CN105532647B - 经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法 - Google Patents

经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105532647B
CN105532647B CN201610077467.5A CN201610077467A CN105532647B CN 105532647 B CN105532647 B CN 105532647B CN 201610077467 A CN201610077467 A CN 201610077467A CN 105532647 B CN105532647 B CN 105532647B
Authority
CN
China
Prior art keywords
menses
liquid
stem cells
cell
endometrial stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610077467.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105532647A (zh
Inventor
陈海佳
王飞
王一飞
葛啸虎
马岩岩
王小燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority to CN201610077467.5A priority Critical patent/CN105532647B/zh
Publication of CN105532647A publication Critical patent/CN105532647A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105532647B publication Critical patent/CN105532647B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及经血源宫内膜干细胞的来源——经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法。利用女性经血作为干细胞采集来源，废物利用，变废为宝，来源丰富；月经血中富含宫内膜干细胞的数量为骨髓的30倍有效成分含量丰富；采用经血保存液进行保存，避免经血在采集到分离的过程中受外界污染。本发明采用独特配方的经血保存液对经血进行保存，显著降低了经血的污染率，同时保证了获得的经血源宫内膜干细胞的纯度和活力。

Description

经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法。
背景技术
子宫是一个具有高度再生及分化能力的组织，每个月经周期，女性的子宫内膜可以从0.5mm左右增长到5～7mm左右，一个女性一生可以经历400次这样的循环。研究表明，子宫内膜中含有干细胞，具有高度的分化潜能，增殖能力以及较低的免疫源性。但是其直接获得途径，包括子宫切除术、早期妊娠脱膜、刮除术均对供者具有严重侵入性。
近年来，日本科学家在女性经血中发现了具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞可用于修复受损的心肌组织。2008年，美国科学家Patel等发现，从健康女性经血中可分离出来间充质干细胞，这些细胞具有多向分化能力，并将该细胞命名为经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells，MenSCs)。MenSCs属于成体干细胞的一种，具有来源丰富、有效成分含量丰富、收集过程无创、增殖和分化潜能巨大、无伦理争论及废物回收利用等优点。同时，研究表明，宫内膜干细胞可以用于治疗卵巢早衰、子宫内膜疾病、预防衰老等功能，有望成为较为理想的种子细胞。
目前，对于宫内膜干细胞的分离培养，多采用直接获得途径，对患者造成很大的伤害，同时来源苦难以及受伦理限制等问题；经血源干细胞虽有少量研究，但是其无简单方便的方法采集经血，导致经血受污染几率较高，获得的干细胞数量较少，纯度较低，分化潜能较低，同时成本较高、过程复杂等。
发明内容
有鉴于此，本发明提供经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法。利用女性经血作为干细胞采集来源，废物利用，变废为宝，来源丰富；月经血中富含宫内膜干细胞的数量为骨髓的30倍有效成分含量丰富；采用经血保存液进行保存，避免经血在采集到分离的过程中受外界污染。本发明采用独特配方的经血保存液对经血进行保存，显著(P＜0.05)降低了经血的污染率，同时保证了获得的经血源宫内膜干细胞的纯度和活力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种经血保存液，包括抗生素、枸橼酸钠和肝素钠。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经血保存液中所述抗生素选自青霉素、链霉素或卡那霉素。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经血保存液中所述卡那霉素的浓度为30～50μg/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经血保存液中所述枸橼酸钠的浓度为30～50μg/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经血保存液中所述肝素钠为100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经血保存液包括(2～5)×青霉素、(2～5)×链霉素、30～50μg/ml卡那霉素、30～50μg/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液。
