CN104561284B - 棉花零式果枝基因的分子鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及棉花零式果枝的分子鉴定方法，具体提供了用于鉴定含零式果枝基因的棉花株系的基因特异引物标记，其为核苷酸序列如SEQ？ID？No.1和2。本发明采用基因特异标记鉴定分离群体中携带零式果枝基因的单株。该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于棉花零式果枝的室内鉴定和分子标记辅助选择育种。

Description

棉花零式果枝基因的分子鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种零式果枝基因鉴定和分子标记辅助育种的分子鉴定方法。
背景技术
零式果枝是指棉花中果枝为有限果枝的一种突变性状。表现为棉桃直接着生在主茎叶腋处，或仅有一个果节。零式果枝材料由于其生长特性，在棉花打顶之后，营养生长基本停止，可以减少对棉花整枝管理的用工。同时由于营养物质大部分供给棉铃的生长发育，棉铃发育快，成熟早，单株上部和下部的棉桃有更好的成熟一致性，利于棉花的收获。零式果枝品种的棉铃具有合理的空间分布，上中下部的棉铃基本均匀分布，具有优良的机械采收特性。在长江流域，种植零式果枝材料相比杂交棉，在管理过程中可以省工75个/公顷，节省用工成本4500元/公顷，减少防病虫用药等生产成本1500元/公顷，共计可节省投入6000元/公顷。
由于零式果枝品种具有适于密植、明显减少管理用工，降低成本和劳动强度，适于机械收获的特点，携带零式果枝基因的棉花品种早已在我国生产上开始应用。但是，采用常规育种技术选育和改良零式果枝材料需要很长年限，且由于零式果枝为单隐性遗传，每次回交转育后都需要进行自交鉴定，以确零式果枝基因在转育和改良过程中没有丢失，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。因此，如何通过分子标记辅助选择方法稳定可靠又快速简便的进行零式果枝材料的选育和改良成为本发明的关键核心。
分子标记直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有数量非常丰富，遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP和SNP等，随着分子标记技术的不断发展和应用，目前，国内外已经越来越多的将各种分子标记技术应用在作物育种材料的分子标记辅助选择育种中。SNP(Singlenucleotidepolymorphisms)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。在所有真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，具有多态性丰富、稳定性好、位点专一性、共显性等特点。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中含零式果枝基因的棉花品系选育田间鉴定检测方法所需时间长，消耗大、准确性差等的问题，提供一种零式果枝基因的分子鉴定方法，从而可以加快零式果枝品系选育和改良进程。
本发明采用的技术方案如下：
为了实现上述的目的，本发明以棉花零式果枝基因gb_nb1的位于第4外显子的第33个碱基处的SNP位点设计引物，见图1。该SNP位点导致零式果枝基因功能的缺失，在这个SNP位点碱基为T的即为零式果枝材料。因此，这个SNP位点与性状100%共分离，不会发生交换。设计引物为：
TH01引物对：
正向引物5’-CAGATGCCACATTTGGTAAG-3’（SEQIDNo.1）
反向引物5’-CTGTGGATCCCTATGTTAGA-3’（SEQIDNo.2）
一种棉花零式果枝基因的分子鉴定方法，包括如下步骤：
步骤（1），对棉花进行DNA提取；
步骤（2），以SEQIDNo.1所示正向引物和SEQIDNo.2所示反向引物对步骤（1）得到的DNA进行PCR扩增，95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
步骤（3），对步骤（2）得到的扩增产物进行电泳检测并采用银染的方法染色，若在195bp处出现特异性条带，则含零式果枝基因；若无特异性条带，则不含零式果枝基因。
本发明技术方案中对棉花进行DNA提取的具体方法为：
取棉花材料真叶期幼嫩叶片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于离心管中，然后向离心管中加入1000μlDNA提取液，混匀后，65℃水浴30min，且每间隔10min轻摇下；所述的DNA提取液中含有：0.05MTris-Cl，0.01MEDTA，2%SDS，1%PVP，0.5%山梨醇，0.705MNaCl和1%β-巯基乙醇，pH值为8.0，高压灭菌；其中，1%β-巯基乙醇为使用前加入，体系中的%代表体积分数；
