CN105547791A - 一种神经系统突触位点的免疫荧光染色方法 - Google Patents
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Abstract
一种神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：(1)挑选；(2)速冻；(3)固定；(4)抗体染色；本发明具有以下优点：冻结效率高，成本低；能有效保持细胞结构的完整性，固定效果好；染色操作方便；染色率高。
Description
技术领域
本发明涉及免疫荧光染色方法，尤其涉及一种神经系统突触位点的免疫荧光染色方法。
背景技术
秀丽隐杆线虫是非常有用且具有很多优势的模式动物，许多科学成果是通过使用秀丽隐杆线虫为动物模型获得，如：获得2002年诺贝尔奖的细胞发育的程序性死亡机制、获得2006年诺贝尔奖的RNA干扰现象的机制、获得2008年诺贝尔奖的绿色荧光蛋白发现及其应用等。
目前，许多科学家开始利用秀丽隐杆线虫进行应用开发研究，但是在使用秀丽隐杆线虫进行免疫荧光染色时，最大的困难在于难以将秀丽隐杆线虫的虫体包被在最外面的一层外皮打开，进而使用去垢剂Triton-X100进行细胞透膜，对细胞内外的亚细胞结构进行有效染色，通过破坏秀丽隐杆线虫虫体外皮的方法对秀丽隐杆线虫外皮内的组织与细胞进行染色，但这些方法都不能使秀丽隐杆线虫虫体保持完整的结构域形态。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种能保持秀丽隐杆线虫虫体结构域形态完整的神经系统突触位点的免疫荧光染色的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：
(1)挑选：挑选每种表型的各生长时期没有饥饿的秀丽隐杆线虫2-4盘；
(2)速冻：用线虫磷酸盐缓冲液洗脱步骤(1)挑选的秀丽隐杆线虫，并用线虫磷酸盐缓冲液将洗脱后的秀丽隐杆线虫收集到试管中，将试管放在冰上5min，吸去上清液，然后用1mlddH20对秀丽隐杆线虫重复洗涤3次，再吸去上清液，用80ul的体积分数为0.025％的戊二醛溶液悬浮秀丽隐杆线虫；
取两块载玻片，将秀丽隐杆线虫的戊二醛悬浮液转移到一块载玻片上，用另一块载玻片合盖在载有秀丽隐杆线虫戊二醛悬浮液的载玻片上方，使秀丽隐杆线虫被上下两块载玻片夹住呈三明治型，然后用无尘纸将三明治型载玻片边缘的液体吸去，使线虫蠕动困难，然后将三明治型载玻片放置在干冰上，放置时间30min以上；
(3)固定：将步骤(2)速冻后的载玻片从干冰中取出，将三明治型载玻片迅速掰开，秀丽隐杆线虫的外表皮被打开，保持了秀丽隐杆线虫虫体的组织结构与形态的完整性，然后将载玻片浸没在固定液中，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与固定液充分接触；
将在固定液中浸没后的载玻片转移到离心管中，离心管中装有40ml1x磷酸盐缓冲液，同种基因型的秀丽隐杆线虫转移在同一离心管中，保存温度为4℃，使秀丽隐杆线虫从载玻片上洗脱到离心管中，并使秀丽隐杆线虫收集在离心管的管底，吸去上清液，将秀丽隐杆线虫转移到试管中，再次吸去上清液，把试管中的沉积物保存在冰上；
(4)抗体染色：向步骤(3)固定后的秀丽隐杆线虫中抗体非特异性蛋白加入500uL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.2％明胶，在常温下封闭30min，然后重悬秀丽隐杆线虫，每一染色组取约20uL的秀丽隐杆线虫放到EP管中，静置3-5min后，移除上清液，保留秀丽隐杆线虫，将一抗抗体溶液加到EP管中，并轻轻混匀，将EP管侧放在支架上，并将支架放在摇床上摇动过夜，室温为4℃，第二天，将EP管正放，并静置5min，移除一抗抗体上清液；
用1mL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.1％明胶进行洗涤，洗涤后将放有EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作四次，使上清液完全去除；
每一染色组加入50uL的二抗抗体稀释溶液到EP管中，并在二抗抗体稀释溶液中加入DAPI进行核染色，然后将EP管侧放在支架上，并将支架放在摇床上摇动过夜，温度为4℃，第二天，将EP管正放，并静置5min，移除二抗抗体上清液；
