CN109182532B - 含ca8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状试剂盒及其应用，利用本发明检测试剂盒通过检测AA、AG和GG等位基因，用于选育提高哈萨克马泌乳性状，检测试剂盒有六个区，包括96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区均为扇形区域，根据特异性引物，以样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物后进行KASP分型；本发明的建立，在为选育泌乳性状优良的哈萨克马品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持的同时，对于保护哈萨克马的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快乳用马发展具有实际应用价值。

Description

含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状试剂盒及其应用

技术领域

发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种哈萨克马泌乳性状筛选的试剂盒的技术领域。

背景技术

新疆养马业历史悠久，以盛产良马著称，也是我国重要的产马基地之一。新疆马匹资源丰富,马存栏数仍然保持在89万匹左右，马匹数量多，品种资源丰富。哈萨克马是食草性家畜。产于新疆的哈萨克马也是一种草原型马种。其形态特征是：头中等大，清秀，耳朵短。颈细长，稍扬起，耆甲高，胸销窄，后肢常呈现刀状。由于长期进行挤乳锻炼，哈萨克马乳腺发育良好，泌乳能力较强，成年马除供幼驹哺乳外，草原好的山区哈萨克马挤奶多在7-8月间，日挤奶7-8次，日挤乳5kg。泌乳期一般130d，可产乳800kg。马奶是牧民乳制食品的重要来源之一。

马乳及其制品由于其独特的营养价值，已经受到越来越多消费者的青睐，在国内外拥有广阔的市场，马乳的价格近年来逐年攀升，市场呈现供不应求的形势。马乳的化学成分与人乳接近，属易消化的乳类，非常稀薄的胃液及少量的胰液，即可将其消化，被人体吸收利用，特别适合婴幼儿和老弱病人饮用。马奶对心血管疾病、胃肠道疾病、神经系统疾病、某些类型的癌症以及糖尿病以及结核病都有一定的预防和治疗作用。马乳的乳糖含量较高，比牛乳高30％以上，马乳蛋白质含量低于牛乳，但质量较佳，马乳蛋白中氨基酸含量丰富，含有人体所需的各种必需氨基酸。由于马乳的市场需求，国内马的需求也逐渐增加。

目前基因组学成为研究家畜性状的方法之一，利用基因组学技术对影响目标性状的基因进行预测，通过竞争性等位基因特异性PCR(缩写KASP)分型技术寻找影响目标性状的具体突变位点，是一种灵活的、广泛应用的分型技术，对提高牧民经济收入，全面提高马的产奶量水平都具有现实的意义。

碳酸酐酶8(Carbonic Anhydrase 8,CA8)是α-碳酸酐酶家族成员之一，由于缺乏重要的锌结合组氨酸残基，CA8没有酶活性。近年来，家畜产奶性状的功能基因研究较多，但是对于将CA8基因作为影响哈萨克马泌乳性状的候选基因，未见相关研究报道。

发明内容

针对现有技术中未见报道专门针对CA8基因在哈萨克马泌乳性状筛选中的SNP标记研究的技术现状，本发明旨在提供了含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，利用哈萨克马血液样本作为测试材料，利用本发明检测试剂盒通过检测AA、AG和GG等位基因，用于选育提高哈萨克马泌乳性状。

本发明提供了一种含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状检测试剂盒，所述用于检测CA8基因的等位基型因包括AA、AG和GG。

本发明中，等位基因型AA、AG和GG从哈萨克马血浆中检测。

本发明同时提供一种含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，包括盒体，盒体外侧设置标签一，盒体内由隔板依次分为96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区，96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区上均设置分盖体，分盖体上设置标签二。

本发明中，盒体呈圆柱状，盒体内中部设置中心柱，中心柱顶端设置轴孔，分盖体底部设置与轴孔相适应的旋转轴。

本发明中，96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区均为扇形区域，分盖体呈六分之一扇形状。

本发明中，分盖体的半径大于盒体的半径。

本发明中，轴孔在中心柱顶端呈圆周阵列设置。

本发明中，盒体两侧设置把手，盒体底端和分盖体顶端相平齐设置。

本发明中，DNA提取试剂区的试剂为蛋白酶K、无水乙醇、缓冲液GB、磁悬浮液B、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱液TB、超纯灭菌水。

本发明中，PCR扩增试剂区的试剂为2×Master Mix、上下游引物和灭菌超纯水。

本发明中，KASP分型的Marker区的试剂为AA等位基因标记物、AG等位基因标记物和GG等位基因标记物。

本发明中，96孔板区放置灭菌96孔板。

本发明中，枪头区放置灭菌枪头。

本发明中，采血管区放置装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管。

本发明提供含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(1)引物设计及合成：根据马的CA8基因(GenBank ID:100052678)，自行人工设计特异性引物。