本发明提供的所述经血保存液在保存经血中的应用。
本发明还提供了经血源宫内膜干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
步骤1：获得经血；采用所述经血保存液保存所述经血；
步骤2：取所述经血稀释后获得经血稀释液，与分离液混合、离心；
步骤3：收集上清液清洗后，再与培养基混合，离心；
步骤4：收集沉淀，接种，培养。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤2中所述稀释为经PBS溶液按照体积比1∶1的比例稀释；
步骤2中所述分离液为Ficoll分离液，所述经血稀释液与所述分离液的体积比为1∶(0.5～1)；
步骤2中所述离心为于700～800g离心15～30min。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤3中所述清洗为用PBS清洗2～4次；
步骤3中所述培养基为无血清培养基。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤4中所述接种的密度为(7～8)×105/mL。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤4中所述培养为48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7～14d在显微镜下观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法所述胰蛋白酶消化为弃去培养基，清洗，加质量浓度为0.3～0.5％(w/w)的胰蛋白酶消化，传代。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法所述消化的时间为2～3min，终止消化，离心，用无血清培养基重悬细胞沉淀。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法所述终止消化采用细胞体积3-5倍量的含5％FBS的培养基；
所述离心为1000rpm离心5min。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤1中获得的经血采用经血保存液保存；所述经血保存液包括(2-5)×青霉素、(2-5)×链霉素、30～50μg/ml卡那霉素、30～50μg/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤2所述与分离液混合和/或步骤3中所述清洗采用隔层离心管。
本发明提供了经血源宫内膜干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：获得经血；取所述经血稀释后获得经血稀释液，与分离液混合、离心；收集上清液清洗后，再与培养基混合，离心；收集沉淀，接种，培养。利用女性经血作为干细胞采集来源，废物利用，变废为宝，来源丰富；月经血中富含宫内膜干细胞的数量为骨髓的30倍有效成分含量丰富；采用经血保存液进行保存，避免经血在采集到分离的过程中受外界污染。本发明采用独特配方的经血保存液对经血进行保存，显著(P＜0.05)降低了经血的污染率，同时保证了获得的经血源宫内膜干细胞的纯度和活力。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
1、利用女性经血作为干细胞采集来源，完全是废物利用，变废为宝，对供者没有任何伤害，安全无痛；来源丰富，每位女性自月经初潮至绝经，在连续30多年的时间中，每个月都有宫内膜干细胞的大量生成；同时，月经血中富含宫内膜干细胞的数量为骨髓的30倍有效成分含量丰富。
2、本发明采用专门的经血采集套装采集经血，本采集方法更能使供者接受，同时能够避免经血污染。
3、在采集经血时，采用专门的经血保存液进行保存，避免经血在采集到分离的过程中受外界污染。
4、本发明采用隔层离心管和细胞贴壁方法相结合对宫内膜干细胞进行分离，并利用无血清培养基培养，操作简单，成本更低，同时可以得到纯度较高、数量较多、分化能力较强的经血宫内膜干细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1制备获得的经血源宫内膜干细胞的细胞形态观察图；其中，图1(A)示原代培养2天，40倍；图1(B)示原代培养2天，100倍；图1(C)示原代培养7天，40倍；图1(D)示原代培养7天，100倍；
图2示对比例制备获得的经血源宫内膜干细胞的细胞形态观察图；其中，图2(A)示原代培养2天，40倍；图2(B)示原代培养2天，100倍；图2(C)示原代培养11天，40倍；图2(D)示原代培养11天，100倍；
图3示实施例1制备获得的经血源宫内膜干细胞的细胞流式鉴定结果；其中图3(A)～图3(C)示对照组的细胞流式鉴定结果；图3(D)～图3(F)示样品组的细胞流式鉴定结果；
图4示对比例制备获得的经血源宫内膜干细胞的细胞流式鉴定结果；其中图4(A)～图4(C)示对照组的细胞流式鉴定结果；图4(D)～图4(F)示样品组的细胞流式鉴定结果。
具体实施方式
本发明公开了经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明具体的实施方案如下：
1.经血采集套装的准备：
包括一个无菌标本保存瓶(内含有5-15ml经血保存液)、一个经过灭菌的月事杯、一对手套、一个巴氏吸管、一份说明书。