用1mL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.1％G明胶进行洗涤，洗涤后将EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作四次；
用1X磷酸盐缓冲液进行洗涤，将EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，然后用15uL的封片液对已经染色的秀丽隐杆线虫进行封片；
即神经系统突触位点的免疫荧光染色完成。
进一步，所述步骤(2)中，载玻片为耐冰冻载玻片，载玻片的内侧设有磨砂，将两块载玻片有磨砂的一面相对合盖，使载玻片上没有磨砂的部分紧密贴合，并在载玻片的磨砂部分用铅笔标记。
进一步，所述步骤(2)中，秀丽隐杆线虫被上下两块载玻片夹住后，在体式显微镜下观察秀丽隐杆线虫的蠕动状态。
进一步，所述步骤(3)中，固定液为丙酮和甲醇，先将载玻片浸没在丙酮中5分钟，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与丙酮充分接触，然后取出用吸水纸快速吸除多余的丙酮，并快速将载玻片浸没在甲醇中5分钟，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与甲醇充分接触，然后取出用吸水纸快速吸除多余的甲醇。
进一步，所述丙酮和甲醇在-20℃至-30℃下预冷，分别装在染色缸中，并将染色缸放在泡沫盒中，染色缸周围用干冰围住。
进一步，所述步骤(3)中，固定液为质量分数为4％多聚甲醛的1x磷酸盐缓冲液，在通风处操作，将载玻片浸没在质量分数为4％多聚甲醛的1x磷酸盐缓冲液中，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与含4％多聚甲醛的1x磷酸盐缓冲液充分接触。
进一步，所述步骤(3)中，通过用手掰开使合盖的载玻片迅速分开。
进一步，所述步骤(3)中，通过用镊子夹住载玻片，在磷酸盐缓冲液中轻轻晃动3-5下，使秀丽隐杆线虫从载玻片上洗到离心管中，并使秀丽隐杆线虫收集在离心管的管底，吸去上清液，用巴斯德玻璃吸管将秀丽隐杆线虫转移到试管中，再用真空吸器吸去上清液，把试管中的沉积物保存在冰上。
进一步，所述步骤(3)中，秀丽隐杆线虫通过重力作用自然沉淀收集在管底，或者通过离心收集在管底，所述离心的条件为1500转/min，离心时间为2min。
进一步，所述步骤(4)中，封片液为抗荧光衰减封片液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)冻结效率高，成本低，在正常的生理条件下，就能够迅速冻结秀丽隐杆线虫虫体；
(2)固定效果好，通过提供可选与可优化不同种固定液对蛋白进行固定，大大提高固定效果和固定率；
(3)能有效保持细胞结构的完整性，染色操作方便，能有效将秀丽隐杆线虫虫体外皮打开，很好地保持机体各种组织与细胞结构的完整性，方便对秀丽隐杆线虫外皮包被内的组织与细胞进行染色；
(4)染色率高，能够仅仅使用100uL的抗体溶液对动物体各种组织与细胞特别是神经系统细胞与亚细胞结构如神经系统突触位点的标记蛋白进行有效地染色。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例中所用材料：耐冰冻的载玻片；预先制成片状，尺寸为10-20cm长的干冰；纯丙酮和甲醇作为固定液，保存在-20℃，使用时，将固定液的轻微毒性覆盖。
(1)挑选：秀丽隐杆线虫挑选每个表型中没有饥饿的各个生长时期的线虫至少2-4盘，Dauers时期的秀丽隐杆线虫和含卵的秀丽隐杆线虫染色不明显。
(2)速冻：
1、用线虫磷酸盐缓冲液M9buffer洗脱挑选的秀丽隐杆线虫，并将秀丽隐杆线虫收集在一个1.5mL的试管中；
2、将试管放在冰上5min，并用吸管吸去上清液；
3、用1mlddH20对秀丽隐杆线虫重复洗涤3次，并用吸管吸去上清液；
4、用80ul体积分数为0.025％戊二醛溶液悬浮秀丽隐杆线虫；
5、取出耐冰冻的载玻片，将一块载玻片有磨砂的一面朝上并用铅笔标记载玻片，然后使用玻璃吸管，将戊二醛的秀丽隐杆线虫悬浮液转移到载玻片的中间，再用手拿起另外一个载玻片，使带磨砂的一面朝下，小心地盖在秀丽隐杆线虫悬浮液上面，慢慢的将手拿的载玻片放下，使载玻片没有磨砂的部分重叠，用铅笔标记的部分不重叠，使两块载玻片呈三明治型；
