CN109022257B - Numb基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能检测试剂盒及其应用，利用本发明检测试剂盒通过检测GA和GG等位基因，用于选育提高哈萨克马泌乳性能，检测试剂盒有六个区，包括96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区均为扇形区域，根据自行设计特异性引物，以样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物后进行KASP分型；本发明不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于提高哈萨克马泌乳量水平、提高农牧民经济收入、加快新疆乳用马业发展具有实际应用价值，为新疆畜牧业的可持续发展提供了科学服务的平台。

Description

NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的试剂盒及其应用

技术领域

发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种哈萨克马泌乳性能筛选的试剂盒的技术领域。

背景技术

新疆作为五大牧区之一，具有丰富的资源，哈萨克马原产于新疆，主要分布在新疆天山北麓，准噶尔盆地以西和阿勒泰山脉西段一带，是经新疆各族人民长期培育形成的一个原始地方品种，具有较为稳定的遗传性和一定的品种特征，有适合军需民用的中等体型和粗糙结实的体质，有灵敏的体躯及一定的速力和持久力，有一定的产肉，泌乳能力。马乳具有极高的营养价值和特殊的保健功能，受到越来越多消费者的青睐，人们对于高产乳用马的需求不断增加。但马作为大家畜，其世代间隔和繁殖周期长、繁殖率低，马的主要乳用性状属于数量性状、遗传力低，用传统育种方法获得的遗传进展较小、选育速度慢。如何加快马遗传进展、提高马产奶量水平称为关键。

人类在驯化动物过程中不断对所需的有利性状进行人工选择，主要目的是为了获得更优质的各种动物制品与资源，如它们的肉、奶用以食用。在人类有意识的选择性保留繁殖过程中，部分对人类有利的性状被不断选择，逐渐使得驯化群体与野生群体产生明显的区分。利用选择信号检测的方法筛选人类在哈萨克马基因组中留下的印迹。

竞争性等位基因特异性PCR(缩写KASP)，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和定位点上的Indels进行精准的双等位基因判断。是一种灵活的、广泛应用的分型技术，从而找到与目标性状相关的位点。目前，对分子育种工作理论的研究重点之一是利用目的性状与标记间的关联性进行标记辅助选择。SNP(单核苷酸多态性的简称)己成为极具应用前景的遗传标记物。

NUMB(Endocytic Adaptor Protein)，细胞命运决定子，是一种与细胞内膜相连的磷酸酪氨酸结合域(phosphotyrosine-binding,PTB)包含蛋白，NUMB基因通过抑制Notch信号通路和稳定p53-p21的活性维持上皮细胞状态，抑制上皮向间质细胞的转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的发生，同时通过抑制Notch信号通路促进p63的活性，激活STAT5信号通路和抑制STAT3信号通路，促进泌乳过程的发生。

目前，在国内外未见到利用试剂盒技术对哈萨克马泌乳性能进行筛选的研究和报道，完全属于空白；此外，对于将NUMB基因作为影响哈萨克马泌乳性能的候选基因，相关研究的报道多见于人类和小鼠中，在马中鲜有报道，在哈萨克马中的应用研究未见报道。

发明内容

针对现有技术中未见报道专门针对NUMB基因在哈萨克马泌乳性能筛选中的SNP标记研究的技术现状，本发明旨在为了提供了含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒，用于选育提高哈萨克马泌乳性能。

本发明提供了一种含NUMB基因筛选哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒，所述用于检测NUMB基因的等位基型因包括GA和GG。

本发明中，等位基因型GA和GG从哈萨克马血浆中检测。

本发明同时提供一种含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒，包括盒体，盒体外侧设置标签一，盒体内由隔板依次分为96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区，96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区上均设置分盖体，分盖体上设置标签二。

本发明中，盒体呈圆柱状，盒体内中部设置中心柱，中心柱顶端设置轴孔，分盖体底部设置与轴孔相适应的旋转轴。

本发明中，96孔板区、枪头区采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区均为扇形区域，分盖体呈六分之一扇形状。

本发明中，分盖体的半径大于盒体的半径。

本发明中，轴孔在中心柱顶端呈圆周阵列设置。

本发明中，盒体两侧设置把手，盒体底端和分盖体顶端相平齐设置。

本发明中，DNA提取试剂区的试剂为蛋白酶K、无水乙醇、缓冲液GB、磁悬浮液B、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱液TB、超纯灭菌水。

