CN110540550A - 蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺，本发明经过蚯蚓浆料制备，蚓浆分离，盐析恒温破乳，离心分离蚯蚓脂质，脂质中萃取卵磷脂，提取蚓激酶等步骤，采用先提取粗制蚯蚓卵磷脂，可降低蚓激酶除杂工序负担，且不影响蚓激酶原有生产过程及产品的性价比，有利于提高蚓激酶的收率和品质，且粗制蚯蚓卵磷脂的获取，增加了蚯蚓的利用度。
Description
技术领域
本发明涉及蚯蚓领域，尤其涉及一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺。
背景技术
近代农业，环保，医药及保健化妆品领域的发展，科技工作者对蚯蚓的实用价值受到极大关注。其生态功能集中用于消纳畜禽粪，农作物废弃垃圾年处理量以千,万吨计；在增加农田土壤团粒结构，提升肥力，改善产物品质等方面的实践资料和文献报道；网搜，俯拾即是可资佐证。
作为庞大生物量的高蛋白资源，蚯蚓蛋白质含量约占体重53.5～65.1％，大宗加工成蚯蚓蛋白粉可替代进口鱼粉。蚯蚓浑身是宝，以蚯蚓制药为特色的溶栓药的产业化，极大的推动了我国蚯蚓事业发展。继其后，致力蚯蚓体综合利用，从事蚯蚓科技同行们竞相孜孜以求的事业。但传统的制备工艺只能从蚯蚓中提取单一产品，这必然造成一定的浪费，使得蚯蚓利用度低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺，能够同时提取蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂，提高了蚯蚓的利用度。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺，包括：
a)蚯蚓浆料制备
排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，冷冻，得到冻蚯蚓；将冻蚯蚓室温解冻后制成浆，得到蚯蚓浆料；
b)蚓浆分离
将步骤a)得到的蚯蚓浆料在40～56℃的水浴锅中保温3～4h后，在12000r/min下离心除渣，得到上清液；
c)盐析升温破乳
向步骤b)得到的上清液中加入无机盐，直至上清液中无机盐的含量为0.6mol/Lol/L，再升温至40～45℃，保持40～60min，得到破乳液；
d)离心分离蚯蚓脂质
将步骤c)得到的破乳液中加入无机盐直至无机盐的浓度为1mol/L，并温度为40～50℃，速度为3000r/min下离心60min，得到蚯蚓脂质，收集离心液；
e)脂质中萃取卵磷脂
向步骤d)得到的蚯蚓脂质中加入无水乙醇，得到乙醇溶出物；将乙醇溶出物中无水乙醇除去，再加入氯仿，得到氯仿溶出物；向氯仿溶出物中加入丙酮，并在4000r/min下离心15min，得到蚯蚓卵磷脂；
f)提取蚓激酶
将步骤d)收集到的离心液通入截留分子量为100000D的膜过滤器，得到过滤液；再将过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到浓缩液，再向浓缩液中加入纯净水，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到浓缩蚓激酶上柱液。将浓缩液通过阴离子交换纤维素树脂离子交换层析进行分离纯化层析，用0.5-2mol/L的氯化钠对层析后的产物进行阶段洗脱，经脱盐、浓缩、冷冻干燥得到蚓激酶。
优选地，步骤a)中，制成浆的方法为机械法或溶解法。
优选地，机械法采用的装置为砂轮磨，胶体磨，震动磨或球磨机。
优选地，溶解法为40～45℃恒温自溶解法、蔗糖溶解法或无机盐溶解法。
优选地，步骤c)与步骤d)中，无机盐相同，无机盐为氯化钠、氯化钙或氯化镁。
