JP7022453B2 - フィコシアニンの精製方法 - Google Patents

Description

関連出願との相互参照
本願は、２０１７年８月１８日付で提出された英国特許出願第１７１３２９３．７号に基づく優先権を主張するものであり、この出願を引用により本明細書に援用する。

発明の分野
本発明は、バイオマスからのフィコシアニンの精製方法に関する。

発明の背景
植物、藻類、シアノバクテリア、細菌、または真菌などの生物源から抽出されるフィコシアニンは、食品用および化粧品用の天然着色料として使用できる数少ない色素のひとつである。フィコシアニンはさらに、免疫増強特性、抗炎症特性、および抗酸化特性を有していることから栄養面での利点もあり、また、より純粋なフィコシアニンは、蛍光特性があるために、免疫診断および分析用途に使用される。フィコシアニンの食品添加物としての承認が米国（証明書が免除）およびＥＵ（食品添加物の証明書に通常必要とされるＥ番号が不要）においてなされたのは、比較的近年のことである。また、この色素は、比較的安定であり、易溶解性である。フィコシアニン市場は相当な規模であり、今後も著しい成長が予期されている。そのため、この市場規模と、予期される市場成長とに見合うよう、フィコシアニンの効果的な製造プロセスの設計が強く望まれている。

バイオマスからフィコシアニンを抽出および精製するための現行の方法には、減圧蒸留、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、吸着、および多様なクロマトグラフィー精製法が含まれる。こうした現行の加工法が有する問題としては、加工工程に時間がかかること、多数の加工工程が必要であること、スケールアップのコスト、および、生物学的基体に由来する細菌などによる汚染が最終製造物に及ぼす影響などがある。

非常に多くの先行技術文献に、シアノバクテリアからのフィコシアニンの抽出における水性２相分離（ＡＴＰＳ）の使用が記載されている。これらの文献のほぼ全てがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－塩のＡＴＰＳ系について記載しており、この系は、フィコシアニンがＰＥＧ上部相に分配されるように選択される。こうしたプロセスでは、ＰＥＧ－タンパク質複合体が形成され、タンパク質の回収が困難であるために、ＰＥＧ相からのフィコシアニンの回収はほぼ例外なく限外ろ過によって行なう。こうしたプロセスのうち一部においては、吸着、透析、および硫酸アンモニウム沈殿を、単独で、または限外ろ過と組み合わせて行なうことも考慮される。こうしたプロセスは、多くの場合、加工工程に時間がかかること、スケールアップに費用がかかること、および製造物の純度が低いことが特徴とされる。

そのため、上述される問題に少なくともある程度対処できる、生物源からのフィコシアニンの単離方法が必要とされている。

本明細書中において、用語「バイオマス」は、その最も広い意味を有するものとし、この用語は、天然または加工された状態であってよく、植物、藻類、シアノバクテリア、細菌、または真菌などの生物源から得ることができる有機物を指す。

さらに、特に記載のない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語およびその派生語である「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などは、明示された整数または整数の群が含まれることを示唆するものであるが、それ以外の任意の整数または整数の群が除外されることを示唆するものではない、ということが理解される。

発明の背景に関する上記記述は、本発明についての理解を促すことのみを意図している。この記述は、言及される内容が本出願優先日の時点において当技術分野での一般常識の一部であったということを認めるものでも許可するものでもない、ということが理解される。

発明の概要
本発明によれば、フィコシアニンを含有する溶液からのフィコシアニンの精製方法であって、上記溶液と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有相および炭水化物含有相を含む水性２相混合物とを接触させる工程であって、その条件は、フィコシアニンが炭水化物含有相に分配され得るように選択される、工程と、炭水化物含有相をＰＥＧ含有相から分離する工程と、炭水化物含有相を硫酸アンモニウムで処理することにより、フィコシアニンが沈殿している沈殿溶液を得る工程と、沈殿したフィコシアニンを回収する工程とを含む方法が提供される。

沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は、１４～３６重量％であってよい。
上記方法は、沈殿したフィコシアニンを溶解して溶液とする工程と、上記溶液を硫酸アンモニウムで処理することにより、フィコシアニンが再沈殿している第２の沈殿溶液を得る工程と、再沈殿したフィコシアニンを回収する工程とをさらに含んでよい。

第２の沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は、２５～３４重量％であってよい。
上記方法は、再沈殿したフィコシアニンを第２の溶液中に再溶解する工程と、再溶解したフィコシアニンを硫酸アンモニウムで処理することにより、フィコシアニンが再沈殿している第３の沈殿溶液を得る工程と、再沈殿したフィコシアニンを回収する工程とをさらに含んでよい。