经血保存液为内含有(2-5)×青霉素、(2-5)×链霉素、30-50μg/ml卡那霉素、30-50μg/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液。
2.经血的采集
经咨询同意后，根据经血采集套装说明书收集健康女性(20-40岁)的经血样品5-10ml，置于无菌标本保存瓶中，充分混匀后低温保存，24h之内处理。
3.无菌检测：
在无菌条件下取样品0.5-1ml利用快速微生物检测仪检测是否细菌污染，若为阴性，继续分离经血源宫内膜干细胞。
4.经血源宫内膜干细胞分离：
取经检验合格的经血，用相同体积的PBS溶液(商品化，斯佳)稀释经血形成经血稀释液；取隔层离心管，加入经血稀释液(0.5-1)倍体积的Ficoll分离液(商品化，斯佳)，缓慢加入经血稀释液，之后(700-800)g离心(15-30)min；将上层溶液移至另一个新的离心管中，PBS清洗(2-4)遍，用无血清培养基(为商品化的培养基，品牌是lonza)重悬离心后沉淀，调整接种密度为(7-8)×105/ml，接种至培养皿中，十字混匀后放于二氧化碳培养箱中培养。
5.经血源宫内膜干细胞培养。
48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化处理。
6.经血源宫内膜干细胞消化：
当细胞生长至70～80％汇合时，吸去培养基，用PBS清洗2-3次，加入2-3ml0.3-0.5胰蛋白酶(商品化，sigma)消化2-3min，在显微镜下观察细胞缩小变圆时，加入3-5倍含5％FBS的培养基终止消化，将所有溶液吸至离心管中，1000rpm离心5min，用新的无血清培养基重悬细胞沉淀，接种至新的培养皿中继续培养。
7.经血源宫内膜干细胞表面抗原鉴定。
取原代经血源宫内膜干细胞，PBS清洗2遍，0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，细胞分别于CD73-APC、CD90-PE、CD45-FITC、HLA-DR-FITC流式抗体(商品化，biolegend)避光孵育(10-20)min。孵育结束后，PBS清洗2遍，洗去未结合的抗体，将细胞样品上机使用流式细胞仪进行检测。
本发明提供的经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.经血采集套装的准备：
包括一个无菌标本保存瓶(内含有5ml经血保存液)、一个经过灭菌的月事杯、一对手套、一个巴氏吸管、一份说明书。
经血保存液为内含有2×青霉素、5×链霉素、40μg/ml卡那霉素、50μg/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液。
2.经血的采集
经咨询同意后，根据经血采集套装说明书收集健康女性(20-40岁)的经血样品5-10ml，置于无菌标本保存瓶中，充分混匀后低温保存，24h之内处理。
3.无菌检测：
在无菌条件下取样品0.5-1ml利用快速微生物检测仪检测是否细菌污染，若为阴性，继续分离经血源宫内膜干细胞。
4.经血源宫内膜干细胞分离：
取经检验合格的经血，用相同体积的PBS溶液(商品化，斯佳)稀释经血形成经血稀释液；取隔层离心管，加入经血稀释液0.8倍体积的Ficoll分离液(商品化，斯佳)，缓慢加入经血稀释液，之后700g离心30min；将上层溶液移至另一个新的离心管中，PBS清洗2遍，用无血清培养基(为商品化的培养基，品牌是lonza)重悬离心后沉淀，调整接种密度为7.5×105/ml，接种至培养皿中，十字混匀后放于二氧化碳培养箱中培养。
5.经血源宫内膜干细胞培养。
48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化处理。
6.经血源宫内膜干细胞消化：
当细胞生长至70～80％汇合时，吸去培养基，用PBS清洗2次，加入2.5ml0.3％(v/v)胰蛋白酶(商品化，sigma)消化2.5min，在显微镜下观察细胞缩小变圆时，加入3倍含5％FBS的培养基终止消化，将所有溶液吸至离心管中，1000rpm离心5min，用新的无血清培养基重悬细胞沉淀，接种至新的培养皿中继续培养。
7.经血源宫内膜干细胞表面抗原鉴定。
样品组：取原代经血源宫内膜干细胞，PBS清洗2遍，0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，细胞分别于CD73-APC、CD90-PE、CD45-FITC、HLA-DR-FITC流式抗体(商品化，biolegend)避光孵育15min。孵育结束后，PBS清洗2遍，洗去未结合的抗体，将细胞样品上机使用流式细胞仪进行检测。
对照组：未经抗体染色的原代经血源宫内膜干细胞上机使用流式细胞仪进行检测。
实施例2
1.经血采集套装的准备：
包括一个无菌标本保存瓶(内含有15ml经血保存液)、一个经过灭菌的月事杯、一对手套、一个巴氏吸管、一份说明书。经血保存液为内含有3×青霉素、4×链霉素、50μg/ml卡那霉素、30μg/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液。
2.经血的采集
经咨询同意后，根据经血采集套装说明书收集健康女性(20-40岁)的经血样品5-10ml，置于无菌标本保存瓶中，充分混匀后低温保存，24h之内处理。
3.无菌检测：
在无菌条件下取样品0.5-1ml利用快速微生物检测仪检测是否细菌污染，若为阴性，继续分离经血源宫内膜干细胞。
4.经血源宫内膜干细胞分离：
取经检验合格的经血，用相同体积的PBS溶液(商品化，斯佳)稀释经血形成经血稀释液；取隔层离心管，加入经血稀释液1倍体积的Ficoll分离液(商品化，斯佳)，缓慢加入经血稀释液，之后800g离心20min；将上层溶液移至另一个新的离心管中，PBS清洗4遍，用无血清培养基(为商品化的培养基，品牌是lonza)重悬离心后沉淀，调整接种密度为7×105/ml，接种至培养皿中，十字混匀后放于二氧化碳培养箱中培养。
