CN112680399A

CN112680399A - 一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN112680399A
Application number: CN202011605111.7A
Authority: CN
Inventors: 周煌凯; 高川; 陈飞钦; 夏昊强; 徐毓璇; 梁国霞
Original assignee: Guangzhou Gene Denovo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Gene Denovo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112680399B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用。本发明提供的制备方法，通过将植物原生质体处理、孵育、酶解、过滤、离心、活性检测等过程，最终制成单细胞悬液。采用本发明所述方法制成的植物原生质体单细胞悬液，细胞活性高达95％以上，可满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，应用价值高。

Description

一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用。

背景技术

多细胞生物个体由多种形态功能不同的细胞组成，细胞的异质性这个普遍存在的生物学现象亟待我们展开深入研究。近十年来，单细胞测序技术发展迅猛，具备高通量、低价格和单分子分辨率和高稳定性等多重技术光环的10×genomics单细胞技术的涌现，使万级别的单细胞研究成为成本可接受的事情。单细胞测序技术已在肿瘤、免疫、发育等方向获得了良好的应用，但植物单细胞研究仍处于早期发展期，目前的所有研究对象都集中在拟南芥根和玉米花粉，研究对象极度匮乏。与动物细胞相比，植物细胞受到一层细胞壁的保护，给植物单细胞悬液的制备造成了更大的障碍。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，只有有效去除细胞壁中的纤维素和果胶，我们才可能获得高质量的植物单细胞悬液，从而突破植物单细胞测序技术障碍。

植物原生质体分离的方法主要有机械法和酶解法两种。机械法分离原生质体过程复杂且得率较低；酶解法可以快速批量获取原生质体且对细胞损伤小，是目前使用较为广泛的分离方法。该方法多通过同时添加果胶酶和纤维素酶来酶解细胞，以去掉细胞壁，但是，在实际应用过程中，植物组织伴随着发育程度不同和功能不同，具有不同的细胞壁厚度和液泡渗透压，如果仅含这两种酶很容易使得最终制成的单细胞悬液的细胞活性低，且还易被杂菌污染，影响细胞的活性。

基于此，中国专利申请CN111647549A公开了一种同时适用于动物、植物单细胞的分离方法，该方法虽然具有适用范围广、细胞活性高等优点，但是其在制备过程中使用的硝酸镧属于化学危险品，对人体有害且具有助燃性，此外，采用的玻璃珠在实验过程中损耗较大，大大增加了试验成本。

综上可知，开发一种成熟通用的，适用于植物原生质体单细胞悬液的制备方法是一件迫在眉睫的事情。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明创造性的提供了一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用。采用本发明所述方法制成的原生质体单细胞悬液，细胞活性高达95％以上，可用于单细胞转录组测序文库的构建，应用价值高。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：

S1、取45～55mg的植物组织切成1mm³的薄片，置于10mL的离心管中，向其中加入5mL的清洗液，摇晃混匀，静置10～15s，除去上清液，制得组织薄片；

S2、向步骤S1制得的组织薄片中加入5mL的酶消化液，于30℃下避光孵育0.5～1h，镜检至消化完全，制得酶解消化液；

S3、将步骤S2制得的酶解消化液用1mL的宽口枪头转移，通过细胞筛，并向其中加入4mL清洗液，混匀，经离心处理，去掉上清液，用宽口枪头加入2mL清洗液重悬原生质体并离心，连续处理2次，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、将步骤S3制得的细胞沉淀经除菌混合液清洗2～3次，离心去除上清液，将细胞沉淀用清洗液溶解，并用显微镜细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，即可。

优选地，步骤S1、S3及S4所述的清洗液为含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M。

优选地，步骤S2所述的酶消化液为由0.5M甘露醇、质量分数为15％的纤维素酶、质量分数为1％的果胶酶及质量分数为3％的离析酶组成。

优选地，步骤S3所述的细胞筛孔径大小为40μm，所述的离心处理过程为于4℃，400～600rpm转速下离心4～8min。

优选地，步骤S4所述的离心过程为于4℃，400～600rpm转速下离心2～5min。

优选地，步骤S4所述的除菌混合液由如下组分及其质量百分数组成：穿心莲提取物3～8％，雷公藤提取物2～3％，甘草提取物8～15％，纯化水74～87％。

本发明还提供了一种利用所述的制备方法在构建单细胞转录组测序文库中的应用。

优选地，将利用所述制备方法制得的单细胞悬液置于冰上，于30min内建库。

本发明中，将植物原生质体经清洗、酶解消化、除菌等过程，最终制成一种单细胞悬液，在制备过程中，采用一种含有甘露醇、纤维素酶、果胶酶及离析酶组成的混合酶处理原生质体组织，这样有利于组织完全酶解，去掉植物细胞壁的同时，不破坏细胞其他部位的完整性。