6、在体式显微镜下观察秀丽隐杆线虫的蠕动状态，并将三明治型的载玻片静置3-5min，然后用无尘纸巾吸走多余的水份直至成年秀丽隐杆线虫被上下两片载玻片夹住而蠕动困难，立即用手拿住下面一片载玻片并将三明治型的载玻片转移到表面平整的干冰上，并将三明治型的载玻片放置在干冰上至少30min。
(3)固定:
1、准备两个染色缸，一个用于装-20--30℃预冷的丙酮，另一个用于装-20--30℃预冷的甲醇，将两个染色缸放在一个泡沫盒中，并在染色缸周围用干冰围住；
2、为每一种基因型的秀丽隐杆线虫准备一个50mL的离心管，并在离心管内装上40ml1xPBS(磷酸盐缓冲液)缓冲液，贴上标签放在冰中保存待用；
3、从干冰上取出速冻的三明治型的载玻片，并用双手快速地将两块载玻片掰开，这时秀丽隐杆线虫外表的外表皮就会被打开，保持了秀丽隐杆线虫虫体各组织结构与形态的完整性；然后把载玻片上没有放线虫的一面迅速地背靠背并放在一起，并立即将载玻片浸没在装有冷冻丙酮的染色缸中5min；然后将背靠背放置的载玻片从丙酮中取出来，用吸水纸快速吸除多余的丙酮并快速将载玻片浸没在装有冷冻的甲醇中5min，然后将载玻片从甲醇中取出，用吸水纸吸除多余的甲醇后，放在含有40ml1xPBS的离心管中，每种基因型的秀丽隐杆线虫虫系放同一个50mL的离心管；
4、用镊子夹住载玻片，在PBS中轻轻晃动3-5下，使固定的秀丽隐杆线虫从载玻片上洗脱下来；
5、对不同基因型的秀丽隐杆线虫虫系进行速冻后进行固定时，只要重复1-4的操作即可；
6、将秀丽隐杆线虫保存在50mL离心管中过夜，保存温度为4℃，使线虫随重力自然沉淀到管底，或者通过在1500转/min的离心条件，离心2min把线虫收集到离心管管底，然后吸去上清液，用巴斯德玻璃吸管把线虫转移到1.5ml试管中，再用真空吸器去除上清液，把1.5ml试管中的沉积物放在在冰上保存。
(4)抗体染色：
1、向秀丽隐杆线虫中抗体非特异性蛋白加500uL的含体积分数为0.2％TritonX100(聚乙二醇辛基苯基醚),质量分数为0.2％Gelatin(明胶)，在常温下封闭30min；
2、重悬秀丽隐杆线虫，每一染色组取约20uL的秀丽隐杆线虫放到1.5mL的EP管中，静置3-5min后，移除上清液，仅保留秀丽隐杆线虫约20uL；
3、按照不同一抗抗体配置的浓度每组染色准备50uL的抗体溶液，然后将一抗抗体溶液加到对应的装有秀丽隐杆线虫的1.5mLEP管中，并用指腹轻轻混匀；
4、将EP管侧放在特制的支架上，并将支架放在摆动的摇床上，摇动过夜，孵育温度为4℃，第二天，将EP管正放静置5min，移除一抗抗体上清液；
5、每管加1mL体积分数为0.2％TritonX100,质量分数为0.1％Gelatin进行洗涤，然后将放有EP管的管架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作四次，尽可能将上清液完全去除；
6、按照不同二抗抗体配置的浓度每组染色准备50uL的二抗抗体溶液，并加入使用浓度的DAPI进行核染色；
7、将EP管侧放在特制的支架上，并将支架放在摆动的摇床上，摇动过夜，室温为4℃，第二天，将EP管正放静置5min，移除二抗抗体上清液；
8、每管加1mL体积分数为0.2％TritonX100,质量分数为0.1％Gelatin进行洗涤，然后将放有EP管的管架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作三次；
9、用1XPBS进行洗涤，然后将放有EP管的管架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的线虫自然沉淀下来；
10、用15uL的抗荧光衰减封片液对已经染色的秀丽隐杆线虫进行封片。
在正常的生理条件下，就能够迅速冻结秀丽隐杆线虫虫体；能有效将秀丽隐杆线虫虫体外表皮打开，很好地保持机体各种组织与细胞结构的完整性，方便对秀丽隐杆线虫外皮包被内的组织与细胞进行染色；仅仅使用100uL的抗体溶液对动物体各种组织与细胞特别是神经系统细胞与亚细胞结构如突触位点的标记蛋白进行有效地染色。
实施例2