5.经血源宫内膜干细胞培养。
48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化处理。
6.经血源宫内膜干细胞消化：
当细胞生长至70～80％汇合时，吸去培养基，用PBS清洗3次，加入3ml0.5％(v/v)胰蛋白酶(商品化，sigma)消化2min，在显微镜下观察细胞缩小变圆时，加入5倍含5％FBS的培养基终止消化，将所有溶液吸至离心管中，1000rpm离心5min，用新的无血清培养基重悬细胞沉淀，接种至新的培养皿中继续培养。
7.经血源宫内膜干细胞表面抗原鉴定。
样品组：取原代经血源宫内膜干细胞，PBS清洗2遍，0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，细胞分别于CD73-APC、CD90-PE、CD45-FITC、HLA-DR-FITC流式抗体(商品化，biolegend)避光孵育20min。孵育结束后，PBS清洗2遍，洗去未结合的抗体，将细胞样品上机使用流式细胞仪进行检测。
对照组：未经抗体染色的原代经血源宫内膜干细胞上机使用流式细胞仪进行检测。
实施例3
1.经血采集套装的准备：
包括一个无菌标本保存瓶(内含有10ml经血保存液)、一个经过灭菌的月事杯、一对手套、一个巴氏吸管、一份说明书。
经血保存液为内含有5×青霉素、2×链霉素、30μg/ml卡那霉素、40μg/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液。
2.经血的采集
经咨询同意后，根据经血采集套装说明书收集健康女性(20-40岁)的经血样品5-10ml，置于无菌标本保存瓶中，充分混匀后低温保存，24h之内处理。
3.无菌检测：
在无菌条件下取样品0.5-1ml利用快速微生物检测仪检测是否细菌污染，若为阴性，继续分离经血源宫内膜干细胞。
4.经血源宫内膜干细胞分离：
取经检验合格的经血，用相同体积的PBS溶液(商品化，斯佳)稀释经血形成经血稀释液；取隔层离心管，加入经血稀释液0.5倍体积的Ficoll分离液(商品化，斯佳)，缓慢加入经血稀释液，之后750g离心15min；将上层溶液移至另一个新的离心管中，PBS清洗3遍，用无血清培养基(为商品化的培养基，品牌是lonza)重悬离心后沉淀，调整接种密度为8×105/ml，接种至培养皿中，十字混匀后放于二氧化碳培养箱中培养。
5.经血源宫内膜干细胞培养。
48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化处理。
6.经血源宫内膜干细胞消化：
当细胞生长至70～80％汇合时，吸去培养基，用PBS清洗2次，加入2ml0.4％(v/v)胰蛋白酶(商品化，sigma)消化3min，在显微镜下观察细胞缩小变圆时，加入4倍含5％FBS的培养基终止消化，将所有溶液吸至离心管中，1000rpm离心5min，用新的无血清培养基重悬细胞沉淀，接种至新的培养皿中继续培养。
7.经血源宫内膜干细胞表面抗原鉴定。
样品组：取原代经血源宫内膜干细胞，PBS清洗2遍，0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，细胞分别于CD73-APC、CD90-PE、CD45-FITC、HLA-DR-FITC流式抗体(商品化，biolegend)避光孵育10min。孵育结束后，PBS清洗2遍，洗去未结合的抗体，将细胞样品上机使用流式细胞仪进行检测。
对照组：未经抗体染色的原代经血源宫内膜干细胞上机使用流式细胞仪进行检测。
对比例：
1.经血采集：
将经血样品存放于含有0.2ml两性霉素B、0.2ml青霉素混合液的磷酸缓冲液中，于低温保存。
2.无菌检测：
在无菌条件下取样品1ml利用快速微生物检测仪检测是否细菌污染，若为阴性，继续分离经血源宫内膜干细胞。
3.经血源宫内膜干细胞分离：
经血用相同体积的PBS溶液稀释混匀后，通过100目筛网过滤得滤液，之后2000rpm离心10min.去除上清，在装有沉淀的离心管中按1∶1比例加入PBS溶液进行稀释；另取1个干净的离心管，加入1份Ficoll分离液，然后将稀释液缓慢的加到Ficoll分离液的上面，700g离心30min；吸取白膜层，PBS缓冲液洗涤两次，1500rpm/min离心5min。弃上清，沉淀用高糖DMEM+20％FBS重悬，调整细胞密度接种至培养皿中，培养箱中培养。
4.经血源宫内膜干细胞培养。
每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化传代继续培养。
5.经血源宫内膜干细胞表面抗原鉴定。
样品组：取原代经血源宫内膜干细胞，PBS清洗2遍，0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，细胞分别于CD73-APC、CD90-PE、CD45-FITC、HLA-DR-FITC流式抗体避光孵育20min。孵育结束后，PBS清洗2遍，洗去未结合的抗体，将细胞样品上机使用流式细胞仪进行检测。
对照组：未经抗体染色的原代经血源宫内膜干细胞上机使用流式细胞仪进行检测。
实施例4实验结果分析
1.经血污染几率比较，见表1：
表1经血污染几率比较结果
项目 对比例 实施例1 实施例2 实施例3
标本量(ml) 各5ml 各5ml 各5ml 各5ml
标本数量 10 10 10 10
细菌阳性 7 1 2 2
污染几率 70％ 10％** 0％** 10％**
注：对比例比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表1可以看出，实施例1、实施例2和实施例3中所使用的保存液要比对比例中的保存液使的经血的保存液污染几率低很多，有显著性差异(P＜0.05)，而实施例中实施例1所使用的保存液要比实施例2和实施例3污染几率小。