第３の沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は、１６～２８重量％であってよい。
ＰＥＧは、平均分子量が、少なくとも６０００ｇ／ｍｏｌ、または少なくとも１０，０００ｇ／ｍｏｌであってよく、ＰＥＧ含有相中に約３～１５重量％の濃度で存在してよい。

炭水化物は、炭水化物含有相中に約１５～４０重量％の濃度で存在してよく、炭水化物は、デキストロース当量が１０～２０であってよく、炭水化物は、マルトデキストリン、フィコール、デキストラン、デンプン、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、セロビオース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、マルツロース、アラビノース、リボース、キシロース、およびトレハロースからなる群より選択されてよい。

２相混合物は、全体として、炭水化物含有相を１５～４０重量％、好ましくは約３０重量％、ＰＥＧ含有相を３～１５重量％、好ましくは約５重量％、およびフィコシアニンを含有する溶液を４５～８２重量％含んでよい。

フィコシアニンを含有する溶液は、湿潤または乾燥バイオマスから細胞抽出物として調製されてよく、バイオマスは、植物、藻類、シアノバクテリア、細菌、または真菌から得られてよく、バイオマスは、スピルリナから得られてよい。

フィコシアニンは、Ｃ－フィコシアニンであってよい。
以下に、本発明の一実施形態が、例示のみを目的として、添付の図面を参照して記載される。

上記方法の一実施形態を例示するフロー図である。 硫酸アンモニウム沈殿段階が、製造されるフィコシアニンの純度に及ぼす効果を、Ｅ番号として示すグラフである。 硫酸アンモニウム沈殿が、上記方法によって単離される乾燥フィコシアニン粉末の微生物汚染に及ぼす効果を示すグラフである。 硫酸アンモニウム沈殿段階が６２０／２８０純度比に及ぼす効果を示すグラフである。 硫酸アンモニウム沈殿段階が６５０／６２０純度比に及ぼす効果を示すグラフである。

発明の詳細な説明
フィコシアニンを含有する溶液からのフィコシアニンの精製方法が提供される。フィコシアニンは、Ｃ－フィコシアニン、Ｒ－フィコシアニン、またはアロフィコシアニンであってよいが、好ましくはＣ－フィコシアニンである。

上記方法は、フィコシアニンを含有する溶液を、水性２相系（ＡＴＰＳ）を形成する水性２相混合物と接触させる工程を含み、この水性２相混合物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有水性相および炭水化物含有水性相を含み、接触させる条件は、フィコシアニンが炭水化物含有相に分配され得るように選択される。上述される条件は、各相の温度、濃度、およびｐＨから選択できる。上記２つの相を混合し、次いで、遠心分離または重力沈降またはそれ以外の任意の好適な方法によって、沈降させるもしくは沈降可能とする。炭水化物含有水性相をＰＥＧ含有水性相から分離し、硫酸アンモニウムで処理して、フィコシアニンが沈殿している沈殿溶液を得る。次いで、沈殿したフィコシアニンを回収する。

ＰＥＧ含有水性相中のＰＥＧの平均分子量は、少なくとも６０００ｇ／ｍｏｌ、７０００ｇ／ｍｏｌ、８０００ｇ／ｍｏｌ、９０００ｇ／ｍｏｌ、または少なくとも１０，０００ｇ／ｍｏｌであってよい。ＰＥＧは、ＰＥＧ含有水性相中に約３～１５重量％の濃度で存在してよい。本開示において、本段落および他の段落中に記載される重量パーセント（重量％）単位は、水１００ミリリットルあたりの溶質（文脈に応じて、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、炭水化物、またはフィコシアニンであり得る）の重量（グラム）を示す。

炭水化物は、炭水化物含有相中に約１５～４０重量％の濃度で存在してよく、炭水化物は、マルトデキストリン、フィコール、デキストラン、デンプン、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、セロビオース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、マルツロース、アラビノース、リボース、キシロース、およびトレハロースからなる群より選択できる。いくつかの実施形態において、炭水化物のデキストロース当量は１０～２０である。

２相混合物は、全体として、炭水化物含有相を１５～４０重量％、好ましくは約３０重量％、ＰＥＧ含有相を３～１５重量％、好ましくは約５重量％、およびフィコシアニンを含有する溶液を４５～８２重量％含んでよい。本明細書中において、重量パーセント（重量％）単位は、相の重量を、２相混合物の総重量に対する百分率として指すものである。炭水化物含有相、ＰＥＧ含有相、およびフィコシアニンを含有する溶液の重量百分率の合計は、約１００パーセントである。