优选地，步骤f)，过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件后，得到的浓缩液的体积为离心液体积的1/5，再加入纯净水，纯净水与浓缩液的总体积等于过滤液的体积，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，重复8～10个循环，得到蚓激酶浆料；向蚓激酶浆料中加入PH7.8磷酸缓冲液，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件进行脱盐，在通入2-已氨基树脂纤维素层析，用0.6mol/L氯化钠对层析后的产物进行洗脱，收集蚓激酶下柱液；将得到蚓激酶下柱液，重复d)步骤浓缩，脱盐操作，再经冷冻干燥，粉碎，得蚓激酶粉。
本发明公开了一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺，本发明经过蚯蚓浆料制备，蚓浆分离，盐析恒温破乳，离心分离蚯蚓脂质，脂质中萃取卵磷脂，提取蚓激酶等步骤，采用先提取粗制蚯蚓卵磷脂，可降低蚓激酶除杂工序负担，且不影响蚓激酶原有生产过程及产品的性价比，有利于提高蚓激酶的收率和品质，且粗制蚯蚓卵磷脂的获取，增加了蚯蚓的利用度。
附图说明
图1为蚓激酶的光谱分析图；
图2为蚓激酶的效价检测图；
图3为蚯蚓脂肪的图片。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明提供的一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺，包括：
a)蚯蚓浆料制备
排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，冷冻，得到冻蚯蚓；将冻蚯蚓室温解冻后制成浆，得到蚯蚓浆料；
b)蚓浆分离
将步骤a)得到的蚯蚓浆料在40～56℃的水浴锅中保温3～4h后，在12000r/min下离心除渣，得到上清液；
c)盐析升温破乳
向步骤b)得到的上清液中加入无机盐，直至上清液中无机盐的含量为0.6mol/Lol/L，再升温至40～45℃，保持40～60min，得到破乳液；
d)离心分离蚯蚓脂质
将步骤c)得到的破乳液中加入无机盐直至无机盐的浓度为1mol/L，并温度为40～50℃，速度为3000r/min下离心60min，收集漂浮在液面上层的蚯蚓脂肪。见(图3，图3a、b均为蚯蚓脂肪)。
收集下层离心液备处理。
e)脂质中萃取卵磷脂
向步骤d)得到的蚯蚓脂质中加入无水乙醇，得到乙醇溶出物；将乙醇溶出物中无水乙醇除去，再加入氯仿，得到氯仿溶出物；向氯仿溶出物中加入丙酮，并在4000r/min下离心15min，得到蚯蚓卵磷脂；
f)提取蚓激酶
将步骤d)收集到的离心液通入截留分子量为100000D的膜过滤器，得到过滤液；再将过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到浓缩液，再向浓缩液中加入纯净水，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到蚓激酶浆料；向蚓激酶浆料中加入PH7.8磷酸缓冲液，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件进行脱盐，在通入2-已氨基树脂纤维素层析，用0.6mol/L氯化钠对层析后的产物进行洗脱，收集蚓激酶下柱液；将得到蚓激酶下柱液，重复d)步骤浓缩，脱盐操作，再经冷冻干燥，粉碎，得蚓激酶粉。
本发明经过蚯蚓浆料制备，蚓浆分离，盐析恒温破乳，离心分离蚯蚓脂质，脂质中萃取卵磷脂，提取蚓激酶等步骤，采用先提取粗制蚯蚓卵磷脂，可降低蚓激酶除杂工序负担，且不影响蚓激酶原有生产过程及产品的性价比，有利于提高蚓激酶的收率和品质，且粗制蚯蚓卵磷脂的获取，增加了蚯蚓的利用度。
本发明排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，冷冻，得到冻蚯蚓；将冻蚯蚓室温解冻后制成浆，得到蚯蚓浆料；为了保证蚯蚓中蚓激酶的活性，蚯蚓浆料制备过程的温度不超过15℃，时间不超过2h。
在本发明的实施例中，制成浆的方法为机械法或溶解法；在优选的实施例中，机械法采用的装置为砂轮磨，胶体磨，震动磨或球磨机；溶解法为40～45℃恒温自溶解法、蔗糖溶解法或无机盐溶解法，利用蚯蚓自身的溶解特性制备蚯蚓浆料。
