干燥林蛙皮粉10g，将其加入到100mL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，持续慢速搅拌24h，每4h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品至中性。
将水洗至中性的林蛙皮样品加至100mL 20％的正丁醇溶液中脱脂，持续慢速搅拌24h，每4h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品三次。
(2)提取酸溶性胶原蛋白：
将预处理后的林蛙皮样品加入到100mL 1.0mol/L的醋酸溶液中。在200W的功率下，微波幅照1min。之后再将样品置于磁力搅拌器上持续慢速搅拌24h，以转数10000g离心30min，收集上清液，沉淀进一步用1.0mol/L醋酸在相同条件下重复提取两次，时间分别为24h，48h。合并上清液置于4℃备用。(3)提取酶溶性胶原蛋白：
取醋酸提取后的残留物，分散于100mL 1.0mol/L的醋酸溶液中(含胃蛋白酶0.01％(w/w))，持续慢速搅拌24h，以转数10000g离心30min，收集上清液，以10倍体积的0.05mol/L Na2HPO4(PH7.2)为透析介质透析3d，每12h换液一次以去除酶的活性，将透析液以转数10000g离心30min，取沉淀并将沉淀溶于100mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，得林蛙皮的酶溶性胶原蛋白，置于4℃备用。
(4)纯化：
向之前得到的酸溶性胶原蛋白与酶溶性胶原蛋白中加入NaCl，使NaCl终浓度为0.7mol/L，搅拌6h后，静置12h，加入NaCl至其终浓度为2.6mol/L，加入三羟甲基氨基甲烷至其终浓度为0.1mol/L，加入HCl或NaOH调节pH值至7.0，搅拌6h后，静置12h，以转数10000g离心30min，得沉淀。将沉淀溶解于50mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，透析，先以10倍体积的0.1mol/L醋酸溶液为透析介质透析24h，再以10倍体积的蒸馏水为透析介质透析至pH为中性，每12h换液一次。
(5)冷冻干燥：
将透析后的溶液经－20℃过夜预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得林蛙皮胶原蛋白。据胶原蛋白含量测定结果显示，其提取率(提取率＝提取出的胶原蛋白量/原料中含有的胶原蛋白量)为15.3％。
实施例2：
(1)预处理：
取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，自来水洗净，室温自然干燥，粉碎。所有提取操作均在4℃条件下进行。
称取粉碎后的干燥林蛙皮粉10g，将其加入到500mL 0.3mol/L的NaOH水溶液(含过氧化氢3％)中，持续慢速搅拌120h，每8h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品至中性。
将水洗至中性的林蛙皮样品加入至500mL 20％的正丁醇溶液中脱脂，持续慢速搅拌72h，每8h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品三次。
(2)提取酸溶性胶原蛋白：
将预处理后的林蛙皮样品加入到500mL 1.0mol/L的醋酸溶液中。在800W的功率下，微波幅照7min。之后再将样品置于磁力搅拌器上持续慢速搅拌24h，以转数30000g离心70min，收集上清液，沉淀进一步用1.0mol/L醋酸在相同条件下重复提取两次，时间分别为24h，48h。合并上清液置于4℃备用。
(3)提取酶溶性胶原蛋白：
取醋酸提取后的残留物，分散于500mL 1.0mol/L的醋酸溶液中(含胃蛋白酶2％(w/w))，持续慢速搅拌120h，以转数30000g离心70min，收集上清液，以50倍体积的0.05mol/L Na2HPO4(PH7.2)为透析介质透析3d，每12h换液一次以去除酶的活性，将透析液以转数30000g离心70min，取沉淀并将沉淀溶于300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，得林蛙皮的酶溶性胶原蛋白，置于4℃备用。
(4)纯化：
往之前得到的酸溶性胶原蛋白与酶溶性胶原蛋白中加入NaCl，使NaCl终浓度为0.7mol/L，搅拌12h后，静置24h，加入NaCl至其终浓度为3mol/L，加入三羟甲基氨基甲烷至其终浓度为0.1mol/L，加入HCl或NaOH调节pH值至7.5，搅拌12h后，静置12h，以转数30000g离心70min，得沉淀。将沉淀溶解于300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，透析，先以50倍体积的0.1mol/L醋酸溶液为透析介质透析24h，再以50倍体积的蒸馏水为透析介质透析至pH为中性，每12h换液一次。
(5)冷冻干燥：
将透析后的溶液经－20℃过夜预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得林蛙皮胶原蛋白。据胶原蛋白含量测定结果显示，其提取率(提取出的胶原蛋白量/原料中含有的胶原蛋白量)为18.4％。