(2)PCR反应试剂：2×Master Mix、上下游引物、DNA模板和水。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如下所示：

CA8引物：

上游引物1：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGAATTTATTTTCTTTTTTCAGTTCTA-3'；

上游引物2:5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAATTTATTTTCTTTTTTCAGTTCTG-3'；

下游引物1:5'-TAACTTCATACAGTTCAAATTCGTG-3'。

进一步，本发明提供含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状检测试剂盒的应用，通过其检测方法体现，具体包括如下步骤：

(1)马基因组DNA的提取：

利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集哈萨克马颈静脉血5ml，-20℃保存；利用以上所述试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用。

(2)CA8基因PCR扩增：

根据设计的特异性引物，利用以上所述试剂盒特异性扩增CA8基因；PCR反应体系为：2×Master Mix 2.5μl，上下游引物各0.07μl，由步骤(1)获得的基因组DNA模板30-50ug，加水至总体积5ul；反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性20s、61-55℃延伸60s、循环10次，95℃变性20s、55℃延伸1min，循环26次，4℃保存。

(3)KASP分型：

基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，对SNP进行双等位基因判断，从而进行基因分型。

本发明中，马的CA8基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站NCBI(National Center for Biotechnology)，检索得到马的CA8基因的DNA序列(GenBank ID:100052678)，借助公知软件Primer 3.0，自行人工设计特异性引物。

通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：

(1)本发明通过提供用于选育哈萨克马泌乳性状的试剂盒，利用试剂盒对哈萨克马的CA8基因的表达量进行检测，并与哈萨克马的日均产奶量(kg/d)进行差异显著性检验，得出CA8基因的SNP位点与哈萨克马日均产奶量(kg/d)密切相关，GG基因型母马日均产奶量比AA型母马多6.61公斤，两者之间差异极显著(P＜0.01)。在实际生产应用中，可通过选择GG和AG基因型个体，淘汰基因型为AA的个体，选育提高哈萨克马的产奶量，用于专门化乳用马品种的培育，对于保护哈萨克马的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快乳用马发展具有实际应用价值。

(2)本发明中，虽然如上所述，在构建一种用于选育哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒中，在采用现有技术中CA8基因作为影响家畜泌乳性状候选基因并构建试剂盒，在新疆哈萨克马群体中，CA8基因SNP位点与哈萨克马的产奶量相关，存在3种基因型：AA、AG、GG，G为优势等位基因，此位点突变使哈萨克马产奶量下降，为选育泌乳性状优良的哈萨克马品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。

附图说明

图1显示为本发明提供的含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒结构示意图一。

图2显示为本发明提供的含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒结构示意图二。

图3显示为本发明提供的盒体结构示意图。

图1-3中，1—盒体，11—把手，12—标签一，2—分盖体，21—标签二，3—隔板，31—96孔板区，32—枪头区，33—采血管区，34—DNA提取试剂区，35—PCR扩增试剂区，36—Marker区，4—中心柱，41—旋转轴，42—轴孔。

附图4所示为DAN凝胶电泳图，其中M道：D 2000DNA Marker，1-5道，PITX2基因PCR扩增产物。

附图5所示为CA8基因(g.24074470A>G位点)的分型结果图。

附图6所示为CA8基因(g.24074470A>G位点)与哈萨克马产奶量关联分析图。

具体实施方式

下面结合附图1-6和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。

本发明中选用的所有试剂、耗材和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：本发明用于检测哈萨克马泌乳性状试剂盒

本发明提供了一种用于检测CA8基因的哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，所述用于检测CA8基因的等位基型因包括AA、AG和GG。

本发明中，等位基因型AA、AG和GG从哈萨克马血浆中检测。

本发明同时提供一种含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，包括盒体1，盒体1外侧设置标签一12，盒体1内由隔板3依次分为96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36，96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36上均设置分盖体2，分盖体2上设置标签二21。

本发明中，盒体1呈圆柱状，盒体1内中部设置中心柱4，中心柱4顶端设置轴孔42，分盖体2底部设置与轴孔42相适应的旋转轴41。

本发明中，96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36均为扇形区域，分盖体2呈六分之一扇形状。