本发明中，PCR扩增试剂区的试剂为2×Master Mix、上下游引物和灭菌超纯水。

本发明中，用于KASP分型的Marker区的试剂为AA等位基因标记物、AG等位基因标记物和GG等位基因标记物。

本发明中，96孔板区放置灭菌96孔板。

本发明中，枪头区放置灭菌枪头。

本发明中，采血管区放置装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管。

本发明提供含NUMB基因用于提高哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(1)引物设计及合成：根据马的NUMB基因的DNA序列(GenBank ID：100050235)，自行人工设计特异性引物。

(2)PCR反应试剂：2×Master Mix、上下游引物、DNA模板和水。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如下所示：

NUMB引物：

上游引物1：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCCCTTGGAAAGGCGG-3'；

上游引物2：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCCTTGGAAAGGCGA-3'；

下游引物1：5'-AGTTCTCCAGCCTCCTCCAC-3'。

进一步，本发明提供含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能检测试剂盒的应用，通过其检测方法体现，具体包括如下步骤：

(1)马基因组DNA的提取：

利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集哈萨克马颈静脉血5ml；-20℃保存；利用以上所述试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用。

(2)NUMB基因PCR扩增：

根据设计的引物，利用以上所述试剂盒特异性扩增NUMB基因；PCR反应体系为：2×Master Mix 2.5μl，上下游引物各0.07μl，由步骤(1)获得的基因组DNA模板30-50ug，加水至总体积5ul；反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性20s、61-55℃延伸1min，循环10次，95℃变性20s、55℃延伸1min，循环26次，4℃保存。

(3)KASP分型：

基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用Douglas平台，对SNP进行双等位基因判断，从而进行基因分型。

本发明中，哈萨克马的NUMB基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站NCBI(National Center for Biotechnology)，检索得到马的NUMB基因的DNA序列(GenBank登录号ID：100050235)，借助公知软件Primer3.0，自行人工设计特异性引物。

通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：

(1)本发明中，虽然如上所述，在构建一种用于选育哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒中，在采用现有技术中NUMB基因作为影响家畜泌乳性能候选基因并构建试剂盒，在新疆哈萨克马群体中，NUMB基因SNP位点与哈萨克马的产奶量相关，存在2种基因型：GG和GA，G为优势等位基因，此位点突变使哈萨克马产奶量下降。在实际生产应用中，可通过选择基因型为GG的个体，淘汰基因型为GA的个体，提高哈萨克马的产奶量，加快新疆专门化乳用马品种的培育。

(2)本发明通过提供用于选育哈萨克马泌乳性能的试剂盒，利用试剂盒对哈萨克马的NUMB基因的表达量进行检测，并与哈萨克马的日均产奶量(kg/d)进行关联分析，其中哈萨克马NUMB基因GG基因型个体平均日泌乳量显著高于GA基因型，差异极显著(P＜0.01)，说明方法具有较好的特异性；这不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于提高哈萨克马泌乳量水平、提高农牧民经济收入、加快新疆乳用马业发展具有实际应用价值，为新疆畜牧业的可持续发展提供了科学服务的平台。

附图说明

图1显示为本发明提供的含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒结构示意图一。

图2显示为本发明提供的含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒结构示意图二。

图3显示为本发明提供的盒体结构示意图。

图1-3中，1—盒体，11—把手，12—标签一，2—分盖体，21—标签二，3—隔板，31—96孔板区，32—枪头区，33—采血管区，34—DNA提取试剂区，35—PCR扩增试剂区，36—Marker区，4—中心柱，41—旋转轴，42—轴孔。

附图4所示为DAN凝胶电泳图，图中，M为DNA Marker，泳道1-60为哈萨克马个体PCR扩增产物。

附图5所示为NUMB基因(g.18986402G>A位点)的分型结果图。

附图6所示为NUMB基因(g.18986402G>A位点)与哈萨克马产奶量关联分析图。

具体实施方式

下面结合附图1-6和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。

本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：本发明用于检测哈萨克马泌乳性能试剂盒

本发明提供了一种用于检测NUMB基因的哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒，所述用于检测NUMB基因的等位基型因包括GA和GG。

本发明中，等位基因型GA和GG从哈萨克马血浆中检测。

本发明同时提供一种含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒，包括盒体1，盒体1外侧设置标签一12，盒体1内由隔板3依次分为96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36，96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36上均设置分盖体2，分盖体2上设置标签二21。