实施例3：
(1)预处理：
取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，自来水洗净，室温自然干燥，粉碎。所有提取操作均在4℃条件下进行。
称取粉碎后的干燥林蛙皮粉10g，将其加入到300mL 0.3mol/L的NaOH水溶液(含过氧化氢1.5％)中，持续慢速搅拌96h，每6h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品至中性。
将水洗至中性的林蛙皮样品加至300mL 20％的正丁醇溶液中脱脂，持续慢速搅拌48h，每6h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品三次。
(2)提取酸溶性胶原蛋白：
将预处理后的林蛙皮样品加入到300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中。在500W的功率下，微波辐照4min。之后再将样品置于磁力搅拌器上持续慢速搅拌24h，以转数20000g离心45min，收集上清液，沉淀进一步用1.0mol/L醋酸在相同条件下重复提取两次，时间分别为24h，48h。合并上清液置于4℃备用。
(3)提取酶溶性胶原蛋白：
取醋酸提取后的残留物，分散于300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中(含胃蛋白酶1％(w/w))，持续慢速搅拌72h，以转数20000g离心45min，收集上清液，以30倍体积的0.05mol/L Na2HPO4(PH7.2)为透析介质透析3d，每12h换液一次以去除酶的活性，将透析液以转数20000g离心45min，取沉淀并将沉淀溶于200mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，得林蛙皮的酶溶性胶原蛋白，置于4℃备用。
(4)纯化：
向之前得到的酸溶性胶原蛋白与酶溶性胶原蛋白中加入NaCl，使NaCl终浓度为0.7mol/L，搅拌9h后，静置12h，加入NaCl至其终浓度为2.4mol/L，加入三羟甲基氨基甲烷至其终浓度为0.1mol/L，加入HCl或NaOH调节pH值至7.3，搅拌9h后，静置12h，以转数20000g离心45min，得沉淀。将沉淀溶解于150mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，透析，先以30倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液为透析介质透析24h，再以30倍体积的蒸馏水为透析介质透析至pH为中性。
(5)冷冻干燥：
将透析后的溶液经－20℃过夜预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得林蛙皮胶原蛋白。据胶原蛋白含量测定结果显示，其提取率(提取出的胶原蛋白量/原料中含有的胶原蛋白量)为40.3％。
对比实施例
(1)预处理：
取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，自来水洗净，室温自然干燥，粉碎。所有提取操作均在4℃条件下进行。
称取粉碎后的干燥林蛙皮粉10g，将其加入到300mL 0.3mol/L的NaOH水溶液(含过氧化氢1.5％)中，持续慢速搅拌96h，每6h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品至中性。
将水洗至中性的林蛙皮样品加至300mL 20％的正丁醇溶液中脱脂，持续慢速搅拌48h，每6h更换一次混合溶液。10倍体积的蒸馏水(4℃)洗涤样品三次。
(2)提取酸溶性胶原蛋白：
将预处理后的林蛙皮样品加入到300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，置于磁力搅拌器上持续慢速搅拌24h，以转数20000g离心45min，收集上清液，沉淀进一步用1.0mol/L醋酸在相同条件下重复提取两次，时间分别为24h，48h。合并上清液置于4℃备用。
(3)提取酶溶性胶原蛋白：
取醋酸提取后的残留物，分散于300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中(含胃蛋白酶1％(w/w))，持续慢速搅拌72h，以转数20000g离心45min，收集上清液，以30倍体积的0.05mol/L Na2HPO4(PH7.2)为透析介质透析3d，每12h换液一次以去除酶的活性，将透析液以转数20000g离心45min，取沉淀并将沉淀溶于200mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，得林蛙皮的酶溶性胶原蛋白，置于4℃备用。
(4)纯化：