本实施例中所用材料：耐冰冻的载玻片；预先制成片状，尺寸为10-20cm长的干冰；含4％PAF的1xPBS作为固定液，在通风处操作，保存在20℃，使用时，将固定液的轻微毒性覆盖。
(1)挑选：本步骤与实施例1基本相同；
(2)速冻：本步骤与实施例1基本相同；
(3)固定:1、将40ml含质量分数为4％PAF(多聚甲醛)的1xPBS溶液分装在50mL的离心管中，每株虫系准备一管；
2、从干冰上取出速冻的三明治型的载玻片，并用双手快速地将两片载玻片掰开，这时秀丽隐杆线虫外表的外皮就会被打开，保持了秀丽隐杆线虫虫体各组织结构与形态的完整性；
3、把载玻片上没有放秀丽隐杆线虫的一面迅速地背靠背并放在一起；并立即将载玻片浸没在质量分数为4％PAF的1xPBS溶液中；
4、用镊子夹住载玻片，在质量分数为4％PAF的PBS溶液中轻轻晃动3-5下，使固定的线虫从载玻片上洗下来，重复此操作在同一菌株的其他载玻片，干冰冷却的载玻片可能会造成固定液冻结在载玻片表面和一些可能溅在溶液中，该操作相对快速，完成时间不超过5min，保证冲洗的第一个秀丽隐杆线虫不能在冻结的固定液中孵卵，然后在室温下在固定剂中孵育15min。
5、通过1500转/min的离心条件，离心2min收集线虫与试管管底，吸去上清液，加入1XPBS到秀丽隐杆线虫中，并对PFA固定的秀丽隐杆线虫进行洗涤2-3次，将秀丽隐杆线虫转移到1.5ml离心管中，针对不同的条件/实验，所有的秀丽隐杆线虫可以保存在一个离心管或分几个离心管，用真空吸尘器吸除上清液，把沉积物放在冰上，秀丽隐杆线虫在1.5ml离心管中可以保存一天或两天，温度为4℃或秀丽隐杆线虫在1.5ml离心管中保存一周以上，温度为-20℃；
(4)抗体染色：本步骤与实施例1基本相同。
在正常的生理条件下，就能够迅速冻结秀丽隐杆线虫虫体；能有效将秀丽隐杆线虫虫体外皮打开，很好地保持机体各种组织与细胞结构的完整性，方便对秀丽隐杆线虫外皮包被内的组织与细胞进行染色；仅仅使用100uL的抗体溶液对动物体各种组织与细胞特别是神经系统细胞与亚细胞结构如突触位点的标记蛋白进行有效地染色。
Claims (10)
1.一种神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)挑选：挑选每种表型的各生长时期没有饥饿的秀丽隐杆线虫2-4盘；
(2)速冻：用线虫磷酸盐缓冲液洗脱步骤(1)挑选的秀丽隐杆线虫，并用线虫磷酸盐缓冲液将洗脱后的秀丽隐杆线虫收集到试管中，将试管放在冰上5min，吸去上清液，然后用1mlddH2O对秀丽隐杆线虫重复洗涤3次，再吸去上清液，用80ul的体积分数为0.025％的戊二醛溶液悬浮秀丽隐杆线虫；
取两块载玻片，将秀丽隐杆线虫的戊二醛悬浮液转移到一块载玻片上，用另一块载玻片合盖在载有秀丽隐杆线虫戊二醛悬浮液的载玻片上方，使秀丽隐杆线虫被上下两块载玻片夹住呈三明治型，然后用无尘纸将三明治型载玻片边缘的液体吸去，使线虫蠕动困难，然后将三明治型载玻片放置在干冰上，放置时间30min以上；
(3)固定：将步骤(2)速冻后的载玻片从干冰中取出，将三明治型载玻片迅速掰开，秀丽隐杆线虫的外表皮被打开，保持了秀丽隐杆线虫虫体的组织结构与形态的完整性，然后将载玻片浸没在固定液中，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与固定液充分接触；
将在固定液中浸没后的载玻片转移到离心管中，离心管中装有40ml1x磷酸盐缓冲液，同种基因型的秀丽隐杆线虫转移在同一离心管中，保存温度为4℃，使秀丽隐杆线虫从载玻片上洗脱到离心管中，并使秀丽隐杆线虫收集在离心管的管底，吸去上清液，将秀丽隐杆线虫转移到试管中，再次吸去上清液，把试管中的沉积物保存在冰上；
(4)抗体染色：向步骤(3)固定后的秀丽隐杆线虫中抗体非特异性蛋白加入500uL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.2％明胶，在常温下封闭30min，然后重悬秀丽隐杆线虫，每一染色组取约20uL的秀丽隐杆线虫放到EP管中，静置3-5min后，移除上清液，保留秀丽隐杆线虫，将一抗抗体溶液加到EP管中，并轻轻混匀，将EP管侧放在支架上，并将支架放在摇床上摇动过夜，室温为4℃，第二天，将EP管正放，并静置5min，移除一抗抗体上清液；