本发明中，盒体1呈圆柱状，盒体1内中部设置中心柱4，中心柱4顶端设置轴孔42，分盖体2底部设置与轴孔42相适应的旋转轴41。

本发明中，96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36均为扇形区域，分盖体2呈六分之一扇形状。

本发明中，分盖体2的半径大于盒体1的半径。

本发明中，轴孔42在中心柱4顶端呈圆周阵列设置。

本发明中，盒体1两侧设置把手11，盒体1底端和分盖体2顶端相平齐设置。

本发明中，DNA提取试剂区34的试剂为蛋白酶K、无水乙醇、缓冲液GB、磁悬浮液B、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱液TB、超纯灭菌水。

本发明中，PCR扩增试剂区35的试剂为2×Master Mix、上下游引物和灭菌超纯水。

本发明中，用于KASP分型的Marker区36的试剂为AA等位基因标记物、AG等位基因标记物和GG等位基因标记物。

本发明中，96孔板区31放置灭菌96孔板。

本发明中，枪头区32放置灭菌枪头。

本发明中，采血管区33放置装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管。

实施例二：本发明用于检测哈萨克马泌乳性能试剂盒

本发明提供一种含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒中，盒体1呈圆柱状，盒体1内中部设置中心柱4，中心柱4顶端设置轴孔42，分盖体2底部设置与轴孔42相适应的旋转轴41，使得分盖体2打开后可以旋转后置于其它分盖体2上，不占用空间，隔板3和分盖体2使得各个区密闭分割，不会互相干扰。

本发明中，96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36均为扇形区域，分盖体2呈六分之一扇形状。

本发明中，分盖体2的半径大于盒体1的半径，方便打开分盖体2。

本发明中，轴孔42在中心柱4顶端呈圆周阵列设置。

本发明中，盒体1两侧设置把手11，盒体1底端和分盖体2顶端相平齐设置，方便本试剂盒的堆叠存放。

在使用本发明提供的含NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒时，根据标签一12选择试剂盒，观察标签二21，从96孔板区31、枪头区32取出96孔板区31、枪头区32，从采血管区33取出采血管，利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集哈萨克马颈静脉血5ml，从DNA提取试剂区34取出DNA提取试剂，提取基因组DNA，-20℃保存待用，提取基因组DNA凝胶电泳图，从PCR扩增试剂区35和Marker区36取出试剂，根据设计的引物，特异性扩增NUMB基因；PCR反应体系为：2×Master Mix2.5μl，上下游特异性引物各0.07μl，由步骤(2)提取的DNA模板30-50ug，加灭菌超纯水至总体积5ul；95℃预变性10min，95℃变性20s、61-55℃延伸1min，循环10次，95℃变性20s、55℃延伸1min，循环26次，4℃保存，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用Douglas平台，对SNP进行双等位基因判断，进行基因分型，通过选择基因型为GG的个体，淘汰基因型为GA的个体，提高哈萨克马的产奶量，加快新疆专门化乳用马品种的培育。

实施例三：含NUMB基因用于提高哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒的应用

本发明提供含NUMB基因用于提高哈萨克马泌乳性能检测试剂盒的应用中，通过检测方法体现，具体包括如下步骤：

(1)组织样基因组DNA的提取：

活体采集待测哈萨克马颈静脉血5ml，利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，-20℃保存，采用上述实施例提供的试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用，基因组DNA提取结果如附图4所示。

(2)NUMB基因PCR扩增：

根据设计的引物，采用上述实施例提供的试剂盒特异性扩增NUMB基因；PCR反应体系为：2×Master Mix2.5μl，上下游引物各0.07μl，由步骤(1)获得的基因组DNA模板30-50ug，加水至总体积5ul；反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性20s、循环10次，61-55℃延伸1min，95℃变性20s、循环26次，55℃延伸1min，4℃保存。

(3)KASP分型：

基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用Douglas平台，对SNP进行双等位基因判断，根据FAM荧光信号类型进行基因分型。

实施例四：含NUMB基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒共建体系的建立

本发明提供含NUMB基因用于提高哈萨克马泌乳性能的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(1)引物设计及合成：

根据马的NUMB基因的DNA序列(GenBank ID：100050235)，自行人工设计特异性引物。

(2)PCR反应试剂：2×Master Mix、上下游引物、DNA模板和水。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如下所示：NUMB引物：