向之前得到的酸溶性胶原蛋白与酶溶性胶原蛋白中加入NaCl，使NaCl终浓度为0.7mol/L，搅拌9h后，静置12h，加入NaCl至其终浓度为2.4mol/L，加入三羟甲基氨基甲烷至其终浓度为0.1mol/L，加入HCl或NaOH调节pH值至7.3，搅拌9h后，静置12h，以转数20000g离心45min，得沉淀。将沉淀溶解于150mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，透析，先以30倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液为透析介质透析24h，再以30倍体积的蒸馏水为透析介质透析至pH为中性。
(5)冷冻干燥：
将透析后的溶液经－20℃过夜预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得林蛙皮胶原蛋白。据胶原蛋白含量测定结果显示，其提取率(提取出的胶原蛋白量/原料中含有的胶原蛋白量)为30.5％。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种制备林蛙皮胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；
(2)称取所述林蛙皮粉10g，进行脱色和脱脂处理，以便获得预处理的林蛙皮样品；
(3)将所述预处理的林蛙皮样品加入至100～500mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有林蛙皮样品的醋酸溶液，将所述含有林蛙皮样品的醋酸溶液置于200～800W功率的微波下，辐照1～10min后，将经过微波处理的含有林蛙皮样品的醋酸溶液持续搅拌24～48h，离心，以便获得第一沉淀和含有酸溶性胶原蛋白的溶液和；
(4)将所述第一沉淀分散于100～500mL含有0.01重量％～2重量％胃蛋白酶的1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得第一溶液，将所述第一溶液进行离心以便获得第一上清液，将所述第一上清液进行透析后，以便获得第一透析液，将所述第一透析液进行离心以便获得第二沉淀，将所述第二沉淀溶于100～300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有酶溶性胶原蛋白的溶液；
(5)向所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液和所述含有酶溶性胶原蛋白的至少之一中添加NaCl，直至NaCl终浓度为0.7mol/L，以便获得第二溶液，搅拌6～12h后，静置12～24h后，再加入NaCl和三羟甲基氨基甲烷，直至NaCl终浓度为2.4～3mol/L，三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.1mol/L，以便获得第三溶液；
(6)将所述第三溶液的pH值调节至7.0～7.5，搅拌6～12h，静置12h，离心，以便获得第三沉淀，将所述第三沉淀溶解于50～300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得第四溶液，将所述第四溶液进行透析直至pH为中性，以便获得第五溶液；
(7)将所述第五溶液经-20℃过夜预冻后，真空冷冻干燥，以便获得林蛙皮胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的所述脱色脱脂包括以下步骤：
(2-1)将所述林蛙皮粉10g加入至100～500mL 0.3mol/L的NaOH溶液中，持续慢速搅拌24～120h，每4～8h更换新鲜的所述NaOH溶液，离心，以便获得经过NaOH溶液处理的林蛙皮样品，任选地，所述NaOH溶液中含有0％～3％过氧化氢；
(2-2)将所述NaOH溶液处理的林蛙皮样品用10倍体积的4℃蒸馏水洗涤样品至中性，以便获得水洗至中性的林蛙皮样品；
(2-3)将所述水洗至中性的林蛙皮样品加入至100～500mL 20％的正丁醇溶液中，持续搅拌24～72h，每4～8h更换新鲜的所述正丁醇溶液，离心，以便获得经过正丁醇溶液处理的林蛙皮样品；
(2-4)将所述经过正丁醇溶液处理的林蛙皮样品用10倍体积4℃的蒸馏水洗涤三次，以便获得所述预处理的林蛙皮样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)之前，步骤(3)之后，进一步包括：
将所述第一沉淀的至少一部分加入到100～500mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，并将所得到的混合物置于200～800W功率的微波下，辐照1～10min后，将经过辐照处理的混合物持续搅拌24～48h，离心，以便获得第四沉淀和含有酸溶性胶原蛋白的溶液，
其中将所述第四沉淀和所述第一沉淀其余部分的至少之一用于步骤(4)的处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中的离心分别独立地为在10000～30000g离心30～70min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的所述透析是按照下列条件进行的：