本发明中，分盖体2的半径大于盒体1的半径。

本发明中，轴孔42在中心柱4顶端呈圆周阵列设置。

本发明中，盒体1两侧设置把手11，盒体1底端和分盖体2顶端相平齐设置。

本发明中，DNA提取试剂区34的试剂为蛋白酶K、无水乙醇、缓冲液GB、磁悬浮液B、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱液TB、超纯灭菌水。

本发明中，PCR扩增试剂区35的试剂为2×Master Mix、上下游引物和灭菌超纯水。

本发明中，用于KASP分型的Marker区36的试剂为AA等位基因标记物、AG等位基因标记物和GG等位基因标记物。

本发明中，96孔板区31放置灭菌96孔板。

本发明中，枪头区32放置灭菌枪头。

本发明中，采血管区33放置装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管。

实施例二：本发明用于检测哈萨克马泌乳性状试剂盒

本发明提供一种含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒中，盒体1呈圆柱状，盒体1内中部设置中心柱4，中心柱4顶端设置轴孔42，分盖体2底部设置与轴孔42相适应的旋转轴41，使得分盖体2打开后可以旋转后置于其它分盖体2上，不占用空间，隔板3和分盖体2使得各个区密闭分割，不会互相干扰。

本发明中，96孔板区31、枪头区32、采血管区33、DNA提取试剂区34、PCR扩增试剂区35和Marker区36均为扇形区域，分盖体2呈六分之一扇形状。

本发明中，分盖体2的半径大于盒体1的半径，方便打开分盖体2。

本发明中，轴孔42在中心柱4顶端呈圆周阵列设置。

本发明中，盒体1两侧设置把手11，盒体1底端和分盖体2顶端相平齐设置，方便本试剂盒的堆叠存放。

在使用本发明提供的含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒时，根据标签一12选择试剂盒，观察标签二21，从96孔板区31、枪头区32取出96孔板区31、枪头区32，从采血管区33取出采血管，利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集哈萨克马颈静脉血5ml，从DNA提取试剂区34取出DNA提取试剂，提取基因组DNA，-20℃保存待用，提取基因组DNA凝胶电泳图，从PCR扩增试剂区35和Marker区36取出试剂，根据设计的引物，特异性扩增CA8基因；PCR反应体系为：2×Master Mix 2.5μl，上下游特异性引物各0.07μl，由提取的DNA模板30-50ug，加灭菌超纯水至总体积5ul；95℃预变性10min，95℃变性20s、61-55℃延伸60s、循环10次，95℃变性20s、55℃延伸1min，循环26次，4℃保存，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用Douglas平台，对SNP进行双等位基因判断，进行基因分型，选择基因型为GG、GA的个体，淘汰基因型为AA的个体，提高哈萨克马泌乳性状，加快专门化乳用马品种的培育。

实施例三：含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒的应用

本发明提供含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒的应用中，通过检测方法体现，具体包括如下步骤：

(1)马基因组DNA的提取：

利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集哈萨克马颈静脉血5ml，利用DNA的提取试剂，采用上述实施例提供的试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用，提取基因组DAN凝胶电泳图，如附图4所示。

(2)CA8基因PCR扩增：

根据设计的引物，采用上述实施例提供的试剂盒特异性扩增CA8基因；PCR反应体系为，2×Master Mix 2.5μl，上下游引物各0.07μl，由步骤(1)获得的基因组DNA模板30-50ug，加水至总体积5ul；反应条件为，95℃预变性10min，95℃变性20s、61-55℃延伸60s、循环10次，95℃变性20s、55℃延伸1min，循环26次，4℃保存。

(3)KASP分型：

基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用Douglas平台，对SNP进行双等位基因判断，根据FAM荧光信号类型进行基因分型。

实施例四：含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒共建体系的建立

本发明提供含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(1)引物设计及合成

根据马的CA8基因(GenBank ID:100052678)，自行人工设计特异性引物。

(2)PCR反应试剂：2×Master Mix、上下游引物、DNA模板和水。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如下所示：CA8引物：

上游引物1：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGAATTTATTTTCTTTTTTCAGTTCTA-3'；

上游引物2:5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAATTTATTTTCTTTTTTCAGTTCTG-3'；

下游引物1:5'-TAACTTCATACAGTTCAAATTCGTG-3'。

实施例五：含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒效果验证试验

采集60匹哈萨克马颈静脉血，按照实施例三中的方法进行操作，对SNP位点进行双等位基因判断，根据FAM荧光信号类型进行基因分型，如附图5所示，并统计的分型结果，利用软件SPSS19.0，对试剂盒检测出的CA8基因SNP位点不同基因型与哈萨克马的平均日均产奶量(kg/d)进行差异显著性检验，结果如下表1及附图6。