用1mL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.1％明胶进行洗涤，洗涤后将放有EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作四次，使上清液完全去除；
每一染色组加入50uL的二抗抗体稀释溶液到EP管中，并在二抗抗体稀释溶液中加入DAPI进行核染色，然后将EP管侧放在支架上，并将支架放在摇床上摇动过夜，温度为4℃，第二天，将EP管正放，并静置5min，移除二抗抗体上清液；
用1mL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.1％G明胶进行洗涤，洗涤后将EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作四次；
用1X磷酸盐缓冲液进行洗涤，将EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，然后用15uL的封片液对已经染色的秀丽隐杆线虫进行封片；
即神经系统突触位点的免疫荧光染色完成。
2.根据权利要求1所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(2)中，载玻片为耐冰冻载玻片，载玻片的内侧设有磨砂，将两块载玻片有磨砂的一面相对合盖，使载玻片上没有磨砂的部分紧密贴合，并在载玻片的磨砂部分用铅笔标记。
3.根据权利要求1所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(2)中，秀丽隐杆线虫被上下两块载玻片夹住后，在体式显微镜下观察秀丽隐杆线虫的蠕动状态。
4.根据权利要求1所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(3)中，固定液为丙酮和甲醇，先将载玻片浸没在丙酮中5分钟，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与丙酮充分接触，然后取出用吸水纸快速吸除多余的丙酮，并快速将载玻片浸没在甲醇中5分钟，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与甲醇充分接触，然后取出用吸水纸快速吸除多余的甲醇。
5.根据权利要求4所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述丙酮和甲醇在-20℃至-30℃下预冷，分别装在染色缸中，并将染色缸放在泡沫盒中，染色缸周围用干冰围住。
6.根据权利要求1所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(3)中，固定液为质量分数为4％多聚甲醛的1x磷酸盐缓冲液，在通风处操作，将载玻片浸没在质量分数为4％多聚甲醛的1x磷酸盐缓冲液中，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与含4％多聚甲醛的1x磷酸盐缓冲液充分接触。
7.根据权利要求1所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(3)中，通过用手掰开使合盖的载玻片迅速分开。
8.根据权利要求1所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(3)中，通过用镊子夹住载玻片，在磷酸盐缓冲液中轻轻晃动3-5下，使秀丽隐杆线虫从载玻片上洗到离心管中，并使秀丽隐杆线虫收集在离心管的管底，吸去上清液，用巴斯德玻璃吸管将秀丽隐杆线虫转移到试管中，再用真空吸器吸去上清液，把试管中的沉积物保存在冰上。
9.根据权利要求1或8所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(3)中，秀丽隐杆线虫通过重力作用自然沉淀收集在管底，或者通过离心收集在管底，所述离心的条件为1500转/min，离心时间为2min。
10.根据权利要求1所述的神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述步骤(4)中，封片液为抗荧光衰减封片液。
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