将得到的蚯蚓浆料在40～56℃的水浴锅中保温3～4h后，在12000r/min下离心除渣，得到上清液。
向上清液中加入无机盐，直至上清液中无机盐的含量为0.6mol/Lol/L，再升温至40～45℃，保持40～60min，得到破乳液；该盐析升温破乳步骤可以观察到原来平滑的液体表面出现黑褐色油脂颗粒状漂浮物，通过观察漂浮物多少判断无机盐的破乳化效果。
将破乳液中加入无机盐直至无机盐的浓度为1mol/L，并温度为40～50℃，速度为3000r/min下离心60min，得到蚯蚓脂质，收集离心液；该离心分离蚯蚓脂质可以获取高收率的粗脂肪；离心分离蚯蚓脂质步骤的离心温度对粗脂肪的收率，及蚓激酶的活性产生影响，离心温度低于40℃时虽然不会对蚓激酶的活性产生影响，但是粗脂肪分离效果差，收率比较低；温度高于50℃，虽然粗脂肪离心效果好，但是会对蚓激酶的活性造成影响，使蚓激酶失活。
需要说明的是，盐析升温破乳与离心分离蚯蚓脂质这两个步骤中无机盐相同，无机盐为氯化钠、氯化钙或氯化镁。
向得到的蚯蚓脂质中加入无水乙醇，得到乙醇溶出物；将乙醇溶出物中无水乙醇除去，再加入氯仿，得到氯仿溶出物；向氯仿溶出物中加入丙酮，并在4000r/min下离心15min，得到蚯蚓卵磷脂；该脂质中萃取卵磷脂步骤采用无水乙醇、氯仿、丙酮萃取得到，卵磷脂在无水乙醇和氯仿中溶解度有差异，而不溶解于丙酮的特性，用于萃取蚯蚓卵磷脂。
将收集到的离心液通入截留分子量为100000D的膜过滤器，得到过滤液；再将过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到浓缩液，再向浓缩液中加入纯净水，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到蚓激酶浆料；调整蚓激酶浆料至PH7.8.再用浓磷酸缓冲液调制到0.005M/l，导入2-已氨基树脂纤维素层析柱中，经0.6mol/L氯化钠对层析后的产物进行洗脱，收集蚓激酶下柱液；得到蚓激酶下柱液，重复d)步骤浓缩，脱盐操作，再经冷冻干燥，粉碎，得蚓激酶粉。该提取蚓激酶步骤中，截留分子量为100000D的膜过滤器用于除去离心液中的微生物等杂质；截留分子量为5000D的中空纤维膜组件用于除去物料中残留无机盐，进一步提高蚓激酶的品质,
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
a)蚯蚓浆料制备
排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后将蚯蚓表面擦干，冷冻，得到冻蚯蚓；取1t冻蚯蚓室温解冻后采用胶体磨制成浆，得到蚯蚓浆料；制备浆料过程中蚯蚓温度不超过15℃，时间为2h；
b)蚓浆分离
将步骤a)得到的蚯蚓浆料在40℃的水浴锅中保温4h后，在12000r/min下离心除渣，得到上清液；
c)盐析升温破乳
向步骤b)得到的上清液中加入氯化镁，直至上清液中氯化镁的含量为0.6mol/Lol/L，再升温至40℃，保持60min，得到破乳液；
d)离心分离蚯蚓脂质
将步骤c)得到的破乳液中加入氯化镁直至氯化镁的浓度为1mol/L，并温度为40℃，速度为3000r/min下离
心60min，得到蚯蚓脂质，收集离心液；
e)脂质中萃取卵磷脂
向步骤d)得到的蚯蚓脂质中加入无水乙醇，得到乙醇溶出物；将乙醇溶出物中无水乙醇除去，再加入氯仿，得到氯仿溶出物；向氯仿溶出物中加入丙酮，并在4000r/min下离心15min，得到蚯蚓卵磷脂；
f)提取蚓激酶
将步骤d)收集到的离心液通入截留分子量为100000D的膜过滤器，得到过滤液；再将过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件后，得到的浓缩液的体积为离心液体积的1/5，再加入纯净水，纯净水与浓缩液的总体积等于过滤液的体积，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，重复8～10个循环调整蚓激酶浆料至PH7.8。再用浓磷酸缓冲液调制到0.005M/l，导入2-已氨基树脂纤维素层析柱中，经0.6mol/L氯化钠对层析后的产物进行洗脱，收集蚓激酶下柱液；重复d)步骤浓缩，脱盐操作，再经冷冻干燥，粉碎，得蚓激酶粉。