水浴结束后，再向离心管中加入800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合溶剂中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，混合均匀后，离心分离；
吸取上清液，加入2μl浓度为10mg/mlRNase酶，混匀后，37℃水浴30min；然后再加入1000μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合溶剂中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，混合均匀后，离心分离；
取上清液，加入体积为上清液体积0.7倍的异丙醇，静置30min，絮状DNA成团析出；
将絮状DNA取出，用体积浓度为70%的乙醇浸泡，浸泡两次，每次10min，再用无水乙醇浸泡过夜后，倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入ddH2O，温室溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。
进一步，优选的是所述的离心分离的速度为12000rpm，时间为10min。
本发明技术方案中步骤（2）具体方法如下：
取1μl浓度为25ng/μl的DNA溶液与9μlPCR反应液混合，进行PCR反应；其中，PCR反应液中含有以下物质：10×PCRBuffer1.0μl，10mMdNTPs0.2μl，25mMMgCL20.8μl，10mMSEQIDNo.1所示正向引物0.5μl，10mMSEQIDNo.2所示反向引物0.5μl，2U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl和ddH2O5.8μl。
本发明技术方案中步骤（3）具体方法如下：
向步骤（2）得到的扩增产物中加入2μl溴酚蓝混匀，制备质量浓度为6%的聚丙烯酰胺凝胶，在1×TBE的电泳缓冲液中电泳检测，电泳电压为220伏，电流为164毫安，时间为50min；电泳结束后采用银染的方法进行染色，具体步骤如下：固定液中固定10min；染色液中染色12min；用蒸馏水快速洗两遍，在显色液中显色5min，直至条带清晰为止；蒸馏水速洗两遍，放入终止液中终止反应；若在195bp处出现特异性条带，则为零式果枝；若无特异性条带，则不为零式果枝；
其中，所述的固定液为40ml体积浓度为95%的乙醇、2ml的纯乙酸和358ml的蒸馏水的混合溶液；所述的染色液的制备方法为将0.6g硝酸银溶于300ml蒸馏水，即得；所述的显色液的制备方法为先将6g氢氧化钠和5ml甲醛加入400ml蒸馏水中混合均匀后，再加入3ml的质量浓度为0.2%的硫代硫酸钠水溶液，混合均匀，即得；所述的终止液的制备方法为将3g碳酸钠溶于400ml蒸馏水，即得。
正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
本发明采用SNP标记对含零式果枝材料进行了分子水平的多态性检测，从本研究的结果中可以看出，标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此该方法非常适用于含零式果枝材料真实性的室内鉴定和新零式果枝材料的分子标记辅助选育。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
（1）速度快：基因特异标记鉴定对辅助选育零式果枝基因的棉花品系具有重要作用。在零式果枝的回交转育过程中，涉及大量的自交鉴定等试验，并且需要调查大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和物力，且易受环境因素影响，因此，常规手段并不能完全准确、真实地反映零式果枝材料的遗传情况。本发明只需提供棉花材料的种子或叶片，提取DNA后，用基因特异引物对进行分子标记鉴定，利用相应分子鉴定体系可以很快地鉴定出零式果枝基因，同时利用本发明可以在零式果枝育种的分子标记辅助选择过程中有效跟踪零式果枝基因的存在与否，免去自交鉴定，从而极大加快零式果枝选育和改良过程。
（2）准确率高：本发明的基因特异标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，很容易通过PCR快速扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明利用一对基因特异引物对零式果枝进行鉴定，其与零式果枝性状完全共分离，可靠性高，且分子鉴定不受环境因素的影响，真正从DNA水平上鉴定零式果枝的遗传情况，提高了准确性。
（3）实用简单：本发明鉴定零式果枝基因和分子标记辅助选择育种的整个程序只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。
总之，本发明提供的基因特异标记及其引物能够快速鉴定携带零式果枝基因的棉花品系，其鉴定方法简单实用，其鉴定结果准确可靠，所以本发明提供的基因特异标记及其引物能够快速有效的辅助棉花育种，对推动育种进程起了决定性的作用。
附图说明
图1为本发明基因特异引物在基因位置的示意图；