上游引物1：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCCCTTGGAAAGGCGG-3'；

上游引物2：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCCTTGGAAAGGCGA-3'；

下游引物1：5'-AGTTCTCCAGCCTCCTCCAC-3'。

实施例五：含NUMB基因用于检测哈萨克马泌乳性能的试剂盒效果验证试验

采集60匹哈萨克马颈静脉血，按照实施例三中的方法进行操作，对SNP位点进行双等位基因判断，根据FAM荧光信号类型进行基因分型，如附图5所示，统计的分型结果，利用软件SPSS19.0，对NUMB基因不同基因型与哈萨克马的平均日均产奶量(kg/d)进行关联分析，结果如下表1及附图6。

表1：哈萨克马NUMB基因不同基因型与平均日泌乳量的关联分析

注：Mean±SD表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

从表1中可以看出，在新疆哈萨克马群体中，NUMB基因SNP位点与哈萨克马的产奶量相关，哈萨克马NUMB基因GG基因型个体平均日泌乳量显著高于GA基因型，差异极显著(P＜0.01)，此位点突变使哈萨克马产奶量下降。在实际生产应用中，可通过选择基因型为GG的个体，淘汰基因型为GA的个体，提高哈萨克马的产奶量，加快新疆专门化乳用马品种的培育。

实施例六：含NUMB基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒效果验证试验

按照实施例三中的方法进行操作，将本发明提供的试剂盒应用于哈萨克马、马伊犁马、新吉尔吉斯马、伊犁马和新吉尔吉斯马杂交马、柯尔克孜马、库素木马中，观测NUMB基因在平均日泌乳量的关联度。具体见表2。

表2：NUMB基因与平均日泌乳量的关联度

注：Mean±SD表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

由表2分析可知，哈萨克马NUMB基因GG基因型个体平均日泌乳量显著高于GA基因型，差异极显著(P＜0.01)表示极强关联度；马伊犁马、新吉尔吉斯马、伊犁马和新吉尔吉斯马杂交马、柯尔克孜马、库素木马NUMB基因GG基因型个体平均日泌乳量与GA基因型个体平均日泌乳量没有显著差异，无明显关联度，说明方法具有较好的特异性。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> NUMB基因用于筛选哈萨克马泌乳性能试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat tattcccttg gaaaggcgg 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tattcccttg gaaaggcga 39

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agttctccag cctcctccac 20

Claims (8)

1.一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述用于检测NUMB基因的等位基因型的等位基因分型位点是g.18986402G>A位点,包括GA和GG基因型；

所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：

（1）引物设计及合成：根据马的NUMB基因的DNA序列，GenBank ID：100050235，自行人工设计特异性引物；

（2）PCR反应试剂：2×Master Mix、上下游引物、DNA模板和水；

所述的特异性引物序列如下所示：

上游引物1：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCCCTTGGAAAGGCGG-3'；

上游引物2：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCCTTGGAAAGGCGA-3'；

下游引物1：5'-AGTTCTCCAGCCTCCTCCAC-3'；

在应用中，通过选择基因型为GG的个体，淘汰基因型为GA的个体，提高哈萨克马的产奶量，加快新疆专门化乳用马品种的培育。

2.如权利要求1所述的一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒包括盒体，盒体外侧设置标签一，盒体内由隔板依次分为96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区，96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区上均设置分盖体，分盖体上设置标签二。

3.如权利要求2所述的一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，盒体呈圆柱状，盒体内中部设置中心柱，中心柱顶端设置轴孔，分盖体底部设置与轴孔相适应的旋转轴。

4.如权利要求2所述的一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区均为扇形区域，分盖体呈六分之一扇形状。

5.如权利要求2所述的一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，分盖体的半径大于盒体的半径。

6.如权利要求3所述的一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，所述轴孔在中心柱顶端呈圆周阵列设置。

7.如权利要求2所述的一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，盒体两侧设置把手，盒体底端和分盖体顶端相平齐设置。

8.如权利要求1所述的一种NUMB基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述应用中，通过检测方法体现，具体包括如下步骤：

（1）组织样基因组DNA的提取：活体采集待测哈萨克马颈静脉血5ml，利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，-20℃保存；利用所述提供的试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用；

（2）NUMB基因PCR扩增：根据设计的引物，所述的试剂盒特异性扩增NUMB基因；PCR反应体系为，2×Master Mix 10.0μl，上下游引物各0.07μl，DNA模板30-50μg，加水至总体积5μl；反应条件为，95℃预变性10min，95℃变性20s、循环10次，61-55℃延伸1min，95℃变性20s、循环26次，55℃延伸1min，4℃保存；

（3）KASP分型：基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用Douglas平台，对SNP进行双等位基因判断，从而进行基因分型。

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