JP2018502592A - タンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
− 目標とする生成物の化学的汚染、
− 対象となる細胞内分子の不可逆的変性または分解をおそらく引き起こす;高過ぎる
破壊エネルギーの使用
を回避しなければならない。
− ビーズミルによる細胞分解、
− 粉砕された微細藻類懸濁液の遠心分離、
− 上清の透析、
− イオン交換樹脂上の通過、
− 溶出液の透析、
− 脱色、次に
− 洗浄および再懸濁
を含む方法を提案した。
変更する代替的な解決策が提案されている。
− 細胞膜の熱透過化の方法、続いて、
− このように透過化された残留バイオマスおよびその副産物の回収および改良を行うことによる、タンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法に関す
る。
− 発酵によって生成される微細藻類バイオマスを提供する工程と、
− 任意選択的に、細胞間可溶性化合物を除去するように、バイオマスを洗浄する工程と、
− 約10秒間〜約5分間の時間、好ましくは約5秒間〜約1分間の時間にわたる、50〜150℃、好ましくは約80〜150℃の温度での、バイオマスの熱透過化、
− 遠心分離技術、より特定的には多段階遠心分離による、このように透過化されたバイオマスと可溶性画分との間の分離、
− 任意選択的に、残留不溶性物質を除去するような精密ろ過による、このように得られた可溶性画分の回収および浄化、
− ペプチド単離物およびペプチド濃縮物を得るような、沈殿による前の可溶性画分の精製
を含むことを特徴とする方法である。
好ましくは、クロレラ属(Chlorella)の微細藻類は、クロレラ(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)およびクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)からなる群から選択され、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)である。
Collection of Algae at the University of Texas at Austin−USA)である。別の実施形態において、菌株は、菌株CCAP211/8D−The Culture Collection of Algae and Protozoa,Scotland,UK)である。
従属栄養条件下で、光の非存在下における培養が、従来、乾燥細胞の45重量%〜70重量%のタンパク質含量(窒素含量N×6.25を測定することによって評価される)を有するクロレラバイオマスの生成をもたらす。
− 窒素が制限され、pH調節が、NH3/KOH混合物を用いて行われる、第1の発酵工程、次に
− NH3単独で行われるpH調節によるこの窒素の制限の除去の第2の工程
を含む、開発された新規な方法を使用することを推奨している。
g/lである。
次に、バイオマスは、フロントろ過もしくはタンジェンシャルろ過または当業者にさらに公知の任意の手段による固液分離によって収集される。
熱処理は、約10秒間〜約5分間の時間、好ましくは約5秒間〜約5分間の時間、好ましくは約10秒間〜約1分間の時間にわたって、50〜150℃、好ましくは約80〜150℃の温度で行われる。好ましい実施形態において、熱処理は、約10秒間にわたって約140℃の温度で行われる。別の好ましい実施形態において、熱処理は、約1分間にわたって約85℃の温度で行われる。
nalytical Biochemistry,315,77−84)。
次に、遠心分離技術、より特定的には多段階遠心分離によって、このように透過化されたバイオマスと可溶性画分との間の分離が行われる。
可溶物が分離された残留バイオマスは、栄養的側面が再調整された全体成分として改良され得る。
ここで、本発明の方法は、培地の特性を変更することによって、沈殿によって、対象となるペプチドの単離をもたらす。
− 培地の物理化学的特性を変更することによって、ペプチド画分の全てまたは一部の沈殿を促進すること。
単離物がこのように抽出された場合、可溶性相(分離後の軽質相)は、(その残留タンパク質含量に応じて)タンパク質濃縮物などとして改良されてもよく、または残留ペプチドをそれから抽出するための新たな精製プロセスを経てもよい。
再循環を可能にし得る)が、微粒子化、凍結乾燥または当業者にさらに公知の任意の手段による乾燥の前に任意選択的に行われる。
使用される菌株は、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(菌株CCAP211/8D−The Culture Collection of Algae and Protozoa,Scotland,UK)である。
− 500mLの三角フラスコ中の150mLの培地;
− 培地の組成:40g/Lのグルコース+10g/Lの酵母エキス。
− 時間:72時間;
− 温度:28℃;
− 振とう:110rpm(Infors Multitron Incubator)。
調製および初期バッチ培地
− 20%v/v(59%)で、400g/l(41%)/NH3で、KOHの混合物を調製し、ろ過し;
− 121℃/20分で、20Lの発酵槽を滅菌し;
− 2つの三角フラスコに、500mLの前培養物(15のOD600nm)を接種し;
− 20%v/vのNH3を用いて、pH4.5にし、
− 300rpmの振とう速度を開始する;
− 通気量:20L/分の空気;
− 30%におけるpO2調節;
原料
− グルコース:500g/L
− 硫酸アンモニウム:5g/L
− リン酸二アンモニウム:20g/L
− リン酸:16g/L
− 硫酸マグネシウム七水和物:12g/L
− 硫酸鉄:170mg/L
− 硝酸カルシウム:610mg/L
− 微量元素の溶液:45mL/L
− ビタミンの溶液:4.5mL/L
− 接種前に、20g/Lの当量を提供し、
− グルコース濃度が0g/Lである場合、指数関数的プロファイル(μ=0.07時−1)で供給を開始し;
− 41%のKOH/59%のNH3混合物を用いて、pHを5.2に調節、
− 2kgのグルコースが、微細藻類によって消費された場合、系を、NH3単独でのpH調節に切り替える。