图2为本发明零式果枝材料及其后代的基因特异标记分析；其中，M：marker，1：零式果枝品种“新海18”，2：正常果枝品系“TM-1”，3-32：从新海18×TM-1的群体中随机选取的30株零式果枝单株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
Tris-Cl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸[Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl]；EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid);SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate);PVP:聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)
所有试剂购买自：生工生物工程（上海）股份有限公司；纯度为：分析纯。
1DNA提取
取含零式果枝的海岛棉品种新海18、陆地棉标准系TM-1以及在TM-1×新海18的F2群体中随机选取的30株零式果枝单株共32个材料，于田间生长的5片真叶期取幼嫩叶片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于2ml的离心管中；加入1000μlDNA提取液，漩涡混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇下；所述的DNA提取液中含有：0.05MTris-Cl，0.01MEDTA，2%SDS，1%PVP，0.5%山梨醇，0.705MNaCl和1%β-巯基乙醇，pH值为8.0，高压灭菌；其中，1%β-巯基乙醇为使用前加入，体系中的%代表体积分数；
水浴结束后，加入800μl体积比25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，上下颠倒混匀至不分层，12000rpm离心10min；
吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入2μl10mg/mlRNase酶，混匀后37℃水浴30min；然后加入1000μl体积比25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，上下颠倒混匀至不分层，12000rpm离心10min；
用剪口枪头吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出；用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的2ml硅化离心管中，浸泡两次，每次十分钟，再无水乙醇浸泡过夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入200μlddH2O，温室溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用，得到DNA样品。
2基因特异标记
PCR扩增：将上述DNA样品1μl与9μlPCR反应液混合，进行PCR反应：95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应液中含有以下物质：10×PCRBuffer1.0μl，10mMdNTPs0.2μl，25mMMgCL20.8μl，10mMSEQIDNo.1所示正向引物0.5μl，10mMSEQIDNo.2所示反向引物0.5μl，2U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl和ddH2O5.8μl。
扩增结束后，在扩增产物中加入2μl溴酚蓝混匀，制备浓度质量为6%的聚丙烯酰胺凝胶，在1×TBE的电泳缓冲液中电泳检测，电泳电压为220伏，电流为164毫安，时间为50min；电泳结束后采用银染的方法进行染色，具体步骤如下：固定液中固定10min；染色液中染色12min；用蒸馏水快速洗两遍，在显色液中显色5min，直至条带清晰为止；蒸馏水速洗两遍，放入终止液中终止反应；若在195bp处出现特异性条带，则为零式果枝；若无特异性条带，则不为零式果枝；
其中，所述的固定液为40ml体积浓度为95%的乙醇、2ml的纯乙酸和358ml的蒸馏水的混合溶液；所述的染色液的制备方法为将0.6g硝酸银溶于300ml蒸馏水，即得；所述的显色液的制备方法为先将6g氢氧化钠和5ml甲醛加入400ml蒸馏水中混合均匀后，再加入3ml的质量浓度为0.2%的硫代硫酸钠水溶肥业，混合均匀，即得；所述的终止液的制备方法为将3g碳酸钠溶于400ml蒸馏水，即得。