同时，本发明还用除菌混合液对细胞沉淀进行处理，去掉单细胞悬液制备过程中可能滋生的细菌、真菌等物质，提高细胞活性(采用本发明制备方法制得单细胞悬液中，细胞活性高达95％以上)，而且，采用本发明所述的制备方法可以构建单细胞转录组测序文库，有利于促进高通量单细胞测序技术的推广应用。

此外，需要注意的是，本发明中，酶消化液中各酶的加入量，根据植物组织的不同，在实际加入时存在区别，根据组织细胞壁厚薄调整纤维素酶和果胶酶的用量，其余各种酶按照本申请实施例所述量添加均可；而最终根据细胞沉淀的多少，在加入细胞沉淀时，也会存在区别，清洗液溶解时的加入量一般在100μL～2mL之间。

与现有技术相比，本发明提供的植物原生质体单细胞悬液的制备方法具有如下优势：

(1)本发明提供的制备方法，采用酶混合液对原生质体组织酶解，去掉细胞壁的同时，清洗液保持了和植物细胞一样的渗透压；

(2)本发明提供的制备方法，用除菌混合液对细胞沉淀进行清洗，提高了细胞活性，防止杂菌污染，提高了单细胞悬液的质量；

(3)本发明提供的制备方法，添加的成分少，且制备过程简单，适合进一步推广应用。

附图说明

图1为酶解孵育后，原生质体消化状态结果图；

图2为显微镜细胞计数板检测细胞浓度及细胞活性图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

所述穿心莲提取物可购自陕西斯诺特生物技术有限公司；所述雷公藤提取物可购自宝鸡润德康生物科技有限公司；所述甘草提取物可购自西安拉维亚生物科技有限公司。

实施例1一种原生质体单细胞悬液的制备方法

所述原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：

S1、取45mg的白菜愈伤组织切成1mm³的薄片，置于10mL的离心管中，向其中加入5mL、含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M的清洗液，摇晃混匀，静置10s，除去上清液，制得组织薄片；

S2、向步骤S1制得的组织薄片中加入5mL、由0.5M甘露醇3mL、质量分数为15％的纤维素酶300μL、质量分数为1％的果胶酶300μL及质量分数为3％的离析酶300μL组成的酶消化液，于30℃下避光孵育0.5h，镜检至消化完全(完全消化时结果如图1所示)，制得酶解消化液；

S3、将步骤S2制得的酶解消化液用宽口枪头转移，通过40μm的细胞筛，并向其中加入4mL、含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M的清洗液，混匀，于4℃，400rpm转速下离心4min，去掉上清液，用宽口枪头加入2mL上述清洗液重悬原生质体并同样于4℃，400rpm转速下离心4min，连续重悬、离心处理2次，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、将步骤S3制得的细胞沉淀经除菌混合液清洗2次，于4℃，400rpm转速下离心2min，去除上清液，将细胞沉淀用500μL清洗液溶解，并用显微镜细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性(检测结果如图1所示)，即可；所述的除菌混合液由如下组分及其质量百分数组成：穿心莲提取物3％，雷公藤提取物2％，甘草提取物8％，纯化水87％。

实施例2一种原生质体单细胞悬液的制备方法

所述原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：

S1、取55mg的白菜根组织切成1mm³的薄片，置于10mL的离心管中，向其中加入5mL、含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M的清洗液，摇晃混匀，静置15s，除去上清液，制得组织薄片；

S2、向步骤S1制得的组织薄片中加入5mL、由0.5M甘露醇3mL、质量分数为15％的纤维素酶400μL、质量分数为1％的果胶酶400μL及质量分数为3％的离析酶300μL组成的酶消化液，于30℃下避光孵育1h，镜检至消化完全(结果与图1相近)，制得酶解消化液；

S3、将步骤S2制得的酶解消化液用宽口枪头转移，通过40μm的细胞筛，并向其中加入4mL、含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M的清洗液，混匀，于4℃，600rpm转速下离心8min，去掉上清液，用宽口枪头加入2mL上述清洗液重悬原生质体并同样于4℃，600rpm转速下离心8min，连续重悬、离心处理2次，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、将步骤S3制得的细胞沉淀经除菌混合液清洗3次，于4℃，600rpm转速下离心5min，去除上清液，将细胞沉淀用2mL清洗液溶解，并用显微镜细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性(结果与图2相近)，即可；所述的除菌混合液由如下组分及其质量百分数组成：穿心莲提取物8％，雷公藤提取物3％，甘草提取物15％，纯化水74％。