上記方法は、フィコシアニンを含有する任意の好適な溶液、典型的には細胞抽出物に対して実施できる。細胞抽出物は、植物、藻類、シアノバクテリア、細菌、または真菌から得られる湿潤または乾燥バイオマスから調製できる。細胞抽出物は、好ましくは、藻類もしくはシアノバクテリア由来のバイオマスの新鮮なもの、またはその乾燥物を水で戻したものから調製される。スピルリナは、フィコシアニン含有量が高く人間に対する毒性がないために、特に好適なバイオマス種である。このことは、人間用途の食品または化粧品用の添加剤としてフィコシアニンが使用される場合に重要である。細胞抽出物は、好ましくは、水性２相混合物またはＡＴＰＳと接触させる前に清澄化する。いくつかの実施形態において、細胞を、ｐＨ約４～８、好ましくはｐＨ約６の水溶液中、ビーズ粉砕によって破壊してよいが、任意の好適な細胞破砕法を使用してよい。さらに好適な細胞破砕法には、とりわけ、物理的細胞破砕、高圧ホモジナイズ、超音波処理、または凍結粉砕が含まれる。次いで、破砕された細胞を放置して浸漬させ、フィコシアニンを溶液中に浸出させてよい。

得られる粗製混合物を、遠心分離、ろ過、接線流ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、または他の任意の好適な手段によって清澄化してよく、水性抽出物を、ＡＴＰＳにおける水性相２つと接触させてよい。ＡＴＰＳにより、抽出物中のバイオマス残渣からフィコシアニンが分離され、原材料中に存在し得る微生物およびタンパク質汚染が除去される。上記方法の全体を、好都合な温度（約２５℃）において、著しい収量減少を伴うことなく実施できるが、上記方法は、任意の周囲温度（約４℃～約５０℃）においても同様に実施できる。

沈殿溶液の最終の硫酸アンモニウム濃度は、約１４～３６重量％、典型的には約２３重量％であってよく、これは、２５～８０％飽和硫酸アンモニウム溶液と同等である。明確さを期して、かつ、曖昧さを回避するために、「％飽和」濃度は、硫酸アンモニウム溶液とフィコシアニン含有相との組合せ溶液の総体積に基づくものであり、上記組合せ溶液の飽和の程度を、１００％飽和硫酸アンモニウム溶液に基づいて示すものである。硫酸アンモニウムを、水溶液状にて沈殿溶液に添加してよい。代替的には、硫酸アンモニウムを、固体状にて添加した後溶解させてもよい。沈殿したフィコシアニンは、遠心分離、重力沈降、ろ過、または接線流ろ過によって集めることができる。

図１中に示すように、上記方法は、単離されるフィコシアニンの純度を高めるために、１つ以上のさらなる硫酸アンモニウム沈殿工程を含んでよい。第２の硫酸アンモニウム沈殿を、沈殿したフィコシアニンを溶解して溶液とし、上記溶液を硫酸アンモニウムで処理することにより、フィコシアニンが再沈殿している第２の沈殿溶液を得て、再沈殿したフィコシアニンを回収することによって実施できる。第２の沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は、２５～３４重量％、典型的には約２９重量％であってよく、これは、５５～７５％飽和硫酸アンモニウム溶液と同等である。再沈殿したフィコシアニンを、遠心分離、重力沈降、ろ過、または接線流ろ過によって回収してよい。

第３の硫酸アンモニウム沈殿を、再沈殿したフィコシアニンを再溶解して溶液とし、上記溶液を硫酸アンモニウムで処理することにより、フィコシアニンが再沈殿している第３の沈殿溶液を得て、再沈殿したフィコシアニンが精製されたものを単離することによって実施できる。第３の沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は、約１６～２８重量％、典型的には約１８重量％であってよく、これは、３５～６０％飽和硫酸アンモニウム溶液と同等である。沈殿したフィコシアニンを、遠心分離、重力沈降、ろ過、または接線流ろ過によって回収した後、乾燥させてよい。溶液中の炭水化物は、フィコシアニンを安定化するものであり、フィコシアニンタンパク質を著しく変性させることなく噴霧乾燥または凍結乾燥することを可能とする。他の乾燥法を使用してもよい。

