CN114940966B - 一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法及应用 - Google Patents

一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法及应用。本发明提供的制备方法，通过将番茄根尖原生质体通过处理、孵育、酶解、过滤、离心、活性检测等过程，最终制成单细胞悬液。采用本发明所述方法制成的植物原生质体单细胞悬液，细胞活性高达90％以上，可满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，应用价值高。

Description

一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法及其在构建单细胞转录组文库中的应用。
背景技术
多细胞生物个体由多种形态功能各不相同的细胞组成，细胞的异质性在多细胞生物体中是普遍存在的生物学现象，不同细胞类群的功能及发育的分子调控机制亟待我们展开深入研究。近十年来，单细胞测序技术发展迅猛，目前具备高通量、低价格和单分子分辨率和高稳定性的10×genomics单细胞技术已经出现，这使万级别的单细胞研究成本不断降低。目前，单细胞测序技术已在肿瘤、免疫、发育等方向获得了良好的应用，由于植物细胞中细胞壁的存在，目前单细胞测序技术在植物领域的研究进展缓慢，迄今为止在番茄中仍未见相关研究报道，截至目前单细胞测序在植物领域的报道还十分有限。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，只有有效去除细胞壁中的纤维素和果胶，我们才可能获得高质量的植物单细胞悬液，从而突破植物单细胞测序技术障碍。
根尖是植物生命活动最为活跃的部分，对于营养物质和水分的吸收以及根的生长和伸长起到重要作用，在生理上具有非常重要的意义。目前还没有番茄根单细胞分离并用于单细胞测序应用的相关报道，原因在于目前番茄根单细胞分离体系还不能在保证较好裂解效果的同时兼顾成活率，而且植物细胞壁一旦被去除导致植物细胞稳定性减弱，容易破碎，尤其是当植物细胞通过10×Genomics平台进行分选时，这常常导致细胞捕获率低。因此急需建立一种能兼顾高裂解效率，高细胞成活率和高细胞捕获率的番茄根尖原生质体单细胞制备的方法，这对于单细胞测序技术在番茄中的发展有着重要作用，能够为番茄其他器官组织的单细胞分离提供参考，推动单细胞测序技术在番茄中的应用。
发明内容
针对现有技术的空缺，本发明创造性的提供了一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法，采用本发明所述方法制备原生质体单细胞悬液，细胞活性高达95％以上，且组织裂解完全，得到的细胞悬液浓度高，细胞总数多，可用于单细胞转录组测序文库的构建，应用价值高。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
S1、将番茄种子灭菌后，24-28℃摇床20h，待番茄种子露白后，选择生长状况良好的种子转移至液体1/2 MS培养基中，黑暗条件下24-28℃静置培养24 h-48h；
S2、使用超纯水配制原生质体分离用的溶液，所述溶液包括甘露醇溶液、酶解液、洗涤液；
S3、选取根部发育良好的番茄幼苗浸泡在甘露醇溶液中，静置10 min；
S4、选取合适长度根尖区域，用锋利刀片切成0.5-1mm的根段，放入冰浴酶解液中；
S5、将含有根段的酶解液在冰浴状态下抽真空；
S6、将步骤S5制得的酶解液与根段的混合物放入摇床于23℃-28避光孵育2-3h，镜检至消化完全；
S7、将步骤S6制得的酶解产物用1mL的宽口枪头转移，通过细胞筛过滤，过滤完成后，向滤网加入2-4mL洗涤液洗涤残渣，经离心处理，去掉上清液，用宽口枪头加入1mL洗涤液重悬原生质体并离心，连续通过离心-洗涤处理2-3次，去掉上清液，制得细胞悬液；制备完成后用显微镜细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，即可。
优选地，步骤S2中所述的甘露醇溶液由如下组分组成：8%（w/v）的甘露醇。
优选地，步骤S2所述的酶解液由如下组分组成：8%（w/v）甘露醇、20mM KCL、20mMMES、20mM CaCl2、20mM MgCl2、0.1%（w/v）的BSA（牛血清蛋白）、1%-1.5%（w/v）的纤维素酶R-10（产自绿色木酶）、0.5%-1%（w/v）的离析酶R-10（产自根霉菌）、0.1%-0.2%（w/v）果胶酶Y-23（产自日本曲霉）、2.5-5.7U/mL的果胶酶p2611（产自棘孢曲霉），且酶解液需通过0.45um无菌滤膜过滤除菌。
优选地，步骤S2所述的洗涤液由如下组分组成：20mM KCl、0.1%（w/v） BSA，8%（w/v）甘露醇，20mM MES，10μM褪黑素，且洗涤液需通过0.45um无菌滤膜过滤除菌。
优选地，步骤S4所述合适长度根尖区域为1-2 cm，切后根段长度为0.5-1mm。
优选地，步骤S5所述的真空度为-0.05MPa，抽真空时间为10-30min。
优选地，步骤S6所述摇床温度为23-26℃，转速设置为30-60r/min，孵育时间为2-3h。
优选地，步骤S7所述的细胞筛孔径大小为40μm，所述的离心处理过程为于4℃，250-400 g转速下离心3-6min。
优选地，步骤S8所述的台盼蓝溶液浓度为0.4%，染色时台盼蓝溶液与细胞悬液比值为1:9-1:5，染色时间为1-3min。
本发明还提供了一种利用上述的制备方法在构建单细胞转录组测序文库中的应用。
优选地，将利用所述制备方法制备的单细胞悬液置于冰上，于30min内完成建库。
本发明的有益效果为：本发明中，将番茄根尖原生质体经清洗、酶解消化、洗涤等过程，最终制成了单细胞悬液。在制备过程中，采用一种含有纤维素酶R-10（产自绿色木酶）、离析酶R-10（产自根霉菌）、果胶酶Y-23（产自日本曲霉）、果胶酶p2611（产自棘孢曲霉）的混合酶处理番茄根尖组织，另外在酶解液中加入了20mM的MgCL2。在酶解液中加入产自棘孢曲霉的p2611果胶酶和MgCL2提高了酶解效率，这样有利于短时间内组织快速完全酶解，去掉植物细胞壁的同时，不破坏细胞的完整性，使细胞活性提高到95%以上。这可能是因为番茄根较粗，细胞层数多以及细胞壁结构和成分与其他植物或番茄其他组织不同，导致常规的酶解液组分无法有效快速裂解其细胞壁，而需要纤维素酶R-10（产自绿色木酶）、离析酶R-10（产自根霉菌）、果胶酶Y-23（产自日本曲霉）、果胶酶p2611（产自棘孢曲霉），再同时配合钙、镁离子提高酶活才能取得最好的裂解效果。
此外，需要注意的是，本发明中，酶消化液中各酶按照本申请实施例所述量添加均可；在单细胞标记建库时，最终根据细胞数量的多少，原生质体悬液的添加体积也会存在区别，洗涤液洗涤时的加入量一般在100μL～2mL之间。
附图说明
图1 实施例1裂解1.5h时根尖裂解情况照片。
图2 实施例2裂解1.5h时根尖裂解情况照片。
图3对比例1裂解1.5h时根尖裂解情况照片。
图4对比例2裂解1.5h时根尖裂解情况照片。
图5对比例3裂解1.5h时根尖裂解情况照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。为了对比不同酶解配方对番茄根尖的酶解效果我们设置了多个对比例。实施例1-2与对照例1-3的区别在于其酶解液成分不同，实施例1与实施例2的区别在于洗涤液的成分不同。
一、样品制备
一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
S1、将番茄种子灭菌后，28℃摇床20h，待番茄种子露白后，选择生长状况良好的种子转移至液体1/2 MS培养基中，黑暗条件下24℃静置培养24 h。
S2、使用超纯水配制分离用的溶液，所述溶液包括甘露醇溶液、酶解液、洗涤液，实施例1-2，对照例1-3所使用的溶液按表1配方配制。其中酶解液与洗涤液配制好后冰浴。
表1
。
S3、选取根部发育良好的番茄幼苗浸泡在甘露醇溶液中，静置10 min。
S4、选取1cm根尖区域，用锋利刀片切成0.5-1mm的根段，收集到冰浴酶解液中。实施例1，实施例2，对照例1，对照例2，对照例3，各使用100个根尖。
S5、将含有根段的酶解液在冰浴状态下抽真空至-0.05MPa，保持10—30min。抽真空的目的是可促进酶解液有效的进入到根尖组织中，加速酶解过程。
S6、将步骤S5制得的酶解液与根段的混合物放入摇床于26℃避光孵育裂解3h，摇床转速设置为50r/min，镜检至消化完全,。其中在酶解1.5h时，取出部分根尖，在显微镜下检查酶解状况并拍照，实施例1-2与对照例1-3的裂解照片如附图1-5所示。
S7、将步骤S6制得的酶解产物用1mL的宽口枪头转移至40um细胞筛过滤，细胞筛放置在无菌50 mL离心管上，过滤完成后，使用对应浓度的原生质体洗涤液冲洗残渣数次。使用离心机离心，离心机温度设置为4℃，调节转速为400× g，离心5 min，去掉上清液，用宽口枪头加入1mL洗涤液重悬原生质体并离心，连续通过离心-洗涤处理2-3次，去掉上清液，制得细胞悬液；制备完成后用显微镜细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，即可。
S8、吸取15 μL原生质体悬液，用细胞计数板在显微镜下观察，统计四角及中间小格原生质体数量，计算浓度，取18μL细胞悬液加入2ul 0.4%台盼蓝混匀，加入细胞计数板，静置2min，统计细胞成活率。
对照例1-3，与实施例1-2在原生质体分离步骤上一致，主要在所使用的酶解液成分存在差异。对照例1的酶解液成分相比实施例1-2缺少果胶酶p2611和MgCL2；对照例2的酶解液成分相比实施例1-2缺少MgCL2；对比例3的酶解液成分相比实施例1-2缺少果胶酶p2611。
实施例1与实施例2，在酶解液成分上一致，但是洗涤液成分有所差异，具体来说实施例2的洗涤液成分中添加了10µM的褪黑素。
二、细胞数量检测
1.试验样品：采用实施例1-2及对照例1-3所述的制备方法制成的单细胞悬液，酶解时间为3h。
2.取上述细胞悬液18μL，加入一次性细胞计数板中，统计四角及中间小格原生质体数量计算平均值。
细胞数量=单个格子细胞数量平均值×10×V，其中V代表悬液体积，可以1ml移液器测量，单位μL。
检测结果见表2：
表2
实施例1 实施例2 对照例1 对照例2 对照例3
细胞数量 4.86×105 4.79×105 1.03×105 2.36×105 2.21×105
三、细胞活性检测
1.试验样品：实施例1-2及对照例1-3所述的制备方法制成的单细胞悬液，酶解时间3h。
2.取上述细胞悬液各180μL，加入试管中，然后向试管中加入20μL浓度为0.4％的台盼蓝染液，染色2min，并吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖玻片，于显微镜下任取几个视野计数细胞总数和活细胞数，计算细胞活性。
细胞活性＝活细胞数/细胞总数×100%。
实验结果见表3：
表3
实施例1 实施例2 对照例1 对照例2 对照例3
细胞活性 96．3% 96．8% 95.1% 94.3% 95.8%
由表2和附图1-2可看出实施例1-2中根尖组织在裂解1.5h时根尖的组织已被破坏，表明实施例1-2的酶解液在酶解番茄根尖时裂解效果最好，后续收集到的细胞较多也说明了这一点。而从表2和附图3-5可以看出对比例1-3的根尖在与实施例1-2相同条件下进行裂解，而根尖仍然具有可辨析的轮廓，表明对比例1-3根尖裂解效果较差，后续收集到的细胞数较少也说明了这一点。在裂解3h后，实施例1和实施例2可以获得最大的细胞数量，且活性达到96.3%和96.8%（见表3），对比例1-3虽然活性也较高（见表3）但是获得的细胞数量相比实施例1和实施例2大幅减少，表明实施例1-2的酶解液更适用于番茄根尖的裂解，根尖组织在对比例1-3中酶解并不充分，酶解不充分会导致获得根细胞的种类不全面，会造成单细胞测序数据结果的较大偏差甚至得出错误结论。上述结果证明了本发明技术方案的完整性和高效性。
四、分选、建库、测序
1.试验样品：采用实施例1-2所述的制备方法制成的单细胞悬液。
2.根据实施例1-2细胞浓度，各取16000个细胞，通过10×genomics单细胞分选平台分选，建库，并使用Illumina平台进行高通量测序，通过生信分析，实施例1和实施例2捕获到的细胞数和捕获率（细胞捕获率=细胞捕获数/分选细胞数）见表4。
表4
样品名 实施例1 实施例2
捕获细胞数 5132个 9685个
细胞捕获率 32.1% 60．5%
由表4可见，在实施例2中的洗涤液中添加褪黑素增加了在使用10×genomics平台进行单细胞分选测序中的细胞捕获率。褪黑素是一种由脑松果体分泌的动物激素，同时其具有较强的抗氧化能力可以清除细胞中的自由基进而提高细胞膜的稳定性，这使得失去细胞壁的植物细胞更加稳定，进而在使用10×genomics平台进行分选时，获得了更高的细胞捕获率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种番茄根尖原生质体单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、番茄种子灭菌后，加入适量无菌水，在摇床中进行孵育，使种子萌发；诱导番茄种子萌发的具体步骤为：取成熟饱满的番茄种子，24-28℃摇床20h，待番茄种子露白后，选择生长状况良好的种子转移至液体1/2 MS培养基中，黑暗条件下24-28℃静置培养24-48h；
S2、使用超纯水配制制备单细胞悬液所用的溶液，包括甘露醇溶液、酶解液以及洗涤液，其中酶解液和洗涤液冰浴；
S3、挑选出根部生长良好的番茄幼苗，放入步骤S2中制备好的甘露醇溶液中浸泡；
S4、从S3中选取合适长度根尖区域，用刀片切成根段，转移至S2中的冰浴酶解液中；
S5、将S4中含有根段的酶解液在冰浴状态下抽真空；
S6、将步骤S5制得的酶解液与根段的混合物放入摇床避光孵育酶解；
S7、将步骤S6制得的酶解产物用1mL的宽口枪头转移，通过细胞筛过滤，过滤完成后，向滤网加入适量洗涤液洗涤残渣，经离心处理，去掉上清液，用宽口枪头加入1mL洗涤液重悬原生质体并离心，连续处理3次，去掉上清液，制得细胞悬液；
S8、将步骤S7制得的细胞悬液稀释，在显微镜下使用细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，即可；
所述步骤S2中所述的甘露醇溶液的浓度为0.08g/mL的甘露醇水溶液；步骤S2所述的酶解液由如下组分组成：0.08g/mL甘露醇、20mM KCL、20mM MES、20mM CaCl2、20mM MgCl2、0.001g/mL的牛血清蛋白BSA、0.015g/mL的产自绿色木酶的纤维素酶R-10、0.005g/mL的产自根霉菌的离析酶R-10、0.001g/mL的产自日本曲霉的果胶酶Y-23、2.5-5.7U/mL的产自棘孢曲霉的果胶酶P2611，且酶解液需通过0.45um无菌滤膜过滤除菌；
所述步骤S2所述的洗涤液由如下成分组成：20mM KCl、0.001g/mLBSA、0.08g/mL甘露醇、20mM MES、10μM褪黑素，且洗涤液需通过0.45um无菌滤膜过滤除菌。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中根尖长度为1-2 cm，切后根段长度为0.5-1mm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述的真空度为-0.05MPa，抽真空时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6所述摇床温度为23-28℃，转速设置为30-60r/min，孵育时间为2-3h。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S7所述的细胞筛孔径大小为40μm，所述的离心处理过程为于4℃，250-400 g转速下离心3-6min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S8所述的台盼蓝溶液浓度为0.4%，染色时台盼蓝溶液与细胞悬液比值为1:9-1:5，染色时间为1-3min。
7.一种根据权利要求1所述制备方法在构建番茄根尖单细胞转录组文库中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将利用权利要求1制备的单细胞悬液置于冰上，于30min内完成建库。
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