表1：哈萨克马CA8基因不同基因型与平均日泌乳量的关联分析

注：Mean±SD表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

从表1中可以看出，在新疆哈萨克马群体中，通过试剂盒检测哈萨克马CA8基因的SNP位点与哈萨克马产奶量密切相关，实验结果表明：GG基因型母马日均产奶量比AA型母马多6.61公斤，两者之间差异极显著(P＜0.01)，此位点突变使哈萨克马产奶量下降。在实际生产应用中，可通过选择基因型为GG、GA的个体，淘汰基因型为AA的个体，提高哈萨克马的产奶量，加快新疆专门化乳用马品种的培育，在为选育泌乳性状优良的哈萨克马品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持的同时，对于保护哈萨克马的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快乳用马发展具有实际应用价值。

实施例六：含CA8基因用于提高哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒效果验证试验

按照实施例三中的方法进行操作，将提供的试剂盒应用于哈萨克马、马伊犁马、新吉尔吉斯马、伊犁马和新吉尔吉斯马杂交马、柯尔克孜马、库素木马中，观测CA8基因在平均日泌乳量的关联度。具体见表2。

表2：CA8基因与平均日泌乳量的关联度

注：Mean±SD表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同小写字母时，表示差异显著(P<0.05)。肩标为不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

由表2分析可知，哈萨克马CA8基因GG、AG基因型个体平均日泌乳量显著高于AA基因型，差异极显著(P＜0.01)表示极强关联度；马伊犁马、新吉尔吉斯马、伊犁马和新吉尔吉斯马杂交马、柯尔克孜马、库素木马CA8基因GG、AG基因型个体平均日泌乳量与AA基因型个体平均日泌乳量没有显著差异，无明显关联度，说明方法具有较好的特异性。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> 含CA8基因用于筛选哈萨克马泌乳性状试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat ttagaattta ttttcttttt tcagttcta 49

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tagaatttat tttctttttt cagttctg 48

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taacttcata cagttcaaat tcgtg 25

Claims (8)

1.一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述用于检测CA8基因的等位基因型包括AA、AG和GG；所述用于检测CA8基因的等位基因型的等位基因分型位点是g.24074470A>G位点,包括AA、AG和GG基因型；所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：

（1）引物设计及合成：根据马的CA8基因，GenBank ID:100052678，自行人工设计特异性引物；

（2）PCR反应试剂：2×Master Mix、上下游引物、DNA模板和水；

所述的特异性引物序列如下所示：

上游引物1：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGAATTTATTTTCTTTTTTCAGTTCTA-3'；

上游引物2: 5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAATTTATTTTCTTTTTTCAGTTCTG-3'；

下游引物1: 5'-TAACTTCATACAGTTCAAATTCGTG-3'；

在应用中，通过选择基因型为GG、GA的个体，淘汰基因型为AA的个体，提高哈萨克马的产奶量，加快新疆专门化乳用马品种的培育。

2.如权利要求1所述的一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒包括盒体，盒体外侧设置标签一，盒体内由隔板依次分为96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区，96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区上均设置分盖体，分盖体上设置标签二。

3.如权利要求2所述的一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，盒体呈圆柱状，盒体内中部设置中心柱，中心柱顶端设置轴孔，分盖体底部设置与轴孔相适应的旋转轴。

4.如权利要求2所述的一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR扩增试剂区和Marker区均为扇形区域，分盖体呈六分之一扇形状。

5.如权利要求2所述的一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，分盖体的半径大于盒体的半径。

6.如权利要求3所述的一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，所述轴孔在中心柱顶端呈圆周阵列设置。

7.如权利要求2所述的一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中，盒体两侧设置把手，盒体底端和分盖体顶端相平齐设置。

8.如权利要求1所述的一种CA8基因分型检测试剂盒在筛选哈萨克马泌乳性能中的应用，其特征在于，所述应用中，通过检测方法体现，具体包括如下步骤：

（1）马基因组DNA的提取：利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集哈萨克马颈静脉血5ml，-20℃保存；利用所述提供的试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用；

（2）CA8基因PCR扩增：根据设计的引物，所述的试剂盒特异性扩增CA8基因；PCR反应体系为，2×Master Mix 2.5μl，上下游引物各0.07μl，DNA模板30-50 μg，加水至总体积5μl；反应条件为，95℃预变性10min，95℃变性20s、61-55℃延伸60s、循环10次，95℃变性20s、55℃延伸1min，循环26次，4℃保存；

（3）KASP分型：基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用Douglas平台，对SNP进行双等位基因判断，从而进行基因分型。

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