利用10～50倍体积pH 7.20.05mol/L Na2HPO4溶液对所述第一上清液进行透析3d，每12h更换一次新鲜的pH 7.20.05mol/L Na2HPO4溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，利用HCl或NaOH将所述第三溶液的pH值调节至7.0～7.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述透析包括以下步骤：
利用10～50倍体积的0.1mol/L醋酸溶液为透析介质，进行透析24h，再以10～50倍体积的蒸馏水为透析介质进行透析直至pH为中性，每12h更换一次新鲜的透析介质。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)～(6)是在低温下，最优选4摄氏度下进行的。
9.一种制备林蛙皮胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：
(1-1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，自来水洗净，室温自然干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；
(1-2)将10g所述林蛙皮粉加入至含有1.5％过氧化氢的300mL 0.3mol/L的NaOH溶液中，持续搅拌96h，每6h更换一次新鲜的含有1.5％过氧化氢的0.3mol/L的NaOH溶液，以便获得第一林蛙皮样品，利用4℃10倍体积的蒸馏水将所述第一林蛙皮样品洗涤至中性，以便获得第二林蛙皮样品；
(1-3)将所述第二林蛙皮样品加入至300mL 20％的正丁醇溶液中进行脱脂处理，持续慢速搅拌48h，每6h更换一次新鲜的20％的正丁醇溶液，以便获得第三林蛙皮样品；
(1-4)利用4℃10倍体积的蒸馏水将所述第三林蛙皮样品洗涤三次，以便获得预处理的林蛙皮样品；
(2)制备含有酸溶性胶原蛋白的溶液：
(2-1)将所述预处理的林蛙皮样品加入至300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有林蛙皮样品的醋酸溶液，将所述含有林蛙皮样品的醋酸溶液置于500W的功率的微波下，辐照4min后，将经过微波处理的含有林蛙皮样品的醋酸溶液持续搅拌24～48h后在20000g离心45min，以便获得第一沉淀和所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液，将所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液置于4℃；
(2-2)将所述第一沉淀重复两次步骤(2-1)，以便获得第二沉淀和所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液，将所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液置于4℃；
(3)制备含有酶溶性胶原蛋白的溶液：
(3-1)将所述第二沉淀分散于含有1重量％胃蛋白酶300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，持续搅拌72h后，在20000g进行离心45min，以便获得第一上清液；
(3-2)利用30倍体积的pH7.20.05mol/L Na2HPO4溶液对所述第一上清液进行透析处理3d，每12h更换一次新鲜的pH7.20.05mol/L Na2HPO4溶液后，以便获得第一透析液；
(3-3)将所述第一透析液在20000g离心45min，以便获得第三沉淀；
(3-4)将所述第三沉淀溶于200mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便获得含有酶溶性胶原蛋白的溶液，并将所述酶溶性胶原蛋白的溶液置于4℃；
(4)纯化：
(4-1)将所述含有酸溶性胶原蛋白的溶液和所述酶溶性胶原蛋白的溶液合并后加入NaCl，直至NaCl终浓度为0.7mol/L，以便获得第一溶液；
(4-2)将第一溶液搅拌9h后并静置12h后，加入NaCl直至NaCl终浓度为2.4mol/L，加入三羟甲基氨基甲烷直至三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.1mol/L，调节pH值至7.3，以便获得第二溶液，将所述第二溶液搅拌9h并静置12h后，在20000g离心45min，以便获得第四沉淀；
(4-3)将所述第四沉淀溶解于150mL 1.0mol/L的醋酸溶液后，以便获得第二溶液；
(4-4)先后利用30倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液与30倍体积的蒸馏水对第二溶液进行透析处理，直至pH为中性，以便获得第二透析液；
(5)冷冻干燥：
将所述第二透析液经-20℃过夜预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得林蛙皮胶原蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1-2)～(4-4)是在低温下，最优选4摄氏度下进行的。
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