2.经血源宫内膜原代分离耗时比较，见表2。
表2经血源宫内膜原代分离耗时比较结果
组别 原代分离耗时(h) 原代培养耗时(d)
对比例 2.5±0.25 10±2
实施例1 1.3±0.14** 7±1
实施例2 1.05±0.13** 8±1.1
实施例3 1.12±0.10** 8.3±0.7
注：对比例比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表2可以看出，和对比例相比较，实施例1、实施例2和实施例3中原代分离耗时和原代培养耗时均较短，有显著性差异，可以在进行细胞库建立时节省更多时间和人力，更适合经血的规模化分离，而优选实施1。
3.细胞形态观察实施例1细胞形态观察见图1；对比例细胞形态观察见图2；
在倒置显微镜下观察，实施例1中的经血源干细胞在48h后已贴壁，贴壁性良好，细胞呈多角形伸展生长；对比例中的经血源干细胞贴壁数量比实施例中少，贴壁效果没有实施例中好。
实施例1中经血源源干细胞在第8天时汇合度达到80％以上，细胞折光性强，呈梭形，无杂细胞，形态、大小均一；对比例中经血源干细胞在第11d时汇合度达到80％以上，耗时比实施例中长。
取实施例2、实施例3进行上述试验，实验结果与实施例1结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
4.细胞流式鉴定比较
实施例1细胞流式鉴定结果见图3；对比例细胞流式鉴定结果见图4；结果见表3。
表3细胞流式鉴定比较结果
间充质干细胞公认的表面标记物为CD90+/CD59+/HLA-DR-/CD45-，其表达率CD90+CD45-≥95％，CD73+HLA-DR-≥95％，证明分离出来的间充质干细胞的质量达标。通过对脂肪间充质干细胞进行以上标记物的流式检测，实施例1、实施2和实施3中CD90+CD45-和CD73+HLA-DR-的表达率显著高于(P＜0.05))对比例中四种标记物的表达率，说明实施例1、2、3中分离的细胞纯度更高，含有干细胞更多，而对比例中分离出来的干细胞质量不达标。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种经血保存液，其特征在于，由(2～5)×青霉素、(2～5)×链霉素、30～50ug/ml卡那霉素、30～50ug/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的经血保存液在保存经血中的应用。
3.经血源宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得经血；采用如权利要求1所述的经血保存液保存所述经血；
步骤2：取所述经血稀释后获得经血稀释液，与分离液混合、离心；
步骤3：收集上清液清洗后，再与培养基混合，离心；
步骤4：收集沉淀，接种，培养。
4.根据权利要求3所述的分离培养方法，其特征在于，步骤2中所述稀释为经PBS溶液按照体积比1:1的比例稀释；
步骤2中所述分离液为Ficoll分离液，所述经血稀释液与所述分离液的体积比为1:(0.5～1)；
步骤2中所述离心为于700～800g离心15～30min；
步骤3中所述清洗为用PBS清洗2～4次；
步骤3中所述培养基为无血清培养基；
步骤4中所述接种的密度为(7～8)×105/mL；
步骤4中所述培养为48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7～14d在显微镜下观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化；
所述胰蛋白酶消化为弃去培养基，清洗，加质量浓度为0.3～0.5％的胰蛋白酶消化，传代；
所述消化的时间为2～3min，终止消化，离心，用无血清培养基重悬细胞沉淀；
所述终止消化采用细胞体积3-5倍量的含5％FBS的培养基；
所述离心为1000rpm离心5min。
5.根据权利要求3或4所述的分离培养方法，其特征在于，步骤2所述与分离液混合和/或步骤3中所述清洗采用隔层离心管。
CN201610077467.5A 2016-02-03 2016-02-03 经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法 Active CN105532647B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610077467.5A CN105532647B (zh) 2016-02-03 2016-02-03 经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610077467.5A CN105532647B (zh) 2016-02-03 2016-02-03 经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105532647A CN105532647A (zh) 2016-05-04
CN105532647B true CN105532647B (zh) 2019-02-15

Family

ID=55812650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610077467.5A Active CN105532647B (zh) 2016-02-03 2016-02-03 经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105532647B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867960A (zh) * 2017-02-28 2017-06-20 兰赫(上海)生物科技有限公司 一种子宫内膜干细胞的培养基及其制备方法