この発酵手順は、N.6.25として表される、65%超のタンパク質を含むバイオマスを得ることを可能にする。
実施例1にしたがって生成されたバイオマスは、80%の純度(全固形分に対するバイオマスの固形分の比率によって定義される純度)で、105g/Lの細胞固形分で採取される。
− 洗浄され、インライン希釈[1:1](VwaterVmust)によって濃縮され、Alfa Laval FEUX 510プレート遠心分離機において遠心分離され、220g/Lの固形分および93%の純度(全固形分に対するバイオマスの固形分の比率によって定義される純度)にされ、次に、
− pHは、水酸化カリウムで7に調整され、
− 間接的な蒸気プレート熱交換器におけるHTSTによる熱処理により、バイオマス
が85℃にされ、保持によって1分間維持され、その後、グリコール−水プレート熱交換器において4℃に冷却される。
− 全アミノ酸:48.73%
− 全糖:27.02%
− 全脂肪酸:15.10%
− 灰分およびその他:9.15%
バイオマスの熱透過化による塩析から得られる可溶物の分離は、遠心分離によって行われる。
− 全アミノ酸:77.3%
− 全糖:17.6%
− 灰分およびその他:5.1%
分離後に採取された可溶物の試料が、タンパク質単離物を得ることを目的とする精製に使用される。
− 全アミノ酸:95.9%
− 全糖:2.44%
− 灰分およびその他:1.66%。
− グルタミン酸:49.9%
− アルギニン:47.21%
− その他:2.89%。
単離物の沈殿および分離後の軽質相を、沈殿されない(より低い分子量の)タンパク質画分を濃縮するように精製してもよい。
R−215実験室用ロータリーエバポレータ(rotavapor)において15ミリバール、−43℃)によって、45.4%の固形分になるように濃縮される。
− 全アミノ酸:68.5%
− 全糖:23.46%
− 灰分およびその他:8.04%
− 全アミノ酸:73.19%
− 全糖:20.45%
− 灰分およびその他:6.36%
実施例2で得られたタンパク質に富む粗不溶物は、残留バイオマスから分離され、残留バイオマスは、改良されるのを可能にするプロセスで処理され得る。
− 全アミノ酸:27.1%
− 全脂肪酸:27.1%
− 全糖:35.8%
− 灰分およびその他:10%
− アスパラギン酸:6.05%
− トレオニン:3.91%
− セリン:3.56%
− グルタミン酸:23.84%
− グリシン:3.56%
− アラニン:5.69%
− バリン:4.27%
− イソロイシン:2.31%
− ロイシン:5.87%
− チロシン:2.49%
− フェニルアラニン:3.20%
− リジン:3.74%
− ヒスチジン:1.60%
− アルギニン:25.98%
− プロリン:3.91%
Claims (8)
- クロレラ属(Chlorella)のタンパク質に富む微細藻類のバイオマスの成分を分画するための方法であって、以下の工程:
− 発酵によって生成される微細藻類バイオマスを提供する工程と、
− 任意選択的に、細胞間可溶性化合物を除去するように、前記バイオマスを洗浄する工程と、
− 約10秒間〜5分間、好ましくは約5秒間〜約1分間にわたる、50〜150℃、好ましくは約80〜150℃の温度での前記バイオマスの熱透過化、
− 遠心分離技術、より特定的には多段階遠心分離による、このように透過化された前記バイオマスと可溶性画分との分離、
− 任意選択的に、残留不溶性物質を除去するような精密ろ過による、このように得られた前記可溶性画分の回収および浄化、
− ペプチド単離物およびペプチド濃縮物を得るような、沈殿による前の可溶性画分の精製
を含むことを特徴とする方法。 - 前記クロレラ属(Chlorella)の微細藻類が、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)およびクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)からなる群から選択され、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- タンパク質に富む微細藻類の前記バイオマスが、
− 窒素不足で、pH調節がNH3/KOH混合物を用いて行われる、第1の発酵工程、次に、
− NH3単独で行われるpH調節によるこの窒素不足の除去の第2の工程
を含む方法によって調製されることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。 - 約5秒間〜約5分間、好ましくは約10秒間〜約1分間にわたって、約80〜150℃の温度の前記熱処理を特徴とする、請求項1ないし請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記熱処理が、約1分間にわたって約85℃の温度で、または約10秒間にわたって約140℃の温度で行われることを特徴とする、請求項1ないし請求項4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記透過化されたバイオマスが、続いて、
− 粉砕、優先的に機械的粉砕、
− pH7における安定化、
− 低温殺菌、
− 微粒子化
によって処理されることを特徴とする、請求項1ないし請求項5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性画分の精製が、
− 任意選択的に、2.5〜6.5、好ましくは3〜5の値へのpHの調整を伴う、10℃未満、好ましくは4℃未満の冷却温度での沈殿、
− 前記ペプチド単離物に対応する重質相、および軽質相を得るような、遠心分離またはデカンテーション、
− このように得られた前記ペプチド単離物の濃縮および乾燥
によって行われることを特徴とする、請求項1ないし請求項6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記残留ペプチドが、エタノールによる沈殿によって、前記軽質相から抽出されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
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