CN105112358B - 多功能的经血干细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种多功能的经血干细胞培养方法，通过经血和血浆的采集阶段、经血的除菌清洗阶段、经血的过滤阶段、自体血浆的制备阶段、单个核细胞的分离阶段、经血干细胞的培养阶段、经血干细胞的纯化及扩增阶段和经血干细胞的冻存阶段，由此本发明一是解决了现有技术必须用高浓度的胎牛血清培养带来的各种弊端，二是用客户自己的血浆培养自己的细胞，更让其自身觉得安全且易接受，真正实现了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多功能的经血干细胞培养方法，特别涉及一种从经血中提取并培养经血干细胞的方法。
背景技术
近众所周知，子宫内膜细胞系具有很强的自我更生能力，在每个月经周期都会有组织和血管的大量增长，这一增长过程会随着月经的来临而终止继而形成经血。经血是女性血液和一些脱落的子宫内膜、子宫颈粘液及阴道分泌物的混杂液体。近年来，美国的研究小组和日本的研究小组利用女性经血成功分离培养出具有多向分化功能的干细胞，并将该细胞命名为子宫内膜经血源间充质干细胞其，简称经血干细胞，其扩增能力是自体骨髓干细胞的30倍，而且在神经修复、抑制肿瘤和美容抗衰老等方面具有非常显著的作用，因此有望用来治疗损伤和衰老的组织。同时经血的获得不具有侵入性不会对供者造成伤害,不仅来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题。此外，经血干细胞还具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞，因此成为寻找人类干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点。
由于子经血干细胞研究是近几年才开始，与之配套的培养体系还不成熟，目前体外扩增培养体系中一般都含有一定浓度的胎牛血清，使用浓度至少10％才能保证细胞的正常生长传代。然而，经血干细胞在高浓度血清培养时，随着传代次数增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，动物血清可能存在动物携带的潜在病毒或支原体污染，对以后可能的临床应用构成威胁。尽管有些研究人员尝试了一些无血清培养基方案，但经血干细胞在无血清培养基中普遍存在生长缓慢，多向分化能力逐渐消失的问题，所以，急需开发一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。
发明内容
本发明的目的提供一种多功能的经血干细胞培养方法，通过经血和血浆的采集阶段、经血的除菌清洗阶段、经血的过滤阶段、自体血浆的制备阶段、单个核细胞的分离阶段、经血干细胞的培养阶段、经血干细胞的纯化及扩增阶段和经血干细胞的冻存阶段，由此本发明一是解决了现有技术必须用高浓度的胎牛血清培养带来的各种弊端，二是用客户自己的血浆培养自己的细胞，更让其自身觉得安全且易接受，真正实现了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。
为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种多功能的经血干细胞培养方法的解决方案，具体如下：
一种多功能的经血干细胞培养方法，步骤如下：
步骤1：经血和血浆的采集阶段，该阶段具体为：采用经血采集器采集经血，并将经血迅速转移到装有保存液的无菌离心管中，在温度为4℃的条件下保存，空腹抽取20-30ml静脉血置入抗凝容器里，在温度为4℃的条件下保存72h后，以此用于自体血浆的制备；
步骤2：经血的除菌清洗阶段，该阶段具体为：在48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，首次离心为800-1000g/10-15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混匀，再次离心为300-700g/10-15min，除去上清；
步骤3：经血的过滤阶段，该阶段具体为：将经过步骤2后所得的经血用清洗液1:1混合，充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块；
步骤4：自体血浆的制备阶段，该阶段具体为：将步骤1中所抽取的静脉血200g-400g/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在温度为2～8℃的条件下保存1～7天备用或在温度为-75～-85℃的条件下长期保存备用；
步骤5：单个核细胞的分离阶段，该阶段具体为：将步骤3中稀释的经血加入人淋巴细胞分离液之上，在温度为18-25℃的条件下700-1000g离心15-20分钟；吸取中央白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2-3次；收集底部单个核细胞沉淀
步骤6：经血干细胞的培养阶段，该阶段具体为：用完全培养基重悬上述单个核细胞并计数，以1×106细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于温度为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血干细胞；
步骤7：经血干细胞的纯化及扩增阶段，该阶段具体为：贴壁培养所述单个核细胞，在细胞培养48-72h后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，初次换液后每天观察细胞的生长情况，每2-3天半量换液一次。使细胞扩增得到纯化的经血干细胞；