添付の図面に例示されるように、本発明の方法により製造されるフィコシアニンの純度は、硫酸アンモニウム沈殿段階の回数が増えるにつれて高くなる。沈殿段階によって、混入タンパク質が除去されると同時に微生物汚染が除去されることにより、フィコシアニンが精製される。ＡＴＰＳを行わない硫酸アンモニウム沈殿では、製造物の純度グレードが必要な程度にならないが、ＡＴＰＳ実施直後にフィコシアニンを抽出すると、微生物汚染が十分に低減されない。望ましい純度の程度は、ＡＴＰＳと硫酸アンモニウム沈殿とを組み合わせた場合にのみ実現できる。

図２中、フィコシアニン純度の改善を、沈殿を連続して行なう毎に１（食品グレードより低い）から５超（食品グレード）で増加するＥ番号の増加として表す。精製の文脈において、Ｅ番号は、フィコシアニンの純度を示し、１重量％溶液の６１８ｎｍにおける吸光度にて測定される。沈殿を連続して行なう毎に生じる微生物汚染の低減を図３中に示すが、これは、乾燥粉末１グラムあたりのコロニー形成単位数（ＣＦＵ／ｇ）にて測定される。沈殿を連続して行なう毎に生じる６２０／２８０ｎｍ（フィコシアニン対総タンパク質）純度比の改善を図４中に示すが、第１の沈殿は低質の食品グレードのフィコシアニンを生じ、第３の沈殿は比率が１．５より大きく、この比率は化粧品用グレードのフィコシアニンと一致する。６５０／６２０ｎｍ比における改善を図５中に示すが、これは、沈殿を連続して行なう毎に製造物が精製されて、アロフィコシアニンよりもＣ－フィコシアニンの比率の方が大きくなることを表している。３回沈殿させた後に得られる０．３未満という６５０／６２０比は、化粧品グレード、さらには試薬グレードのフィコシアニンと一致する。本発明の方法により、食品グレードまたはそれより高いグレードのフィコシアニンが、最小限の微生物汚染にて製造され、当技術分野において一般的に使用されるクロマトグラフィーおよび減圧蒸留装置などの高価な機器を有利にも不要とすることができる。また、この方法は、フィコシアニンの抽出に使用される従来のクロマトグラフィー、蒸留、またはＡＴＰＳ法よりも著しく短い時間で実施できる。

次に、以下の非制限的な実施例を用いて、本発明をさらに詳細に記載する。
実施例
３Ｌの容器に１ｍｍのガラスビーズを１ｋｇ詰め、オーバーヘッドスターラーにより１８０ＲＰＭにて撹拌した。シアノバクテリア由来の原材料（本実施形態においてはスピルリナ、乾燥物１００ｇまたは湿潤物９００ｇ）を入れ、クエン酸塩の混合物（クエン酸ナトリウム９２％、クエン酸８％）を添加して、ｐＨ６での緩衝能力を５ｇ／Ｌとし、水を加えて１Ｌとした。シアノバクテリアを１５分間粉砕し、次いで４８時間浸漬させて、フィコシアニンを溶液中に浸出させることによって、フィコシアニンを最適に回収した。フィコシアニンの抽出を最適とするためにはｐＨが重要であることが分かり、ｐＨ４未満およびｐＨ８超では収率が減少した。したがって、ｐＨ６での緩衝が重要であった。シアノバクテリアの添加およびビーズの材料（ガラスまたはスチール）によるフィコシアニン製造への影響は確認されなかった。１ｍｍのビーズを使用したところ、これより大きなものと比較して、抽出が最良となった。

バッチ式遠心分離機を７０００ｇにおいて２０分間使用して、廃棄バイオマスを除去した。遠心分離後、上清を慎重に出して、バイオマスのペレットを廃棄した。このバッチ式遠心分離の手法は、実験室規模での操作に用いるのに非常に好適であった。遠心分離に代えて接線流ろ過を用いることもできるが、デッドエンドろ過は、バイオマスの残骸が急速に堆積するため、効果的でないことが分かった。

マルトデキストリン含有水性相を１５～４０重量％含み（いくつかの実施例ではマルトデキストリンを３０重量％含有）、かつＰＥＧ含有水溶液を３～１５重量％含む（いくつかの実施例ではＰＥＧを５重量％含有する）水性２相系（ＡＴＰＳ）を使用して、分離を行なった。ＰＥＧ含有水溶液の平均ＰＥＧ分子量は１００００ｇ／ｍｏｌ以上であった。残り（重量％）はバイオマス粉砕物に由来するフィコシアニン含有水性上清であった。２相混合物およびフィコシアニン含有上清を激しく撹拌して完全に混合した後、遠心分離または重力沈降によって２相を分離した。次いで、さらなる加工のために、フィコシアニンに富むマルトデキストリン下層を除去した。