CN110612978A (zh) * 2019-09-26 2019-12-27 广东华夏健康生命科学有限公司 一种用于人月经血的保存液及其制备方法
CN110622954A (zh) * 2019-09-26 2019-12-31 广东华夏健康生命科学有限公司 一种用于人月经血的保存液及其制备方法
CN113041258A (zh) * 2021-03-29 2021-06-29 林树 一种用于修复宫腔粘连的生物组合物及其制备方法
CN115386538A (zh) * 2021-05-24 2022-11-25 上海长一干细胞研究中心有限公司 一种从月经血中分离、提取、培养子宫内膜干细胞的方法和专用培养基
CN113633754B (zh) * 2021-09-28 2022-08-30 上海揽微赛尔生物科技有限公司 卵巢干细胞在制备卵巢抗衰的药物中的用途
CN115644170A (zh) * 2022-11-21 2023-01-31 北京赛普九洲科技发展有限公司 一种经血保存液及制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5962213A (en) * 1996-06-14 1999-10-05 Biostore New Zealand Limited Compositions and methods for the preservation of living tissues
CN102399746A (zh) * 2011-08-17 2012-04-04 天津美德太平洋科技有限公司 细胞高富集靶向分离方法
CN103849944A (zh) * 2012-12-05 2014-06-11 上海坤爱生物科技有限公司 一种宫膜干细胞库的构建方法
CN103966162B (zh) * 2014-05-29 2016-07-06 成都清科生物科技有限公司 一种经血来源间充质干细胞分离方法
CN105112358B (zh) * 2015-09-08 2018-06-26 东莞赛尔生物科技有限公司 多功能的经血干细胞培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105532647A (zh) 2016-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105532647B (zh) 经血保存液及其应用、经血源宫内膜干细胞的分离培养方法
CN105861430B (zh) 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
Miller et al. Isolation of Methanobrevibacter smithii from human feces
CN103966162B (zh) 一种经血来源间充质干细胞分离方法
CN108812645A (zh) 一种人脐带间充质干细胞的细胞冻存液
CN105624099A (zh) 经血源宫内膜干细胞的分离培养方法
CN104450611A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法
CN103130890A (zh) Hpv16e7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用
CN104694466A (zh) 间充质干细胞来源的胞外体制备及在急性肺损伤中的应用
CN109593706B (zh) 一种培养基和子宫内膜干细胞的培养方法
CN106801032A (zh) 人羊膜上皮干细胞库的构建方法
CN104480062A (zh) 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法
CN112899182A (zh) 一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌
CN107354130A (zh) 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法
CN107236705B (zh) 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系
CN112011508B (zh) 一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法
CN105018422B (zh) 一种人脐带间充质干细胞规模化制备的方法
CN107541497A (zh) 人垂体腺瘤细胞株及其用途
CN107326062A (zh) 一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法
CN108070560A (zh) 一种人原代胃癌细胞的分离及培养方法
CN108034634B (zh) 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法
CN110982783A (zh) 精原干细胞的培养方法及其应用
CN110079496A (zh) 一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法
CN114426938B (zh) 具有缓解pcos功能的植物乳杆菌ccfm1202及其应用
CN106244525B (zh) 一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant