CN111474231A - 利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体dna损伤程度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：获取浮萍植株，剪取浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27‑29℃处理28‑30min，用组织酶解液在黑暗、25‑26℃条件下酶解浮萍植株的假根25‑30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，琼脂糖包埋原生质体，原生质体的裂解，单细胞凝胶电泳，染色及观察，在荧光显微镜下观察原生质体的彗星图像，当出现彗星拖尾现象判断为该原生质体DNA受损。本发明的方法首创了利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度，利用该方法可在短时间内检测浮萍原生质体DNA损伤程度。
Description
本发明得到：国家自然科学基金青年项目(31700443)的资助。天津师范大学2018年市级创新训练项目(201810065031)。
技术领域
本发明属于单细胞凝胶电泳技术领域，具体来说涉及一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法。
背景技术
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)又称彗星试验(comet assay)是近年来发展起来的可以在细胞水平检测真核细胞DNA损伤的一种遗传毒理分析技术,具有简便、快速、灵敏、样品用量少和无需放射性标记等特点。目前运用单细胞凝胶电泳技术检测动物或人细胞DNA损伤的研究国际上已有一些报道，但应用于植物细胞DNA损伤研究的尚不多见。若以动物或人体细胞为原材料进行单细胞凝胶电泳，其培养技术相对复杂，来源少、成本高；制备单个细胞时多数需要经过酶解或细胞剪切、匀浆，不可避免的对细胞造成一些伤害，而且所获细胞来源、尺寸不同，可能会影响结果的判断。另一方面，以往的以植物细胞为材料进行电泳，获得的彗星图像效率均不高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，该方法通过一定的方法处理使植物细胞质壁分离、降解细胞壁获取原生质体，进行悬浮培养，无酶学消化作用，具有快速、简便、成本低廉、结果准确等优点，有效的获取的浮萍原生质体进行单细胞凝胶电泳的彗星图像。本发明以单细胞凝胶电泳技术为手段检测萍原生质体DNA损伤程度，可用于探索重金属镉对植物遗传毒理效应的检测方法和实验体系，并为研究植物相应重金属胁迫的细胞和分子机理提供新的证据。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍(Lemnaturionifera)原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：
1)获取浮萍植株；
2)剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27-29℃处理28-30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L-150g/L；
在所述步骤2)中，所述假根的长度为2-5cm。
3)用组织酶解液在黑暗、25-26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍植株的假根25-30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，其中，在酶解过程中，每隔8-10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；所述组织酶解液的组成包括：
在所述步骤3)中，每次清洗所述原生质体的方法为：用A液垂直打入离心管，以使原生质体自动悬起，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液，其中，离心的温度为20-25℃，转速为2000-3000×g，时间为2-5min。
4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加150-200μL正常熔点琼脂糖凝胶制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温20～25℃保持至少10小时，以使正常熔点琼脂糖凝胶干燥，移除所述盖玻片；将60-70μL低熔点琼脂糖凝胶与30-40μL步骤3)所得原生质体混合，滴加在所述第一层胶上，再次加盖盖玻片，于4℃固化10-20min；
在所述步骤4)中，所述低熔点琼脂糖凝胶由低熔点琼脂糖与去离子水组成，低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。
在所述步骤4)中，所述正常熔点琼脂糖凝胶由正常熔点琼脂糖和去离子水组成，正常熔点琼脂糖凝胶中正常熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。
在所述步骤4)中，正常熔点琼脂糖的熔点为87-92℃；低熔点琼脂糖的熔点为62-68℃。
5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用所述纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解55-65min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h，PBS缓冲液的组成包括：
K2HPO4·3H2O 11-12g/l
KH2PO4 6-8g/l
溶剂为去离子水
所述碱性裂解液的组成包括：
NaCL 146-146.5g/l
Na2EDTA 37-37.5g/l
Tris(三羟甲基氨基甲烷) 1-1.5g/l
溶剂为去离子水
其中，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h前加入该碱性裂解液质量10-11wt％的DMSO(二甲基亚砜)和1-2wt％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)并均匀混合；
在所述步骤5)中，所述碱性裂解液的pH为9.8-10.2。
在所述步骤5)中，所述PBS缓冲液的pH为7.3-7.5。
6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片3-5次，置于水平电泳槽内，加入Ph为13-15的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育28-35min后进行电泳，电泳条件如下：电压为20-25V，电流为300-350mA，电泳时间为30-35min；
在所述步骤6)中，电泳缓冲液的组成包括：
Na2EDTA 0.35-0.4g/l
NaOH 1-1.5g/l
溶剂为去离子水
7)染色及观察：从水平电泳槽中取出载玻片，用PBS缓冲液漂洗3-5次，每次3-5min，漂洗后用SYBR Gold对所述原生质体染色；
在所述步骤7)中，染色后将载玻片浸泡在PBS缓冲液中，用于洗掉多余的染料。
8)在荧光显微镜下观察步骤7)得到原生质体的彗星图像，当出现彗星拖尾现象判断为该原生质体DNA受损。
本发明的方法首创了利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度，利用该方法可在短时间内检测浮萍原生质体DNA损伤程度，应用于浮萍经重金属镉胁迫后原生质体DNA损伤和修复的研究，填补了检测植物细胞DNA损伤程度的方法的空白。该方法取材少，耗时短，操作简单方便，检测结果准确可靠。浮萍对重金属镉胁迫较敏感，可以根据浮萍原生质体DNA损伤程度探索重金属镉对植物遗传毒理效应的检测方法和实验体系，并未研究植物相应重金属胁迫的细胞和分子机理提供新的证据。
附图说明
图1为未经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图；
图2为经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图(实施例1)；
图3为经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图(实施例2)；
图4为经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图(实施例3)。
具体实施方式
在本发明的实施例中，浮萍(Lemna turionifera)采集自天津市西青区湖水中。
为了验证本发明检测的结果，步骤1)中浮萍植株为经重金属镉胁迫后的浮萍植株，经重金属镉胁迫后的浮萍植株的获取方法为：配置含镉离子的Datko培养基，将浮萍培养于含镉离子的Datko培养基上，得到浮萍植株，其中，培养温度为23℃，培养时间24h，光照周期16小时/天，光强95μmol m-2s-1，其中，Datko培养基中镉离子的浓度为50μM。
Datko培养基获取方法：在每3mL的Datko培养基母液加入1L去离子水进行稀释，得到Datko培养基，将Datko培养基调至pH 5.6-5.8并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
Datko培养基母液组成包括：
以上试剂配好后于4℃保存。Datko培养基的组成包括：
在下述实施例中，每次清洗原生质体的方法为：用800μL A液垂直打入离心管，以使原生质体自动悬起，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液，其中，离心的温度为20℃，转速为2000×g，时间为3min。
药品购买源及纯度说明
在下述实施例的步骤4)中，低熔点琼脂糖凝胶由低熔点琼脂糖与去离子水组成，低熔点琼脂糖购买自天津为科生物技术有限公司，熔点为62-68℃。
在下述实施例的步骤4)中，正常熔点琼脂糖凝胶由正常熔点琼脂糖和去离子水组成，正常熔点琼脂糖购买自天津为科生物技术有限公司，熔点为87-92℃。
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：
1)获取10株经重金属镉胁迫后的浮萍植株；
2)用灭菌后的剪刀剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，假根的长度为2-5cm不等。放入1.5mL离心管中，再放入甘露醇溶液并于27℃处理28min，以使浮萍发生质壁分离，其中，甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L；
3)用组织组织酶解液在黑暗、25℃条件下酶解步骤2)所得浮萍的假根25min，得到原生质体，用A液清洗原生质体2次，其中，在酶解过程中，每隔8min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；组织酶解液的组成包括：
4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加150μL正常熔点琼脂糖制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温20℃保持10小时，以使正常熔点琼脂糖彻底干燥，移除盖玻片；将60μL低熔点琼脂糖与40μL步骤3)所得原生质体混合，缓缓滴加在第一层胶上，保证表面光洁，再次加盖盖玻片，于4℃固化10min；低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量分数为0.8％，正常熔点琼脂糖凝胶中正常熔点琼脂糖的质量分数为0.8％。
5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解55min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，碱性裂解液在4℃放置2h，PBS缓冲液的组成包括：
K2HPO4·3H2O 11g/l
KH2PO4 6g/l
溶剂为去离子水
碱性裂解液的组成包括：
NaCL 146g/l
Na2EDTA 37g/l
Tris 1g/l
溶剂为去离子水
其中，碱性裂解液在4℃放置2h前加入该碱性裂解液质量10wt％的DMSO和1wt％的Triton X-100并均匀混合；
在步骤5)中，碱性裂解液的pH为9.8。
在步骤5)中，PBS缓冲液的pH为7.3。
6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片3次，置于水平电泳槽内，加入Ph为14的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育30min后进行电泳，电泳条件如下：电压为20V，电流为300mA，电泳时间为30min；
在步骤6)中，电泳缓冲液的组成包括：
Na2EDTA 0.37g/l
NaOH 1g/l
溶剂为去离子水
7)染色及观察：从水平电泳槽中取出载玻片，用PBS缓冲液漂洗3次，每次3min，漂洗后用SYBR Gold对原生质体染色，染色后将载玻片浸泡在PBS缓冲液中，用于洗掉多余的染料。
8)数据分析，在荧光显微镜下观察步骤7)得到原生质体的彗星图像，发现DNA受损原生质体出现彗星拖尾现象，判断为该原生质体DNA受损。
实施例2
一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：
1)获取10株经重金属镉胁迫后的浮萍植株；
2)用灭菌后的剪刀剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，假根的长度为2-5cm不等。放入1.5mL离心管中，再放入甘露醇溶液并于29℃处理30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，甘露醇溶液中甘露醇的浓度为140g/L；
3)用组织组织酶解液在黑暗、25.5℃条件下酶解步骤2)所得浮萍的假根28min，得到原生质体，用A液清洗原生质体3次，其中，在酶解过程中，每隔10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；组织酶解液的组成包括：
4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加180μL正常熔点琼脂糖制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温23℃保持12小时，以使正常熔点琼脂糖彻底干燥，移除盖玻片；将65μL低熔点琼脂糖与35μL步骤3)所得原生质体混合，缓缓滴加在第一层胶上，保证表面光洁，再次加盖盖玻片，于4℃固化15min；低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量分数为0.9％，正常熔点琼脂糖凝胶中正常熔点琼脂糖的质量分数为0.9％。5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解55min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，碱性裂解液在4℃放置3h，PBS缓冲液的组成包括：
K2HPO4·3H2O 11.5g/l
KH2PO4 7.3g/l
溶剂为去离子水
碱性裂解液的组成包括：
NaCL 146.5g/l
Na2EDTA 37.2g/l
Tris 1.3g/l
溶剂为去离子水
其中，碱性裂解液在4℃放置3h前加入该碱性裂解液质量11wt％的DMSO和2wt％的Triton X-100并均匀混合；
在步骤5)中，碱性裂解液的pH为10。
在步骤5)中，PBS缓冲液的pH为7.3。
6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片4次，置于水平电泳槽内，加入Ph为13的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育28min后进行电泳，电泳条件如下：电压为25V，电流为350mA，电泳时间为28min；
在步骤6)中，电泳缓冲液的组成包括：
Na2EDTA 0.35g/l
NaOH 1.3g/l
溶剂为去离子水
7)染色及观察：从水平电泳槽中取出载玻片，用PBS缓冲液漂洗4次，每次3min，漂洗后用SYBR Gold对原生质体染色，染色后将载玻片浸泡在PBS缓冲液中，用于洗掉多余的染料。
8)在荧光显微镜下观察步骤7)得到原生质体的彗星图像，可发现DNA受损原生质体出现彗星拖尾现象，判断为该原生质体DNA受损。
实施例3
一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：
1)获取10株经重金属镉胁迫后的浮萍植株；
2)用灭菌后的剪刀剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，假根的长度为2-5cm不等。放入1.5mL离心管中，再放入甘露醇溶液并于29℃处理30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，甘露醇溶液中甘露醇的浓度为150g/L；
3)用组织组织酶解液在黑暗、26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍的假根30min，得到原生质体，用A液清洗原生质体2次，其中，在酶解过程中，每隔9min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；组织酶解液的组成包括：
4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加200μL正常熔点琼脂糖制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温25℃保持10小时，以使正常熔点琼脂糖彻底干燥，移除盖玻片；将70μL低熔点琼脂糖与30μL步骤3)所得原生质体混合，缓缓滴加在第一层胶上，保证表面光洁，再次加盖盖玻片，于4℃固化20min；低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量分数为1％，正常熔点琼脂糖凝胶中正常熔点琼脂糖的质量分数为1％。
5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解60min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，碱性裂解液在4℃放置8h，PBS缓冲液的组成包括：
K2HPO4·3H2O 12g/l
KH2PO4 7g/l
溶剂为去离子水
碱性裂解液的组成包括：
NaCL 146.5g/l
Na2EDTA 37.5g/l
Tris 1.5g/l
溶剂为去离子水
其中，碱性裂解液在4℃放置8h前加入该碱性裂解液质量10wt％的DMSO和1wt％的Triton X-100并均匀混合；
在步骤5)中，碱性裂解液的pH为10.2。
在步骤5)中，PBS缓冲液的pH为7.4。
6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片4次，置于水平电泳槽内，加入Ph为13的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育28min后进行电泳，电泳条件如下：电压为25V，电流为350mA，电泳时间为28min；
在步骤6)中，电泳缓冲液的组成包括：
Na2EDTA 0.4g/l
NaOH 1.5g/l
溶剂为去离子水
7)染色及观察：从水平电泳槽中取出载玻片，用PBS缓冲液漂洗4次，每次3min，漂洗后用SYBR Gold对原生质体染色，染色后将载玻片浸泡在PBS缓冲液中，用于洗掉多余的染料。
8)数据分析，在荧光显微镜下观察步骤7)得到原生质体的彗星图像，可发现DNA受损原生质体出现彗星拖尾现象，判断为该原生质体DNA受损。
图1为未经CdCl2处理的浮萍按照本发明方法得到的电泳图，图2为实施例1得到的浮萍原生质体电泳图，图3为实施例2得到的浮萍原生质体电泳图；图4为实施例3得到的浮萍原生质体电泳图。由图可知，未经CdCl2处理的浮萍原生质体呈圆形荧光团，DNA集中，亮度较强，未产生彗星拖尾现象，表明根部细胞内核DNA保持完好；而经CdCl2处理的浮萍原生质体由于受损，DNA链断裂，电泳时断片向阳极移动，彗星头部变小，产生彗星拖尾现象。由于浮萍原生质体十分脆弱，任何条件改变都可能使细胞产生损伤，产生不同程度的拖尾现象。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取浮萍植株；
2)剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27-29℃处理28-30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L-150g/L；
3)用组织酶解液在黑暗、25-26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍植株的假根25-30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，其中，在酶解过程中，每隔8-10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；所述组织酶解液的组成包括：
4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加150-200μL正常熔点琼脂糖凝胶制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温20～25℃保持至少10小时，以使正常熔点琼脂糖凝胶干燥，移除所述盖玻片；将60-70μL低熔点琼脂糖凝胶与30-40μL步骤3)所得原生质体混合，滴加在所述第一层胶上，再次加盖盖玻片，于4℃固化10-20min；
5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用所述纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解55-65min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h，PBS缓冲液的组成包括：
K2HPO4·3H2O 11-12g/l
KH2PO4 6-8g/l
溶剂为去离子水
所述碱性裂解液的组成包括：
NaCL 146-146.5g/l
Na2EDTA 37-37.5g/l
Tris(三羟甲基氨基甲烷) 1-1.5g/l
溶剂为去离子水
其中，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h前加入该碱性裂解液质量10-11wt％的DMSO(二甲基亚砜)和1-2wt％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)并均匀混合；
6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片3-5次，置于水平电泳槽内，加入Ph为13-15的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育28-35min后进行电泳，电泳条件如下：电压为20-25V，电流为300-350mA，电泳时间为30-35min；
7)染色及观察：从水平电泳槽中取出载玻片，用PBS缓冲液漂洗3-5次，每次3-5min，漂洗后用SYBR Gold对所述原生质体染色；
8)在荧光显微镜下观察步骤7)得到原生质体的彗星图像，当出现彗星拖尾现象判断为该原生质体DNA受损。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述假根的长度为2-5cm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，每次清洗所述原生质体的方法为：用A液垂直打入离心管，以使原生质体自动悬起，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液，其中，离心的温度为20-25℃，转速为2000-3000×g，时间为2-5min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，所述低熔点琼脂糖凝胶由低熔点琼脂糖与去离子水组成，低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，所述正常熔点琼脂糖凝胶由正常熔点琼脂糖和去离子水组成，正常熔点琼脂糖凝胶中正常熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤5)中，所述碱性裂解液的pH为9.8-10.2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤5)中，所述PBS缓冲液的pH为7.3-7.5。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤6)中，电泳缓冲液的组成包括：
Na2EDTA 0.35-0.4g/l
NaOH 1-1.5g/l
溶剂为去离子水。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述步骤7)中，染色后将载玻片浸泡在PBS缓冲液中，用于洗掉多余的染料。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，正常熔点琼脂糖的熔点为87-92℃；低熔点琼脂糖的熔点为62-68℃。
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