ＡＴＰＳは、周囲温度約２５℃において都合よく行なった。ｐＨは、粉砕および廃棄バイオマス除去段階から変化せず、ｐＨ約６において行なった。

ＰＥＧの分子量を用いることにより、フィコシアニンがマルトデキストリンまたはＰＥＧ層のいずれに分配されたかを選択した。調べたところ、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ７０００、ＰＥＧ８０００、およびＰＥＧ９０００をこの方法に好適に使用できるが、ＰＥＧ１０，０００またはそれ以上のＰＥＧを使用するとフィコシアニンがマルトデキストリン層に最も良好に回収された。その結果、次工程のフィコシアニンの回収を困難にするＰＥＧ－タンパク質複合体（水性２相系で生じる場合がある）は生成されなかった。マルトデキストリンはフィコシアニンと複合体を形成するが、この複合体は結合が弱いため、ＰＥＧ－フィコシアニン複合体よりも容易にフィコシアニンが沈殿し得る。マルトデキストリンを３０重量％およびＰＥＧ１０，０００を５重量％含有するＡＴＰＳが、フィコシアニンの回収に最適であることが分かった。

ＡＴＰＳからのフィコシアニン溶液を硫酸アンモニウム（１４～３６重量％）で処理し、混合物を最低１時間静置した後、７０００ｇで遠心分離した。続いて、透明な上清液を吸引によって除去した。次いで、残った細胞ペレットを水に再溶解して、最初の体積の８０％とし、２５～３４重量％の硫酸アンモニウムで処理した。混合物を最低１時間静置した後、７０００ｇで遠心分離した。透明な上清を吸引によって除去し、ペレットを水に再溶解して、最初の体積の８０％とした。この溶液を硫酸アンモニウム（１６～２８重量％）で再度処理し、少なくとも１時間静置した後、７０００ｇで遠心分離した。透明な上清を除去した後、沈殿を噴霧乾燥または凍結乾燥させて、高度に精製されたフィコシアニン製造物を得た。

Claims (15)

1. フィコシアニンを含有する溶液からのフィコシアニンの精製方法であって、
   前記溶液と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有相および炭水化物含有相を含む水性２相混合物とを接触させる工程と、
   前記炭水化物含有相を前記ＰＥＧ含有相から分離する工程と、
   前記炭水化物含有相を硫酸アンモニウムで処理することにより、前記フィコシアニンが沈殿している沈殿溶液を得る工程と、
   前記沈殿したフィコシアニンを回収する工程とを含み、
   前記炭水化物含有相は、マルトデキストリン、フィコール、デキストラン、デンプン、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、セロビオース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、マルツロース、アラビノース、リボース、キシロース、およびトレハロースからなる群より選択される炭水化物を含む、方法。
2. 前記沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は１４～３６重量％である、請求項１に記載の方法。
3. 前記沈殿したフィコシアニンを溶解して溶液とする工程と、前記溶液を硫酸アンモニウムで処理することにより、前記フィコシアニンが再沈殿している第２の沈殿溶液を得る工程と、前記再沈殿したフィコシアニンを回収する工程とをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記第２の沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は２５～３４重量％である、請求項３に記載の方法。
5. 前記再沈殿したフィコシアニンを再溶解して溶液とする工程と、前記溶液を硫酸アンモニウムで処理することにより、前記フィコシアニンが再沈殿している第３の沈殿溶液を得る工程と、前記再沈殿したフィコシアニンを回収する工程とをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記第３の沈殿溶液の硫酸アンモニウム濃度は１６～２８重量％である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＰＥＧは平均分子量が少なくとも６０００ｇ／ｍｏｌであり、より具体的には前記ＰＥＧは平均分子量が少なくとも１０，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記ＰＥＧは前記ＰＥＧ含有水性相中に約３～１５重量％の濃度で存在する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記炭水化物は前記炭水化物含有相中に約１５～４０重量％の濃度で存在する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記２相混合物は、全体として、前記炭水化物含有相を１５～４０重量％、前記ＰＥＧ含有相を３～１５重量％、および前記フィコシアニンを含有する溶液を４５～８２重量％
    含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記フィコシアニンを含有する溶液は細胞抽出物である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記細胞抽出物は湿潤バイオマスから調製される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記細胞抽出物は乾燥バイオマスから調製される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記バイオマスは植物、藻類、シアノバクテリア、細菌、または真菌から得られ、より具体的には前記バイオマスはスピルリナから得られる、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記フィコシアニンはＣ－フィコシアニンである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

Images