实施例3一种原生质体单细胞悬液的制备方法

所述原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：

S1、取50mg的拟南芥根组织切成1mm³的薄片，置于10mL的离心管中，向其中加入5mL、含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M的清洗液，摇晃混匀，静置13s，除去上清液，制得组织薄片；

S2、向步骤S1制得的组织薄片中加入5mL、由0.5M甘露醇3mL、质量分数为15％的纤维素酶300μL、质量分数为1％的果胶酶400μL及质量分数为3％的离析酶300μL组成的酶消化液，于30℃下避光孵育0.8h，镜检至消化完全(结果与图1相近)，制得酶解消化液；

S3、将步骤S2制得的酶解消化液用宽口枪头转移，通过40μm的细胞筛，并向其中4mL、含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M的清洗液，混匀，于4℃，500rpm转速下离心6min，去掉上清液，用宽口枪头加入2mL上述清洗液重悬原生质体并同样于4℃，500rpm转速下离心6min，连续重悬、离心处理2次，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、将步骤S3制得的细胞沉淀经除菌混合液清洗2次，于4℃，500rpm转速下离心3min，去除上清液，将细胞沉淀用1mL的清洗液溶解，并用显微镜细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性(结果与图2相近)，即可；所述的除菌混合液由如下组分及其质量百分数组成：穿心莲提取物5％，雷公藤提取物2.5％，甘草提取物12％，纯化水80.5％。

对比例1一种原生质体单细胞悬液的制备方法

所述原生质体单细胞悬液的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例1中的步骤S4中不加除菌混合液清洗沉淀过程。

对比例2一种原生质体单细胞悬液的制备方法

所述原生质体单细胞悬液的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例2中的步骤S4中的除菌混合液中去掉雷公藤提取物，增加水的比例。

对比例3一种原生质体单细胞悬液的制备方法

所述原生质体单细胞悬液的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例3中的步骤S2中的混合酶仅包含质量分数为15％的纤维素酶及质量分数为1％的果胶酶。

试验例1细胞活性检测试验

1.试验样品：实施例1-3及对比例1-3所述的制备方法制成的单细胞悬液；

2.试验方法：取上述细胞悬液各500μL，稀释至1.0×10⁴，各取300μL加入试管中，然后向试管中加入300μL，4％的台盼蓝染液，染色2～3min，并吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖玻片，于显微镜下任取几个视野计数死细胞数和活细胞数，计算细胞活性。

细胞活性＝活细胞数/(死细胞数+活细胞数)×100。

3.试验结果：具体试验结果见表1。

表1不同试验样品活性检测结果

试验样品	细胞总数/个	活细胞数/个	细胞活性/％
				实施例1组	2547	2440	95.79％
实施例2组	2486	2394	96.29％
				实施例3组	2607	2531	97.08％
对比例1组	2584	1850	71.59％
				对比例2组	2649	1992	75.19％
对比例3组	2432	1721	70.76％

由表1可知，采用本发明实施例1-3所述方法制得的单细胞悬液，细胞活性均在95％以上，尤其是实施例3组的细胞活性达97.08％，因此，实施例3为本发明的最佳实施例，而对比例1-3组制得的单细胞悬液，其细胞活性均在85％以下，这是由于破坏了细胞沉淀的杀菌功能，或改变酶混合液的组成，影响酶解效果，使得最终细胞活性降低至75％以下，与实施例组相比，活性降低显著，这进一步证明了本发明技术方案的完整性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1、S3及S4所述的清洗液为含质量百分数为0.04％的牛血清白蛋白的甘露醇0.4M。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述的酶消化液为由0.5M甘露醇、质量分数为15％的纤维素酶、质量分数为1％的果胶酶及质量分数为3％的离析酶组成。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的细胞筛孔径大小为40μm，所述的离心处理过程为于4℃，400～600rpm转速下离心4～8min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述的离心过程为于4℃，400～600rpm转速下离心2～5min。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述的除菌混合液由如下组分及其质量百分数组成：穿心莲提取物3～8％，雷公藤提取物2～3％，甘草提取物8～15％，纯化水74～87％。

7.一种利用权利要求1所述的制备方法在构建单细胞转录组文库中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将利用权利要求1制备的单细胞悬液置于冰上，于30min内建库。