步骤8：经血干细胞的冻存阶段，该阶段具体为：当扩增的经血干细胞数量达到1-2*108细胞时，按每106-107细胞加入0.5-1ml冻存液，放入冻存盒采用程序降温，4度1-2h，-20度1-2h,转入-80℃冰箱，12～24h后转入-196℃液氮保存备用。
所述的步骤1和步骤2中的保存液为0.9％生理盐水或者PBS，加入相应的抗生素和抗凝剂，抗生素浓度为终浓度为0.5-3％的青霉素和链霉素、终浓度为1-10ug/ml的两性霉素B和肝素。
所述的步骤2和步骤3中的清洗液为理盐水或者PBS，加入相应青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素，其中青霉素和链霉素为0.5-3％的终浓度，两性霉素B为1-10ug/ml的终浓度，庆大霉素为100-200U/ml的终浓度。
所述的步骤6和步骤7中的完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、80U/ml庆大霉素。
所述步骤8中的冻存液由80％基础培养基α-MEM,9％自体血浆，1％的氨基酸，10％的二甲基亚砜组成。
本发明通过培养的子宫内膜经血源间充质干细胞的鉴定，可知：
1)形态特征：置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一；
2)经血干细胞表面标志：用直接免疫荧光法检测以上得到的梭形细胞的表面标志的表达，细胞用藻红蛋白(PE)CD44和异硫氰酸荧光素(FITC)CD34标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。结果表明这种梭形细胞表达间充质干细胞的表面标志CD44，不表达造血干细胞的表面标志CD34；
3)经血干细胞的多能性：经血干细胞向脂肪细胞分化及油红O染色检测；经血干细胞向骨细胞分化及茜素红染色检测。说明干细胞亚群可在体外诱导分化为成骨细胞。
附图说明
图1为本发明的实施例1的形态特征的效果图；
图2为本发明的实施例1的经血干细胞表面标志的效果图；
图3为本发明的实施例1的诱导分化成脂肪细胞的效果图；
图4为本发明的实施例1的诱导分化为成骨细胞的效果图。
具体实施方式
本发明所用的自体血浆采用分次低剂量抽血，分次提取自体血浆，这样避免一次大剂量抽血对客户造成精神上及身体上的负担。具体为采经血时抽取客户30ml静脉血，分离其中的血浆,其中的2/3的血浆用于经血干细胞培养及初步扩增，1/3血浆-20度冻存以备后续经血源干细胞培养及储存时用，细胞少量扩增后分装冻存，以后根据客户的应用分次抽取客户自体血浆扩增培养其自体细胞。
下面结合附图和实施例对发明内容作进一步说明：
实施例1：
多功能的经血干细胞培养方法，步骤如下：
步骤1：经血和血浆的采集阶段，该阶段具体为：采用经血采集器采集经血，选用的经血采集器应该具有对女性外阴无创伤，使用方便，不易受污染，成本低廉，为下一步提取干细胞提供了高质量的保证，并将经血迅速转移到装有保存液的无菌离心管中，在温度为4℃的条件下保存，空腹抽取20ml静脉血置入抗凝容器里，在温度为4℃的条件下保存72h后，以此用于自体血浆的制备；
步骤2：经血的除菌清洗阶段，该阶段具体为：在48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，首次离心为800g/10min，除去上清，再次加入清洗液，充分混匀，再次离心为300g/10min，除去上清；
步骤3：经血的过滤阶段，该阶段具体为：将经过步骤2后所得的经血用清洗液1:1混合，充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块；
步骤4：自体血浆的制备阶段，该阶段具体为：将步骤1中所抽取的静脉血200g/min离心8min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在温度为2℃的条件下保存1天备用或在温度为-75℃的条件下长期保存备用；
步骤5：单个核细胞的分离阶段，该阶段具体为：将步骤3中稀释的经血加入人淋巴细胞分离液之上，在温度为18℃的条件下700g离心15分钟；吸取中央白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2次；收集底部单个核细胞沉淀；
步骤6：经血干细胞的培养阶段，该阶段具体为：用完全培养基重悬上述单个核细胞并计数，以1×106细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于温度为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血干细胞；
步骤7：经血干细胞的纯化及扩增阶段，该阶段具体为：贴壁培养所述单个核细胞，在细胞培养48h后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，初次换液后每天观察细胞的生长情况，每2天半量换液一次。使细胞扩增得到纯化的经血干细胞；
步骤8：经血干细胞的冻存阶段，该阶段具体为：当扩增的经血干细胞数量达到1*108细胞时，按每106细胞加入0.5ml冻存液，放入冻存盒采用程序降温，4度1h，-20度1,转入-80℃冰箱，12h后转入-196℃液氮保存备用。
所述的步骤1和步骤2中的保存液为0.9％生理盐水或者PBS，加入相应的抗生素和抗凝剂，抗生素浓度为终浓度为0.5％的青霉素和链霉素、终浓度为1ug/ml的两性霉素B和肝素。
所述的步骤2和步骤3中的清洗液为理盐水或者PBS，加入相应青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素，其中青霉素和链霉素为0.5％的终浓度，两性霉素B为1ug/ml的终浓度，庆大霉素为100U/ml的终浓度。