实施例2
a)蚯蚓浆料制备
排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后将蚯蚓表面擦干，冷冻，得到冻蚯蚓；取1t冻蚯蚓室温解冻后制成浆，得到蚯蚓浆料；制备浆料过程中温度不超过15℃，时间为1.5h；
b)蚓浆分离
将步骤a)得到的蚯蚓浆料在56℃的水浴锅中保温3h后，在12000r/min下离心除渣，得到上清液；
c)盐析升温破乳
向步骤b)得到的上清液中加入氯化钙，直至上清液中氯化钙的含量为0.6mol/Lol/L，再升温至45℃，保持10min，得到破乳液；
d)离心分离蚯蚓脂质
将步骤c)得到的破乳液中加入氯化钙直至氯化钙的浓度为1mol/L，并温度为50℃，速度为3000r/min下离心60min，得到蚯蚓脂质，收集离心液；
e)脂质中萃取卵磷脂
将步骤d)得到的蚯蚓脂质中加入无水乙醇，得到乙醇溶出物；将乙醇溶出物中无水乙醇除去，再加入氯仿，得到氯仿溶出物；向氯仿溶出物中加入丙酮，并在4000r/min下离心15min，得到蚯蚓卵磷脂；
f)提取蚓激酶
将步骤d)收集到的离心液通入截留分子量为100000D的膜过滤器，得到过滤液；再将过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件后，得到的浓缩液的体积为离心液体积的1/5，再加入纯净水，纯净水与浓缩液的总体积等于过滤液的体积，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，重复8～10个循环，调整蚓激酶浆料至PH7.8。再用浓磷酸缓冲液调制到0.005M/l，导入2-已氨基树脂纤维素层析柱中，经0.6mol/L氯化钠对层析后的产物进行洗脱，收集蚓激酶下柱液；重复d)步骤浓缩，脱盐操作，再经冷冻干燥，粉碎，得蚓激酶粉。
实施例3
a)蚯蚓浆料制备
排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后将蚯蚓表面擦干，冷冻，得到冻蚯蚓；取1t冻蚯蚓室温解冻后采用球磨机制成浆，得到蚯蚓浆料；制备浆料过程中温度不超过15℃，时间为2h；
b)蚓浆分离
将步骤a)得到的蚯蚓浆料在50℃的水浴锅中保温3.5h后，在12000r/min下离心除渣，得到上清液；
c)盐析升温破乳
向步骤b)得到的上清液中加入氯化钠，直至上清液中氯化钠的含量为0.6mol/Lol/L，再升温至45℃，保持50min，得到破乳液；
d)离心分离蚯蚓脂质
将步骤c)得到的破乳液中加入氯化钠直至氯化钠的浓度为1mol/L，并温度为45℃，速度为3000r/min下离心60min，得到蚯蚓脂质，收集离心液；
e)脂质中萃取卵磷脂
向步骤d)得到的蚯蚓脂质中加入无水乙醇，得到乙醇溶出物；将乙醇溶出物中无水乙醇除去，再加入氯仿，得到氯仿溶出物；向氯仿溶出物中加入丙酮，并在4000r/min下离心15min，得到蚯蚓卵磷脂；
f)提取蚓激酶
将步骤d)收集到的离心液通入截留分子量为100000D的膜过滤器，得到过滤液；再将过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件后，得到的浓缩液的体积为离心液体积的1/5，再加入纯净水，纯净水与浓缩液的总体积等于过滤液的体积，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，重复8～10个循环，调整蚓激酶浆料至PH7.8。再用浓磷酸缓冲液调制到0.005M/l，导入2-已氨基树脂纤维素层析柱中，经0.6mol/L氯化钠对层析后的产物进行洗脱，收集蚓激酶下柱液；重复d)步骤浓缩，脱盐操作，再经冷冻干燥，粉碎，得蚓激酶粉。
以实施例3制得的蚓激酶为例，进行光谱分析和效价检测，光谱分析图谱见图1，从图1可以看出，蚓激酶的光谱峰值为280nm；效价检测见图2，效价检测采用紫外分光光度法在276nm的波长处测得，从图2可以看出，蚓激酶效价检测≥12000u/mg，为25000u/mg。