结果如图2所示，32个材料以TH01引物对（SEQIDNo.1和2）进行扩增，在195bp有特征带，30个零式类型材料都扩增出特征带。图2中“新海18亲本”以marker为标准的195bp位置能检测到与零式果枝相关的特异性条带。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种棉花零式果枝基因的分子鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），对棉花进行DNA提取；
步骤（2），以SEQIDNo.1所示正向引物和SEQIDNo.2所示反向引物对步骤（1）得到的DNA进行PCR扩增，95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
步骤（3），对步骤（2）得到的扩增产物进行电泳检测并采用银染的方法染色，若在195bp处出现特异性条带，则含零式果枝基因；若无特异性条带，则不含零式果枝基因。
2.根据权利要求1所述的棉花零式果枝基因的分子鉴定方法，其特征在于对棉花进行DNA提取的具体方法为：
取棉花材料真叶期幼嫩叶片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于离心管中，然后向离心管中加入1000μlDNA提取液，混匀后，65℃水浴30min，且每间隔10min轻摇下；所述的DNA提取液中含有：0.05MTris-Cl，0.01MEDTA，2%SDS，1%PVP，0.5%山梨醇，0.705MNaCl和1%β-巯基乙醇，pH值为8.0，高压灭菌；其中，1%β-巯基乙醇为使用前加入，体系中的%代表体积分数；
水浴结束后，再向离心管中加入800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合溶剂中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，混合均匀后，离心分离；
吸取上清液，加入2μl浓度为10mg/mlRNase酶，混匀后，37℃水浴30min；然后再加入1000μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合溶剂中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，混合均匀后，离心分离；
取上清液，加入体积为上清液体积0.7倍的异丙醇，静置30min，絮状DNA成团析出；
将絮状DNA取出，用体积浓度为70%的乙醇浸泡，浸泡两次，每次10min，再用无水乙醇浸泡过夜后，倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入ddH2O，温室溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的棉花零式果枝基因的分子鉴定方法，其特征在于所述的离心分离的速度为12000rpm，时间为10min。
4.根据权利要求2所述的棉花零式果枝基因的分子鉴定方法，其特征在于步骤（2）具体方法如下：
取1μl浓度为25ng/μl的DNA溶液与9μlPCR反应液混合，进行PCR反应；其中，PCR反应液中含有以下物质：10×PCRBuffer1.0μl，10mMdNTPs0.2μl，25mMMgCL20.8μl，10mMSEQIDNo.1所示正向引物0.5μl，10mMSEQIDNo.2所示反向引物0.5μl，2U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl和ddH2O5.8μl。
5.根据权利要求4所述的棉花零式果枝基因的分子鉴定方法，其特征在于步骤（3）具体方法如下：
向步骤（2）得到的扩增产物中加入2μl溴酚蓝混匀，制备质量浓度为6%的聚丙烯酰胺凝胶，在1×TBE的电泳缓冲液中电泳检测，电泳电压为220伏，电流为164毫安，时间为50min；电泳结束后采用银染的方法进行染色，具体步骤如下：固定液中固定10min；染色液中染色12min；用蒸馏水快速洗两遍，在显色液中显色5min，直至条带清晰为止；蒸馏水速洗两遍，放入终止液中终止反应；若在195bp处出现特异性条带，则为零式果枝；若无特异性条带，则不为零式果枝；
其中，所述的固定液为40ml体积浓度为95%的乙醇、2ml的纯乙酸和358ml的蒸馏水的混合溶液；所述的染色液的制备方法为将0.6g硝酸银溶于300ml蒸馏水，即得；所述的显色液的制备方法为先将6g氢氧化钠和5ml甲醛加入400ml蒸馏水中混合均匀后，再加入3ml的质量浓度为0.2%硫代硫酸钠水溶液，混合均匀，即得；所述的终止液的制备方法为将3g碳酸钠溶于400ml蒸馏水，即得。
6.权利要求1所述的棉花零式果枝基因的分子鉴定方法，其特征在于，正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
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CN101429541A (zh) * 2007-11-09 2009-05-13 中国农业科学院棉花研究所 一种ssr分子指纹鉴定方法

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