所述的步骤6和步骤7中的完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、80U/ml庆大霉素。
所述步骤8中的冻存液由80％基础培养基α-MEM,9％自体血浆，1％的氨基酸，10％的二甲基亚砜组成。
对实施例1所得的干细胞进行培养的子宫内膜经血源间充质干细胞的鉴定
1)形态特征：置于倒置显微镜下拍照，如图1所示，细胞形状为短梭形，大小均一；
2)经血干细胞表面标志：用直接免疫荧光法检测以上得到的梭形细胞的表面标志的表达，细胞用藻红蛋白(PE)CD44和异硫氰酸荧光素(FITC)CD34标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。如图2所示，结果表明这种梭形细胞表达间充质干细胞的表面标志CD44，不表造血干细胞的表面标志CD34。
(3)经血干细胞向脂肪细胞分化及油红O染色检测
细胞传至第3代时将其以2X107/L的细胞数转入成脂诱导培养基中进行培养。诱导培养后不同时间段，对成脂诱导组进行油红O脂肪颗粒染色。成脂诱导培养基包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、0.5mM IBMX(isobulyl-1-methylxanthione)、0.1mM消炎痛、1uM地塞米松。在第6天、第12天和第16天分别进行油红O染色。结果显示：培养12天可见到折光度增加的液泡充满整个细胞；油红O染色发现培养中约60～80％细胞富含脂肪滴如图3所示，说明干细胞亚群可在体外诱导分化成脂肪细胞。
(4)经血干细胞向骨细胞分化及茜素红染色检测
取第三代经血干细胞，培养在6孔板中，待细胞长到80％左右时换用成骨诱导液培养，诱导液的成分包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、10Mmβ-磷酸甘油、0.1mM抗坏血酸磷酸盐Vc、0.1uM地塞米松。每三天换液，培养3周，于2周、3周分别进行茜素红染色观察。结果显示：成骨诱导培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照组中细胞仍是梭形且呈单层生长；如图4所示，2周之后已有矿化结节形成了，3周后结节比较多，染色比较明显。说明干细胞亚群可在体外诱导分化为成骨细胞。
实施例2：
多功能的经血干细胞培养方法，步骤如下：
步骤1：经血和血浆的采集阶段，该阶段具体为：采用经血采集器采集经血，并将经血迅速转移到装有保存液的无菌离心管中，在温度为4℃的条件下保存，空腹抽取25ml静脉血置入抗凝容器里，在温度为4℃的条件下保存72h后，以此用于自体血浆的制备；
步骤2：经血的除菌清洗阶段，该阶段具体为：在48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，首次离心为900g/13min，除去上清，再次加入清洗液，充分混匀，再次离心为500g/13min，除去上清；
步骤3：经血的过滤阶段，该阶段具体为：将经过步骤2后所得的经血用清洗液1:1混合，充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块；
步骤4：自体血浆的制备阶段，该阶段具体为：将步骤1中所抽取的静脉血300g/min离心10min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在温度为5℃的条件下保存4天备用或在温度为-80℃的条件下长期保存备用；
步骤5：单个核细胞的分离阶段，该阶段具体为：将步骤3中稀释的经血加入人淋巴细胞分离液之上，在温度为23℃的条件下850g离心17分钟；吸取中央白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2次；收集底部单个核细胞沉淀
步骤6：经血干细胞的培养阶段，该阶段具体为：用完全培养基重悬上述单个核细胞并计数，以1×106细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于温度为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血干细胞；
步骤7：经血干细胞的纯化及扩增阶段，该阶段具体为：贴壁培养所述单个核细胞，在细胞培养60h后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，初次换液后每天观察细胞的生长情况，每2.5天半量换液一次。使细胞扩增得到纯化的经血干细胞；
步骤8：经血干细胞的冻存阶段，该阶段具体为：当扩增的经血干细胞数量达到1.5*108细胞时，按每106细胞加入0.7ml冻存液，放入冻存盒采用程序降温，4度1.5h，-20度1.5h,转入-80℃冰箱，18h后转入-196℃液氮保存备用。
所述的步骤1和步骤2中的保存液为0.9％生理盐水或者PBS，加入相应的抗生素和抗凝剂，抗生素浓度为终浓度为1.5％的青霉素和链霉素、终浓度为5ug/ml的两性霉素B和肝素。
所述的步骤2和步骤3中的清洗液为理盐水或者PBS，加入相应青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素，其中青霉素和链霉素为1.5％的终浓度，两性霉素B为5ug/ml的终浓度，庆大霉素为150U/ml的终浓度。
所述的步骤6和步骤7中的完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、80U/ml庆大霉素。
所述步骤8中的冻存液由80％基础培养基α-MEM,9％自体血浆，1％的氨基酸，10％的二甲基亚砜组成。