测试实施例1～3得到的蚯蚓脂质和蚯蚓卵磷脂的提取率，结果见表1。
表1实验结果
蚯蚓卵磷脂原料提取率
| 批号 | 蚯蚓重量克 | 粗脂肪收率 | 卵磷脂收率 | 残渣 |
| 190512 | 7700 | 3.9％ | 0.624％ | 7.1％ |
| 190517 | 1500 | 5.7％ | 0.9264％ | 5.5％ |
| 190519 | 1900 | 4.2％ | 0.627％ | 3.14％ |
| 均值 | 4,6％ | 0.73％ | 5.21％ |
测试实施例1～3得到的蚓激酶的提取率，结果见表2
表2实验结果
| 提取率(W/W) | |
| 实施例1 | 0.45 |
| 实施例2 | 0.47 |
| 实施例3 | 0.44 |
以上对本发明提供的一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种蚓激酶与粗制蚯蚓卵磷脂的联合制备工艺，其特征在于，包括：
a)蚯蚓浆料制备
排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，冷冻，得到冻蚯蚓；将冻蚯蚓室温解冻后制成浆，得到蚯蚓浆料；
b)蚓浆分离
将步骤a)得到的蚯蚓浆料在40～56℃的水浴锅中保温3～4h后，在12000r/min下离心除渣，得到上清液；
c)盐析升温破乳
向步骤b)得到的上清液中加入无机盐，直至上清液中无机盐的含量为0.6mol/Lol/L，再升温至40～45℃，保持40～60min，得到破乳液；
d)离心分离蚯蚓脂质
将步骤c)得到的破乳液中加入无机盐直至无机盐的浓度为1mol/L，并温度为40～50℃，速度为3000r/min下离心60min，得到蚯蚓脂质，收集离心液；
e)脂质中萃取卵磷脂
向步骤d)得到的蚯蚓脂质中加入无水乙醇，得到乙醇溶出物；将乙醇溶出物中无水乙醇除去，再加入氯仿，得到氯仿溶出物；向氯仿溶出物中加入丙酮，并在4000r/min下离心15min，得到蚯蚓卵磷脂；
f)提取蚓激酶
将步骤d)收集到的离心液通入截留分子量为100000D的膜过滤器，得到过滤液；再将过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到浓缩液，再向浓缩液中加入纯净水，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，得到浓缩蚓激酶上柱液。将浓缩液通过阴离子交换纤维素树脂离子交换层析进行分离纯化层析，用0.5-2mol/L的氯化钠对层析后的产物进行阶段洗脱，经脱盐、浓缩、冷冻干燥得到蚓激酶。
2.如权利要求1所述的联合制备工艺，其特征在于，步骤a)中，制成浆的方法为机械法或溶解法。
3.如权利要求1所述的联合制备工艺，其特征在于，机械法采用的装置为砂轮磨，胶体磨，震动磨或球磨机。
4.如权利要求1所述的联合制备工艺，其特征在于，溶解法为40～45℃恒温自溶解法、蔗糖溶解法或无机盐溶解法。
5.如权利要求1所述的联合制备工艺，其特征在于，步骤c)与步骤d)中，无机盐相同，无机盐为氯化钠、氯化钙或氯化镁。
6.如权利要求1所述的联合制备工艺，其特征在于，步骤f)，过滤液通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件后，得到的浓缩液的体积为离心液体积的1/5，再加入纯净水，纯净水与浓缩液的总体积等于过滤液的体积，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件，重复8～10个循环，得到蚓激酶浆料；向蚓激酶浆料中加入PH7.8磷酸缓冲液，再通入截留分子量为5000D的中空纤维膜组件进行脱盐，在通入2-已氨基树脂纤维素层析，用0.6mol/L氯化钠对层析后的产物进行洗脱，收集蚓激酶下柱液；将得到蚓激酶下柱液，重复d)步骤浓缩，脱盐操作，再经冷冻干燥，粉碎，得蚓激酶粉。
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