对实施例2所得的干细胞进行培养的子宫内膜经血源间充质干细胞的鉴定
1)形态特征：置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一；
2)经血干细胞表面标志：用直接免疫荧光法检测以上得到的梭形细胞的表面标志的表达，细胞用藻红蛋白(PE)CD44和异硫氰酸荧光素(FITC)CD34标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。结果表明这种梭形细胞表达间充质干细胞的表面标志CD44，不表造血干细胞的表面标志CD34。
(3)经血干细胞向脂肪细胞分化及油红O染色检测
细胞传至第3代时将其以2X107/L的细胞数转入成脂诱导培养基中进行培养。诱导培养后不同时间段，对成脂诱导组进行油红O脂肪颗粒染色。成脂诱导培养基包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、0.5mM IBMX(isobulyl-1-methylxanthione)、0.1mM消炎痛、1uM地塞米松。在第6天、第12天和第16天分别进行油红O染色。结果显示：培养12天可见到折光度增加的液泡充满整个细胞；油红O染色发现培养中约60～80％细胞富含脂肪滴说明干细胞亚群可在体外诱导分化成脂肪细胞。
(4)经血干细胞向骨细胞分化及茜素红染色检测
取第三代经血干细胞，培养在6孔板中，待细胞长到80％左右时换用成骨诱导液培养，诱导液的成分包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、10Mmβ-磷酸甘油、0.1mM抗坏血酸磷酸盐Vc、0.1uM地塞米松。每三天换液，培养3周，于2周、3周分别进行茜素红染色观察。结果显示：成骨诱导培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照组中细胞仍是梭形且呈单层生长；2周之后已有矿化结节形成了，3周后结节比较多，染色比较明显。说明干细胞亚群可在体外诱导分化为成骨细胞。
实施例3：
多功能的经血干细胞培养方法，步骤如下：
步骤1：经血和血浆的采集阶段，该阶段具体为：采用经血采集器采集经血，并将经血迅速转移到装有保存液的无菌离心管中，在温度为4℃的条件下保存，空腹抽取30ml静脉血置入抗凝容器里，在温度为4℃的条件下保存72h后，以此用于自体血浆的制备；
步骤2：经血的除菌清洗阶段，该阶段具体为：在48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，首次离心为1000g/15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混匀，再次离心为700g/15min，除去上清；
步骤3：经血的过滤阶段，该阶段具体为：将经过步骤2后所得的经血用清洗液1:1混合，充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块；
步骤4：自体血浆的制备阶段，该阶段具体为：将步骤1中所抽取的静脉血400g/min离心12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在温度为8℃的条件下保存7天备用或在温度为-85℃的条件下长期保存备用；
步骤5：单个核细胞的分离阶段，该阶段具体为：将步骤3中稀释的经血加入人淋巴细胞分离液之上，在温度为25℃的条件下1000g离心20分钟；吸取中央白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤3次；收集底部单个核细胞沉淀
步骤6：经血干细胞的培养阶段，该阶段具体为：用完全培养基重悬上述单个核细胞并计数，以1×106细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于温度为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血干细胞；
步骤7：经血干细胞的纯化及扩增阶段，该阶段具体为：贴壁培养所述单个核细胞，在细胞培养72h后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，初次换液后每天观察细胞的生长情况，每3天半量换液一次。使细胞扩增得到纯化的经血干细胞；
步骤8：经血干细胞的冻存阶段，该阶段具体为：当扩增的经血干细胞数量达到1-2*108细胞时，按每107细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒采用程序降温，4度2h，-20度2h,转入-80℃冰箱，24h后转入-196℃液氮保存备用。
所述的步骤1和步骤2中的保存液为0.9％生理盐水或者PBS，加入相应的抗生素和抗凝剂，抗生素浓度为终浓度为3％的青霉素和链霉素、终浓度为10ug/ml的两性霉素B和肝素。
所述的步骤2和步骤3中的清洗液为理盐水或者PBS，加入相应青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素，其中青霉素和链霉素为3％的终浓度，两性霉素B为10ug/ml的终浓度，庆大霉素为200U/ml的终浓度。
所述的步骤6和步骤7中的完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、80U/ml庆大霉素。
所述步骤8中的冻存液由80％基础培养基α-MEM,9％自体血浆，1％的氨基酸，10％的二甲基亚砜组成。
对实施例3所得的干细胞进行培养的子宫内膜经血源间充质干细胞的鉴定
1)形态特征：置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一；
2)经血干细胞表面标志：用直接免疫荧光法检测以上得到的梭形细胞的表面标志的表达，细胞用藻红蛋白(PE)CD44和异硫氰酸荧光素(FITC)CD34标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。结果表明这种梭形细胞表达间充质干细胞的表面标志CD44，不表造血干细胞的表面标志CD34。
(3)经血干细胞向脂肪细胞分化及油红O染色检测
细胞传至第3代时将其以2X107/L的细胞数转入成脂诱导培养基中进行培养。诱导培养后不同时间段，对成脂诱导组进行油红O脂肪颗粒染色。成脂诱导培养基包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、0.5mM IBMX(isobulyl-1-methylxanthione)、0.1mM消炎痛、1uM地塞米松。在第6天、第12天和第16天分别进行油红O染色。结果显示：培养12天可见到折光度增加的液泡充满整个细胞；油红O染色发现培养中约60～80％细胞富含脂肪滴说明干细胞亚群可在体外诱导分化成脂肪细胞。
(4)经血干细胞向骨细胞分化及茜素红染色检测
取第三代经血干细胞，培养在6孔板中，待细胞长到80％左右时换用成骨诱导液培养，诱导液的成分包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、10Mmβ-磷酸甘油、0.1mM抗坏血酸磷酸盐Vc、0.1uM地塞米松。每三天换液，培养3周，于2周、3周分别进行茜素红染色观察。结果显示：成骨诱导培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照组中细胞仍是梭形且呈单层生长；2周之后已有矿化结节形成了，3周后结节比较多，染色比较明显。说明干细胞亚群可在体外诱导分化为成骨细胞。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种多功能的经血干细胞培养方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1：经血和血浆的采集阶段，该阶段具体为：采用经血采集器采集经血，并将经血迅速转移到装有保存液的无菌离心管中，在温度为4℃的条件下保存，空腹抽取20-30ml静脉血置入抗凝容器里，在温度为4℃的条件下保存72h后，以此用于自体血浆的制备；
步骤2：经血的除菌清洗阶段，该阶段具体为：在48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，首次离心为800-1000g/10-15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混匀，再次离心为300-700g/10-15min，除去上清；
步骤3：经血的过滤阶段，该阶段具体为：将经过步骤2后所得的经血用清洗液1:1混合，充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块；
步骤4：自体血浆的制备阶段，该阶段具体为：将步骤1中所抽取的静脉血200-400g/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在温度为2～8℃的条件下保存1～7天备用或在温度为-75～-85℃的条件下长期保存备用；
步骤5：单个核细胞的分离阶段，该阶段具体为：将步骤3中稀释的经血加入人淋巴细胞分离液之上，在温度为18-25℃的条件下700-1000g离心15-20分钟；吸取中央白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2-3次；收集底部单个核细胞沉淀；
步骤6：经血干细胞的培养阶段，该阶段具体为：用完全培养基重悬上述单个核细胞并计数，以1×106细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于温度为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血干细胞；
步骤7：经血干细胞的纯化及扩增阶段，该阶段具体为：贴壁培养所述单个核细胞，在细胞培养48-72h后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，初次换液后每天观察细胞的生长情况，每2-3天半量换液一次；
步骤8：经血干细胞的冻存阶段，该阶段具体为：当扩增的经血干细胞数量达到1-2×108细胞时，按每106-107细胞加入0.5-1ml冻存液，放入冻存盒采用程序降温，4℃1-2h，-20℃1-2h，转入-80℃冰箱，12～24h后转入-196℃液氮保存备用；
其中所述的步骤1和步骤2中的保存液为0.9％生理盐水或者PBS，加入相应的抗生素和抗凝剂，抗生素浓度为终浓度为0.5-3％的青霉素和链霉素、终浓度为1-10ug/ml的两性霉素B和肝素；
其中，所述的步骤2和步骤3中的清洗液为生理盐水或者PBS，加入相应青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素，其中青霉素和链霉素为0.5-3％的终浓度，两性霉素B为1-10ug/ml的终浓度，庆大霉素为100-200U/ml的终浓度；
其中，所述的步骤6和步骤7中的完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、80U/ml庆大霉素；
其中，所述步骤8中的冻存液由80％基础培养基α-MEM，9％自体血浆，1％的氨基酸，10％的二甲基亚砜组成。
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